Bezwzględna ocena ilościowa Aβ_1-42 w płynie mózgowo-rdzeniowym przy użyciu referencyjnej procedury pomiaru spektrometrii mas

Ogólnym celem tej referencyjnej procedury pomiarowej jest harmonizacja pomiarów beta-amyloidu w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Metoda ta może pomóc w standaryzacji testów do pomiaru poziomu beta-amyloidu 42 w CSF, który jest biomarkerem centralnej patologii amyloidowej i neuropatologiczną cechą charakterystyczną choroby Alzheimera. Główną zaletą tej techniki jest to, że została ona gruntownie zwalidowana i nie wykorzystuje przeciwciał do ilościowego oznaczenia Aβ42.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię choroby Alzheimera, ponieważ mogłaby ona służyć do harmonizacji testów i ułatwić wprowadzenie ogólnych poziomów odcięcia w badaniach klinicznych. Choć metoda ta może dostarczyć wglądu w patologię amyloidową u ludzi, może być ona również stosowana u innych organizmów ssaków, takich jak myszy transgeniczne i naczelne, w celu opracowania nowych leków. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ AVR 142 jest bardzo hydrofobowy i może łatwo przywierać do powierzchni, takich jak końcówki pipet i probówki.

W pierwszej kolejności należy dodać 40 µL peptydu N15 a beta do 0,46 mL 20% acetonitrylu i 4% stężonego amoniaku w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL. Roztwór peptydu należy mieszać na mikserze wiertarkowym (vortex) przez jedną minutę. Następnie należy dodać 50 µL roztworu peptydu do 1,95 mL 20% acetonitrylu i 4% stężonego amoniaku w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL.

Mieszaj roztwór peptydu na mieszalniku wiroksowym przez jedną minutę. Następnie przygotuj sześć roztworów kalibratora, mieszając odpowiednie objętości każdego roztworu w probówkach do mikrocentryfugi. Po wymieszaniu roztworów kalibratora przygotuj końcowe kalibratory w duplikacie, mieszając odpowiednie objętości odpowiadających im roztworów kalibratora oraz ludzkiego CSF w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 ml.

Każdy roztwór mieszaj na mieszalniku wortex przez jedną minutę. Aby przygotować standard wewnętrzny, najpierw dodaj 32 µL 13C a beta peptide do 1,968 mL 20% acetonitrylu i 4% stężonego amoniaku w probówce do mikrocentryfugi o pojemności dwóch mililitrów. Roztwór peptydu mieszaj na mieszalniku wortex przez jedną minutę.

Następnie dodaj 0.1 milliliters roztworu peptydów do 4.9 milliliters 20%acetonitrile i 4%concentrated ammonia w probówce do mikrocentryfugi o pojemności pięciu mililitrów. Mieszaj roztwór peptydów na mikserze wiorowym przez jedną minutę. Aby przygotować próbkę współczynnika odpowiedzi, dodaj 40 microliters natywnego peptydu a beta do 0.46 milliliters 20%acetonitrile i 4%concentrated ammonia w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 0.5 milliliter.

Po wymieszaniu do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml dodaj 20 µL roztworu peptydu oraz 20 µL peptydu beta znakowanego 15N w stężeniu 4 µg/ml do 1,96 ml 20% acetonitrylu i 4% stężonego amoniaku. Wymieszaj roztwór peptydu na wirówce vortex przez jedną minutę. Następnie 20 µL roztworu peptydu dodaj do 0,38 ml sztucznego CSF w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 ml.

Po przygotowaniu duplikatów wymieszaj każdy roztwór na mieszalniku wiorowym przez jedną minutę. Po rozmrożeniu próbek na mieszalniku obrotowym, dodaj 0,18 ml każdego kalibratora, czynnika odpowiedzi oraz nieznanej próbki do 96-dołkowej głębokiej płytki białkowej o pojemności jednego mililitra, upewniając się, że próbki są dodawane na dno lub blisko dna dołków. Następnie dodaj 20 µl standardu wewnętrznego do każdego dołka, upuszczając kroplę standardu na ściankę dołka blisko powierzchni próbki, nie zanurzając końcówki pipety.

Następnie do każdej dołki należy dodać 0,2 ml pięciomolarnego chlorku guanidyny. Płytkę z próbkami należy umieścić na wytrząsarce do mikropłytek i mieszać próbki przez 45 minut przy 1100 rpm. Po wymieszaniu do każdej dołki należy dodać 0,2 ml 4% kwasu fosforowego.

Następnie umieść płytkę z próbkami na wytrząsarce do mikropłytek i mieszaj krótko przy 1000 rpm. Pod płytkę do ekstrakcji do fazy stałej (SPE) z 96 dołkami do kationowym wymieniaczem mieszanego trybu w komorze manifoldu do płytek ekstrakcyjnych wstaw kuwetę na odpady. Następnie kondycjonuj sorbent SPE, dodając 0,2 milliliters metanolu do każdego dołka.

Następnie przeprowadź ekwilibrację sorbentu, dodając do każdej studni 0,2 ml 4% kwasu fosforowego. Za pomocą pipety ośmiokanałowej przenieś wszystkie próbki z płytki głębokich studni do płytki SPE. Po przejściu próbek przez sorbent, przemyj go dwukrotnie, dodając do każdej studni 0,2 ml 4% kwasu fosforowego.

Po wypłukaniu rozpuszczalnika myjącego z sorbentu, zastąp tackę z rezerwuarem probówkami. Następnie wymyj próbkę z sorbentu, dodając dwie 50 µL aliquoty 75% acetonitrylu i 10% stężonego amoniaku, pamiętając, że roztwór ten wymaga bardzo niskiej próżni, aby przejść przez sorbent. Osusz eluaty, stosując wirowanie w próżni bez podgrzewania.

Na koniec szczelnie zamknij probówki i zamroź je w temperaturze 80 °C do czasu przeprowadzenia analizy. Kalibratory powinny znajdować się blisko linii regresji przy niskich odchyleniach standardowych. Jeśli kalibracja jest nieliniowa, pomiar należy odrzucić; odchylenie wynika najprawdopodobniej z nieprawidłowej techniki pipetowania i/lub błędów w rozcieńczaniu kalibratorów.

Współczynnik zmienności powtórzeń powinien wynosić najlepiej poniżej 10%. Natywne 15N oraz 13C a beta eluują z kolumny LC jednocześnie, tworząc bliskie symetrii piki bez znaczącego rozmycia. Dla każdego piku należy wykonać co najmniej 10 pomiarów, co można dostosować poprzez maksymalny czas wstrzyknięcia w metodzie. Peptydy można mierzyć jednocześnie podczas analizy MS, chyba że czułość metody jest suboptymalna, w takim przypadku podczas każdego wstrzyknięcia należy mierzyć tylko interesujące nas peptydy.

Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zająć cztery godziny. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o tym, aby zawsze nasycać końcówki pipet przed przeniesieniem roztworu peptydów. Ważne jest również stosowanie probówek o jak najmniejszej objętości martwej.

Po opracowaniu technika ten utorował drogę badaczom w dziedzinie choroby Alzheimera do zbadania zgodności z innymi metodami, takimi jak obrazowanie PET amyloidu. Był on również wykorzystywany do przypisywania stężeń beta 142 materiałom referencyjnym opartym na CSF. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować kalibratory w ludzkim CSF oraz jak wykorzystać ekstrakcję w fazie stałej przed analizą LCMS w celu pomiaru bezwzględnego stężenia beta 142 w próbkach.

Należy pamiętać, że praca z ludzkim płynem mózgowo-rdzeniowym może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy stosować środki ostrożności, takie jak rękawiczki, okulary ochronne i inne zabezpieczenia.