Dwa algorytmy wysokoprzepustowej i wieloparametrycznej kwantyfikacji morfologii połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila
May 3rd, 2017
Dwa algorytmy analizy obrazu, "Drosophila NMJ Morphometrics" i "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" zostały stworzone, aby automatycznie określić ilościowo dziewięć cech morfologicznych połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila (NMJ).
Ogólnym celem tej procedury jest automatyczne ilościowe określenie cech morfologicznych połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila za pomocą makr oprogramowania morfometrycznego. Metoda ta może pomóc w identyfikacji regulatorów rozwoju synaps, co jest kluczowym pytaniem w neurobiologii. Główną zaletą tej techniki jest automatyczna kwantyfikacja wielu cech NMJ.
Pozwala to na obiektywną analizę morfologii NMJ w wysokim przepływie. Zdecydowaliśmy się rozwinąć tę metodologię, aby móc zbadać morfologię NMJ w dużej liczbie modeli chorobowych. Zastanawialiśmy się, jak zapobiec ich osobistym różnicom i jak znacznie przyspieszyć proces kwantyfikacji.
Wizualna demonstracja tej metody jest bardzo pomocna. Odpowiednie ustawienia makr mają kluczowe znaczenie, a niektóre kroki mogą być trudne dla nowych użytkowników, zwłaszcza gdy nie są zaznajomieni z oprogramowaniem VT. Dla tego protokołu wygeneruj stosy obrazów NMJ i zapisz je jako indywidualne pliki TIFF, gdzie kanał pierwszy pokazuje barwienie DLG1 lub podobny marker, a kanał drugi pokazuje barwienie BRP.
Aby rozpocząć, utwórz projekcje C i hiperstosy plików obrazów NMJ. Otwórz opcje wtyczki i wybierz Drosophila NMJ Morphometrics. Teraz zidentyfikuj unikatowy ciąg plików, który mikroskop przypisał do serii obrazów podczas zapisywania ich jako TIFF.
Będzie to na końcu nazwy obrazu. Skopiuj i wklej ciąg podany najniższej płaszczyźnie i numerze kanału do unikalnego okna ustawień ciągu pliku. Następnie wybierz makro podrzędne Konwertuj na stos i wybierz katalog lub folder, w którym znajdują się obrazy.
Dla każdego pliku obrazu tworzone są dwa nowe pliki z domyślnymi nazwami stosu i płaskiego stosu, po których następuje oryginalna nazwa obrazu. Oryginalne pliki można następnie usunąć, aby zaoszczędzić miejsce na dysku. Następnie z interfejsu Drosophila NMJ Morphometrics wybierz makro podrzędne definiowania ROI i wybierz katalog plików obrazu.
Po otwarciu pierwszego rzutowania wybierz narzędzie do zaznaczania odręcznego. Następnie użyj myszki, aby zdefiniować region zawierający kompletny terminal NMJ, który Cię interesuje. Po wybraniu kliknij przycisk OK w oknie definiowania terminala.
Kontynuuj tę czynność, aż zaciski NMJ zostaną zdefiniowane we wszystkich rzutach. Makro automatycznie przyspiesza proces. Dla każdego pliku obrazu tworzony jest jeden nowy plik z domyślnymi nazwami ROI, po których następuje oryginalna nazwa obrazu.
Aby określić ilościowo cechy NMJ, najpierw przejdź do interfejsu morfometrycznego Drosophila NMJ i ustaw skalę. Na przykład, jeśli jeden piksel na obrazie odpowiada 0,72 mikrona, ustaw skalę pikseli na jeden, a odległość skali na 0,072. Następnie wybierz analizę makra podrzędnego, a jeśli są dwa obrazy kanałów, przełącz również wagę.
Naciśnij OK i po wyświetleniu monitu wybierz katalog plików obrazu. Czas przetwarzania może wynosić kilka minut na synapsę. Po analizie nowe pliki obrazów dla każdej analizowanej synapsy są przechowywane w folderze nadrzędnym, a pomiary ilościowe są wynikami.
plik txt. Sprawdź wszystkie obrazy i wyklucz zdjęcia z błędami segmentacji. Na przykład części zakończenia synaptycznego mogą nie być uwzględnione w żółtym konturze.
Części tła mogą być zawarte w terminalu synaptycznym. Niebieska linia szkieletu może wychodzić poza zakończenie synaptyczne. Może być zbyt wiele aktywnych stref lub niektóre aktywne strefy mogą pozostać niewykryte.
Jeśli więcej niż 5% obrazów ma błędy segmentacji, zapoznaj się z różnymi algorytmami analizy, aby poprawić przetwarzanie obrazu. W kolejnych sekcjach filmu opisano sposób definiowania wielu z tych ustawień analizy makr. Aby dostosować wartość promienia toczącej się kuli dla makra, wybierz trzy projekcje NMJ Z, które są reprezentatywne dla zestawu danych obrazu.
Usuń nazwę obrazu z res wynikową i nazwę obrazu stosu dwóch aktywnych stref, utworzonych wcześniej przez analizę makra podrzędnego. Otwórz pliki z nazwami obrazów stosu dla każdego wybranego obrazu, a następnie z paska narzędzi wybierz podziel kanały, aby utworzyć obraz kanału pierwszego i obraz kanału drugiego i zapisz te pliki. Otwórz obraz należący do kanału pierwszego, który w tym przypadku odpowiada znakowaniu immunologicznemu DLG one.
Teraz uruchom filtr odejmuj tło, znajdujący się na karcie procesu. Ustaw promień toczącej się piłki na wartość, która zwiększa kontrast między synapsą a tłem. Utwórz projekcję Z z typem projekcji jako maksymalną intensywnością i zapisz obraz.
Następnie uruchom algorytm odejmowania tła z nowym promieniem toczącej się kuli na wszystkich rzutach Z i zapisz wyniki. Aby określić najlepsze progi automatyczne dla makra, otwórz zapisane projekcje C i uruchom automatyczny próg z opcją wypróbuj wszystko. Z wynikowych obrazów znajdź najbardziej odpowiedni algorytm dla obrazów i kontynuuj korzystanie z tego ustawienia progu podczas uruchamiania makra dla dalszych obrazów.
Definiowanie różnych progów automatycznych ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej segmentacji obrazu przez makro. Z tego powodu, aby prawidłowo określić ilościowo osiem parametrów oznakowania, ważne jest, aby zapoznać się z 16 opcjami automatycznych progów oferowanych przez oprogramowanie. Naciśnij przycisk plusa, aby powiększyć obraz wyniku automatycznego progu.
Nazwy algorytmów znajdują się pod każdym obrazem wynikowym. W tym przykładzie najlepszym algorytmem automatycznego progu do ustawiania progu konspektu NMJ jest Huang. W przypadku progu szkieletowego najlepszym ustawieniem jest Li, a najlepszym ustawieniem progu strefy aktywnej jest Huang.
Aby zdefiniować maksymalną wartość tolerancji szumów dla makro, wróć do oryginalnych reprezentatywnych obrazów NMJ. Otwórz kanał BRP. Przejdź do zakładki wtyczki w menu podręcznym i wybierz maksymalne 3D.
Po krótkiej chwili pojawi się nowy obraz, a następnie zamknij oryginalny obraz. Następnie użyj polecenia minimum 3D. Następnie zamknij maksymalną liczbę stosów C2 synapse jeden obraz i wybierz nowo utworzony obraz minimum maksymalnej liczby C2 stos synapse jeden.
Teraz użyj polecenia find maxima. W nowym oknie wybierz podgląd wyboru punktu i ustaw tolerancję szumów na 50. Punkty maksimów są następnie oznaczane małymi krzyżykami, które powinny pokrywać tylko strefy aktywne synaps.
Jeśli wykonano zbyt wiele skrzyżowań, zwiększ wartość tolerancji hałasu. Jeśli niektóre aktywne strefy nie są oznaczone adnotacjami, zmniejsz wartość tolerancji hałasu. Użyj pochodnej wartości progowej dla pola znajdź maksymalną tolerancję szumu makra.
Wybierając maksymalną wartość tolerancji hałasu, ważne jest, aby odpowiednio określić ilościowo liczbę aktywnych stref. Czasami konieczne jest wypróbowanie różnych wartości, aby zdefiniować właściwą. Teraz dostosuj wszystkie wartości pochodne w algorytmach progowych w interfejsie makr i uruchom analizę makra podrzędnego na reprezentatywnych obrazach, które zostały pierwotnie użyte do zdefiniowania ustawień makr.
Zostanie utworzony nowy plik z aktywnymi strefami oznaczonymi białymi kropkami. Otwórz ten plik, przeciągając go i upuszczając na pasek narzędzi, a następnie wybierając projekt Z z typem projekcji jako niektóre plasterki. W ten sposób tworzony jest plik projekcyjny.
Następnym krokiem jest dostosowanie progu. W nowym oknie progu przesuń górny pasek, aby wybrać wartość progową, w której odczytywane są wszystkie żądane ogniska. To są pozytywne punkty BRP.
Użyj tej wartości jako dolnego progu BRP puncta. Teraz ponownie uruchom analizę na oryginalnych reprezentatywnych obrazach NMJ, używając wcześniej zdefiniowanych wartości, algorytmów, a następnie nowej wartości progowej BRP puncta. Uzyskane obrazy powinny spełniać kryteria analizy krytycznej.
Teraz użyj ustawień definiowania, aby uruchomić makro na wszystkich obrazach NMJ uzyskanych w tych samych warunkach. Makro morfometria Drosophila NMJ wykorzystano do walidacji różnych znanych defektów synaptycznych w trzech zmutowanych genotypach. Wiadomo, że dwa mutanty ankyryny mają połączone bulony i mniejsze NMJ.
Za pomocą makro zmierzono obszar i obwód panuronilu i quirinu, dwóch NNAM powalających RNAI i stwierdzono, że są one znacznie mniejsze niż w grupie kontrolnej. GTPaza Rab3 jest niezbędna do prawidłowej dystrybucji bruckpila. W przypadku zakłóceń jest mniej aktywnych stref.
Stosując makro panuronil Rab 3, muchy knock-down miały średnio 138 aktywnych stref na terminal NMJ, w porównaniu do 290 wykrytych w kontrolach. Wysoki drut jest ważnym regulatorem wzrostu NMJ, a gdy zmutowane NMJ mają rozszerzone rozgałęzienia na swoich końcach. Użycie linii knockdown RNAI o wysokiej długości drutu makro panuronil wykazało znaczny wzrost kilku parametrów pochodnych szkieletu w ich NMJ, w tym długości całkowitej, najdłuższej długości gałęzi, liczby gałęzi i liczby punktów rozgałęzień.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obsługiwać i dostosowywać ustawienia makra morfometrii Drosophila NMJ. Po opanowaniu analizy 50 synaps można przeprowadzić w ciągu jednej godziny. Pozwala to zaoszczędzić około 15 minut czasu kwantyfikacji na synapsę.
Ważne jest, aby uzyskać dobrej jakości obrazy NMJ. Im lepsze obrazy, tym lepiej będzie działać makro. Technika ta pomoże naukowcom z dziedziny neurobiologii w skutecznym ilościowym określeniu parametrów morfologicznych Drosophila NMJ.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia dwa algorytmy analizy obrazów, "Drosophila NMJ Morfometria" i "Drosophila NMJ Bouton Morfometria," zaprojektowane w celu automatycznego ilościowego określania dziewięciu cech morfologicznych złącza nerwowo-mięśniowego Drosophila (NMJ). Metodologia ma na celu ułatwienie badania morfologii NMJ w różnych modelach chorobowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Analiza obrazów
- Rozwijanie synaps
Tło
- Badanie koncentruje się na złączu nerwowo-mięśniowym Drosophila (NMJ).
- Rozumienie morfologii NMJ jest kluczowe dla identyfikacji regulatorów rozwoju synaps.
- Automatyczne ilościowe określania poprawia efektywność analizy morfologicznej.
- Demonstracje wizualne pomagają w zrozumieniu metodologii.
Cel badania
- Opracowanie algorytmów do automatycznego ilościowego określania cech NMJ.
- Możliwość przeprowadzania wysokoszybkowych analiz morfologii NMJ.
- Zmniejszenie różnic indywidualnych w ilościowym określaniu.
Zastosowanie metod
- Generowanie stosów obrazów NMJ i zapisywanie ich jako pliki TIFF.
- Stworzenie makr do automatyzacji procesu ilościowego określania.
- Definiowanie obszarów zainteresowania (ROI) dla końcówek NMJ.
- Optymalizacja ustawień progów automatycznych i tolerancji na hałas dla dokładnej segmentacji.
Główne wyniki
- Generowanie nowych plików obrazów z ilościowymi pomiarami po analizie.
- Identyfikacja i usuwanie błędów segmentacji poprzez dostosowywanie algorytmów.
- Wyznaczenie optymalnych ustawień progów automatycznych dla dokładnego ilościowego określania cech.
Wnioski
- Opracowanie algorytmów znacząco poprawia analizę morfologii NMJ.
- Metody automatyczne zapewniają obiektywne i powtarzalne wyniki.
- To podejście może być zastosowane do różnych modeli chorobowych w celu badania rozwoju synaps.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Automated, high-throughput quantification of synaptic morphology enables objective assessment of synaptic regulators in disease models, reducing variability and accelerating target validation in neurobiology. This approach supports predictive confidence by providing reproducible, multi-parametric readouts that clarify structure-function relationships at glutamatergic synapses. It addresses a key bottleneck in preclinical discovery where subtle morphological changes may be missed by qualitative methods, thereby improving mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying NMJ area, perimeter, bouton number, and active zones to assess synaptic integrity.
- Operational Value: Automates measurement of nine morphological features, reducing manual effort and increasing throughput for large-scale mutant or RNAi screens.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by detecting subtle morphological defects in disease models that may predict functional synaptic dysfunction.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative outputs (e.g., NMJ length, branch points) suitable for compound screening and dose-response analysis.
- Reproducibility: Uses Fiji-compatible macros with optimized thresholds and noise tolerance settings to ensure consistent segmentation across image sets.
- Scalability: Enables analysis of 50 synapses per hour, supporting platform reuse in discovery workflows requiring high-content imaging.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applied to mutant genotypes (e.g., ankyrin two, Rab3, high wire) to validate known synaptic defects, demonstrating utility in preclinical model characterization.
- Translational Continuity: Links morphological metrics (e.g., active zone count, branching) to synaptic function, supporting biomarker alignment in neurodevelopmental disorder models.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides objective morphometric thresholds to inform go/no-go decisions based on structural rescue or deterioration.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by converting raw imaging data into quantifiable synaptic phenotypes that feed into lead identification and preclinical validation stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via automated quantification of NMJ morphology to clarify gene function in synapse development pathways.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative readouts (bouton number, NMJ area, active zones) enabling reliable compound or genetic modifier evaluation.
- Analytics: Generates multi-parametric data (nine features) that allow statistical comparison across conditions and support data-driven prioritization.
- Translational Research: Connects structural NMJ metrics to functional outcomes in disease models, enabling continuity from discovery to preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Fiji-compatible macros represent a reusable imaging analysis capability applicable across multiple projects and model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through objective, multi-parametric morphometric profiling.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility across users and labs via macro-driven automation and defined threshold settings.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing quantification time per synapse (~15 minutes saved) and enabling larger cohort screening.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by identifying subtle morphological modifiers that may be missed in qualitative screens.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal imaging and Fiji/ImageJ macro environments for proper setup and execution.
- Dependent on high-quality immunolabeled NMJ images (Dlg-1, Brp) with consistent staining and segmentation to avoid artifacts.
- Necessitates cross-team standardization of macro settings (rolling ball radius, auto thresholds, noise tolerance) for reproducible results across sites.
- Adaptation to other markers (Hrp, Csp, Syt) requires validation of signal specificity and threshold optimization per channel.
- Practical limitation: Segmentation errors (>5%) require iterative algorithm adjustment, adding setup time before large-scale deployment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
4:50
Macro Settings: Rolling Ball Radius Value and Auto-threshold
7:26
Macro Settings: Maxima Noise Tolerance Value, and Brp-puncta Thresholds
10:16
Results: Validating the Marco by Recapitulating Known NMJ Defects
11:38
Conclusion
1:03
Creating NMJ Images with Defined Features
