Przygotowanie tkanki mózgowej naczelnych innych niż ludzie do wstępnego zatopienia immunohistochemii i mikroskopii elektronowej

Ogólnym celem tego eksperymentu jest uzyskanie wiarygodnego wstępnego zatapiania immunologicznego tkanki mózgowej nienaczelnych do mikroskopii elektronowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuroanatomii, takie jak występowanie synaps danego unerwienia w precyzyjnej strukturze mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to łatwa i tania metoda oznaczania określonych unerwień odpowiednich do mikroskopii elektronowej.

Rozpocznij od przeniesienia odcinków o grubości 50 mikronów utrwalonego w mózgu naczelnych o grubości 50 mikronów, zawierającego obszar zainteresowania, na 12-dołkową płytkę zawierającą PBS. Przemyć swobodnie pływające sekcje trzy razy w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować sekcje w świeżo przygotowanym roztworze borowodorku sodu przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Kołysz się delikatnie bez pokrowca.

Po upływie 30 minut odessać borowodorek sodu i dodać PBS do każdej studzienki. Umieść talerz na bujaczku i energicznie potrząsaj przez 10 minut. Powtórz mycie jeszcze dwa razy lub do momentu, gdy nie pozostanie żaden gaz reakcyjny.

Zablokuj skrawki przez inkubację w roztworze 2% normalnej surowicy i 0,5% zimnej żelatyny rybnej rozcieńczonej w PBS przez godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem. Po upływie czasu inkubacji należy inkubować skrawki w roztworze przeciwciała pierwotnego, delikatnie kołysząc przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia, po umyciu skrawków jak poprzednio, inkubować skrawki w wtórnym roztworze przeciwciał przez półtorej godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem.

Po umyciu skrawków jak poprzednio, inkubować w roztworze peroksydazy awidyny-biotyny lub ABC przez godzinę z kołysaniem. Następnie przygotuj świeży roztwór 0,05%3,3'Diaminobenzydyny z 0,005% nadtlenkiem wodoru rozcieńczonym w TBS. Po umyciu inkubować skrawki w roztworze DAB przez trzy do siedmiu minut, delikatnie kołysząc.

Gdy brązowy osad osiągnie pożądany kolor, zatrzymaj reakcję, szybko myjąc dwukrotnie w zimnym TBS, a następnie przez serię czasowych płukań TBS i PB. Przenieś płytkę zawierającą sekcje zabarwione DAB do okapu wentylacyjnego. Przenieś skrawki do sześciodołkowej płytki wypełnionej PB i całkowicie spłaszcz sekcje, ostrożnie pipetując PB z płytki, a następnie dodaj roztwór tetratlenku osmu kropla po kropli, aby uniknąć naruszenia spłaszczonych sekcji.

Przykryj płytkę folią aluminiową, aby chronić sekcje przed światłem i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej bez mieszania. Podczas osmizacji przygotuj wodoodporną żywicę epoksydową, dodając odpowiednie ilości każdego składnika mieszanki żywicy epoksydowej do dużego plastikowego kubka. Mieszać drewnianym patyczkiem lub plastikową pipetą, aż do uzyskania jednorodnego brązowego koloru, a następnie przenieść równe ilości żywicy do aluminiowych kubków o wielkości odpowiedniej do liczby sekcji do przetworzenia i pozostawić do odpoczynku.

Po upływie okresu osmizacji umyj sekcje trzy razy w PB przez 10 minut z kołysaniem na niskiej prędkości. Po umyciu odwodnić sekcje w następnej serii sortowanego etanolu przez dwie minuty każda. Następnie przenieś skrawki do szklanych fiolek wypełnionych tlenkiem propylenu i inkubuj w tlenku propylenu trzy razy przez dwie minuty każda, aby zakończyć proces odwadniania.

Następnie ostrożnie przenieś sekcje, jedna po drugiej, do aluminiowych miseczek, unikając w jak największym stopniu kontaktu z powietrzem. Płaskie sekcje należy zanurzyć we wcześniej zmieszanej wodoodpornej żywicy epoksydowej i inkubować przez noc pod okapem wentylacyjnym w temperaturze pokojowej. Następnego dnia pokryj szkiełka podstawowe i plastikowe szkiełka nakrywkowe olejem mineralnym, a następnie zmiękcz żywicę, inkubując aluminiowe kubki w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez maksymalnie 12 do 15 minut.

Ostrożnie spłaszcz sekcje po natłuszczonej stronie szkiełka podstawowego. Umieść nasmarowany szkiełko nakrywkowe i ostrożnie wypchnij pozostałe powietrze. Inkubuj szkiełka w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 48 godzin.

Po 48 godzinach usuń plastikowe szkiełko nakrywkowe, pozostawiając sekcję pokrytą żywicą. Zacznij od użycia lornetki, aby zlokalizować obszar zainteresowania, a następnie użyj skalpela, aby wyciąć mały czworokątny kawałek tkanki o powierzchni około jednego mililitra kwadratowego. Następnie spiłuj końcówkę bloku żywicy, a następnie przyklej do niego czworokątny kawałek tkanki.

Po wyschnięciu umieść blok żywicy w pokładzie ultramikrotomu w pozycji pionowej i za pomocą ostrej żyletki stopniowo przecinaj każdą stronę bloku żywicy, aby utworzyć trapez o gładkich bokach. Następnie ustaw pokład w pozycji poziomej i obracaj blok, aż najdłuższy bok trapezu będzie skierowany w dół. Umieść diamentowe narzędzie do przycinania lub nóż do szkła w przeznaczonym do tego miejscu.

Ustaw ultramikrotom tak, aby wycinał odcinki o grubości 300 mikronów z prędkością jednego milimetra na sekundę. Ustaw nóż tak, aby był pionowo równoległy do czworokątnego elementu i wyświetlał bardzo mały kąt poziomy wynoszący około jednego stopnia, a następnie przycinaj powierzchnię czworokątnego elementu, aż zacznie pojawiać się tkanka. Teraz przełącz się na nóż diamentowy o ultra 45 stopniach wyposażony w łódkę wypełnioną wodą destylowaną do cięcia odcinków o grubości 80 mikronów.

Wygładź sekcje, przechodząc po nich kawałkiem chłonnego papieru zakończonego ksylenem bez dotykania powierzchni wody, a następnie zbierz odcinki szeregowe na gołych miedzianych siatkach o oczkach 150. Umieść kratki w siatkowym pudełku do przechowywania, a następnie przygotuj jeden do jednego roztwór podstawowy cytrynianu ołowiu i wody destylowanej i przefiltruj przez filtr strzykawkowy o wielkości 0,2 mikrona. Przykryć fiolkę folią aluminiową w celu ochrony przed światłem.

Umieść każdą siatkę na kropli rozcieńczonego roztworu cytrynianu ołowiu, tak aby sekcja stykała się z roztworem Następnie użyj małej pęsety, aby przytrzymać siatkę i dokładnie opłucz ją w dwóch zlewkach zawierających wodę destylowaną. Delikatnie usuń nadmiar wody papierem absorpcyjnym i umieść kratki w pudełku z siatką. Po 30 minutach skrawki można badać za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Ten mikrograf elektronowy wewnętrznej gałki bladej małpy wiewiórki pokazuje dobrze zachowany materiał po perfuzji przezsercowej akroleina-PFA w technice immunoperoksydazy diaminobenzydyny. Jak widać tam, procedura pozwala zobaczyć osłonkę mielinową dużego aksonu, oznaczoną grotem strzałki. Ten mikrograf elektronowy zewnętrznej gałki bladej pokazuje profile dendrytyczne, oznaczone literą d, małe niezmielinizowane aksony, oznaczone a, oraz żylaksy aksonów, oznaczone av, można łatwo zidentyfikować.

Strzałki pokazują przykład żylaka aksonu ustanawiającego symetryczny kontakt synaptyczny z profilem dendrytycznym. Pierwiastki znakowane immunologicznie można łatwo zidentyfikować po ich cytoplazmie lub aksoplazmie wypełnionej gęstym elektronowo osadem DAB. W tym przypadku dendryt wybarwiony immunologicznie na acetylotransferazę choliny w GPi otrzymuje kontakt synaptyczny z nieznakowanego żylaksa aksonu.

Ten mikrograf elektronowy pokazuje zmielinizowany akson w GPe ze stosunkowo nienaruszoną osłonką mielinową, której aksoplazma jest znakowana immunologicznie dla hydroksylazy tyrozyny. Ten przykład pokazuje żylaki aksonów w GPi znakowanym immunologicznie dla transportera serotoniny, który ustanawia symetryczny kontakt synaptyczny z dendrytem. W tym przykładzie osad DAB wytrąca się na błonie plazmatycznej i zewnętrznej powierzchni organelli.

Pokazane tutaj żylaki aksonów zaobserwowano w GPe i znakowano immunologicznie dla hydroksylazy tyrozyny. Jest to przykład całkowitego wypełnienia aksoplazmy osadu DAB, z widocznymi pęcherzykami synaptycznymi, ale trudniejszymi do nakreślenia. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak wstępne osadzenie podwójnej immunohistochemii, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak kolokalizacje białek lub receptorów na poziomie synaptycznym.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować immunohistochemię wstępnego zatapiania tkanki mózgowej innych niż naczelne, przejść do zatapiania w żywicy epoksydowej i ultraciąć obszar zainteresowania na odcinki o grubości 80 mikrometrów odpowiednie do mikroskopii elektronowej.