Name: Ekspresja cytokin egzogennych w ksenoprzeszczepach pobranych od pacjentów poprzez wstrzyknięcie linii komórek zrębu transdukowanej cytokiną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania cytokin egzogennych w mysich ksenoprzeszczepach poprzez wstrzyknięcie linii komórek zrębu transdukowanej cytokiną. Technika ta umożliwia badanie rozwoju limfocytów i testowanie nowych terapii przeciwnowotworowych bez konieczności tworzenia drogich linii myszy transgenicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez NIH R21CA162259, NIH R01CA209829, NIH P20 MD006988, NIH 2R25 GM060507, Hyundai Hope Hope Scholar Grant, Department of Pathology and Human Anatomy, Department of Basic Sciences oraz Center for Health Disparities and Molecular Medicine at Loma Linda University School of Medicine oraz przez Grant na Promowanie Wspólnych i Translacyjnych Badań z Uniwersytetu Loma Linda (KJP). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy NIH.

<ol><li>Francis, O. L., Milford, T. A., Beldiman, C., Payne, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-tuning+patient-derived+xenograft+models+for+precision+medicine+approaches+in+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Investig+Med%22%5BJournal%5D)">Fine-tuning patient-derived xenograft models for precision medicine approaches in leukemia.</a> J Investig Med. 64 (3), 740-744 (2016).</li>
<li>Parrish, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7+Dependence+in+human+B+lymphopoiesis+increases+during+progression+of+ontogeny+from+cord+blood+to+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-7 Dependence in human B lymphopoiesis increases during progression of ontogeny from cord blood to bone marrow.</a> J Immunol. 182 (7), 4255-4266 (2009).</li>
<li>Johnson, S. E., Shah, N., Panoskaltsis-Mortari, A., LeBien, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+and+human+IL-7+activate+STAT5+and+induce+proliferation+of+normal+human+pro-B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Murine and human IL-7 activate STAT5 and induce proliferation of normal human pro-B cells.</a> J Immunol. 175 (11), 7325-7331 (2005).</li>
<li>Milford, T. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/304249946_TSLP_or_IL-7_provide_an_IL-7R_signal_that_is_critical_for_human_B_lymphopoiesis?ev=prf_high">TSLP or IL-7 provide an IL-7Ralpha signal that is critical for human B lymphopoiesis.</a> Eur J Immunol. 46 (9), 2155-2161 (2016).</li>
<li>Reche, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+thymic+stromal+lymphopoietin+preferentially+stimulates+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human thymic stromal lymphopoietin preferentially stimulates myeloid cells.</a> J Immunol. 167 (1), 336-343 (2001).</li>
<li>Francis, O. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+xenograft+model+to+study+the+role+of+TSLP-induced+CRLF2+signals+in+normal+and+malignant+human+B+lymphopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">A novel xenograft model to study the role of TSLP-induced CRLF2 signals in normal and malignant human B lymphopoiesis.</a> Haematologica. 101 (4), 417-426 (2016).</li>
<li>Willinger, T., Rongvaux, A., Strowig, T., Manz, M. G., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+human+hemato-lymphoid-system+mice+by+cytokine+knock-in+gene+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Improving human hemato-lymphoid-system mice by cytokine knock-in gene replacement.</a> Trends Immunol. 32 (7), 321-327 (2011).</li>
<li>Graf, L., Iwata, M., Torok-Storb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+the+functionally+distinct+human+bone+marrow+stromal+cell+lines+HS-5+and+HS-27a%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of the functionally distinct human bone marrow stromal cell lines HS-5 and HS-27a.</a> Blood. 100 (4), 1509-1511 (2002).</li>
<li>Follenzi, A., Ailles, L. E., Bakovic, S., Geuna, M., Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+by+lentiviral+vectors+is+limited+by+nuclear+translocation+and+rescued+by+HIV-1+pol+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene transfer by lentiviral vectors is limited by nuclear translocation and rescued by HIV-1 pol sequences.</a> Nat Genet. 25 (2), 217-222 (2000).</li>
<li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031(2012).</li>
<li>Cockrell, A. S., Kafri, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+by+lentivirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Gene delivery by lentivirus vectors.</a> Mol Biotechnol. 36 (3), 184-204 (2007).</li>
<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freezing%2C+thawing%2C+and+packaging+cells+for+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Freezing, thawing, and packaging cells for transport.</a> J Vis Exp. (17), (2008).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The ELISA Method. JoVE. , Cambridge, MA. 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5061">http://www.jove.com/science-education/5061</a> (2016).</li>
<li>Tasian, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+STAT5+and+PI3K%2FmTOR+pathway+signaling+occurs+in+human+CRLF2-rearranged+B-precursor+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Aberrant STAT5 and PI3K/mTOR pathway signaling occurs in human CRLF2-rearranged B-precursor acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 120 (4), 833-842 (2012).</li>
<li>Kalaitzidis, D., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+phosphoprotein+analysis+reveals+agonist+and+temporal+differences+in+responses+of+murine+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 3 (11), (2008).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE. , Cambridge, MA. 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5048">http://www.jove.com/science-education/5048</a> (2016).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Introducing Experimental Agents into the Mouse. JoVE. , Cambridge, MA. 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5161">http://www.jove.com/science-education/5161</a> (2016).</li>
<li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li>
<li>Kovacsics, D., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+of+proteins+by+hydrodynamic+gene+delivery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transient expression of proteins by hydrodynamic gene delivery in mice.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3023233/">Chapter 15, Creation of &#34;humanized&#34; mice to study human immunity.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li>
<li>Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bone+marrow+derived+murine+dendritic+cells+for+use+in+2-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging.</a> J Vis Exp. (17), (2008).</li>
<li>Scheeren, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+stromal+lymphopoietin+induces+early+human+B-cell+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic stromal lymphopoietin induces early human B-cell proliferation and differentiation.</a> Eur J Immunol. 40 (4), 955-965 (2010).</li>
<li>Lee, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+serum+thymic+stromal+lymphopoietin+in+children+with+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Increased serum thymic stromal lymphopoietin in children with atopic dermatitis.</a> Pediatr Allergy Immunol. 21 (2 Pt 2), e457-e460 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ten manuskrypt opisuje prostą, szybką i stosunkowo opłacalną metodę inżynierii PDX w celu ekspresji egzogennej ludzkiej cytokiny. Opisana tutaj strategia opiera się na cotygodniowych iniekcjach dootrzewnowych linii komórek zrębu transdukowanej w celu ekspresji ludzkiej cytokiny, TSLP. Przed wykonaniem opisanych tutaj metod wygenerowano zrąb zaprojektowany do wyrażania wysokich poziomów cytokiny będącej przedmiotem zainteresowania (TSLP) i podobnie zmodyfikowany zrąb kontrolny. W przedstawionych tutaj protokołach zrąb jes...

Ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów (PDX) stanowią potężny model in vivo do badania produkcji prawidłowych i złośliwych komórek krwiotwórczych w „rodzimym” środowisku ssaków. Najczęściej PDX są tworzone poprzez wstrzykiwanie lub przeszczepianie ludzkich komórek do myszy z niedoborem odporności. Tworzenie PDX z wykorzystaniem prawidłowych ludzkich komórek macierzystych krwiotwórczych umożliwia badania in vivo rozwoju prawidłowych ludzkich komórek krwi i komórek odpornościowych. PDX wytworzone z komórek białaczkowych lub innych komórek nowotworowych pozwalają na badanie mechanizmów onkogennych oraz identyfikację skutecznych terapii w kontekście różnorodności krajobrazów genetycznych i mutacji występujących w populacji ludzkiej.1 W konsekwencji PDX są obecnie złotym standardem w translacyjnych badaniach biomedycznych służących identyfikacji skutecznych terapii oraz ważnym narzędziem do zrozumienia mechanizmów progresji nowotworów. Modele PDX są niezbędnym narzędziem wspomagającym badania nad chorobami wynikającymi z nierówności zdrowotnych spowodowanych specyficznymi uszkodzeniami genetycznymi lub każdą chorobą, w której wariacje krajobrazu genetycznego pacjenta mogą w znacznym stopniu przyczyniać się do onkogenezy i wyniku leczenia.
Modele PDX myszo-ludzkie są możliwe dzięki temu, że wiele cytokin mysich w stopniu wystarczającym naśladuje swoje ludzkie odpowiedniki w aktywacji receptorów cytokinowych ludzkich komórek podczas ich przebywania w organizmie myszy. Na przykład interleukina-7 (IL-7) dostarcza krytycznego sygnału dla rozwoju ludzkich limfocytów B.2 W tym przypadku mysia IL-7 wykazuje wystarczającą homologię z ludzką IL-7, aby cytokina mysia stymulowała szlaki sygnalizacyjne w ludzkich prekursorach limfocytów B.2,3,4 Nie dotyczy to jednak limfopoetyny stroma lneiej grasicy (TSLP),5,6 która wraz z innymi cytokinami (IL-3, czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów (GM-CSF), czynnik wzrostu komórek macierzystych (SCF),7 jest ważna dla produkcji prawidłowych i nowotworowych ludzkich komórek krwiotwórczych. Gdy cytokiny mysie i ludzkie wykazują niską homologię, cytokiny mysie nie aktywują odpowiednich receptorów na ludzkich komórkach. Aby pokonać tę przeszkodę, zastosowano szereg strategii w celu zaprojektowania ekspresji ludzkich cytokin w myszach PDX. Obejmują one wstrzykiwanie rekombinowanych ludzkich cytokin, wstrzykiwanie hydrodynamiczne DNA, ekspresję lentiwirusową, ekspresję transgeniczną oraz zastąpienie genu metodą knockin.7 Niniejszy raport opisuje metodę modyfikacji PDX w celu produkcji ludzkiej cytokiny poprzez stroma-pośrednią dostawę cytokin (Rysunek 1).
W zaprezentowanej tutaj metodzie myszy PDX są modyfikowane tak, aby ekspresować ludzką cytokinę TSLP lub służyć jako kontrole negatywne pod względem cytokin. PDX ekspresujące TSLP uzyskuje się poprzez cotygodniowe iniekcje dootrzewnowe komórek zrębu, które zostały przetransdukowane w celu ekspresji wysokich poziomów ludzkiej TSLP. Myszy „kontrolne” PDX negatywne pod względem cytokin są modyfikowane w podobny sposób, przy czym zrąb kontrolny jest transdukowany wektorem kontrolnym. Metoda ta pozwala na osiągnięcie normalnych fizjologicznych poziomów ludzkiej TSLP w myszach PDX, którym wstrzyknięto zrąb TSLP+. W myszach PDX otrzymujących zrąb negatywny pod względem cytokin nie obserwuje się wykrywalnej TSLP. Do naszych badań wybraliśmy ludzką linię komórek zrębu HS-27A, ponieważ rośnie ona intensywnie w hodowli i wykazuje bardzo niski poziom produkcji cytokin, który nie wspiera proliferacji izolowanych komórek progenitorowych w kokulturach.8 W celu ekspresji ludzkiej TSLP zrąb został przetransdukowany zaawansowanym wektorem lentiwirusowym samoartefakcyjnym, pochodzącym z wcześniej opisanego szkieletu,9 zawierającym element cPPT/cts oraz posttranskrypcyjny element regulacyjny wirusa zapalenia wątroby świstaka (WPRE) w celu zwiększenia ekspresji transgenu. Gen ludzkiej TSLP został wprowadzony do tego wektora pod kontrolą promotora alfa czynnika elongacyjnego-1 (EF-1), aby uzyskać silną, konstytutywną i długotrwałą ekspresję.
Konstrukcja tego modelu PDX z wzmocnioną produkcją ludzkich cytokin składa się z 4 głównych etapów. Po pierwsze, przetransdukowane zręby są namnażane in vitro i oceniane za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA) pod kątem stabilnej, wysokiej produkcji cytokin. Po drugie, aktywność ludzkiej cytokiny produkowanej przez przetransdukowane komórki zrębu (oraz brak aktywności cytokin w zrębie kontrolnym) jest weryfikowana za pomocą cytometrii przepływowej z pomiarem fosforylacji (phospho-flow). Linie komórkowe znane z odpowiedzi na badaną cytokinę (w tym przypadku TSLP) są inkubowane z nadsączem komórek zrębu, a następnie poddawane analizie pod kątem indukowanej cytokiną fosforylacji. Po trzecie, myszom wstrzykuje się przetransdukowany ludzki zrąb, a następnie w osoczu myszy co tydzień ocenia się poziom ludzkiej cytokiny za pomocą testu ELISA. Po czwarte, przeszczepia się ludzkie komórki hematopoetyczne i ocenia efekty funkcjonalne ludzkiej cytokiny in vivo na znanym celu (np. populacji komórek).
<img alt="Schemat ludzko-mysiego modelu białaczki; tworzenie PDX, monitorowanie cytokin, proces pozyskiwania komórek." src="/files/ftp_upload/55384/55384fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Model PDX zaprojektowany do produkcji egzogennej ludzkiej cytokiny u myszy. (1A) Zaplanowanie eksperymentu i pozyskanie transdukowanych ludzkich komórek zrębu (1B) Pozyskanie ludzkich komórek (hematopoetycznych komórek macierzystych, komórek białaczkowych, itp.) w celu generowania myszy PDX (ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta). (2A) Iniekcja zmodyfikowanego zrębu i (2B) przeszczepienie ludzkich komórek do myszy z niedoborem odporności zgodnie z harmonogramem eksperymentalnym. (3A-B) Monitorowanie stężeń cytokin w nadsączu zrębu oraz w osoczu myszy za pomocą testu ELISA. (4) Pozyskanie ludzkich komórek i ocena funkcjonalnych efektów in vivo ludzkiej cytokiny obecnej w PDX. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55384/55384fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Dostarczanie ludzkich cytokin via komórki zrębu oferuje zarówno zalety, jak i wady w porównaniu z innymi metodami dostarczania/produkcji ludzkich cytokin w myszach PDX.7 W porównaniu z wstrzykiwaniem rekombinowanej ludzkiej cytokiny, dostarczanie za pośrednictwem zrębu jest zazwyczaj mniej kosztowne (koszt hodowli komórek zrębu jest niższy niż koszt rekombinowanej cytokiny) i mniej pracochłonne (jedno wstrzyknięcie na tydzień w przeciwieństwie do wielu wstrzyknięć na tydzień). Problem krótkiego okresu półtrwania cytokiny jest również ograniczony, ponieważ zrąb stale produkuje egzogenną cytokinę. Dostarczanie cytokiny via hydrodynamiczne wstrzykiwanie DNA może być mniej kosztowne niż dostarczanie via zrąb. Jest ono jednak podobnie przejściowe i może wymagać większych umiejętności technicznych niż proste cotygodniowe wstrzyknięcie doszprytnewe wymagane przy dostarczaniu za pośrednictwem zrębu. Lentiwirusowa ekspresja genów u myszy może zapewnić mniej przejściową metodę dostarczania cytokin; jednak w naszych badaniach nie osiągnięto fizjologicznych poziomów TSLP. Dodatkowo metoda ta jest pracochłonna, gdyż wymaga ciągłej produkcji wektora lentiwirusowego. Myszy transgeniczne lub knock-in oferują stabilną, długoterminową ekspresję cytokiny i mogą być modyfikowane w celu uzyskania ekspresji specyficznej dla tkanki, co może być zaletą. Z drugiej strony, transgeniczna ekspresja ludzkiego genu cytokiny na tle myszy z niedoborem odporności, wymaganym dla myszy PDX, wiąże się z ogromnymi nakładami zasobów, zanim wartość modelu zostanie ustalona. Co więcej, modele transgeniczne zazwyczaj nie pozwalają na możliwość zmiany czasu rozpoczęcia podaży cytokiny lub poziomu produkcji cytokiny in vivo. Można to osiągnąć w przypadku dostarczania za pośrednictwem zrębu, po prostu zmieniając punkt czasowy rozpoczęcia wstrzykiwania komórek zrębu lub dawkę wstrzykiwanych komórek zrębu.
Opisana tutaj metoda dostarczania cytokin za pośrednictwem komórek zrębu została wykorzystana do opracowania modelu PDX w celu oceny roli TSLP w prawidłowym rozwoju ludzkich limfocytów B4,6 oraz w ostrej białaczkowej białaczce limfoblastycznej z komórek B wysokiego ryzyka.6 Metoda ta stanowi alternatywny sposób dostarczania cytokin do generowania podobnych modeli z wykorzystaniem innych ludzkich cytokin niż TSLP. Model ten może być również przydatny do uzyskania wstępnych danych, które pomogą określić, czy wartość transgenicznego modelu PDX z cytokiną lub modelu PDX z knock-in cytokiny uzasadniałaby znaczne nakłady czasu i pieniędzy.

<table><tbody><tr><td><mocne>Mokre odczynniki laboratoryjne&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T-25 EasYFlasks do hodowli komórek Nunc, pojemność 7 ml, &nbsp; 25cm&sup2; obszar hodowli</td><td>Thermo Scientific / Fisher</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask o pojemności 250 ml, obszar hodowli 75 cm&sup2 i wentylowana nasadka</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Kolba poddana działaniu kultur tkankowych T-150 Falcon, pojemność 600 ml, 150 cm2; Obszar kultury & nasadka wentylowana</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 10 ml</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>15 mL&nbsp; polipropylenowe probówki stożkowe</td><td>Fisher</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Probówki z polistyrenu okrągłodennego 5 ml</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polipropylenowe rurki stożkowe</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml fiolki kriogeniczne, z gwintem zewnętrznym</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>4230659</td><td></td></tr><tr><td>1 mL końcówki do pipet</td><td>Fisher</td><td>2707509</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; Końcówki do pipet L&nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>P3020-CPS</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L końcówki do pipet</td><td>Denville Scientific</td><td>P-1096-CP</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne jednorazowe jednostki filtrujące z membraną SFCA, Nalgene Rapid-Flow</td><td>Fisher</td><td>09-740-28D</td><td></td></tr><tr><td>2 NH2SO4&nbsp; </td><td>BioLegend</td><td>423001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco" s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) bez kaliku i magnezu, 1 razy;</td><td>Corning cellgro/ Mediatech</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Human TSLP ELISA Max Deluxe Set</td><td>BioLegend</td><td>434204</td><td></td></tr><tr><td>3% Kwas octowy z błękitem metylenowym</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7060</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue&nbsp;</td><td>Corning</td><td>25-900-CL</td><td></td></tr> <tr><td>"Trypsin" 1x 0,25% Trypsyna 2,21 mM EDTA w HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td>25-053</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20 BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-7949</td><td></td></tr><tr><td>" Czynnik R10" pożywka do hodowli komórkowych, % całkowitej objętości (składniki 565 ml)</td><td>-</td><td>-</td><td>Lab Recipe</td></tr><tr><td>RPMI, 88,5% (500 ml)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>10-040-CV&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS, 9,9% (56 ml)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina, 0,99% (5,6 ml)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna, 0,50% (2,8 ml)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol, 0,10% (560 &mikro; L)&nbsp;</td><td>MP</td><td>190242</td><td></td></tr><tr><td><silny>" Czynnik chłodniczy R20" pożywka do hodowli komórkowych, % całkowitej objętości (składniki na 195 ml)</td><td>-</td><td>-</td><td>Lab Receptura</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; RPMI, 76,84% (150&nbsp; ml)</td><td>patrz wyżej</td><td>patrz wyżej</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; FBS, 20,49% (40 ml)</td><td>patrz wyżej</td><td>patrz wyżej</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 2mM L-glutamina, 1,02% (2 mL)</td><td>patrz wyżej</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1 mM Na pirogronian, 1,02% (2 ml )</td> <td>patrz wyżej</td><td>patrz wyżej</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Penicylina-Streptomycyna,&nbsp; 0,51% (1 ml)</td><td>patrz wyżej</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 2-merkaptoetanol, 0,10% (0,1 M),&nbsp; 0,10% (200 &mikro; L)</td> <td>patrz wyżej</td>, <td>patrz wyżej</td><td></td></tr><tr><td><silny>" Podłoże do zamrażania", % objętości całkowitej</mocny></td><td>-</td><td><silny>-</mocny></td><td><silny>Receptura laboratoryjna</mocny></td></tr><tr><td>" Czynnik R10" średni, 45%</td><td>patrz przepis "R10"</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FBS, 20%</td><td>patrz wyżej</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, 10%</td><td>Corning</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>D(-)(+)-Trehaloza dwuwodna, 5%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2687-100</td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katologa</silny> </td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Biologics&nbsp; < / silna></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>"HS-27" HS-27A ludzka linia zrębu</td><td>ATCC</td><td>CRL-2496</td><td></td></tr> <tr><td>"CALL-4" Linia komórkowa MHH-CALL-4, białaczka prekursorowa ludzkich komórek B</td><td>DSMZ</td><td>ACC 337</td><td></td></tr> <tr><td>" Myszy NSG" SKINIENIE. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, mężczyzna lub kobieta, wiek 6 &ndash; 8 tygodni</td><td>myszy JAX&nbsp;</td><td># 005557</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa MUTZ-5, białaczka prekursorowa ludzkich komórek B</td><td>DSMZ</td><td>ACC 490</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko TSLP</td><td>R& D Systems</td><td>1398-TS-010</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katologa</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Flow cytomery przeciwciała (klon)*</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 FITC (30F11)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-778</td><td></td></tr><tr><td>CD127 PE (MB15-18C9) (alternatywna nazwa to IL-7R&alpha;)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-094</td><td></td></tr><tr><td>CD34 APC (8G12)</td><td>BD Biosciences</td><td>340667</td><td></td></tr><tr><td>CD45 PE-CY7&nbsp; (HI30)</td><td>eBioscience</td><td>25-0459</td><td></td></tr><tr><td>"FVD" Barwnik do utrwalenia żywotności&nbsp; eFluor 780&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>65-0865</td><td></td></tr><tr><td>Ig &kappa; łańcuch lekki FITC&nbsp; (G20-193)</td><td>BD Pharmingen</td><td>555791</td><td></td></tr><tr><td>Ig &lambda; łańcuch lekki FITC (JDC-12)</td><td>BD Pharmingen</td><td>561379</td><td></td></tr><tr><td>IgD PE (IA6-2)</td><td>BioLegend</td><td>348203</td><td></td></tr><tr><td>IgM PE-Cy5 (G20-127)</td><td>BD Biosciences</td><td>551079</td><td></td></tr><tr><td>pSTAT5 PE,&nbsp; mysi anty-STAT5 (pY694)</td><td>BD PhosphoFlow</td><td>612567</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa </td><td><silny>Firma</silny><</td><td>silny>Numer Katologa</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Inne materiały i sprzęt&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zwierzęcy wszczepialny nanotransponder z Canula</td><td>Trovan&nbsp;</td><td>ID-100B(1.25)EMLA</td><td></td></tr> krem <tr><td>znieczulający z lidokainą (uzyskany przez receptę w placówce opieki nad zwierzętami)</td><td>recepta</td> na <td>receptę</td><td></td></tr><tr><td>BD &frac12; cc LO-DOSE U-100 Strzykawka insulinowa 28G&frac12; &nbsp;</td><td>BD</td><td>#329461</td><td></td></tr><tr><td>Rurki mikrotainera BD z K2EDTA</td><td>BD&nbsp;</td><td>#365974</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>Alegra X-15R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rurki kapilarne FisherBrand (heparynizowane)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-260-950</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Fisher</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td></td></tr><tr><td>Klatka dla myszy</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>MPC-1</td><td></td></tr><tr><td>Ogranicznik iluminatora ogona myszy</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>MTI STD</td><td></td></tr><tr><td>Implantator Uchwytu Pistoletowego</td><td>Trovan&nbsp;</td><td>IM-300(1.25)</td><td></td></tr><tr><td>&mikro; Ilość&nbsp;</td><td>Bio-Tek Instruments Inc.</td>Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej <td>MQX200</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo, LLC</td><td>Wersja 10</td><td></td></tr><tr><td>*Wszystkie przeciwciała są przeciwciała przeciwko ludziom, chyba że zaznaczono inaczej.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ekspresja cytokin egzogennych w ksenoprzeszczepach pobranych od pacjentów poprzez wstrzyknięcie linii komórek zrębu transdukowanej cytokiną

Expression of Exogenous Cytokine in Patient-derived Xenografts via Injection with a Cytokine-transduced Stromal Cell Line

Myszy ksenoprzeszczepowe (PDX) pochodzące od pacjentów są produkowane przez przeszczepianie komórek ludzkich myszom z niedoborem odporności. Modele te są ważnym narzędziem do badania mechanizmów prawidłowej i złośliwej hematopoezy i są złotym standardem w identyfikacji skutecznych chemioterapii wielu nowotworów złośliwych. Modele PDX są możliwe, ponieważ wiele cytokin myszy działa również na komórki ludzkie. Nie dotyczy to jednak wszystkich cytokin, w tym wielu, które mają kluczowe znaczenie dla badania prawidłowej i złośliwej hematopoezy w komórkach ludzkich. Techniki, które pozwalają myszom wytwarzać ludzkie cytokiny (modele transgeniczne i knock-in) wymagają znacznych kosztów, zanim zostanie wykazana przydatność modelu. Inne techniki są pracochłonne (wstrzyknięcie rekombinowanej cytokiny lub lentiwirusa), a w niektórych przypadkach wymagają wysokiego poziomu wiedzy technicznej (hydrodynamiczne wstrzykiwanie DNA). W tym raporcie opisano prostą metodę generowania myszy PDX, które mają egzogenną ludzką cytokinę (TSLP, limfopoetynę zrębu grasicy) poprzez cotygodniowe dootrzewnowe wstrzyknięcie zrębu, który został transdukowany w celu nadekspresji tej cytokiny. Zastosowanie tej metody zapewnia źródło in vivo ciągłej produkcji cytokin, która osiąga fizjologiczne poziomy krążącej ludzkiej cytokiny u myszy. Poziomy ludzkiej cytokiny w osoczu mogą być zmieniane w zależności od liczby wstrzykniętych komórek zrębu, a produkcję cytokin można rozpocząć w dowolnym momencie eksperymentu. Metoda ta obejmuje również myszy kontrolne z cytokinami ujemnymi, które są podobnie produkowane, ale poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie zrębu transdukowanego wektorem kontrolnym. Wcześniej wykazaliśmy, że komórki białaczkowe zebrane z PDX eksprymującego TSLP, w porównaniu z kontrolnym PDX, wykazują wzorzec ekspresji genów bardziej podobny do oryginalnej próbki pacjenta. Razem myszy PDX wytwarzające cytokiny i ujemne pod względem cytokin wyprodukowane tą metodą stanowią system modelowy, który z powodzeniem wykorzystaliśmy do badania roli TSLP w prawidłowej i złośliwej hematopoezie.

Przegląd modelu przedstawiono na Rysunku 1. Po uzyskaniu stromy kontrolnej oraz stromy produkującej cytokiny (stroma TSLP+), są one namnażane w hodowli. Przed wstrzyknięciem stromy myszom, supernatant komórek stromalnych jest analizowany za pomocą testu ELISA w celu weryfikacji produkcji cytokin (Rysunek 2), a aktywność cytokiny produkowanej przez stromę jest potwierdzana za pomocą fosfo-cytometrii przepływowej (Protokół #3). Supernatant jest zbierany z k...

Opisana tutaj jest metoda wytwarzania egzogennej cytokiny u myszy z ksenoprzeszczepem pochodzącym od pacjenta (PDX) poprzez cotygodniowe dootrzewnowe wstrzykiwanie linii komórek zrębu transdukowanej cytokinami. Metoda ta rozszerza użyteczność PDX i zapewnia opcję przejściowego lub trwałego dostarczania cytokin egzogennych w wielu modelach PDX.

Ekspresja cytokin egzogennych w ksenoprzeszczepach pobranych od pacjentów poprzez wstrzyknięcie linii komórek zrębu transdukowanej cytokiną

Patient-derived xenograft (PDX) mice are produced by transplanting human cells into immune deficient mice. These models are an important tool for studying ...

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie myszy z ksenoprzeszczepami z krążącymi cytokinami ludzkimi. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie nowotworów i hematopoezy, takie jak: jaka jest rola konkretnej cytokiny w prawidłowym i nowotworowym rozwoju limfocytów? Główną zaletą tej techniki jest możliwość regulowania stężeń krążącej egzogennej cytokiny u zwierząt z ksenoprzeszczepami, zgodnie z potrzebami danego eksperymentu.Eliminuje to konieczność tworzenia nowych i kosztownych linii myszy transgenicznych. Technika ta będzie przydatna w badaniach nad nowymi terapiami nowotworowymi, ponieważ ten model przedkliniczny może być wykorzystywany do testowania leków przeciwnowotworowych, w sposób zbliżony do stosowanego w praktyce klinicznej. Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat prawidłowej hematopoezy, może być również wykorzystana do badania konkretnych schorzeń, takich jak białaczka.Pomysł ten opracowałem początkowo, gdy potrzebowaliśmy modelu in vivo do oceny roli cytokiny TSLP w prawidłowej i nowotworowej produkcji ludzkich limfocytów B. Należy rozpocząć od wysiania świeżo rozmrożonych, transdukowanych pustym wektorem kontrolnymi stromalnych

expression-exogenous-cytokine-patient-derived-xenografts-via

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisano wydajny protokół ekspansji ex vivo limfocytów T reaktywnych przeciwko nowotworowi, izolowanych z węzłów chłonnych drenujących guz lub innych wtórnych tkanek limfatycznych organizmów z nowotworem. Protokół ten pozwala na selektywną ekspansję swoistych dla nowotworu limfocytów T do zastosowania w adoptywnej immunoterapii raka piersi.

Ex vivo ekspansja limfocytów T reaktywnych przeciwko nowotworowi za pomocą bryostatyny 1/ionomycyny oraz formulacji cytokin wspólnego łańcucha gamma

Przeszczepianie szpiku kostnego u myszy jest powszechnie stosowaną techniką badania mechanizmów immunologicznych sterujących chorobą przeszczep przeciw gospodarzowi u ludzi. Możliwość monitorowania wzorców migracji limfocytów T in vivo pozwala na szczegółową analizę rozwoju i utrwalania odpowiedzi limfocytów T podczas choroby przeszczep przeciw gospodarzowi.

Indukcja choroby przeszczep przeciw gospodarzowi i monitorowanie limfocytów T in vivo z wykorzystaniem modelu mysiego dopasowanego pod kątem MHC

Ten artykuł opisuje technikę stymulacji limfocytów T ex vivo w celu zwiększenia wewnątrzkomórkowego stężenia cytokin, takich jak interferon-gamma lub IFN-gamma i czynnika martwicy nowotworu-alfa lub TNF-alfa w limfocytach T. Cytokiny te pośredniczą w skutecznej odpowiedzi przeciwnowotworowej i mogą pełnić rolę terapeutyczną w guzie.

Stymulacja limfocytów T ex vivo w guzie trzustki: metoda zwiększania produkcji cytokin w komórkach T

Ten film pokazuje ocenę wewnątrzkomórkowej fosforylacji białek w komórkach białaczki wywołanej cytokinami zrębowymi. Te wewnątrzkomórkowe fosforylowane białka są oznaczane ilościowo za pomocą techniki cytometrii fosfoprzepływowej.

Ocena wewnątrzkomórkowej fosforylacji białek indukowanej cytokinami zrębowymi za pomocą cytometrii fosfoprzepływowej

Tutaj opisujemy minimalnie inwazyjny model syngenicznego przeszczepu ortotopowego komórek gruczolakoraka płuc myszy jako model redukujący czas i koszty do badania niedrobnokomórkowego raka płuc.

Ortotopowe przeszczepienie komórek syngenicznego gruczolakoraka płuc w celu zbadania ekspresji PD-L1

Tutaj prezentujemy protokół do wywoływania i oceniania choroby w modelu xenoGVHD (xenoGVHD) ksenogenicznej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. xenoGVHD dostarcza model in vivo do badania immunosupresji ludzkich limfocytów T. Dodatkowo opisujemy, jak wykrywać ludzkie limfocyty T w tkankach za pomocą cyfrowego PCR jako narzędzia do ilościowego określania immunosupresji.

Indukcja i ocena choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi w ksenogenicznym mysim modelu i kwantyfikacja ludzkich limfocytów T w tkankach myszy przy użyciu cyfrowego PCR

Choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi jest poważnym powikłaniem po allogenicznym przeszczepie szpiku kostnego. Komórki dendrytyczne odgrywają kluczową rolę w patogenezie choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. W niniejszym artykule opisano nowatorską platformę przeszczepu szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w rozwoju choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi i efektowi przeszczep przeciwko białaczce.

Platforma do przeszczepiania szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi

To badanie opisuje metodę izolowania z embrionalnych komórek macierzystych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wzbogaconych egzosomami przenoszących czynniki stymulujące tworzenie kolonii granulocytów makrofagów granulocytów.

Izolacja wzbogaconych egzosomami pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przenoszących czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów z embrionalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia izolacji i ekspansji komórek zabójczych CD3+CD56+ pochodzących z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pochodzących z cytokin indukowanych cytokinami i ilustrujemy ich efekt cytotoksyczności wobec hematologicznych i litych komórek nowotworowych za pomocą systemu cytometrii przepływowej in vitro.

Izolacja i ekspansja cytotoksycznych limfocytów T zabójców indukowanych cytokinami w leczeniu raka

Ten protokół opisuje chirurgiczne generowanie ortotopowych guzów trzustki i szybkie trawienie świeżo wyizolowanych mysich guzów trzustki. Po trawieniu żywotne populacje komórek odpornościowych można wykorzystać do dalszej analizy, w tym stymulacji ex vivo limfocytów T do wewnątrzkomórkowego wykrywania cytokin za pomocą cytometrii przepływowej.

Generowanie ortotopowych guzów trzustki i charakterystyka ex vivo cytotoksyczności limfocytów T naciekających nowotwór

Obecny protokół opisuje, jak przeszczepić ludzką skórę nieotyłym myszom z cukrzycą (NOD)-scid z receptorem łańcucha gamma interleukiny-2 (NSG). W raporcie zawarto szczegółowy opis przygotowania skóry ludzkiej do przeszczepu, przygotowania myszy do przeszczepu, przeszczepu skóry ludzkiej o podzielonej grubości oraz procedury rekonwalescencji po przeszczepie.

Model skóry ksenoprzeszczepu do manipulowania ludzkimi odpowiedziami immunologicznymi in vivo

Poznaj metodę wytwarzania cytokin egzogennych w mysich ksenoprzeszczepach poprzez wstrzyknięcie linii komórek zrębu transdukowanej cytokiną. Technika ta umożliwia badanie rozwoju limfocytów i testowanie nowych terapii przeciwnowotworowych bez konieczności tworzenia drogich linii myszy transgenicznych.

Ekspresja cytokin egzogennych w ksenoprzeszczepach pobranych od pacjentów poprzez wstrzyknięcie linii komórek zrębu transdukowanej cytokiną (Wideo) | JoVE Journal

Ekspresja cytokin egzogennych w ksenoprzeszczepach pobranych od pacjentów poprzez wstrzyknięcie linii komórek zrębu transdukowanej cytokiną

Przeglądaj więcej filmów