Name: Bezwzględna ocena ilościowa Aβ1-42 w płynie mózgowo-rdzeniowym przy użyciu referencyjnej procedury pomiaru spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Poznaj procedurę referencyjną do bezwzględnej ilościowej oceny Aβ1-42 w płynie mózgowo-rdzeniowym człowieka za pomocą ekstrakcji na fazie stałej i chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas. Ta metoda standaryzuje oznaczenia biomarkera choroby Alzheimera bez użycia przeciwciał.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została wykonana w imieniu Grupy Roboczej ds. Białek CSF Międzynarodowej Federacji Chemii Klinicznej, która ma następujący skład: Kaj Blennow (Przewodniczący) i Henrik Zetterberg, Uniwersytet w Göteborgu, Szwecja; Les Shaw i Magdalena Korecka, University of Philadelphia, PA, USA; Ingrid Zegers, Instytut Materiałów Referencyjnych i Pomiarów, Geel, Belgia; Piotr Lewczuk, Universitätsklinikum Erlangen, Niemcy; oraz Rand Jenkins, Laboratorium Bioanalityczne PPD, Richmond, Wirginia, USA; Randall Bateman, Uniwersytet Waszyngtoński, MO, Stany Zjednoczone; oraz H Vanderstichele, Innogenetics NV, Gandawa, Belgia. Prace te były również częścią Grupy Roboczej ds. Metod Referencyjnych Metod Referencyjnych Globalnego Konsorcjum ds. Standaryzacji Biomarkerów CSF, której przewodniczy dr Maria C. Carrillo, starszy dyrektor ds. relacji medycznych i naukowych w Stowarzyszeniu Alzheimera. Badanie było wspierane przez Szwedzką Radę ds. Badań Naukowych (granty #14002, #521-2011-4709 i #2013-2546); Fundacja Knuta i Alice Wallenbergów; Demensförbundet; oraz fundacje Emila i Wery Cornellów, Ainy Wallström i Mary-Ann Sjöblom, Guna i Bertila Stohne, Magnusa Bergvalla i Gamli Tjänarinnor.

UWAGA: Ten protokół wymaga podwielokrotności co najmniej 50 μL, o stężeniu 50 μg/ml dla każdego peptydu Aβ, jako materiału wyjściowego. Peptydy Aβ należy rozpuścić w 20% acetonitrylu (ACN) i 4% stężonym roztworze amoniaku w wodzie dejonizowanej (v/v) i przechowywać w temperaturze 80 °C.
Uwaga: Zobacz Tabelę 1, aby uzyskać informacje dotyczące bezpieczeństwa.
1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotuj 100 ml 20% ACN i 4% stężonego roztworu amoniaku w wodzie dejonizowanej (v/v), rozcieńczając 20 ml ACN i 4 ml stężonego amoniaku (~25%) w wodzie dejonizowanej. Dostosuj końcową objętość do 100 ml wodą dejonizowaną. Codziennie rób świeże.</li>
	<li>Przygotować 50 ml 5 M chlorowodorku guanidyny, rozpuszczając 26,08 g chlorowodorku guanidyny w wodzie dejonizowanej do końcowej objętości 50 ml. Przechowywać w temperaturze 20 °C i przygotowywać świeże co miesiąc.</li>
	<li>Przygotuj 200 ml 4% kwasu fosforowego w wodzie dejonizowanej (v/v), rozcieńczając 9,4 ml stężonego kwasu fosforowego (~85%) w wodzie dejonizowanej. Dostosuj końcową objętość do 200 ml wodą dejonizowaną. Przechowuj w lodówce i co tydzień przygotowuj świeże.</li>
	<li>Przygotuj 50 ml 75% ACN i 10% stężonego roztworu amoniaku (v/v) w wodzie dejonizowanej, rozcieńczając 37,5 ml ACN i 5 ml stężonego amoniaku (~25%) w wodzie dejonizowanej. Dostosuj końcową objętość do 50 ml wodą dejonizowaną. Codziennie rób świeże.</li>
	<li>Rozmrozić co najmniej 2,5 ml ludzkiego płynu mózgowo-rdzeniowego dla kalibratorów, uzyskanego z zanonimizowanych próbek pozostałych po rutynowej analizie klinicznej.</li>
	<li>Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy zawierający 150 mM Na, 3,0 mM K, 1,4 mM Ca, 0,8 mM Mg, 1,0 mM P i 155 mM Cl w wodzie dejonizowanej i dodać albuminę surowicy bydlęcej do końcowego stężenia 4 mg / ml. Na analizę potrzebny jest tylko 1 ml, ale przygotuj dużą objętość, podziel ją na porcje i przechowuj do wykorzystania w przyszłości.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kalibratorów
<ol>
	<li>Przygotuj 0,5 ml peptydu 4 μg/ml 15N-Aβ1-42, dodając 40 μl 50 μg/ml 15NAβ142 do 0,46 ml 20% ACN i 4% stężonego amoniaku w probówce mikrowirówki o pojemności 0,5 ml. Mieszaj na mikserze wirowym przez 1 min.</li>
	<li>Przygotuj 2 ml peptydu 100 ng/ml 15N-Aβ1-42, dodając 50 μl 4 μg/ml 15NAβ142 do 1,95 ml 20% ACN i 4% stężonego amoniaku w probówce mikrowirówki o pojemności 2 ml. Mieszaj na mikserze wirowym przez 1 min.</li>
	<li>Przygotować sześć roztworów kalibracyjnych (A-F), mieszając objętości każdego roztworu wskazane w Tabeli 2. Użyj probówek do mikrowirówek o pojemności 0,5, 1,5 i 2 ml. Mieszaj na mikserze wirowym przez 1 min.</li>
	<li>Przygotować końcowe kalibratory (w dwóch egzemplarzach) w probówkach do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml, dodając odpowiednie roztwory kalibracyjne i płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) zgodnie z tabelą 3. Mieszaj na mikserze wirowym przez 1 min.</li>
</ol>
3. Przygotowanie wzorca wewnętrznego
<ol>
	<li>Przygotuj 2 ml 0,8 μg/ml 13C-Aβ1-42 peptydu, dodając 32 μl 50 μg/ml 13CAβ142 do 1,968 ml 20% ACN i 4% stężonego amoniaku w probówce do mikrowirówki o pojemności 2 ml. Mieszaj na mikserze wirowym przez 1 min.</li>
	<li>Przygotuj 5 ml peptydu 16 ng/ml 13C-Aβ1-42, dodając 0,1 ml 0,8 μg/ml do 4,9 ml 20% ACN i 4% stężonego amoniaku w probówce mikrowirówki o pojemności 5 ml. Mieszaj na mikserze wirowym przez 1 min.</li>
</ol>
4. Przygotowanie próbki czynnika odpowiedzi
UWAGA: Określenie współczynnika odpowiedzi (RF) jest wykonywane w celu określenia stężenia znakowanego peptydu użytego do kalibracji (15N-Aβ1-42). Wymaga to określenia stężenia natywnego peptydu Aβ1-42 za pomocą analizy aminokwasów (AAA). Tak więc objętość i stężenie natywnych podwielokrotności peptydu Aβ1-42 muszą spełniać wymagania AAA.
<ol>
	<li>Przygotuj 0,5 ml 4 μg/ml natywnego (nieznakowanego) Aβ1-42, dodając 40 μl 50 μg/ml natywnego Aβ1-42 do 0,46 ml 20% ACN i 4% stężonego amoniaku w probówce mikrowirówki o pojemności 0,5 ml. Mieszaj na mikserze wirowym przez 1 min.</li>
	<li>Przygotuj 2-mililitrową mieszaninę 40 ng/ml natywnego i 15N-Aβ1-42, dodając 20 μl 4 μg/ml natywnego Aβ1-42 i 20 μl 4 μg/ml 15N-Aβ1-42 do 1,96 ml 20% ACN i 4% stężonego amoniaku w probówce do mikrowirówki o pojemności 2 ml. Mieszaj na mikserze wirowym przez 1 min.</li>
	<li>Dodać 20 μl mieszaniny 40 ng/ml do 0,38 ml sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego w probówce do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml. Przygotuj duplikaty i mieszaj na mikserze wirowym przez 1 minutę.</li>
</ol>
5. Przygotowanie próbki
UWAGA: Rozmrozić próbki do pomiaru w temperaturze pokojowej na walcu.
<ol>
	<li>Dodać 0,18 ml każdego kalibratora, współczynnika odpowiedzi i nieznanej próbki (w tym próbek kontroli jakości [QC], jeśli są używane) do 1 ml białkowej płytki 96-dołkowej, zgodnie z rysunkiem 1 (zakładając, że używana jest pełna płytka). Upewnij się, że dodałeś próbki do dna studzienek lub w ich pobliżu.</li>
	<li>Dodać 20 μl wzorca wewnętrznego do każdego dołka (tj. kalibratorów, współczynników odpowiedzi, kontroli jakości i niewiadomych); bardzo ważne jest, aby uwolnić kroplę po stronie studzienki blisko powierzchni próbki bez zanurzania końcówki pipety.</li>
	<li>Dodać 0,2 ml 5 M chlorowodorku guanidyny do każdej studzienki.</li>
	<li>Umieścić płytkę z próbką na wytrząsarce do mikropłytek i mieszać próbki przez 45 minut z prędkością 1 100 obr./min. Optymalna częstotliwość może się różnić w zależności od oprzyrządowania. Ustaw częstotliwość i amplitudę mieszalnika tak, aby roztwory były dokładnie wymieszane i żadne krople wzorca wewnętrznego lub CSF nie pozostały niezmieszane z boku studzienek.</li>
	<li>Dodaj 0,2 ml 4% kwasu fosforowego do każdej studzienki. Krótko wymieszaj wirowo.</li>
</ol>
6. Ekstrakcja do fazy stałej
UWAGA: We wszystkich etapach mycia, ładowania i elucji, zastosuj najniższą możliwą próżnię po dodaniu roztworu i stopniowo zwiększaj w razie potrzeby, aby załadować lub wymyć roztwór. Wyłącz podciśnienie między każdym etapem ładowania i elucji.
<ol>
	<li>Umieść tacę zbiornika na odpady pod 96-dołkową płytką do ekstrakcji fazy stałej (SPE) w trybie mieszanym, z wymianą kationową, w komorze kolektora z płytą ekstrakcyjną</li>.
	<li>Kondycjonować sorbent SPE, dodając 0,2 ml metanolu do każdej studzienki.</li>
	<li>Zrównoważyć sorbent, dodając 0,2 ml 4% kwasu fosforowego do każdej studzienki.</li>
	<li>Przenieść wszystkie próbki (około 0,62 ml w każdym dołku) z płytki głębokiej na płytkę SPE. Do przenoszenia próbek z płytki głębinowej na płytkę SPE należy używać pipety ośmiokanałowej; Nie jest konieczne przenoszenie całej lub równej objętości wszystkich próbek, ponieważ próbki zawierają wewnętrzny wzorzec, który kompensuje różnice.</li>
	<li>Po przejściu próbek przez sorbent należy przepłukać przez dodanie 0,2 ml 4% kwasu fosforowego do każdej studzienki.</li>
	<li>Po wypłukaniu rozpuszczalnika myjącego z sorbentu zastąp tacę zbiornika płytką lub rurkami zbiorczymi.</li>
	<li>Eluować próbkę z sorbentu, dodając dwukrotnie 50 μl 75% ACN/10% stężonego amoniaku i należy pamiętać, że roztwór ten wymaga bardzo niskiej próżni, aby przejść przez sorbent. Pamiętaj, aby wyłączyć próżnię między każdym dodawaniem.
	<ol>
		<li>OPCJONALNIE: Uszczelnić płytkę lub probówki zbiorcze i zamrozić je w temperaturze -80 °C. Usunąć uszczelkę z płytki lub probówek zbiorczych przed przejściem do kroku 6.8.2.</li>
		<li>Wysuszyć eluaty za pomocą wirowania próżniowego (bez stosowania ciepła); może to zająć od jednej do kilku godzin, w zależności od wirówki próżniowej.</li>
		<li>Zamknąć pojemniki i zamrozić je w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Chromatografia cieczowa
<ol>
	<li>Przygotować ruchomą fazę A (5% ACN i 0,3% stężonego amoniaku w wodzie dejonizowanej [v/v]), B (4% wody dejonizowanej i 0,1% stężonego amoniaku w ACN [v/v]) i płukać igłami (50% ACN i 4% stężonego amoniaku w wodzie dejonizowanej [v/v]).
	<ol>
		<li>Na 500 ml ruchomej fazy A dodaj 25 ml ACN i 1,5 ml stężonego amoniaku do wody dejonizowanej. Dostosuj końcową objętość do 500 ml wodą dejonizowaną.</li>
		<li>Na 500 ml ruchomej fazy B dodaj 500 μl stężonego amoniaku i 25 ml wody dejonizowanej do ACN. Dostosuj końcową objętość do 500 ml za pomocą ACN.</li>
		<li>Przygotuj 250 ml płynu do płukania igł, dodając 120 ml ACN i 10 ml stężonego amoniaku do wody dejonizowanej. Dostosuj końcową objętość do 250 ml wodą dejonizowaną.</li>
		<li>Umieść ruchome fazy A i B oraz butelki do mycia igł otwarte w kąpieli sonicyjnej na 20 minut przed użyciem z systemem LC</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpuścić każdą próbkę w 25 μl 20% ACN i 4% stężonego roztworu amoniaku i umieścić je na wytrząsarce na 20 minut. Odwirować próbki i umieścić je w automatycznym podajniku próbek (przechowywać w temperaturze 7 °C).</li>
	<li>Wstrzyknąć 20 μl próbki na monolityczną kolumnę o wymiarach 1 x 250mm2 polistyren-diwinylobenzen (z odwróconymi fazami) utrzymywaną w temperaturze 50 °C.
	<ol>
		<li>Użyć gradientu LC pokazanego w tabeli 4 przy natężeniu przepływu 0,3 ml/min. Pierwsze dwie i ostatnie pięć minut należy przekierować do odpadów (po kolumnie) za pomocą zaworu przełączającego, aby zmniejszyć zanieczyszczenie spektrometru masowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Analiza spektrometryczna mas
UWAGA: Te parametry zostały użyte dla hybrydowego spektrometru mas kwadrupolowo-orbitrapowego, wyposażonego w podgrzewane źródło jonizacji elektrorozpylania.
<ol>
	<li>Ustaw parametry źródła jonów zgodnie z tabelą 5.</li>
	<li>Ustaw przyrząd MS tak, aby wyizolował 4+ stanów naładowania natywnego Aβ1-42 (stosunek masy do ładunku 1 129,48 [m/z]), 15N-Aβ1-42 (1 143,00 m/z) i 13C-Aβ1-42 (1 179,50 m/z) w kwadrupolowym analizatorze masy o szerokości izolacji 2,5 m/z.</li>
	<li>Fragmentuj izolowane peptydy w komórce zderzeniowej ze znormalizowaną energią zderzenia (NCE) wynoszącą 17,0. Może to wymagać dostrojenia dla każdego instrumentu, nawet tego samego typu (a zwłaszcza w przypadku korzystania z innych typów instrumentów, takich jak potrójny kwadrupol MS).</li>
	<li>Rejestruj widma fragmentów z rozdzielczością 17.500, z celem automatycznej kontroli wzmocnienia 2 x 105 ładunków i maksymalnym czasem wtrysku 250 ms.</li>
</ol>
9. Przetwarzanie danych
<ol>
	<li>Do obliczenia powierzchni chromatograficznych dla każdego peptydu należy wykorzystać sumę jonów potomnych (z tolerancją masy ± 250 jednostek masy mili [mmu]) podaną w tabeli 6. Należy pamiętać, że typy i liczby jonów są pokazane tylko dla natywnych jonów poprodukcyjnych Aβ1-42, ponieważ są takie same zarówno dla 15N-Aβ1-42, jak i 13C-Aβ1-42.</li>
	<li>Określić średni współczynnik odpowiedzi dwóch próbek współczynnika odpowiedzi, dzieląc obszar pod krzywą (pik chromatograficzny) 15N-Aβ1-42 przez obszar pod krzywą natywnego Aβ1-42.</li>
	<li>Dostosuj stężenie 15N-Aβ1-42 użyte do kalibracji, mnożąc je przez współczynnik odpowiedzi obliczony w kroku 9.2.</li>
	<li>Skonstruuj krzywą kalibracyjną, wykreślając stosunki powierzchni 15N-Aβ1-42 do 13C-Aβ1-42 z dwóch zestawów kalibratorów w zależności od stężenia.</li>
	<li>Obliczyć nachylenie i punkt przecięcia krzywej kalibracyjnej za pomocą regresji liniowej.</li>
	<li>Obliczyć stosunek powierzchni natywnego Aβ1-42 do wzorca wewnętrznego (13C-Aβ1-42) dla nieznanych próbek.</li>
	<li>Ekstrapolować stężenie nieznanych próbek z krzywej kalibracyjnej, korzystając z nachylenia i punktu przecięcia uzyskanych w kroku 9.5.</li>
</ol>

<ol><li>Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20107219">Alzheimer's disease.</a> N Engl J Med. 362 (4), 329-344 (2010).</li>
<li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+neuropathology+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurol+Scand+Suppl%22%5BJournal%5D)">Evolution of the neuropathology of Alzheimer's disease.</a> Acta Neurol Scand Suppl. 165, 3-12 (1996).</li>
<li>Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16876668">Alzheimer's disease.</a> Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).</li>
<li>Dubois, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+research+diagnostic+criteria+for+Alzheimer%27s+disease%3A+the+IWG-2+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG-2 criteria.</a> Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).</li>
<li>Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+and+plasma+biomarkers+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease.</a> Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).</li>
<li>Buchhave, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22213792">Cerebrospinal fluid levels of beta-amyloid 1-42, but not of tau, are fully changed already 5 to 10 years before the onset of Alzheimer dementia.</a> Arch Gen Psychiatry. 69 (1), 98-106 (2012).</li>
<li>Olsson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF+and+blood+biomarkers+for+the+diagnosis+of+Alzheimer%27s+disease%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Neurology. 15 (7), 673-684 (2016).</li>
<li>Bjerke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confounding+factors+influencing+amyloid+Beta+concentration+in+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Confounding factors influencing amyloid Beta concentration in cerebrospinal fluid.</a> Int J Alzheimers Dis. , (2010).</li>
<li>Dumurgier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersite+variability+of+CSF+Alzheimer%27s+disease+biomarkers+in+clinical+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Dement%22%5BJournal%5D)">Intersite variability of CSF Alzheimer's disease biomarkers in clinical setting.</a> Alzheimers Dement. 9 (4), 406-413 (2013).</li>
<li>Mattsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF+biomarker+variability+in+the+Alzheimer%27s+Association+quality+control+program%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Dement%22%5BJournal%5D)">CSF biomarker variability in the Alzheimer's Association quality control program.</a> Alzheimers Dement. 9 (3), 251-261 (2013).</li>
<li>Kang, J. H., Korecka, M., Toledo, J. B., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23519967">Clinical Utility and Analytical Challenges in Measurement of Cerebrospinal Fluid Amyloid-beta1-42 and tau Proteins as Alzheimer Disease Biomarkers.</a> Clin Chem. 59 (6), 903-916 (2013).</li>
<li>Mattsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+measurement+procedures+for+Alzheimer%27s+disease+cerebrospinal+fluid+biomarkers%3A+definitions+and+approaches+with+focus+on+amyloid+beta42%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Med%22%5BJournal%5D)">Reference measurement procedures for Alzheimer's disease cerebrospinal fluid biomarkers: definitions and approaches with focus on amyloid beta42.</a> Biomark Med. 6 (4), 409-417 (2012).</li>
<li>Ahmadkhaniha, R., Shafiee, A., Rastkari, N., Kobarfard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+of+endogenous+androgenic+steroids+in+cattle%27s+meat+by+gas+chromatography+mass+spectrometry+using+a+surrogate+analyte+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification of endogenous androgenic steroids in cattle's meat by gas chromatography mass spectrometry using a surrogate analyte approach.</a> Anal Chim Acta. 631 (1), 80-86 (2009).</li>
<li>Jemal, M., Schuster, A., Whigan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+chromatography%2Ftandem+mass+spectrometry+methods+for+quantitation+of+mevalonic+acid+in+human+plasma+and+urine%3A+method+validation%2C+demonstration+of+using+a+surrogate+analyte%2C+and+demonstration+of+unacceptable+matrix+effect+in+spite+of+use+of+a+stable+isotope+analog+internal+standard%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Liquid chromatography/tandem mass spectrometry methods for quantitation of mevalonic acid in human plasma and urine: method validation, demonstration of using a surrogate analyte, and demonstration of unacceptable matrix effect in spite of use of a stable isotope analog internal standard.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (15), 1723-1734 (2003).</li>
<li>Leinenbach, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+candidate+reference+measurement+procedure+for+quantification+of+amyloid-beta+in+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based candidate reference measurement procedure for quantification of amyloid-beta in cerebrospinal fluid.</a> Clin Chem. 60 (7), 987-994 (2014).</li>
<li>Li, W., Cohen, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+endogenous+analytes+in+biofluid+without+a+true+blank+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitation of endogenous analytes in biofluid without a true blank matrix.</a> Anal Chem. 75 (21), 5854-5859 (2003).</li>
<li>Perret-Liaudet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+collection+tubes%3A+a+critical+issue+for+Alzheimer+disease+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid collection tubes: a critical issue for Alzheimer disease diagnosis.</a> Clin Chem. 58 (4), 787-789 (2012).</li>
<li>Lewczuk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+sample+collection+tubes+on+cerebrospinal+fluid+concentrations+of+tau+proteins+and+amyloid+beta+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides.</a> Clin Chem. 52 (2), 332-334 (2006).</li>
<li>Pannee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+measurement+procedure+for+CSF+amyloid+beta+%28A%CE%B2%291-42+and+the+CSF+A%CE%B21-42+%2FA%CE%B21-40+ratio+-+a+cross-validation+study+against+amyloid+PET%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Reference measurement procedure for CSF amyloid beta (Aβ)1-42 and the CSF Aβ1-42 /Aβ1-40 ratio - a cross-validation study against amyloid PET.</a> J Neurochem. 139 (4), 651-658 (2016).</li>
<li>Thienpont, L. M., Van Houcke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceability+to+a+common+standard+for+protein+measurements+by+immunoassay+for+in-vitro+diagnostic+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Traceability to a common standard for protein measurements by immunoassay for in-vitro diagnostic purposes.</a> Clin Chim Acta. 411 (23-24), 2058-2061 (2010).</li>
<li>Vesper, H. W., Thienpont, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceability+in+laboratory+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Traceability in laboratory medicine.</a> Clin Chem. 55 (6), 1067-1075 (2009).</li>
</ol>

JP i EP nie informują o żadnych ujawnieniach. Zasiadał w radach doradczych Roche Diagnostics, Eli Lilly i Pharmasum Therapeutics. KB pełnił funkcję konsultanta lub zasiadał w radach doradczych Fujirebio Europe, IBL International i Roche Diagnostics. HZ i KB są współzałożycielami Brain Biomarker Solutions w Göteborgu AB, firmy platformowej z siedzibą w GU Venture na Uniwersytecie w Göteborgu.

Dla opisanej metody, zamiast stosowania matrycy zastępczej, zastosowaliśmy podejście analitu zastępczego 13,14,15,16, które umożliwia kalibrację w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym. Podejście do analitu zastępczego obejmuje dwa różne wzorce znakowane izotopowo. Jeden (15NAβ142) służy do generowania krzywej kalibracyjnej w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym, podczas gdy drug...

Choroba Alzheimera (AD) jest najczęstszą formą demencji i dotyka około 35 milionów ludzi na całym świecie1. Neuropatologicznymi cechami charakterystycznymi choroby, powszechnie uważanymi za leżące u podstaw patogenezy AD, są wewnątrzkomórkowe splątki neurofibrylarne hiperfosforylowanego białka tau2 oraz blaszki zewnątrzkomórkowe składające się z zagregowanych peptydów amyloid-beta (Aβ)3. W związku z tym ocena patologii blaszki miażdżycowej in vivo za pomocą biomarkerów została niedawno włączona do badawczych kryteriów diagnostycznych dla AD4. Do pomiarów płynu mózgowo-rdzeniowego Aβ1-42 dostępnych jest kilka testów immunologicznych, które są stosowane w wielu laboratoriach klinicznych5. Stężenie Aβ1-42 w płynie mózgowo-rdzeniowym jest o około 50% niższe u pacjentów z AD niż u osób w podeszłym wieku zdrowym poznawczo, co odzwierciedla odkładanie się peptydu w blaszkach w mózgu<klasa sup="xref">6,7.
Te biomarkery są głównie analizowane za pomocą testów immunologicznych (tj. technik opartych na przeciwciałach), ale na te testy mogą mieć wpływ efekty matrycowe8. Stosowanie testów immunologicznych na różnych platformach technologicznych i brak standaryzacji testów9,10 utrudnia wprowadzenie globalnych stężeń granicznych11,12. Zweryfikowany analitycznie RMP pozwoliłby na jednolitą kalibrację różnych platform testowych, co w idealnym przypadku doprowadziłoby do lepszej porównywalności między platformami analitycznymi i lepszej kontroli czynników przyczyniających się do ogólnej zmienności pomiaru.
Bezwzględna kwantyfikacja Aβ1-42 przy użyciu opracowanej metody LC-MS/MS przezwycięża wiele problemów związanych z technikami opartymi na przeciwciałach. Metoda, wymieniona jako RMP przez Wspólny Komitet ds. Identyfikowalności w Medycynie Laboratoryjnej (numer identyfikacyjny bazy danych JCTLM C11RMP9), zostanie wykorzystana do określenia bezwzględnego stężenia Aβ1-42 w certyfikowanym materiale odniesienia (CRM) w celu harmonizacji pomiarów CSF Aβ1-42 w różnych technikach i platformach analitycznych. Opisany przebieg pracy powinien mieć znaczenie dla opracowania potencjalnych metod referencyjnych dla peptydów i białek w innych dziedzinach medycyny.

<table><tbody><tr><td>Probówki do mikrowirówek Eppendorf Protein LoBind, 0,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Eppendorf Protein LoBind, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Eppendorf Protein LoBind, 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>022431102</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Eppendorf Protein LoBind, 5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.310</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96</td><td>Eppendorf</td><td>951032905</td><td></td></tr><tr><td>Micronic 0,75 ml probówek polipropylenowych, probówki Micronic MPW32071BC3 z dnem w kształcie litery V</td><td></td><td></td><td>używane do zbierania eluatu SPE, ale można stosować inne urządzenia do pobierania, takie jak płytki 96-dołkowe.</td></tr><tr><td>Micronic Split TPE Capcluster do 96 ind. probówek</td><td>Micronic</td><td>MP53026</td><td>Caps do mikronicznych probówek.</td></tr><tr><td>Micronic Loborack-96 biały z wysoką pokrywą z kodem kreskowym</td><td>Micronic</td><td>MPW51015BC3 Uchwyt do</td><td>probówek Micronic.</td></tr><tr><td>Końcówki Biohit Optifit 1,2 ml</td><td>Sartorius</td><td>791210</td><td>Służą do sięgania aż do dna płytek głębinowych LoBind (96-dołkowych). Inne wąskie wskazówki również mogą działać.</td></tr><tr><td>Waters Oasis MCX 96-studniowy i mikro; Wody z płyt elucyjnych</td><td></td><td>186001830BA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Waters Plate kolektor</td> zbiornikowy <td>Waters</td><td>WAT058942</td><td></td></tr><tr><td>Waters Płyta ekstrakcyjna Kolektor płytowy do Oasis 96-Well Plates</td><td>Wody</td><td>186001831</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wodorotlenku amonu, Puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 na bazie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30501-1L-D</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl, daleki gradient UV HPLC, 2,5 L</td><td>Kwas</td> ortofosforowy <td>Fisher Scientific A/0627/17X</td><td></td></tr><tr><td>85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td><td>Merck Milipore</td><td>1005731000</td><td></td></tr><tr><td>chlorowodorek guanidyny, 500 g</td><td>Thermo Scientific</td><td>24110</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Q-exactive hybrydowy kwadrupolowy spektrometr masowy Orbitrap</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td><td>Z dołączonym Dionex Ultimate 3000 LC i automatycznym samplerem.</td></tr><tr><td>Kolumna monolityczna Dionex ProSwift RP-4H (1,0 x 250 mm)</td><td>Dionex</td><td>066640</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej, liofilizowany proszek, odpowiedni do (do biologii molekularnej), Nieacetylowany</td> beta-amyloid <td>Sigma-Aldrich</td><td>B6917</td><td></td></tr><tr><td>(1-42), ultra czysty, TFA</td><td>rPeptide</td><td>A-1002-2</td><td></td></tr><tr><td>15N Beta-amyloid (1-42), Jednolicie znakowany</td><td>rPeptide</td><td>A-1102-2</td><td></td></tr><tr><td>13C Beta-Amyloid (1-42), Jednolicie znakowane</td><td>rPeptide</td><td>A-1106-2</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarki do mikropłytek, TiMix 2</td><td>Edmund B&uuml; HLER</td><td>6110 000</td><td></td></tr></tbody></table>

bezwzględna ocena ilościowa aβ1-42 w płynie mózgowo-rdzeniowym przy użyciu referencyjnej procedury pomiaru spektrometrii mas

Absolute Quantification of A&#946;1-42 in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure

Choroba Alzheimera (AD) jest najczęstszą chorobą neurodegeneracyjną wśród osób starszych i stanowi 60-80% wszystkich przypadków demencji. Obecnie diagnoza AD opiera się na testach poznawczych i badaniach stanu psychicznego, ale peptyd amyloid-beta (Aβ) w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) jest coraz częściej stosowany w badaniach klinicznych i warunkach. Podobnie jak w przypadku większości biomarkerów białkowych i peptydowych, kwantyfikacja odbywa się przy użyciu technik opartych na przeciwciałach, takich jak test immunoenzymatyczny (ELISA). Jednak wewnątrz- i międzylaboratoryjna zmienność w tych testach utrudnia jego wykorzystanie jako markera diagnostycznego w rutynie klinicznej.
Niezależna od przeciwciał Procedura Pomiaru Referencyjnego (RMP) została opracowana w oparciu o ekstrakcję do fazy stałej (SPE) i chromatografię cieczową (LC) - tandemową spektrometrię mas (MS/MS), gdzie stabilne, znakowane izotopowo peptydy Aβ zostały użyte jako wewnętrzne wzorce, umożliwiające bezwzględną kwantyfikację. Do pomiarów wykorzystano hybrydowy instrument kwadrupolowo-orbitrapowy o wysokiej rozdzielczości. Metoda pozwala na ilościowe oznaczenie płynu mózgowo-rdzeniowego Aβ1-42 w zakresie 150-4 000 pg/ml.

Układ płytki przedstawiony na Rysunku 1 jest przeznaczony dla pełnej płytki próbek. W przypadku analizy mniejszej liczby próbek nieznanych, drugi kalibrator, RF oraz zestawy QC należy umieścić po pierwszej połowie próbek nieznanych.
Jak widać na Rysunku 2, kalibratory znajdują się blisko linii regresji, wykazując niskie odchylenia standardowe. Metoda ta posiada dolną granicę kwantyfikacji na poz...

Opisana jest referencyjna procedura pomiarowa do bezwzględnej kwantyfikacji Aβ1-42 w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym w oparciu o ekstrakcję do fazy stałej i tandemową spektrometrię mas chromatografii cieczowej.

Bezwzględna ocena ilościowa Aβ1-42 w płynie mózgowo-rdzeniowym przy użyciu referencyjnej procedury pomiaru spektrometrii mas

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the ...

Ogólnym celem tej referencyjnej procedury pomiarowej jest harmonizacja pomiarów beta-amyloidu w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Metoda ta może pomóc w standaryzacji testów do pomiaru poziomu beta-amyloidu 42 w CSF, który jest biomarkerem centralnej patologii amyloidowej i neuropatologiczną cechą charakterystyczną choroby Alzheimera. Główną zaletą tej techniki jest to, że została ona gruntownie zwalidowana i nie wykorzystuje przeciwciał do ilościowego oznaczenia Aβ42.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię choroby Alzheimera, ponieważ mogłaby ona służyć do harmonizacji testów i ułatwić wprowadzenie ogólnych poziomów odcięcia w badaniach klinicznych. Choć metoda ta może dostarczyć wglądu w patologię amyloidową u ludzi, może być ona również stosowana u innych organizmów ssaków, takich jak myszy transgeniczne i naczelne, w celu opracowania nowych leków. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ AVR 142 jest bardzo hydrofobowy i może łatwo przywierać do powierzchni, takich jak końcówki pipet i probówki.W pierwszej kolejności należy dodać 40 µL peptydu N15 a beta do 0,46 mL 20% acetonitrylu i 4% stężonego amoniaku w probówce do

absolute-quantification-a1-42-csf-using-mass-spectrometric-reference

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Źródło: Samuels, D. J. i in. Podejście oparte na tandemowej chromatografii cieczowej – spektrometrii mas do analizy metabolitów gronkowca aureus. J. Vis. Exp. (2017)Ten film demonstruje zastosowanie chromatografii cieczowej – spektrometrii mas do identyfikacji i ilościowej identyfikacji metabolitów wewnątrzkomórkowych S. aureus. Przedstawia etapy związane z ekstracją metabolitów, normalizacją peptydów, chromatografią cieczową oraz analizą spektrometriczną mas.

Podejście oparte na chromatografii cieczowej – spektrometrii mas do analizy metabolitów S. aureus

Ten artykuł opisuje zastosowanie krioanalitycznej mikroskopii elektronowej do ilościowego pomiaru całkowitej zawartości i dystrybucji wapnia w rozdzielczości subkomórkowej w fizjologicznie zdefiniowanych próbkach biologicznych.

Pomiar całkowitego wapnia w neuronach za pomocą mikroanalizy rentgenowskiej sondy elektronowej

Profilowanie metabolitów było cennym atutem w badaniach nad metabolizmem w zdrowiu i chorobie. Wykorzystując chromatografię cieczową z fazami normalnymi sprzężoną ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości ze zmianą polaryzacji i szybkim cyklem pracy, opisujemy protokół analizy polarnego składu metabolicznego materiału biologicznego z wysoką czułością, dokładnością i rozdzielczością.

Strategia dla wrażliwej, wielkoskalowej metabolomiki ilościowej

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać bezwzględne testy kwantyfikacyjne docelowych białek w złożonych próbkach biologicznych przy użyciu monitorowania wybranych reakcji. Wykorzystano go do dokładnego ilościowego określenia białek szlaku sygnałowego chemotaksji makrofagów myszy. Szczegółowo opisano wybór peptydów docelowych, opracowywanie testów oraz testy jakościowe i ilościowe.

Spektrometria mas do monitorowania wybranych reakcji do bezwzględnej kwantyfikacji białek

Chromatografia wykluczania wielkości z łącznikiem plazmy sprzężonej indukcyjnie - spektrometria mas (ICP-MS) to potężne narzędzie do pomiaru zmian w obfitości metaloprotein bezpośrednio z próbek biologicznych. W tym miejscu opisujemy zestaw wzorców metaloprotein używanych do szacowania masy cząsteczkowej i ilości metalu związanego z nieznanymi białkami.

Standardy ilościowej analizy metaloproteomicznej z wykorzystaniem wykluczenia wielkości ICP-MS

Opisujemy wysokoprzepustowy, multipleksowy i celowany test proteomicznego płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), opracowany z potencjałem do klinicznego tłumaczenia. Test może określić ilościowo potencjalne markery i czynniki ryzyka neurodegeneracji, takie jak warianty apolipoproteiny E (E2, E3 i E4), oraz zmierzyć ich ekspresję alleli.

Wysokoprzepustowy, multipleksowany i ukierunkowany test proteomiczny, płyn mózgowo-rdzeniowy do ilościowego określania biomarkerów neurodegeneracyjnych i statusu izoform apolipoproteiny E

Tutaj prezentujemy bezstronną kwantyfikację specyficznej dla miejsca acetylacji białek i/lub zajętości sukcynylacji (stechiometria) całego proteomu poprzez analizę ratiometryczną endogennych modyfikacji modyfikacji wprowadzonych po ilościowym acylowaniu chemicznym przy użyciu stabilnych bezwodników znakowanych izotopami. W połączeniu ze spektrometrią mas akwizycji niezależnym od wrażliwych danych, uzyskuje się dokładne pomiary zajętości obiektu.

Kwantyfikacja stechiometrii stechiometrii lizyny białek specyficznych dla miejsca przy użyciu spektrometrii mas z akwizycją niezależną od danych

Synteza białek jest krytycznym procesem biologicznym dla komórek. W mózgu jest niezbędna do zmian adaptacyjnych. Pomiar tempa syntezy białek w nienaruszonym mózgu wymaga starannych rozważań metodologicznych. W tym artykule przedstawiono ilościową metodę autoradiograficzną L-[1-14C]-leucyny do oznaczania regionalnych szybkości syntezy białek mózgowych in vivo.

Ilościowa metoda autoradiograficzna do oznaczania regionalnych szybkości syntezy białek mózgowych in vivo

Tutaj prezentujemy solidny protokół do ilościowego oznaczania 40 związków biorących udział w centralnym metabolizmie węgla i energii w reakcjach syntezy białek bez komórek. Bezkomórkowa mieszanina syntezy jest derywatyzowana aniliną w celu skutecznego rozdzielania za pomocą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami, a następnie oznaczana ilościowo za pomocą spektrometrii mas przy użyciu izotopowo znakowanych wzorców wewnętrznych.

Bezwzględna kwantyfikacja metabolizmu syntezy białek bezkomórkowych za pomocą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami i spektrometrią mas

Podwyższony poziom białka w płynie mózgowo-rdzeniowym może być wynikiem dyfuzji białka osocza przez zmienioną barierę krew-mózg lub syntezy dokanałowej. W artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół testowy, który pomaga rozróżnić oba przypadki i zapewnia pomiary ilościowe białek syntetyzowanych dokanałowo.

Ilościowy pomiar białek syntetyzowanych dooponowo u myszy

Przedstawiamy protokół identyfikacji i oceny ilościowej głównych klas rozpuszczalnych w wodzie metabolitów w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda jest wszechstronna, solidna i czuła. Pozwala na oddzielenie od siebie izomerów strukturalnych i stereoizomerycznych form metabolitów rozpuszczalnych w wodzie.

Ilościowa metabolomika Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Poznaj procedurę referencyjną do bezwzględnej ilościowej oceny Aβ1-42 w płynie mózgowo-rdzeniowym człowieka za pomocą ekstrakcji na fazie stałej i chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas. Ta metoda standaryzuje oznaczenia biomarkera choroby Alzheimera bez użycia przeciwciał.

Bezwzględna ocena ilościowa Aβ_1-42 w płynie mózgowo-rdzeniowym przy użyciu referencyjnej procedury pomiaru spektrometrii mas

Przeglądaj więcej filmów