Name: Analiza morfologii dendrytycznej w kolumnach i warstwach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Poznaj metodę analizy morfologii dendrytycznej neuronów siatkówki Drosophila w przestrzeni 3D przy użyciu obrazowania dwukierunkowego. Technika ta umożliwia szczegółowe mapowanie struktur dendrytów i identyfikację typów komórek nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Intramural Research Program of the National Institutes of Health, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (grant HD008913 dla C.-H.L.) oraz Center for Information Technology (P.G.M., N.P., E.S.M. i M.M.).

<ol><li>Kaas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+maps+are+fundamental+to+sensory+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Topographic maps are fundamental to sensory processing.</a> Brain Res Bull. 44 (2), 107-112 (1997).</li>
<li>Sanes, J. R., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+principles+of+insect+and+vertebrate+visual+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Design principles of insect and vertebrate visual systems.</a> Neuron. 66 (1), 15-36 (2010).</li>
<li>Huberman, A. D., Clandinin, T. R., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+mechanisms+of+lamina-specific+axon+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular mechanisms of lamina-specific axon targeting.</a> CSH Perspect Biol. 2 (3), a001743(2010).</li>
<li>Clandinin, T. R., Feldheim, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+a+visual+map%3A+mechanisms+and+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Making a visual map: mechanisms and molecules.</a> Curr Opin Neurobiol. 19 (2), 174-180 (2009).</li>
<li>Luo, J., McQueen, P. G., Shi, B., Lee, C. H., Ting, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiring+dendrites+in+layers+and+columns%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Wiring dendrites in layers and columns.</a> J Neurogenet. 30 (2), 69-79 (2016).</li>
<li>Meinertzhagen, I. A., Hanson, T. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeinertzhagen%2C+IA+%22The+development+of+the+optic+lobe.+In+The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The development of the optic lobe. In The Development of Drosophila melanogaster</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. 1363-1491 (1993).</li>
<li>Takemura, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+visual+motion+detection+circuit+suggested+by+Drosophila+connectomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A visual motion detection circuit suggested by Drosophila connectomics.</a> Nature. 500 (7461), 175-181 (2013).</li>
<li>Takemura, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+circuits+and+their+variations+within+different+columns+in+the+visual+system+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Synaptic circuits and their variations within different columns in the visual system of Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (44), 13711-13716 (2015).</li>
<li>Gao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+substrate+of+spectral+preference+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The neural substrate of spectral preference in Drosophila.</a> Neuron. 60 (2), 328-342 (2008).</li>
<li>Karuppudurai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hard-wired+glutamatergic+circuit+pools+and+relays+UV+signals+to+mediate+spectral+preference+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A hard-wired glutamatergic circuit pools and relays UV signals to mediate spectral preference in Drosophila.</a> Neuron. 81 (3), 603-615 (2014).</li>
<li>Strother, J. A., Nern, A., Reiser, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+ON+and+OFF+pathways+in+the+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct observation of ON and OFF pathways in the Drosophila visual system.</a> Curr Biol. 24 (9), 976-983 (2014).</li>
<li>Ting, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor-derived+activin+promotes+dendritic+termination+and+restricts+the+receptive+fields+of+first-order+interneurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor-derived activin promotes dendritic termination and restricts the receptive fields of first-order interneurons in Drosophila.</a> Neuron. 81 (4), 830-846 (2014).</li>
<li>Ting, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+R7+axons+in+the+Drosophila+visual+system+is+mediated+both+by+transduction+of+an+activin+signal+to+the+nucleus+and+by+mutual+repulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Tiling of R7 axons in the Drosophila visual system is mediated both by transduction of an activin signal to the nucleus and by mutual repulsion.</a> Neuron. 56 (5), 793-806 (2007).</li>
<li>Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V3D+enables+real-time+3D+visualization+and+quantitative+analysis+of+large-scale+biological+image+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets.</a> Nat Biotechnol. 28 (4), 348-353 (2010).</li>
<li>Takemura, S. Y., Lu, Z., Meinertzhagen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+circuits+of+the+Drosophila+optic+lobe%3A+the+input+terminals+to+the+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synaptic circuits of the Drosophila optic lobe: the input terminals to the medulla.</a> J Comp Neurol. 509 (5), 493-513 (2008).</li>
<li>Takemura, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+circuits+integrate+neighboring+visual+signals+in+a+Drosophila+motion+detection+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cholinergic circuits integrate neighboring visual signals in a Drosophila motion detection pathway.</a> Curr Biol. 21 (24), 2077-2084 (2011).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+isotropic+four-dimensional+imaging+with+dual-view+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Spatially isotropic four-dimensional imaging with dual-view plane illumination microscopy.</a> Nat Biotechnol. 31 (11), 1032-1038 (2013).</li>
<li>Popko, J., Fernandes, A., Brites, D., Lanier, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+NeuronJ+tracing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of NeuronJ tracing data.</a> Cytometry A. 75 (4), 371-376 (2009).</li>
<li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).</li>
<li>Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuriteTracer%3A+a+novel+ImageJ+plugin+for+automated+quantification+of+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth.</a> J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).</li>
<li>Scorcioni, R., Polavaram, S., Ascoli, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-Measure%3A+a+web-accessible+tool+for+the+analysis%2C+comparison+and+search+of+digital+reconstructions+of+neuronal+morphologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">L-Measure: a web-accessible tool for the analysis, comparison and search of digital reconstructions of neuronal morphologies.</a> Nat Protoc. 3 (5), 866-876 (2008).</li>
<li>Kaplan, E. L., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonparametric+Estimation+from+Incomplete+Observations%5BTitle%5D)+AND+%22JASA%22%5BJournal%5D)">Nonparametric Estimation from Incomplete Observations.</a> JASA. 53, 457-481 (1958).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj pokazujemy, jak obrazować i analizować dendrytyczne altany neuronów rdzenia Drosophila . Pierwsza sekcja, obrazowanie w dwóch widokach, opisuje dekonwolucję i łączenie dwóch stosów obrazów w stos obrazów o wysokiej rozdzielczości. Druga sekcja, śledzenie i rejestracja dendrytów, opisuje śledzenie i rejestrację dendrytów neuronów rdzenia do układu kolumn referencyjnych. Trzecia sekcja, analiza dendrytyczna, opisuje użycie niestandardowych skryptów do analizowania wzorców dendrytycznych. Razem protokoły te z...

Podczas rozwoju, neurony tworzą dendryty w złożone, ale stereotypowe rozgałęzione wzory, tworząc synapsy ze swoimi presynaptycznymi partnerami. Wzorce rozgałęzień dendrytycznych korelują z tożsamością i funkcjami neuronów. Lokalizacje altan dendrytycznych określają rodzaj otrzymywanych przez nie presynaptycznych danych wejściowych, podczas gdy złożoność rozgałęzień dendrytycznych i rozmiary pól regulują liczbę wejść. Tak więc dendrytyczne właściwości morfologiczne są krytycznymi determinantami łączności synaptycznej i obliczeń neuronalnych. W wielu obszarach złożonych mózgów, takich jak płaty wzrokowe muchy i siatkówka kręgowców, obwody synaptyczne są zorganizowane w kolumny i warstwy, aby ułatwić przetwarzanie informacji1,2. W takiej organizacji kolumn i warstw neurony presynaptyczne o odrębnej modalności projektują aksony, aby kończyły się na określonej warstwie (tzw. celowanie specyficzne dla warstwy) i tworzyły uporządkowaną dwuwymiarową tablicę (tak zwana mapa topograficzna), podczas gdy neurony postsynaptyczne wydłużają dendryty o odpowiednich rozmiarach w określonych warstwach, aby odbierać presynaptyczne dane wejściowe o odpowiednich typach i liczbach. Podczas gdy celowanie aksonalne do warstw i kolumn zostało dobrze zbadane3,4, znacznie mniej wiadomo o tym, w jaki sposób dendryty są kierowane do określonych warstw i rozszerzają pola recepcyjne o odpowiedniej wielkości, aby utworzyć połączenia synaptyczne z właściwymi partnerami presynaptycznymi5. Trudność w obrazowaniu i ilościowym określeniu ukierunkowania dendrytycznego na warstwy i kolumny utrudniła badania nad rozwojem dendrytycznych w kolumnowych i laminowanych strukturach mózgu.
Neurony rdzenia Drosophila są idealnym modelem do badania dendrytycznego routingu i składania obwodów w kolumnach i warstwach. Rdzeń muchy neuropil jest zorganizowany jako siatka 3D składająca się z 10 warstw i około 750 kolumn. Każda kolumna jest unerwiona przez zestaw aferentów, w tym fotoreceptory R7/R8 i neurony blaszki L1 - L5, których zakończenia aksonalne tworzą mapy topograficzne w sposób specyficzny dla warstwy6. Około 38 typów neuronów rdzenia jest obecnych w każdej kolumnie rdzenia i wyszukanych dendrytów w określonych warstwach i o odpowiednich rozmiarach pól, aby otrzymywać dane wejściowe od tych aferentów7. Obwody synaptyczne w rdzeniu zostały zrekonstruowane na poziomie mikroskopii elektronowej; W ten sposób partnerstwa synaptyczne są dobrze ugruntowane7,8. Ponadto dostępne są narzędzia genetyczne do oznaczania różnych typów neuronów rdzenia9,10,11. Badając trzy typy neuronów transmerdzenia (Tm) (Tm2, Tm9 i Tm20), wcześniej zidentyfikowaliśmy dwa specyficzne dla typu komórki atrybuty dendrytyczne: (i) neurony Tm rzutują dendryty w kierunku przednim lub tylnym (kierunek projekcji płaskiej), w zależności od typów komórek oraz (ii) dendryty neuronów rdzenia kończą się w określonych warstwach rdzenia w sposób specyficzny dla typu komórki (zakończenie specyficzne dla warstwy)<klasa sup = "xref">12. Kierunek projekcji planarnej i zakończenie specyficzne dla warstwy są wystarczające do rozróżnienia tych trzech typów neuronów Tm, podczas gdy mutacje, które zakłócają odpowiedzi Tm na sygnały warstwowe i kolumnowe, wpływają na różne aspekty tych atrybutów.
Tutaj prezentujemy kompletny proces badania dendrytycznych wzorów neuronów rdzenia Drosophila w kolumnach i warstwach (Rysunek 1). Po pierwsze, pokazujemy metodę obrazowania w podwójnym widoku, która wykorzystuje niestandardowe oprogramowanie do łączenia dwóch stosów obrazów konfokalnych w celu wygenerowania wysokiej jakości obrazów izotropowych. Metoda ta wymaga jedynie konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej w celu wygenerowania wysokiej jakości obrazów, które pozwalają na wiarygodne śledzenie gałęzi dendrytycznych, bez uciekania się do mikroskopii o wysokiej rozdzielczości, takiej jak STED (Stimulated Emission Depletion) lub oświetlenia strukturalnego. Po drugie, przedstawiamy metodę śledzenia altan dendrytycznych i rejestrowania powstałych śladów neurytów w tablicy kolumn referencyjnych. Po trzecie, pokazujemy metody obliczeniowe do wydobywania informacji o kierunku projekcji płaskiej i terminacji dendrytów specyficznej dla warstwy, a także do uzyskiwania szacunków dla częstotliwości rozgałęzień dendrytycznych i terminacji. Łącznie metody te pozwalają na scharakteryzowanie wzorców dendrytycznych w 3D, klasyfikację typów komórek na podstawie morfologii dendrytycznych oraz identyfikację potencjalnych defektów mutantów.

<table><tbody><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Huygens Professional</td><td>Scientific Volume Imaging</td><td>wersja 16.05</td><td>do dekonwolucji obrazu (https://svi.nl).&nbsp; komercyjne oprogramowanie</td></tr><tr><td>MIPAV</td><td></td><td>w wersji 7.3.0</td><td>do rekombinacji i rejestracji obrazu (http://mipav.cit.nih.gov/); darmowa</td></tr><tr><td>wtyczka MIPAV: PlugInDrosophila RetinalRegistration.class</td><td></td><td></td><td>darmowa</td></tr><tr><td>wtyczka MIPAV: PlugInDrosophilaStandard ColumnRegistration.class</td><td></td><td></td><td>freeware</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td>do śledzenia neurytów i przypisywania punktów odniesienia do rejestracji obrazu (http://www.bitplane.com); komercyjne oprogramowanie</td></tr><tr><td>Vaa3D</td><td></td><td></td><td>do wizualizacji plików swc ( https://github.com/Vaa3D/release/releases/); freeware</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>R2014b</td><td>do analizy morfometrycznej dendrytów (http://www.mathworks.com); oprogramowanie komercyjne</td></tr><tr><td>Zestaw narzędzi Matlab: TREES1.14</td><td></td><td>v1.14</td><td>do analizy dendrytycznych parametrów morfometrycznych (http://www.treestoolbox.org/download.html); darmowy</td></tr><tr><td>zestaw narzędzi Matlab: Dendritic_Tree_Toolbox</td><td></td><td>v1.0</td><td>Do obliczania parametrów morfometrycznych (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware</td></tr><tr><td>Nazwa<</td><td>strong>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Sample files</td><td></td><td></td><td></td></tr>definicja <tr><td>pliku</td><td></td><td></td> SWC <td>http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html</td></tr><tr><td>Kody i przykładowe pliki do łączenia i rejestracji</td><td></td><td></td> obrazów <td>https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration</td></tr><tr><td>Przykład punktu odniesienia&nbsp;</td><td></td><td></td><td>https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate= 1471880596000&api=v2</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>System komputerowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS Windows Windows 7 x64 lub Macintosh OS X 10.7 lub nowszy</td><td></td><td></td><td>3GHz 64-bitowy czterordzeniowy procesor, 16G RAM (minimum)</td></tr><tr><td>Opcjonalnie: Quadro4000&nbsp; (lub wyższa) karta graficzna</td><td>Nvidia</td><td></td><td>do stereograficznej wizualizacji dendrytów.</td></tr><tr><td>Opcjonalnie: NVIDIA 3D vision2</td><td>Nvidia</td><td></td><td>http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html</td></tr><tr><td>Opcjonalnie: wyświetlacz LCD 120 Hz dla NVIDIA 3D vision2</td><td></td><td></td><td>http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Odczynniki do obrazowania</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24B10</td><td>przeciwciało Badania rozwojowe Hybridoma Bank</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>GFP Tag Przeciwciało</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>G10362</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-królik (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-mysz (H+L), Alexa Fluor 568</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A21124</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Średni montaż przeciwblakowy</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Montaż&nbsp; Glina&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>S04179</td><td></td></tr><tr><td>70% glicerolu w 1x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe, wysoka wydajność, D = 0,17&nbsp; mm</td><td>Zeiss</td><td>474030-9000-000</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza morfologii dendrytycznej w kolumnach i warstwach

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

W wielu obszarach ośrodkowego układu nerwowego, takich jak płaty wzrokowe muchy i kora kręgowców, obwody synaptyczne są zorganizowane w warstwy i kolumny, aby ułatwić okablowanie mózgu podczas rozwoju i przetwarzania informacji u rozwiniętych zwierząt. Neurony postsynaptyczne tworzą dendryty we specyficznych dla typu wzorcach w określonych warstwach do synapsy z odpowiednimi zakończeniami presynaptycznymi. Rdzeń muchy neuropil składa się z 10 warstw i około 750 kolumn; Każda kolumna jest unerwiona przez dendryty ponad 38 typów neuronów rdzenia, które pasują do zakończeń aksonalnych około 7 typów aferentów w sposób specyficzny dla typu. Ten raport szczegółowo opisuje procedury obrazowania i analizy dendrytów neuronów rdzenia. Przepływ pracy obejmuje trzy sekcje: (i) sekcja obrazowania w podwójnym widoku łączy dwa konfokalne stosy obrazów zebrane w orientacji ortogonalnej w obraz 3D dendrytów o wysokiej rozdzielczości; (ii) sekcja śledzenia i rejestracji dendrytów śledzi altany dendrytyczne w 3D i rejestruje ślady dendrytyczne w układzie kolumn referencyjnych; (iii) Sekcja Analiza dendrytyczna analizuje wzorce dendrytyczne w odniesieniu do kolumn i warstw, w tym zakończenia specyficzne dla warstwy i kierunek projekcji płaskiej trzpieni dendrytycznych, a także uzyskuje szacunki częstotliwości rozgałęzień dendrytycznych i zakończeń. Protokoły wykorzystują niestandardowe wtyczki zbudowane na platformie open source MIPAV (Medical Imaging Processing, Analysis, and Visualization) oraz niestandardowe zestawy narzędzi w języku laboratorium matrycowego. Razem protokoły te zapewniają kompletny przepływ pracy w celu analizy dendrytycznego routingu neuronów rdzenia Drosophila w warstwach i kolumnach, w celu identyfikacji typów komórek i określenia defektów mutantów.

Stosując przedstawioną tutaj procedurę obrazowania w dwóch widokach, obrazowano mózg muchy zawierający rzadko znakowane neurony Tm20 w dwóch ortogonalnych kierunkach. Przed obrazowaniem mózg zabarwiono odpowiednimi przeciwciałami pierwotnymi i wtórnymi w celu wizualizacji GFP związanej z błoną oraz aksonów fotoreceptorów. Do obrazowania mózg zamocowano najpierw w orientacji poziomej (Rysunek 2A, B). Znakowany GFP neuron Tm20 oraz otaczające go aksony fotoreceptorów obrazo...

Tutaj pokazujemy, jak analizować dendrytyczne kierowanie neuronów rdzenia Drosophila w kolumnach i warstwach. Przepływ pracy obejmuje technikę obrazowania w podwójnym widoku w celu poprawy jakości obrazu oraz narzędzia obliczeniowe do śledzenia, rejestrowania trzpieni dendrytycznych do układu kolumn referencyjnych oraz do analizy struktur dendrytycznych w przestrzeni 3D.

Analiza morfologii dendrytycznej w kolumnach i warstwach

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest analiza routingu dendrytów neuronów medullary adult drosophila w kolumnach i warstwach w celu scharakteryzowania wzorców dendrytycznych, określenia typów komórek na podstawie morfologii oraz identyfikacji mutantów. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neuronauki, w tym w mapowaniu obwodów mózgowych i zrozumieniu mechanizmów okablowania dendrytów. Główną zaletą tej techniki jest możliwość odwzorowania właściwości dendrytycznych w przestrzeni trójwymiarowej, co usprawnia zrozumienie logiki okablowania i funkcji dendrytów.Celem niniejszej procedury jest uzyskanie dwóch stosów obrazów interesujących neuronów w dwóch ortogonalnych orientacjach: poziomej i frontalnej. Stosując standardowe techniki, należy zabarwić wypreparowane mózgi much przeciwciałami króliczymi anty-GFP oraz przeciwciałem znakującym aksony fotoreceptorów jako przeciwciała pierwszorzędowe. Następnie należy znakować przeciwciała pierwszorzędowe fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi i przeprowadzić klarowanie mózgu w 70% glycerolu oraz 1X PBS.Aby zamocować mózg w orientacji poziomej, należy przenieść mózg przejrzystny w glicerolu do kropli 20 µL medium montażowego zapobiegającego blaknięciu (antifade), naniesionej centralnie na szkiełko przedmiotowe. Następnie na szkiełku nakrywkowym należy przymocować małe kawałki gliny w czterech rogach, aby zapobiec zmiażdżeniu mózgu przez szkiełko nakrywkowe. Teraz, korzystając z mikroskopu stereoskopowego, należy ustawić mózgi stroną brzuszna do góry.Wykorzystaj wypukłą powierzchnię grzbietową mózgu jako punkt orientacyjny, aby określić orientację próbki mózgu. Zapewni to poziomy widok neuronu. Następnie przymocuj szkiełko nakrywkowe.Używając mikroskopu konfokalnego, najlepiej wyposażonego w detektory GaAsP, należy uzyskać stos obrazów w rzucie poziomym, stosując obiektyw o wysokiej aperturze numerycznej oraz cyfrowe powiększenie 2,5. Należy zebrać co najmniej 180 przekrojów optycznych, przy rozdzielczości 512 pikseli kwadratowych i wielkości kroku 2 mikronów. Po wykonaniu pierwszego stosu obrazów należy zdjąć szkiełko nakrywkowe z preparatu i zmienić położenie mózgu na pozycję z przodem skierowanym do góry, co zapewni widok czołowy.Następnie, stosując tę samą technikę, wykonaj nowy stos obrazów w widoku czołowym tych samych neuronów, które obrazowano w widoku horyzontalnym. Należy również zapisać położenie badanego neuronu względem neuropilu rdzenia przedłużonego. Identyfikacja tych samych neuronów jest możliwa przy mniejszym powiększeniu.Jeśli jednak sygnał zostanie utracony z powodu dużej głębokości tkanki, należy obrazować jedynie brzuszną połowę mózgu. Należy również sprawdzić na podstawie stosów obrazów, czy próbka nie przesunęła się podczas akwizycji. Dekonwolucja oraz łączenie obrazów zostały szczegółowo opisane w protokole tekstowym.Celem niniejszej procedury jest śledzenie neurytów oraz wyznaczanie punktów referencyjnych do rejestracji. Najpierw otwórz plik z rekombinowanym obrazem. Następnie przejdź do edycji.Następnie wyświetl ustawienia obrazu i wyłącz kanał fotoreceptorów, który jest czerwony. Dalej zwizualizuj obraz w trybie surpass. Jeśli komputer jest wyposażony w system stereograficzny, włącz tryb stereo i użyj trybu quad buffer, aby wyświetlić obrazy 3D.Aby dodać nowe filamenty, przejdź do sekcji surpass, następnie do filamentów i kliknij kartę o nazwie skip automatic creation, edit manually. Następnie kliknij kartę draw i wybierz AutoDepth. W kolejnym kroku wybierz settings.Przełącz opcję linii i wprowadź odpowiednią liczbę pikseli, aby uzyskać lepszą wizualizację. Następnie przełącz opcje pokazuj dendryty, punkt początkowy oraz punkt rozgałęzienia i ustaw jakość renderowania na 100%. Teraz wybierz kartę rysuj i rozpocznij obrysowywanie neurytów. Zacznij od aksonu, a następnie przejdź do dendrytów.Aksony i dendryty neuronów rdzenia przechodniego powinny być łatwe do rozróżnienia. Po prześledzeniu neurytów należy wrócić do ustawień i odznaczyć zarówno punkt początkowy, jak i punkt rozgałęzienia. Następnie należy przejść do funkcji surpass, a potem do eksportu.Wybierz obiekt i zapisz filament jako plik inventor. Następnym krokiem jest wyznaczenie punktów referencyjnych. Aby rozpocząć, wybierz opcję dostosowania wyświetlania i włącz oba kanały obrazowania.Następnie przejdź do sekcji surpass, a potem do measurement. W karcie edit włącz opcję specific channel i wybierz kanał fotoreceptorów w tym przypadku. Teraz wyznacz punkty referencyjne dla górnej warstwy.Wybierz opcję surpass, następnie measurement points i zaznacz początek warstwy m1 jako warstwę wierzchnią. Użyj funkcji clipping plane, aby ułatwić przypisywanie punktów. Kolejność punktów to: równikowy, przednio-równikowy, przedni, przednio-brzuszny, brzuszny, tylno-brzuszny, tylny, tylno-równikowy oraz centralny.Aby zlokalizować centralny fotoreceptor, należy wybrać ten, z którym powiązanych jest najwięcej wypustek dendrytycznych. Następnie, stosując tę samą technikę, wyznacz punkty odniesienia dla warstw R8 i R7. Po zdefiniowaniu każdego zestawu punktów odniesienia należy wyeksportować współrzędne.Wybierz opcję statystyki, następnie wartości szczegółowe i konkretne oraz pozycję. Następnie w zakładce wyświetlania wybierz eksport statystyk do pliku i zapisz współrzędne jako plik CSV. W kolejnym kroku otwórz trzy pliki CSV w edytorze arkuszy kalkulacyjnych.Skopiuj i wklej współrzędne 27 punktów referencyjnych do nowego pliku, zachowując kolejność: góra, R8, a następnie R7. Postępuj zgodnie z protokołem tekstowym dotyczącym standaryzacji rejestracji ciała sztywnego i nieliniowej TPS do konfiguracji brzusznej prawej w celu obliczenia częstotliwości rozgałęzień i zakończeń dendrytycznych. Ostatecznie dane te są wykorzystywane do stworzenia różnych wykresów informacyjnych. Zastosowanie przedstawionej tutaj procedury obrazowania w podwójnym widoku pozwoliło na obrazowanie mózgu muchy zawierającego rzadko znakowane neurony tm 20 w dwóch kierunkach ortogonalnych.Rekombinacja obrazów poprawia rozdzielczość osiową. Obraz rekombinowany charakteryzuje się lepszą rozdzielczością niż obrazy z widoku poziomego i czołowego. Po analizie modeli 3D zebrano ślady dendrytów z 15 neuronów tm 20 i porównano je ze śladami dendrytów z 15 neuronów tm 2.Przeanalizowano prawdopodobieństwo rozgałęziania i kończenia się tych neuronów. Oba typy były podobne dla segmentów o długości mniejszej niż 4 µm. Analiza zakończeń dendrytów w odniesieniu do poszczególnych warstw wykazała, że oba typy neuronów rozmieszczaj się w odmienny, specyficzny dla danej warstwy sposób.Dendryty Tm 2 otrzymują sygnały wejściowe w m2 i m5. Z kolei dendryty Tm 20 kończą się w warstwie od m1 do m3. Analiza planarna wykazuje, że dendryty Tm 2 są skierowane przednio, natomiast dendryty Tm 20 są skierowane tylno.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak pozyskać dwa z obrazów konfokalnych. Odczytajcie Państwo znaczniki badania w plikach obrazowania i wyodrębnijcie właściwości dendrytów z tych obrazów. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby prawidłowo oznaczyć próbkę przed obrazowaniem konfokalnym.Ponieważ kombinacja obrazowania nie powiedzie się, jeśli próbka przesunie się podczas obrazowania.

analyzing-dendritic-morphology-in-columns-and-layers

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Liczne niedawne badania zidentyfikowały mutacje w białkach synaptycznych powiązanych z patologiami mózgu. Pierwotne hodowle neuronów korowych zapewniają dużą elastyczność w badaniu wpływu tych białek związanych z chorobami na morfologię i ruchliwość kolców dendrytycznych.

Analiza morfologii kolców dendrytycznych w hodowlanych neuronach OUN

Neurony sensoryczne o arboryzacji dendrytycznej w obwodowym układzie nerwowym larw Drosophila stanowią użyteczne modele do wyjaśniania zarówno ogólnych, jak i specyficznych dla danej klasy neuronów mechanizmów różnicowania neuronów. Przedstawiamy praktyczny przewodnik po generowaniu i analizie mozaik genetycznych neuronów o arboryzacji dendrytycznej.

Analiza morfologiczna dendrytów i aksonów obwodowych neuronów sensorycznych larw Drosophila z wykorzystaniem mozaik genetycznych

Przedstawiamy protokół umożliwiający obrazowanie i ilościową ocenę morfologii drzewa dendrytycznego pojedynczych komórek Purkinjego hodowanych w organotypowych kulturach skrawków móżdżku. Protokół ten ma na celu wspieranie badań nad mechanizmami rozwoju dendrytów komórek Purkinjego.

Analiza morfologii dendrytów komórek Purkinjego w organotypowych kulturach skrawków

Źródło: Ting, C., et al., Analiza morfologii dendrytycznej w kolumnach i warstwach. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje procedurę przygotowania mózgu Drosophila, przechwytywania poziomych i czołowych stosów obrazów dendrytów rdzenia znakowanych GFP pod mikroskopem konfokalnym oraz tworzenia rekonstrukcji 3D w celu analizy ich morfologii w warstwach i kolumnach.

Analiza morfologii dendrytycznej w warstwach i kolumnach rdzenia Drosophila

Opisujemy dwie metody wizualizacji i kwantyfikacji arboryzacji dendrytycznej w hipokampie modeli mysich: obrazowanie w czasie rzeczywistym i rozszerzoną głębię ostrości. Podczas gdy pierwsza metoda pozwala na zaawansowane śledzenie topograficzne i ilościowe określenie zakresu rozgałęzień, druga pozwala na szybką wizualizację drzewa dendrytycznego.

Ocena arboryzacji dendrytycznej w zakręcie zębatym okolicy hipokampa u myszy

Tutaj prezentujemy szczegółowo protokół Golgi-Cox. Ta niezawodna metoda barwienia tkanek pozwala na wysokiej jakości ocenę cytoarchitektury w hipokampie i w całym mózgu, przy minimalnym rozwiązywaniu problemów.

Ocena złożoności dendrytycznej hipokampa u starszych myszy przy użyciu metody Golgiego-Coxa

Ten protokół skupia się na ilościowej analizie złożoności neuronalnej arboryzacji dendrytycznej (NDAC) u Drosophila, która może być wykorzystana do badań morfogenezy dendrytycznej.

Analiza ilościowa złożoności neuronalnej arboryzacji dendrytycznej u Drosophila

Przedstawiamy protokół do oznaczania i analizowania neuronów piramidowych, który jest kluczowy dla oceny potencjalnych zmian morfologicznych w neuronach i kolcach dendrytycznych, które mogą leżeć u podstaw nieprawidłowości neurochemicznych i behawioralnych.

Znakowanie balistyczne neuronów piramidowych w wycinkach mózgu i w pierwotnej hodowli komórkowej

Neuronalna morfologia dendrytyczna często leży u podstaw funkcji. Rzeczywiście, wiele procesów chorobowych, które wpływają na rozwój neuronów, objawia się fenotypem morfologicznym. Protokół ten opisuje prostą i potężną metodę analizy nienaruszonych altan dendrytycznych i związanych z nimi kolców.

Obrazowanie i kwantyfikacja nienaruszonych dendrytów neuronalnych za pomocą oczyszczania tkanek w ramach projektu CLARITY

Presented to narzędzie obliczeniowe, które umożliwia prosty i bezpośredni automatyczny pomiar orientacji gałęzi dendrytycznych neuronów na podstawie obrazów fluorescencyjnych 2D.

Automatyczna identyfikacja gałęzi dendrytycznych i ich orientacji

Kolce dendrytyczne są postsynaptycznymi przedziałami większości synaps pobudzających. Zmiany w morfologii kolców dendrytycznych występują podczas rozwoju neurologicznego, starzenia się, uczenia się oraz wielu zaburzeń neurologicznych i psychiatrycznych, co podkreśla znaczenie wiarygodnej analizy kręgosłupa dendrytycznego. Protokół ten opisuje ilościowe określanie morfologii kolców dendrytycznych w sposób dokładny i powtarzalny przy użyciu oprogramowania do automatycznej trójwymiarowej...

Kwantyfikacja dendrytycznego kręgosłupa za pomocą automatycznego oprogramowania do trójwymiarowej rekonstrukcji neuronów

Poznaj metodę analizy morfologii dendrytycznej neuronów siatkówki Drosophila w przestrzeni 3D przy użyciu obrazowania dwukierunkowego. Technika ta umożliwia szczegółowe mapowanie struktur dendrytów i identyfikację typów komórek nerwowych.

Analiza morfologii dendrytycznej w kolumnach i warstwach

Przeglądaj więcej filmów