Bezwzględna ocena ilościowa Aβ_1-42 w płynie mózgowo-rdzeniowym przy użyciu referencyjnej procedury pomiaru spektrometrii mas

Ogólnym celem tej referencyjnej procedury pomiarowej jest harmonizacja pomiarów beta w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym. Metoda ta może pomóc w standaryzacji testów do pomiaru płynu mózgowo-rdzeniowego beta 42, który jest biomarkerem centralnej patologii amyloidu i neuropatologiczną cechą charakterystyczną choroby Alzheimera. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona dokładnie zwalidowana i nie wykorzystuje przeciwciał do ilościowego oznaczania AVR 142.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię choroby Alzheimera, ponieważ byłaby ona wykorzystywana do harmonizacji testów i ułatwienia wprowadzenia ogólnych poziomów odcięcia w badaniach klinicznych. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat patologii amyloidu u ludzi, może być również stosowana do innych organizmów śmiertelnych, takich jak myszy transgeniczne i naczelne w celu inwazji na nowe leki. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały problemy, ponieważ AVR 142 jest bardzo hydrofobowy i może łatwo przyklejać się do powierzchni, takich jak końcówki pipet i rurki.

Najpierw dodaj 40 mikrolitrów N15, peptydu beta, do 0,46 mililitra 20% acetonitrylu i 4% stężonego amoniaku w 0,5 mililitrowej probówce do mikrowirówki. Mieszaj roztwór peptydów w mieszalniku wirowym przez jedną minutę. Dodaj 50 mikrolitrów roztworu peptydu do 1,95 mililitra 20% acetonitrylu i 4% stężonego amoniaku w dwumililitrowej probówce do mikrowirówki.

Mieszaj roztwór peptydów w mieszalniku wirowym przez jedną minutę. Następnie przygotuj sześć roztworów kalibracyjnych, mieszając odpowiednie objętości każdego roztworu w probówkach do mikrowirówek. Po wymieszaniu roztworów kalibratora należy przygotować końcowe kalibratory w dwóch egzemplarzach, mieszając odpowiednie objętości odpowiednich roztworów kalibracyjnych i ludzkiego płynu mózgowo-rdzeniowego w 0,5 mililitrowych probówkach wirówek.

Mieszaj każdy roztwór w mikserze wirowym przez jedną minutę. Aby przygotować wzorzec wewnętrzny, najpierw dodaj 32 mikrolitry 13C peptydu beta do 1,968 mililitra 20% acetonitrylu i 4% stężonego amoniaku w dwumililitrowej probówce mikrowirówkowej. Mieszaj roztwór peptydów w mieszalniku wirowym przez jedną minutę.

Następnie dodaj 0,1 mililitra roztworu peptydu do 4,9 mililitra 20% acetonitrylu i 4% stężonego amoniaku w pięciomililitrowej probówce do mikrowirówki. Mieszaj roztwór peptydów w mieszalniku wirowym przez jedną minutę. Aby przygotować próbkę współczynnika odpowiedzi, dodaj 40 mikrolitrów natywnego peptydu beta do 0,46 mililitra 20% acetonitrylu i 4% skoncentrowanego amoniaku w 0,5 mililitrowej probówce do mikrowirówki.

Po wymieszaniu dodaj 20 mikrolitrów roztworu peptydu i 20 mikrolitrów po cztery mikrogramy na mililitr, 15N peptydu beta do 1,96 mililitra 20% acetonitrylu i 4% stężonego amoniaku w dwumililitrowej probówce do mikrowirówki. Mieszaj roztwór peptydów w mieszalniku wirowym przez jedną minutę. Następnie dodaj 20 mikrolitrów roztworu peptydu do 0,38 mililitra sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego w 0,5 mililitrowej probówce do mikrowirówki.

Po przygotowaniu duplikatów mieszaj każdy roztwór na mikserze wirowym przez jedną minutę. Po rozmrożeniu próbek na walcu dodaj 0,18 mililitra każdego kalibratora, współczynnika odpowiedzi i nieznanej próbki do jednomililitrowej płytki z białkiem 96 głębokich dołków, upewniając się, że dodałeś próbki do lub blisko dna studzienek. Teraz dodaj 20 mikrolitrów wzorca wewnętrznego do każdej studzienki, uwalniając kroplę wzorca po stronie studzienki blisko powierzchni próbki bez zanurzania końcówki pipety.

Następnie dodaj 0,2 mililitra pięciu molowych chlorowodorków guanadyny do każdej studzienki. Umieścić płytkę z próbką na wytrząsarce do mikropłytek i mieszać próbki przez 45 minut z prędkością 1100 obr./min. Po wymieszaniu dodaj 0,2 mililitra 4% kwasu fosforowego do każdej studzienki.

Następnie umieścić płytkę z próbką na wytrząsarce do mikropłytek i krótko wymieszać z prędkością 1000 obr./min. Umieść tacę zbiornika na odpady pod 96-dołkową ekstrakcją do fazy stałej z wymianą kationową w trybie mieszanym lub płytką SPE w komorze kolektora z płytą ekstrakcyjną. Następnie kondycjonuj sorbent SPE, dodając 0,2 mililitra metanolu do każdej studzienki.

Następnie zrównoważyć sorbent, dodając 0,2 mililitra 4% kwasu fosforowego do każdej studzienki. Za pomocą pipety ośmiokanałowej przenieść wszystkie próbki z płytki studzienki głębinowej na płytkę SPE. Następnie przemyć sorbent dwukrotnie po przejściu próbek, dodając 0,2 mililitra 4% kwasu fosforowego do każdej studzienki.

Po wypłukaniu rozpuszczalnika myjącego z sorbentu należy wymienić tacę zbiornika na rurki. Teraz wymyj próbkę z sorbentu, dodając dwa 50-mikrolitrowe alokwaty o zawartości 75% acetonitrylu i 10% stężonego amoniaku, zwracając uwagę, że roztwór ten wymaga bardzo niskiej próżni, aby przejść przez sorbent. Wysuszyć eluaty, stosując wirowanie próżniowe bez stosowania ciepła.

Na koniec zamknij probówki i zamroź je w temperaturze 80 stopni Celsjusza do czasu analizy. Kalibratory znajdują się blisko linii regresji z małymi odchyleniami standardowymi. Jeśli kalibracja jest nieliniowa, przebieg należy pominąć, a odchylenie jest najprawdopodobniej spowodowane nieprawidłowymi technikami pipetowania i/lub błędami w rozcieńczaniu kalibratorów.

Współczynnik zmienności kontrprób powinien być korzystnie niższy niż 10%Natywne 15N i 13C a beta eluują z kolumny LC jednocześnie z pikami bliskimi symetrycznymi i bez znacznego ogonowania. Dla każdego piku należy wykonać co najmniej 10 pomiarów, które można dostosować z maksymalnym czasem iniekcji w metodzie. Peptydy mogą być mierzone jednocześnie podczas analizy MS, chyba że czułość metody jest nieoptymalna, w której dla każdego wstrzyknięcia należy mierzyć tylko peptydy będące przedmiotem zainteresowania.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby zawsze nasycić końcówki pipet przed przeniesieniem roztworu peptydowego. Ważne jest również, aby używać rurek o jak najmniejszej objętości pustych przestrzeni.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się chorobą Alzheimera do zbadania zgodności z innymi metodami, takimi jak obrazowanie PET amyloidu. Został również wykorzystany do przypisania stężeń beta 142 materiałom referencyjnym na bazie płynu mózgowo-rdzeniowego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować kalibratory w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym i używać ekstrakcji do fazy stałej przed analizą LCMS do pomiaru bezwzględnego stężenia beta 142 w próbkach.

Nie zapominaj, że praca z ludzkim płynem mózgowo-rdzeniowym może być bardzo niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak rękawice, okulary ochronne i inne środki bezpieczeństwa.