Analiza morfologii dendrytycznej w kolumnach i warstwach
23 marca 2017
Tutaj pokazujemy, jak analizować dendrytyczne kierowanie neuronów rdzenia Drosophila w kolumnach i warstwach. Przepływ pracy obejmuje technikę obrazowania w podwójnym widoku w celu poprawy jakości obrazu oraz narzędzia obliczeniowe do śledzenia, rejestrowania trzpieni dendrytycznych do układu kolumn referencyjnych oraz do analizy struktur dendrytycznych w przestrzeni 3D.
Ogólnym celem tego protokołu jest analiza trasowania dendrycznego dorosłych neuronów rdzenia Drosophila w kolumnach i warstwach w celu scharakteryzowania wzorów dendrycznych, określenia typów komórek na podstawie morfologii i identyfikacji mutantów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, w tym mapowanie obwodów mózgowych i zrozumienie mechanizmu okablowania dendrytu. Główną zaletą tej techniki jest to, że przekazuje ona właściwości dendrytyczne w przestrzeni trójwymiarowej, poprawiając w ten sposób zrozumienie logiki i funkcji okablowania dendrytycznego.
Celem tej procedury jest uzyskanie dwóch stosów obrazów interesujących neuronów w dwóch orientacjach ortogonalnej, poziomej i czołowej. Korzystając ze standardowych technik, wybarwiono mózgi much króliczym anty-GFP i przeciwciałem, które znakuje aksony fotoreceptorów jako przeciwciała pierwotne. Następnie oznacz przeciwciała pierwszorzędowe fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi i oczyść mózg w 70% glicerolu i 1X PBS.
Aby zamontować mózg w orientacji poziomej, przenieś mózg oczyszczony z glicerolu do 20-mikrolitrowej kropli środka mocującego zapobiegającego blaknięciu osadzonej centralnie na szkiełku mikroskopowym. Następnie na szkiełku nakrywkowym przymocuj małe plamy gliny w czterech rogach, aby szkiełko nakrywkowe nie zmiażdżyło mózgu. Teraz pod mikroskopem preparacyjnym ustaw mózgi w pozycji brzusznej do góry.
Użyj wypukłej grzbietowej powierzchni mózgu jako punktu orientacyjnego, aby określić orientację próbki mózgu. Zapewni to horyzontalny widok neuronu. Następnie przymocuj szkiełko nakrywkowe.
Za pomocą mikroskopu konfokalnego, najlepiej wyposażonego w detektory GaAsP, uzyskaj stos obrazów w widoku poziomym z obiektywem o dużej aperturze numerycznej i zoomem cyfrowym 2,5. Zdobądź co najmniej 180 sekcji optycznych, mieć 512 pikseli kwadratowych i rozmiar kroku 2 mikrony. Po zrobieniu pierwszego stosu obrazów zdejmij szkiełko nakrywkowe ze szkiełka i ustaw mózg w pozycji przedniej do góry, która zapewnia widok z przodu.
Następnie, korzystając z tej samej techniki, utwórz nowy stos obrazów przedstawiający widok z przodu tych samych neuronów zobrazowanych w widoku poziomym. Pamiętaj również, aby zapisać lokalizację neuronu będącego przedmiotem zainteresowania w stosunku do rdzenia nerwowego. Identyfikacja tych samych neuronów jest możliwa przy mniejszym powiększeniu.
Jeśli jednak sygnał zostanie utracony, ponieważ tkanka jest głęboka, po prostu wyobraź sobie brzuszną połowę mózgu. Sprawdź również, czy próbka poruszyła się podczas pozyskiwania obrazów, badając stosy obrazów. Konwolucja obrazu i łączenie obrazów są szczegółowo opisane w protokole tekstowym.
Celem tej procedury jest prześledzenie neurytów i przypisanie punktów odniesienia do rejestracji. Najpierw otwórz ponownie połączony plik obrazu. Następnie przejdź do edycji.
Następnie pokaż regulację wyświetlacza i wyłącz kanał fotoreceptora, który jest czerwony. Następnie zwizualizuj obraz w trybie przewyższania. Jeśli komputer jest wyposażony w system stereograficzny, włącz stereo i użyj trybu poczwórnego bufora do wizualizacji obrazów 3D.
Dodaj nowe filamenty, przejdź do przewyższenia, następnie filamentów i kliknij zakładkę oznaczoną pomiń automatyczne tworzenie, edytuj ręcznie. Następnie kliknij kartę rysowania i wybierz opcję AutoDepth. Następnie wybierz ustawienia.
Przełącz opcję linii i wprowadź odpowiedni numer piksela, aby uzyskać lepszą wizualizację. Następnie przełącz pokaż dendryty, punkt początkowy i punkt rozgałęzienia i ustaw jakość renderowania na 100%Teraz wybierz kartę rysowania i rozpocznij śledzenie neurytów. Zacznij od aksonu, a następnie przejdź do dendrytów.
Aksony i dendryty neuronów rdzenia trans powinny być łatwe do rozróżnienia. Po prześledzeniu neurytów wróć do ustawień i przełącz zarówno punkt początkowy, jak i punkt rozgałęzienia. Następnie przejdź do przekroczenia, a następnie eksportuj.
Wybierz obiekt i zapisz filament jako plik programu Inventor. Kolejnym krokiem jest przypisanie punktów odniesienia. Aby rozpocząć, wybierz opcję pokaż regulację wyświetlacza i włącz oba kanały obrazowania.
Następnie przejdź do przekroczenia, a następnie pomiaru. A na karcie edycji przełącz określony kanał i wybierz kanał fotoreceptora w tym przypadku. Teraz przypisz punkty odniesienia dla górnej warstwy.
Wybierz przekroczenie, a następnie zmierz punkty i zaznacz początek warstwy m1 jako warstwę wierzchnią. Użyj funkcji płaszczyzny tnącej, aby ułatwić przypisywanie punktów. Kolejność punktów jest równikowa, przednia równikowa, przednia, przednia brzuszna, brzuszna, tylna brzuszna, tylna, tylna równikowa i środkowa.
Aby znaleźć centralny fotoreceptor, jest to ten związany z największą liczbą procesów dendrytycznych. Następnie przypisz punkty odniesienia dla warstw R8 i R7 przy użyciu tej samej techniki. Po zdefiniowaniu każdego zestawu punktów odniesienia należy wyeksportować współrzędne.
Wybierz statystyki, a następnie szczegółowe, określone wartości i pozycję. Następnie wybierz opcję eksportuj statystyki na karcie do pliku i zapisz współrzędne jako plik CSV. Następnie otwórz trzy pliki CSV w edytorze arkuszy kalkulacyjnych.
Skopiuj i wklej współrzędne 27 punktów odniesienia do nowego pliku, postępując zgodnie z kolejnością góra, R8, a następnie R7. Postępuj zgodnie z protokołem tekstowym dla standaryzacji nieliniowej rejestracji ciała sztywnego i TPS do konfiguracji prawej brzusznej w obliczeniach dendrytycznych częstotliwości rozgałęzień i zakończeń. Ostatecznie dane są wykorzystywane do tworzenia różnych wykresów informacyjnych. Korzystając z przedstawionej tutaj procedury obrazowania w podwójnym widoku, mózg muchy zawierający słabo znakowane neurony tm 20 został zobrazowany w dwóch ortogonalnych kierunkach.
Rekombinacja obrazu poprawia rozdzielczość osiową. Ponownie połączony obraz ma lepszą rozdzielczość niż obrazy w widoku poziomym i widoku frontalnym. Po zapoznaniu się z modelami 3D pobrano ślady dendrytyczne z 15 neuronów tm 20 i porównano je ze śladami dendrytycznymi z 15 neuronów tm 2.
Przeanalizowano prawdopodobieństwo rozgałęzienia i zakończenia tych neuronów. Oba typy były podobne dla segmentów mniejszych niż 4 mikrony. Specyficzna dla warstwy analiza terminacji dendrytycznej wykazała, że te dwa typy neuronów rozprowadzają się w różny sposób specyficzny dla warstwy.
Dendryty Tm 2 otrzymują dane wejściowe w m2 i m5. Podczas gdy dendryty tm 20 kończą się w warstwie m1 do m3. Analiza planarna pokazuje, że dendryty tm 2 wystają do przodu, podczas gdy dendryty tm 20 wystają do tyłu.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać dwa obrazy konfokalne. Przeczytaj swoje znaki badawcze w plikach obrazowania i wyodrębnij właściwości dendrytyczne z tych obrazów. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby odpowiednio oznaczyć próbkę przed obrazowaniem konfokalnym
.Ponieważ kombinacja obrazowania zakończy się niepowodzeniem, jeśli próbka poruszy się podczas obrazowania.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę analizy przebiegu dendrytów neuronów ciała grudkowatego (medulla) dorosłych much Drosophila w kolumnach i warstwach. Wykorzystuje on techniki obrazowania dwuwidokowego oraz narzędzia obliczeniowe w celu poprawy jakości obrazu i analizy struktur dendrytycznych w przestrzeni 3D.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Neuroanatomia
- Techniki obrazowania
Wprowadzenie
- Kierowanie dendrytyczne ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia obwodów mózgowych.
- Charakterystyka wzorców dendrytycznych pomaga w określaniu typów komórek.
- Identyfikacja mutantów może dostarczyć wiedzy na temat funkcji neuronów.
- Analiza 3D poprawia zrozumienie logiki połączeń dendrytycznych.
Cel badania
- W celu analizy przebiegu dendrytów w neuronach meduli Drosophila.
- W celu charakterystyki wzorców dendrytycznych i określenia typów komórek.
- W celu zidentyfikowania mutantów wpływających na morfologię dendrytów.
Zastosowane metody
- Należy pozyskać dwa stosy obrazów neuronów w orientacjach ortogonalnych.
- Wypreparowane mózgi much należy barwić swoistymi przeciwciałami.
- Przeciwciała pierwotne należy znakować fluorescencyjnymi przeciwciałami wtórnymi.
- Mózg należy przejrzeć przy użyciu glicerolu i PBS w celu przeprowadzenia obrazowania.
Główne wyniki
- Udoskonalone techniki obrazowania usprawniają analizę struktury dendrytów.
- Mapowanie 3D ujawnia złożone połączenia dendrytów.
- Osiągnięto charakterystykę typów komórek na podstawie morfologii.
- Identyfikacja mutantów dostarcza wiedzy na temat rozwoju neuronów.
Wnioski
- Metoda ta znacząco poszerza wiedzę na temat prowadzenia dendrytów.
- Ułatwia ona mapowanie obwodów mózgowych u Drosophila.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę technikę w szerszych zastosowaniach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia wysokorozdzielczą analizę 3D architektury dendrytycznej w określonych obwodach neuronalnych, wspierając walidację celów w neurofarmakologii poprzez powiązanie fenotypów strukturalnych z perturbacjami genetycznymi. Poprzez kwantyfikację specyficznych dla warstw zakończeń oraz projekcji planarnej drzew dendrytycznych, metoda ta pozwala na mechanistyczne ograniczanie ryzyka w procesie odkrywania leków na OUN dzięki zwiększeniu wiarygodności predykcyjnej modeli obwodów neuronalnych. Przepływ pracy ułatwia identyfikację defektów specyficznych dla danego typu komórek, pomagając w dostrojeniu translacyjnych biomarkerów oraz udoskonaleniu modeli przedklinicznych w wskazaniach neuropsychiatrycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez korelację morfologii dendrytów z manipulacjami genetycznymi lub farmakologicznymi w określonych podtypach neuronów.
- Wartość operacyjna: Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez ilościową ocenę rozgałęzień dendrytycznych i częstotliwości zakończeń jako funkcjonalnych odczytów.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do wyznaczonego celu poprzez ustanowienie zależności struktura-funkcja w obwodach neuronów rdzenia przedłużonego istotnych dla konserwatywnych szlaków rozwoju neurologicznego.
Przesiewy i opracowanie testów
- Gotowość do analizy: Generuje standaryzowane, powtarzalne trójwymiarowe rekonstrukcje dendrytów zarejestrowane względem referencyjnej struktury kolumnowej w celu zapewnienia spójnej oceny morfologicznej.
- Wyniki ilościowe: Dostarcza częstotliwości zakończeń specyficzne dla poszczególnych warstw oraz parametry projekcji płaskiej, co umożliwia wysokoprzepustową analizę rozmieszczenia dendrytów.
- Użyteczność platformy: Wykorzystuje otwartoźródłowe narzędzia MIPAV oraz MATLAB, wspierając skalowalność i powtarzalność między laboratoriami w kampaniach przesiewowych skoncentrowanych na neuroanatomii.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Mapuje defekty dendrytów do konkretnych warstw (np. m1–m3 dla tm20 vs m2/m5 dla tm2), co umożliwia korelację z translacyjnymi biomarkerami dysfunkcji obwodów.
- Ciągłość przedkliniczna: Zapewnia istotny w kontekście choroby system do oceny mutantów genetycznych wpływających na połączenia neuronalne, wspierając decyzje o dalszych etapach badań w oparciu o analizę ryzyka.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnia defekty logiki połączeń w modelach neurorozwojowych, zmniejszając niejednoznaczność w badaniach nad oddziaływaniem na cel terapeutyczny.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków poprzez konwersję danych obrazowych na mierzalne cechy dendrytów, co wspiera etapy identyfikacji związków wiodących oraz walidacji przedklinicznej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez 3D dendritic tracing i analizę specyficzną dla warstw w celu wyjaśnienia tożsamości neuronów i logiki obwodów.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzację testów dzięki rejestracji opartej na referencjach oraz zautomatyzowanemu śledzeniu drzew dendrytycznych w różnych tłach genetycznych.
- Analityka: Pozwala na wyznaczenie częstotliwości rozgałęzień i zakończeń jako ilościowych odczytów do porównywania warunków w analizach mutantów w stosunku do typu dzikiego.
- Badania translacyjne: Łączy preferencje warstw dendrytycznych z domniemanymi homologami w korze kręgowców, wspierając ciągłość translacyjną między gatunkami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielokrotnie wykorzystywalny rurociąg obrazowania i analizy do systematycznego fenotypowania mutantów neuronalnych w programach badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w fenotypowaniu neuronów, dostarczając danych o architekturze dendrytów z rozdzielczością przestrzenną.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki rekombinacji obrazów z dwóch widoków oraz ustandaryzowanemu przypisywaniu punktów referencyjnych w obrębie warstw.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez umożliwienie obiektywnej stratyfikacji podtypów neuronów w oparciu o morfologię.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o wierność strukturalną modeli dendrytycznych w systemach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii konfokalnej, rejestracji obrazów 3D oraz analizy morfologii neuronów.
- Zależność od obiektywów o wysokiej aperturze numerycznej (high-NA), detektorów GaAsP oraz platform obliczeniowych obsługujących MIPAV i śledzenie oparte na MATLAB.
- Konieczność standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia spójnych protokołów barwienia, klarowania i obrazowania w różnych laboratoriach.
- Adaptacja do innych systemów modelowych może wymagać modyfikacji ram referencyjnych i definicji warstw.
- Ograniczenia praktyczne obejmują utratę sygnału w głębokich tkankach oraz wrażliwość na przemieszczanie się próbki podczas akwizycji z podwójnym widokiem (dual-view).
