Przygotowanie tkanki mózgowej naczelnych innych niż ludzie do wstępnego zatopienia immunohistochemii i mikroskopii elektronowej

Ogólnym celem tego eksperymentu jest uzyskanie wiarygodnego immunobarwienia przed zatopieniem tkanki mózgowej nieprymatów do mikroskopii elektronowej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neuroanatomii, takie jak częstość synaptyczna danej unerwienia w precyzyjnie określonej strukturze mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona prostą i niskokosztową metodę znakowania specyficznych unerwień, odpowiednią do mikroskopii elektronowej.

Zacznij od przeniesienia przekrojów o grubości 50 µm mózgu naczelnego (pozaludzkiego), utrwalonych akroleiną i zawierających obszar zainteresowania, do płytki 12-dołkowej z PBS. Przemyj swobodnie pływające przekroje trzykrotnie w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie inkubuj przekroje w świeżo przygotowanym roztworze borowodorku sodu przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Kołysz delikatnie bez przykrycia.

Po upływie 30 minut odessać borowodorek sodu i dodać PBS do każdej studni. Umieścić płytkę na wytrząsarce i intensywnie mieszać przez 10 minut. Powtórzyć płukanie jeszcze dwa razy lub do momentu, aż całkowicie ustąpi wydzielanie gazu z reakcji.

Zablokuj sekcje, inkubując je w roztworze 2% surowicy normalnej i 0,5% zimowej żelatyny rybiej rozcieńczonej w PBS przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej przy delikatnym kołysaniu. Po upływie czasu inkubacji inkubuj sekcje w roztworze przeciwciał pierwszorzędowych przez noc w temperaturze pokojowej przy delikatnym kołysaniu. Następnego dnia, po ponownym przemyciu sekcji w ten sam sposób, inkubuj sekcje w roztworze przeciwciał drugiej rzędowych przez półtorej godziny w temperaturze pokojowej przy delikatnym kołysaniu.

Po ponownym przemyciu przekrojów, należy inkubować je w roztworze awidyny-biotyny-peroksydazy lub roztworze ABC przez jedną godzinę przy delikatnym kołysaniu. Następnie należy przygotować świeży roztwór 0,05% 3,3'-diaminobenzydyny z 0,005% nadtlenkiem wodoru rozpuszczonym w TBS. Po przemyciu przekroje należy inkubować w roztworze DAB od trzech do siedmiu minut przy delikatnym kołysaniu.

Gdy brązowy osad osiągnie pożądany kolor, przerwać reakcję poprzez szybkie dwukrotne przemycie w zimnym TBS, a następnie serii płukań w TBS i PB w określonych odstępach czasu. Przenieść płytkę z przekrojami barwionymi DAB pod wyciąg. Przenieść przekroje do płytki sześciodołkowej wypełnionej PB i całkowicie je rozpłaszczyć, ostrożnie odpipetowując PB z płytki, a następnie kroplami dodawać roztwór osmotetratlenku, aby uniknąć naruszenia rozpłaszczonych przekrojów.

Przykryć płytkę folią aluminiową, aby chronić skrawki przed światłem, i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej bez mieszania. Podczas osmowania przygotować wodoodporną żywicę epoksydową, dodając odpowiednie ilości każdego składnika mieszanki żywicy epoksydowej do dużego plastikowego kubka. Mieszać drewnianym patyczkiem lub plastikową pipetą do uzyskania jednorodnego brązowego koloru, a następnie przenieść równe ilości żywicy do aluminiowych kubeczków o rozmiarze odpowiednim dla liczby przetwarzanych skrawków i pozostawić do odpoczęcia.

Po upływie czasu osmyfikacji należy przemyć przekroje trzykrotnie w PB przez 10 minut, stosując wolnoobrotowe kołysanie. Po przemyciu odwodnij przekroje w następującej serii gradowanych stężeń etanolu przez dwie minuty w każdym z nich. Następnie przenieś przekroje do szklanych fiolek wypełnionych tlenkiem propylenu i inkubuj w tlenku propylenu trzykrotnie po dwie minuty, aby zakończyć proces odwadniania.

Następnie ostrożnie przenieś przekroje, jeden po drugim, do aluminiowych pojemniczków, unikając w miarę możliwości kontaktu z powietrzem. Osadź przekroje płasko w uprzednio wymieszanej hydrofobowej żywicy epoksydowej i inkubuj je przez noc pod wyciągiem w temperaturze pokojowej. Następnego dnia pokryj szkiełka przedmiotowe i plastikowe szkiełka nakrywkowe olejem mineralnym, a następnie zmiękcz żywicę, inkubując aluminiowe pojemniczki w temperaturze 60 °C przez maksymalnie 12 do 15 minut.

Ostrożnie wygładzić przekroje po wysmarowanej stronie szkiełka przedmiotowego. Nałożyć wysmarowane szkiełko zakryciowe i ostrożnie wypchnąć wszelkie pozostałe pęcherzyki powietrza. Inkubować preparaty w temperaturze 60 °C przez 48 godzin.

Po 48 godzinach należy usunąć plastikową szkiełko przykrywowe, pozostawiając przekrój zatopiony w żywicy. W pierwszej kolejności należy zlokalizować obszar zainteresowania za pomocą binokularów, a następnie wyciąć skalpelem niewielki czworoboczny fragment tkanki o powierzchni około jednego milimetra kwadratowego. Następnie należy opiłować końcówkę bloku żywicznego i przykleić do niej czworoboczny fragment tkanki.

Po wysuszeniu umieść blok żywicy w uchwycie ultramikrotomu w pozycji pionowej i za pomocą ostrego ostrza brzytwy stopniowo przytnij każdą stronę bloku, aby utworzyć trapez o gładkich bokach. Następnie ustaw uchwyt w pozycji poziomej i obróć blok tak, aby najdłuższa strona trapezu była skierowana w dół. Umieść diamentowe narzędzie do przycinania lub nóż szklany w wyznaczonym miejscu.

Ustaw ultramikrotom na wycinanie sekcji o grubości 300 micron z prędkością jednego milimetra na sekundę. Wyreguluj nóż tak, aby był równolegle pionowo do czworobocznego fragmentu i wykazywał bardzo mały kąt poziomy wynoszący około jednego stopnia, a następnie przycinaj powierzchnię czworobocznego fragmentu, aż zacznie pojawić się tkanka. Teraz przełącz się na diamentowy nóż ultra 45 stopni wyposażony w korytko wypełnione wodą destylowaną, aby wycinać sekcje o grubości 80 micron.

Wygładzić przekroje, przesuwając nad nimi kawałek papieru absorpcyjnego nasączonego ksylenem, nie dotykając powierzchni wody, a następnie zebrać seryjne przekroje na gołe miedziane siatki o oczku 150 mesh. Umieścić siatki w pudełku do przechowywania siatek, a następnie przygotować roztwór stężnego cytrynianu ołowiu z wodą destylowaną w stosunku jeden do jednego i przefiltrować go przez filtr strzykawkowy 0,2 mikrona. Przykryć fiolkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem.

Nanieś każdą siatkę na kroplę rozcieńczonego roztworu cytrynianu ołowiu, tak aby sekcja miała kontakt z roztworem. Następnie, używając małej pincety, przytrzymaj siatkę i dokładnie wypłucz ją w dwóch zlewkach z wodą destylowaną. Delikatnie usuń nadmiar wody za pomocą papieru chłonnego i umieść siatki w pudełku na siatki. Po 30 minutach sekcje można poddać analizie za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

Ta mikrografia elektronowa wewnętrznej części gałki bladej małpki sajmiri pokazuje dobrze zachowany materiał po transkardiowej perfuzji akroleiną i PFA w technice immunoperoksydazy z diaminobenzydyną. Jak widać, procedura ta pozwala na zaobserwowanie osłonki mielinowej dużego aksonu, wskazanego grotem strzałki. Ta mikrografia elektronowa zewnętrznej części gałki bladej pokazuje, że można łatwo zidentyfikować profile dendrytyczne, oznaczone literą d, małe nieumielinowane aksony, oznaczone literą a, oraz żylakowatości aksonalne, oznaczone jako av.

Strzałki wskazują przykład wzdęcia aksonu tworzącego symetryczny kontakt synaptyczny z profilem dendrytycznym. Elementy znakowane immunologicznie można łatwo zidentyfikować po cytoplazmie lub aksoplazmie wypełnionej elektronowo gęstym opadem DAB. W tym przypadku dendryt w GPi, poddany immunohistochemicznemu barwieniu na cholinowęglan transferazę, otrzymuje kontakt synaptyczny z nieznakowanym wzdęciem aksonu.

Ta mikrografia elektronowa przedstawia zmjelinizowany akson w GPe z względnie nienaruszoną osłoną mielinową, którego aksoplazma została immunoznakowana pod kątem hydroksylazy tyrozynowej. Ten przykład pokazuje żyłkę aksonalną w GPi, immunoznakowaną pod kątem transportera serotoniny, która tworzy symetryczny kontakt synaptyczny z dendrytem. W tym przypadku osad DAB wyścieła błonę komórkową oraz zewnętrzną powierzchnię organelli.

Przedstawiona tutaj żarna aksonu została zaobserwowana w GPe i immunoznakowana pod kątem hydroksylazy tyrozynowej. Jest to przykład osadu DAB całkowicie wypełniającego aksoplazmę, w której pęcherzyki synaptyczne są widoczne, lecz trudniejsze do dokładnego wyodrębnienia. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak przedwtapialna podwójna immunohistochemia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. dotyczące kolokalizacji białek lub receptorów na poziomie synaptycznym.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przygotować immunohistochemię przed zatopieniem w tkance mózgowej zwierząt nieprynasowatych, przeprowadzić zatapianie w żywicy epoksydowej oraz wykonać ultramikrotomię obszaru zainteresowania w celu uzyskania sekcji o grubości 80 µm, odpowiednich do mikroskopii elektronowej.