Wykorzystanie obrazowania żywych komórek in vitro do badania chemioterapeutyków dostarczanych przez nanocząstki na bazie lipidów
1 listopada 2017
Obrazowanie żywych komórek to potężne narzędzie do wizualizacji dynamicznych procesów. Badanie nieruchomych komórek dostarcza jedynie statycznych obrazów, co może prowadzić do błędnej interpretacji i zamieszania co do procesu. W pracy przedstawiono metodę badania wychwytu, uwalniania leków i lokalizacji wewnątrzkomórkowej nanocząstek liposomalnych w żywych komórkach.
Ogólnym celem tej techniki obrazowania żywych komórek jest śledzenie procesów komórkowych, takich jak wychwyt i dystrybucja chemioterapeutyków, bez konieczności fiksacji. Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie raka, takie jak: w jaki sposób chemioterapeutyki, zarówno w postaci wolnej, jak i zamkniętej w nanocząsteczkach, są wchłaniane przez komórki nowotworowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że obrazujemy żywe komórki, zapobiegając w ten sposób artefaktom fiksacji i umożliwiając dynamiczną ocenę w czasie rzeczywistym.
Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zaobserwowaliśmy, że nanocząstki rozpadają się podczas fiksacji, co prowadzi do błędnej interpretacji podawanego leku. Aby zmontować komorę obrazowania, należy umieścić 25-milimetrową szklaną pokrywę w dolnej części komory i przykręcić górną część do dolnej części. Nie dokręcaj zbyt mocno, ponieważ szkło może pęknąć.
Autoklaw całej komory. Aby pokryć komórki płytką, wyjmij komorę obrazowania z worka sterylizacyjnego w komorze z przepływem laminarnym. Ostrożnie dokręć komorę i umieść ją na szalce Petriego.
Pokryj szklankę komory obrazowania jednym mililitrem 0,1 procent sterylnej żelatyny przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach dwutlenku węgla. Po wyjęciu pożywki z kolb do hodowli komórkowych, umyj komórki raz 1x PBS i odłącz komórki za pomocą 0,25% trypsyny. Dezaktywuj trypsynę, dodając pożywkę do hodowli komórkowych.
Następnie zbierz komórki i obracaj je w temperaturze 1,100 G przez pięć minut. Ponownie zawiesić osad w pięciomililitrowym roztworze do hodowli komórkowych. Po policzeniu komórek zgodnie z opisem w protokole tekstowym, odessać żelatynę i pokryć komórki w rozcieńczeniu, które pozwala na maksymalnie 70-procentowe pokrycie w ciągu 24 godzin.
Pozwól komórkom przylegać do pięciu procent dwutlenku węgla i 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Wykonaj ocenę komórek pod mikroskopem pod kątem zbiegu, morfologii komórkowej i zanieczyszczenia. Następnie włącz mikroskop konfokalny, światło fluorescencyjne i komputer.
Podłącz grzałkę obiektywu do obiektywu i ustaw ją na 35 stopni. Przygotować jednostkę inkubacyjną zgodnie z protokołem tekstowym. Umieść jednostkę inkubacyjną na stoliku mikroskopu i podłącz rurkę z dwutlenkiem węgla wlotowym i odpływowym.
Otwórz główny zawór dwutlenku węgla i włącz kontroler dwutlenku węgla. Sprawdź, czy kontroler jest ustawiony na pięć procent dwutlenku węgla. Odpowiednie warunki hodowli komórek, takie jak temperatura, CO2, pH, wilgotność i sterylność, mają kluczowe znaczenie dla długoterminowego obrazowania komórek.
Tak więc dla każdego inkubatora muszą one zostać odpowiednio przetestowane. Ustaw temperaturę sceny na 37 stopni Celsjusza. Pozwól, aby jednostka inkubacyjna osiągnęła wybraną temperaturę i procentową zawartość dwutlenku węgla.
Pobrać komorę obrazowania z głównego inkubatora dwutlenku węgla i przetransportować ją na szalce Petriego do pomieszczenia mikroskopowego. Umieść komorę obrazowania w specjalnie wykonanym uchwycie stolika o średnicy 35 milimetrów i zamknij komorę specjalnie wykonaną pokrywą uszczelniającą. Otwórz jednostkę inkubacyjną i pracuj tak szybko, jak to możliwe, aby zapobiec wychłodzeniu komórek; Zastąp czerwoną plamkę komorą obrazowania, a następnie zamknij jednostkę.
Upewnij się, że żadne nie utknęły między stage a mikroskopem. Pozostaw urządzenie do aklimatyzacji na 30 minut. Następnie otwórz oprogramowanie i włącz laser.
Utwórz nową bazę danych, klikając Nowy"na karcie Plik. Nazwij i zapisz bazę danych. Ustaw konfigurację, klikając Konfiguracja" w zakładce Nabierz.
Wybierz tryb kanału"i pojedynczą ścieżkę", aby ocenić pojedynczy fluorofor. Wybierz Multi Track" dla kilku fluoroforów. Następnie należy dobrać odpowiednie filtry pasmowo-przeszłe, pasujące do fluoroforu.
Wybierz jasny kanał pola na jednej ze ścieżek. Skanowanie jest zaburzone między sygnałem fluorescencyjnym związków a jakością obrazu. Prześwietlenie, fotowybielanie, stosunek sygnału do szumu, jakość komórek, dodane związki to czynniki, które mogą wpływać na wyniki i muszą być odpowiednio przetestowane.
Ustaw kontrolkę skanowania, klikając Skanuj"na karcie Nabierz. Następnie kliknij Tryb"aby ustawić rozmiar ramki, szybkość skanowania, kierunek skanowania i średnią skanowania. Kliknij Kanały", aby ustawić otwór, wzmocnienie i przesunięcie oraz moc lasera.
Zapisz te ustawienia, klikając "Konfiguracja" w zakładce Konfiguracja i zapisz je w bazie danych konfiguracji. Ustaw film poklatkowy, klikając Muti TimeX" w zakładce Makro. Kliknij opcję Pojedyncza lokalizacja.
Zastosuj zapisaną konfigurację, klikając Single Track" i przewiń do wymaganej konfiguracji w bazie danych konfiguracji. Ustaw przedział czasu i liczbę skanowań. Załaduj konfigurację, klikając przycisk Załaduj konfigurację.
Nazwij film poklatkowy w polu Nazwa pliku podstawowego i wybierz bazę danych, klikając Baza danych obrazu", aby zapisać film poklatkowy. Ustaw folder tymczasowy, klikając Tymczasowy folder obrazu"Następnie otwórz jednostkę inkubacyjną, podnieś pierścień obrazowania, dodaj kroplę olejku immersyjnego do obiektywu i zamknij jednostkę tak szybko, jak to możliwe. Ustaw ostrość i wybierz pozycję w komorze obrazowania.
W komorze z przepływem laminarnym rozcieńczyć wolny lek lub nanocząstki w stężeniu pięciu mikrogramów na mililitr leku lub 0,05 mikromola lipidów w pożywce do hodowli komórkowych. Przefiltruj przez filtr strzykawkowy o wielkości 0,22 mikrona, jeśli lek lub nanocząsteczki nie są sterylne. Otwórz komorę inkubacyjną i podnieś pokrywę sufitową.
Następnie usuń pożywkę z komórek, dodaj jeden mililitr rozcieńczonego leku lub nanocząstek i zamknij urządzenie tak szybko, jak to możliwe. Skoncentruj się na komórkach i wykonaj szybkie skanowanie, klikając Pojedynczy"na karcie Kontrola skanowania. Gdy obraz w jasnym polu pokazuje skoncentrowane komórki, rozpocznij film poklatkowy, klikając przycisk Czas rozpoczęcia"w makrze Multi TimeX.
Liczba powtórzeń i pozostały czas są pokazane w makro i na obrazach. Sprawdzaj regularnie, czy komórki są nadal ostre, lub użyj autofokusa. Program automatycznie zapisuje film poklatkowy w bazie danych.
Nie zamykaj bazy danych, gdy program jest uruchomiony. Jest to trzygodzinny upływ czasu komórek wystawionych na działanie wolnej doksorubicyny. Obserwuj wychwyt i natychmiastową translokację doksorubicyny we fluorescencji czerwonej do jądra.
Tutaj komórki inkubuje się przez trzy godziny z kapsułkowaną doksorubicyną. Sygnał fluorescencyjny jest znacznie niższy i znajduje się w cytoplazmie. Sygnał jest ledwo widoczny w jądrze.
Przenosząc te filmy poklatkowe na obraz J, można narysować obszar zainteresowania wokół jądra i zmierzyć gęstość pikseli. Przedstawiony tutaj wykres pokazuje różnicę w wychwytywaniu jądrowym w czasie w komórkach inkubowanych z wolną lub kapsułkowaną doksorubicyną. Pokazane tutaj są komórki inkubowane z kapsułkowaną doksorubicyną, pokazaną na czerwono.
Fioletowy sygnał reprezentuje nośnika, a lizosomy są barwione zielonym markerem Live Cell. Porównanie obu typów komórek pokazuje różnicę w rozmieszczeniu lizosomalnym. Lizosomy w komórkach B16BL6 są rozmieszczone w cytoplazmie.
Natomiast lizosomy w komórkach BLM znajdują się blisko jądra. Jednak obie linie komórkowe wykazują wysoką kolokalizację czerwonego i fioletowego sygnału w lizosomach, co wskazuje, że doksorubicyna i jej nośnik są uwięzione w tych organellach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obrazować wychwyt środków chemioterapeutycznych i innych markerów fluorescencyjnych w żywych komórkach przez kilka godzin, a nawet dni.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia technikę obrazowania żywych komórek służącą do wizualizacji w czasie rzeczywistym poboru i dystrybucji środków chemioterapeutycznych. Dzięki uniknięciu artefaktów utrwalania metoda ta pozwala na dokładną obserwację procesów dostarczania leków w żywych komórkach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Neuronauka
- Badania nad rakiem
Wprowadzenie
- Obrazowanie żywych komórek dostarcza dynamicznych informacji na temat procesów komórkowych.
- Obrazowanie utrwalonych komórek może prowadzić do błędnej interpretacji mechanizmów dostarczania leków.
- Nanocząsteczki mogą ulegać degradacji podczas utrwalania, co komplikuje analizę.
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym jest niezbędne do zrozumienia interakcji leków w terapii nowotworów.
Cel badania
- Opracowanie metody śledzenia poboru leków chemioterapeutycznych w żywych komórkach.
- Ocena rozkładu nanocząsteczek bez artefaktów związanych z fiksacją.
- Pogłębienie zrozumienia mechanizmów dostarczania leków do komórek nowotworowych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie komory obrazowania do obserwacji żywych komórek.
- Hodowla komórek w kontrolowanych warunkach (temperatura, CO2, wilgotność).
- Wykorzystanie mikroskopii konfokalnej do monitorowania procesów komórkowych.
- Obrazowanie time-lapse w celu zarejestrowania dynamicznych zmian w czasie.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja pobierania i dystrybucji leku w czasie rzeczywistym.
- Wykazanie zalet obrazowania żywych komórek w porównaniu do metod z wykorzystaniem komórek utrwalonych.
- Uzyskanie wiedzy na temat zachowania nanocząsteczek w żywych komórkach.
- Umożliwienie obserwacji odpowiedzi komórkowych na ekspozycję na lek.
Wnioski
- Obrazowanie żywych komórek jest cennym narzędziem do badania mechanizmów dostarczania leków.
- Metoda ta zmniejsza ryzyko błędnej interpretacji związanej z utrwalaniem próbek.
- Przyszłe zastosowania mogą usprawnić strategie leczenia nowotworów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie żywych komórek umożliwia śledzenie w czasie rzeczywistym pobierania nanocząsteczek chemoterapeutycznych oraz ich transportu wewnątrzkomórkowego, co wypełnia krytyczną lukę w rozwoju leków onkologicznych, w której artefakty utrwalania maskują dynamiczne zdarzenia uwalniania leku oraz translokację jądrową. Podejście to wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez dostarczenie ilościowych, rozdzielczych w czasie danych na temat kinetyki uwalniania leku i lokalizacji subkomórkowej, co bezpośrednio wpływa na optymalizację wiodących związków i wybór kandydatów do badań przedklinicznych. Dzięki wizualizacji losów nanonośników opartych na lipidach w żywych komórkach nowotworowych, metoda ta zwiększa pewność prognostyczną na wczesnym etapie odkrywania, zmniejszając odsetek niepowodzeń w późnych fazach z powodu błędnego zrozumienia mechanizmów działania.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia bezpośrednią obserwację uwalniania leku chemioterapeutycznego z nanonośników oraz następującą po nim translokację do jądra komórkowego, co wyjaśnia mechanistyczny związek między dostarczaniem leku a jego aktywnością biologiczną.
- Wartość operacyjna: Eliminuje artefakty wywołane fiksacją, które zniekształcają integralność nanocząstek i dystrybucję leku, zapewniając dokładną interpretację profili pobierania i uwalniania.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych pomiarów intensywności fluorescencji w czasie, co umożliwia porównanie kinetyki leku wolnego i enkapsulowanego w kontekście fizjologicznie istotnym.
- Wartość operacyjna: Tworzy zestandaryzowaną, powtarzalną platformę do oceny systemów dostarczania leków opartych na nanocząsteczkach w warunkach żywych komórek, co wspiera skalowalność analizy i ponowne wykorzystanie w innych projektach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Powiązuje degradację nanonośnika i uwalnianie leku z kolokalizacją lizosomalną oraz akumulacją jądrową, dostarczając translacyjnego biomarkera dostępności leku wewnątrzkomórkowego.
- Wartość operacyjna: Ułatwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez wizualizację, czy enkapsulowane leki osiągają wystarczającą dostawę do jądra komórkowego, aby wywołać oczekiwane efekty farmakologiczne, co redukuje niepewność mechanistyczną w modelach przedklinicznych.
Integracja rurociągów i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania leków, od wczesnej walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, w którym wizualizacja uwalniania leku i rozkładu wewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym dostarcza informacji o zależnościach struktura-aktywność oraz optymalizacji projektu nanonośnika przed badaniami nad skutecznością przedkliniczną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących stabilności nanonośników, kinetyki uwalniania leku oraz szlaków transportu wewnątrzkomórkowego, umożliwiając bezpośrednią obserwację translokacji doksorubicyny z cytoplazmy do jądra komórkowego.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy, ilościowe odczyty poboru leku i akumulacji jądrowej w czasie, co pozwala na bezpośrednie porównanie zmiennych formulacji w identycznych warunkach żywych komórek.
- Analityka: Zapewnia dane z obrazowania sekwencyjnego (time-lapse) dotyczące intensywności fluorescencji z określonych obszarów zainteresowania (np. jądra, lizosomów), umożliwiając statystyczne porównanie wydajności dostarczania leku pomiędzy wolnymi środkami a tymi enkapsulowanymi w nanocząsteczkach.
- Badania translacyjne: Łączy zachowanie nanonośników w żywych komórkach z późniejszymi efektami farmakologicznymi poprzez korelację wzorców transportu lizosomalnego z dostępnością leku w jądrze, wspierając decyzje o rozwoju oparte na biomarkerach.
- Zastosowania korporacyjne: Stanowi modularną możliwość obrazowania, którą można zastosować w wielu platformach nanocząsteczek i środków chemioterapeutycznych, co redukuje redundantny rozwój metod i umożliwia mechanistyczne przesiewanie w całym portfolio produktów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie mechanizmu działania leku poprzez obrazowanie w czasie rzeczywistym uwalniania leku i translokacji jądrowej, co zmniejsza niejednoznaczność w ocenie wiązania z celem i aktywacji szlaków sygnałowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji przygotowania komory, kontroli środowiskowej i parametrów obrazowania, minimalizując zmienność w podłużnych badaniach żywych komórek.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez wczesną identyfikację niefunkcjonalnych nanonośników, zapobiegając inwestycjom w systemy dostarczania, które nie uwalniają aktywnego leku w miejscu działania.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów na nanonośniki z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o wykazane wewnątrzkomórkowe uwalnianie leku i dostarczanie do jądra, co pozwala na dostosowanie postępów prac do poprawności mechanistycznej.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy z zakresu obrazowania żywych komórek, mikroskopii konfokalnej oraz akwizycji time-lapse w celu utrzymania żywotności komórek i integralności sygnału przez dłuższy czas.
- Zależne od specjalistycznego instrumentarium, w tym jednostek inkubacyjnych z kontrolą temperatury i poziomu CO2, laserów konfokalnych oraz czułych detektorów do śledzenia nanocząsteczek o niskim sygnale.
- Wymaga standaryzacji przygotowania komórek, dawkowania leków i protokołów obrazowania pomiędzy zespołami w celu zapewnienia porównywalności wyników w różnych badaniach i ośrodkach.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji dla różnych linii komórkowych, rozmiarów nanocząsteczek i znaczników fluorescencyjnych, ponieważ stosunek sygnału do szumu oraz progi fototoksyczności różnią się w zależności od warunków eksperymentalnych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują ryzyko fotoblaknięcia podczas długotrwałego obrazowania oraz konieczność dokładnej optymalizacji mocy lasera i prędkości skanowania, aby zrównoważyć jakość sygnału ze stanem zdrowia komórek.
