Zastosowanie testu konduktometrycznego biosensora na bazie β-laktamazy do wykrywania oddziaływań biomolekularnych
1 lutego 2018
W tej pracy opisujemy nową metodę badania interakcji białko-białko za pomocą konduktometrycznego biosensora opartego na technologii hybrydowej β-laktamazy. Metoda ta polega na uwalnianiu protonów w wyniku hydrolizy β-laktamów.
Ogólnym celem tego testu biosensora konduktometrycznego jest wykrycie interakcji biomolekularnych przy użyciu hybrydowej technologii beta-laktamazy. Opisujemy metodę wykrywania oddziaływań antygenu przeciwciał przy użyciu chimerycznego białka beta-laktamazy. Zasada działania tej metody polega na wykrywaniu wiązania poprzez pomiar uwalniania protonów aktywności beta-laktamazy.
Główną przewagą tej techniki nad konwencjonalnymi immunosensorami jest zastosowanie chimerycznej beta-laktamazy, co sprawia, że tańsze i szybsze testy sensoryczne dzięki użyciu białka hybrydowego do wykrywania analitów Zademonstruje to Mathieu Dondelinger, doktor nauk humanistycznych. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania próbki białka i roztworu zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przygotuj elektrodę wielokrotnego użytku, zanurzając końcówki w dołkach 96-dołkowej płytki zawierającej 300 mikrolitrów roztworu do przygotowania elektrody na dołek na dwie minuty z delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej.
Powtórz ten krok trzy razy. Następnie przepłucz elektrody, zanurzając końcówki w studzienkach 96-dołkowej płytki zawierającej 300 mikrolitrów wody destylowanej na studzienkę na dwie minuty z delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej. Aby zregenerować elektrody, zanurz końcówki w dołkach 96-dołkowej płytki zawierającej 300 mikrolitrów roztworu regeneracyjnego na dołek przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub jednej godziny w temperaturze pokojowej.
Następnie wykonaj trzy płukania elektrod, zanurzając końcówki w studzienkach z 96-dołkową płytką zawierającą 300 mikrolitrów na studzienkę soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Wykonuj każde pranie przez dwie minuty, delikatnie mieszając w temperaturze pokojowej. Pokryj lizozym z białka jaja kurzego na powierzchni polianiliny elektrody, osadzając na powierzchni elektrody 15-mikrolitrową kroplę 40 mikrogramów na mililitr HEWL przygotowanej w buforze fosforanowym.
Inkubować elektrodę przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie wykonaj trzy płukanie elektrod buforem fosforanowym, zanurzając części elektrod chipów czujnika w studzience 96-dołkowej płytki zawierającej 300 mikrolitrów buforu fosforanowego na studzienkę. Wykonuj każde pranie przez dwie minuty, delikatnie mieszając w temperaturze pokojowej.
Nasycić elektrody, dodając 30-mikrolitrową kroplę roztworu blokującego na powierzchnię elektrody. Inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie umyj trzy razy tak jak poprzednio.
Rozcieńczyć roztwory BlaP-cAb-Lys3 lub BlaP do 20 mikrogramów na mililitr w buforze wiążącym. Następnie nałóż 15-mikrolitrową kroplę tego rozcieńczonego roztworu na elektrody. Inkubować elektrody przez godzinę w temperaturze pokojowej.
Po reakcji nanonowej antygenu przemyć elektrody trzykrotnie roztworem myjącym. Następnie umyj elektrody czujnika w buforze detekcyjnym, zanurzając elektrody w studzience z 96-dołkową płytką zawierającą 300 mikrolitrów na studzienkę buforu detekcyjnego. I inkubować krótko przez minutę.
W celu wykrycia podłącz multimetr cyfrowy do komputera. Następnie podłącz chip czujnika do multimetru cyfrowego za pomocą miedzianej części obwodów. Zainicjuj odpowiedź czujnika, nakładając 50-mikrolitrową kroplę czteromilimolowego roztworu penicyliny benzylowej na elektrody znakowane dodatnio.
Nałóż 50-mikrolitrową kroplę roztworu detekcyjnego na elektrody znakowane ujemnie, aby służyły jako kontrola ujemna. Monitoruj wartości konduktometryczne za pomocą podłączonego multimetru cyfrowego przez 30 minut. Wizualizuj dane w czasie rzeczywistym bezpośrednio na ekranie lub eksportuj dane cyfrowe jako plik tekstowy.
Te surowe dane można wykreślić w celu stworzenia graficznego wyjścia przedstawiającego pomiary zmian przewodności między elektrodą odniesienia a elektrodą próbki w czasie. Do skonstruowania białka chimerycznego jako białko nośnikowe użyto beta-laktamazy klasy A BlaP. W tym przypadku pozostałości katalityczne są przedstawione na czerwono.
Miejsce wprowadzenia znajdujące się w pętli naświetlanej przez rozpuszczalnik jest oznaczone kolorem żółtym. Fragment przeciwciała wielbłądowatego o nazwie cAb-Lys3 został wprowadzony do BlaP. Powstałe w ten sposób chimeryczne białko, BlaP-cAb-Lyse3, jest w stanie wiązać HEWL przy zachowaniu aktywności beta-laktamazy.
HEWL został unieruchomiony na elektrodzie kodowanej polianiliną przed załadowaniem BlaP-cAb-Lys3. Uwalnianie protonów podczas hydrolizy penicyliny benzylowej przez unieruchomione białko chimeryczne indukuje zmiany przewodnictwa, które mogą być interpretowane przez użytkownika. Czujniki zawierają osiem chipów zorganizowanych w cztery pary.
Każdy chip zawiera trzy elektrody, jedną elektrodę roboczą pokrytą polianiliną, jedną elektrodę odniesienia i jedną przeciwelektrodę. Dla każdej pary chip oznaczony jako ujemny odpowiada kontroli ujemnej, natomiast chip oznaczony jako dodatni odpowiada badanej próbce. Pokazano tutaj pomiary przewodności pokazujące specyficzne oddziaływanie BlaP-cAb-Lys3 do HEWL.
Zmiany przewodnictwa wynikają z uwalniania protonów wywołanego hydrolizą antybiotyków przez unieruchomioną chimeryczną beta-laktamazę. Nie wykryto wiązania dla kontroli negatywnej, natywnej beta-laktamazy BlaP. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 1/2 dziennie, jeśli została wykonana prawidłowo, a warunki eksperymentalne są zoptymalizowane.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ wprowadzenie fragmentu przeciwciała do BlaP jest trudne. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że jakość generowanych danych będzie zależała od funkcjonalności chimerycznej beta-laktamazy. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, które pozwalają na ilościowe określenie wykrytego oddziaływania, w celu wyznaczenia stałej asocjacji równowagi tego oddziaływania.
Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biosensorami immunologicznymi do badania interakcji molekularnych w różnych próbkach, począwszy od organizmów żywych, a skończywszy na różnych środowiskach. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku wykrywania wielu biomolekuł, ponieważ technologia chimerycznej beta-laktamazy jest wszechstronnym narzędziem do funkcjonalizacji dowolnego przeciwciała lub fragmentu białka w sieci. W związku z tym może być wykorzystany do opracowania tanich i szybkich narzędzi diagnostycznych w wielu dziedzinach, takich jak zdrowie ludzi i zwierząt.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia analizę z wykorzystaniem biosensora konduktometrycznego opartego na hybrydowej technologii β-laktamazy do wykrywania oddziaływań biomolekularnych. Metoda ta koncentruje się na pomiarze uwalniania protonów podczas oddziaływań przeciwciało-antygen, stanowiąc kosztowo efektywną i szybką alternatywę dla tradycyjnych immunosensorów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Biofizyka
- Chemia analityczna
Wprowadzenie
- Interakcje białko-białko są kluczowe dla wielu procesów biologicznych.
- Tradycyjne metody badania tych oddziaływań mogą być kosztowne i czasochłonne.
- Technologia hybrydowych β-laktamaz zapewnia nowatorskie podejście do zwiększenia wydajności detekcji.
- Biosensory konduktometryczne mogą umożliwić monitorowanie oddziaływań w czasie rzeczywistym.
Cel badania
- Opracowanie nowej metody badania oddziaływań białko-białko.
- Wykorzystanie chimerycznej β-laktamazy do wykrywania oddziaływań przeciwciało-antygen.
- Wykazanie zalet tej metody w porównaniu z konwencjonalnymi immunosensorami.
Zastosowane metody
- Przygotowanie próbek białek i roztworów zgodnie z protokołem.
- Tworzenie elektrod wielokrotnego użytku poprzez zanurzanie w roztworze do przygotowania elektrod.
- Pomiar uwalniania protonów w celu oceny oddziaływań wiążących.
- Prezentacja procedury przeprowadzona przez badacza na studiach doktoranckich.
Główne wyniki
- Biosensor konduktometryczny pomyślnie wykrył oddziaływania przeciwciało-antygen.
- Skutecznie zmierzono uwalnianie protonów, co wskazało na zdarzenia wiązania.
- Metoda okazała się szybsza i bardziej kosztowo efektywna niż metody tradycyjne.
- Wykazano potencjał do szerszego zastosowania w badaniach oddziaływań biomolekularnych.
Wnioski
- Hybrydowy konduktometryczny biosensor oparty na β-laktamazie jest obiecującym narzędziem do badania oddziaływań białkowych.
- Metoda ta może ułatwić szybsze i tańsze analizy sensoryczne.
- Przyszłe zastosowania mogą objąć różne dziedziny biochemia i biologii molekularnej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Hybrydowe biosensory konduktometryczne oparte na β-laktamazie umożliwiają szybką, ilościową detekcję oddziaływań biomolekularnych, wspierając wczesną walidację celów oraz opracowywanie testów. Technologia ta oferuje skalowalne i kosztowo efektywne alternatywy dla tradycyjnych immunosensorów, zwiększając wiarygodność prognostyczną w krytycznych punktach zwrotnych procesu odkrywania. Jej modułowość oraz odczyt w czasie rzeczywistym czynią ją platformą wielokrotnego użytku do przesiewania całego portfolio oraz ograniczania ryzyka mechanistycznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę oddziaływań białko-białko oraz przeciwciało-antygen w celu funkcjonalnej walidacji celu.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez potwierdzenie specyficzności wiązania oraz zachowania aktywności w konstrukcjach modyfikowanych genetycznie.
- Ułatwia szybką selekcję potencjalnych cząsteczek wiążących na podstawie ilościowych wyników konduktometrycznych.
Przesiewy i rozwój testów
- Zapewnia standaryzowaną, powtarzalną platformę biosensorową do wysokoprzepustowego screeningu oddziaływań molekularnych.
- Umożliwia ilościowe pomiary zdarzeń wiązania w czasie rzeczywistym poprzez detekcję uwalniania protonów.
- Skraca czas i obniża koszty opracowania testów w porównaniu do konwencjonalnych procedur immunosensorowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie sygnałów z biosensorów do detekcji biomarkerów istotnych dla przebiegu choroby, wykorzystując specyficzność nanociał.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej, umożliwiając szybką ocenę oddziaływań molekularnych w różnych typach próbek.
- Oferuje predykcyjne ograniczanie ryzyka w strategiach translacyjnych dotyczących biomarkerów dzięki zastosowaniu wytrzymałych, ilościowych odczytów.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Niniejszy konkurencyjny test biosensora konduktometrycznego wpisuje się w proces przechodzenia od etapu odkrycia do identyfikacji wiodących związków, stanowiąc pomost pomiędzy wczesnym testowaniem hipotez a późniejszym screeningiem lub walidacją przedkliniczną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera walidację interakcji molekularnych i mapowanie szlaków w oparciu o postawione hipotezy.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy, powtarzalne i ilościowe wyniki do oceny związków lub ligandów.
- Analityka: Umożliwia uzyskanie eksportowalnych danych o przewodnictwie w czasie rzeczywistym do analizy porównawczej w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie biomarkerów i zapewnienie ciągłości w przypadku, gdy nanociała celują w białka istotne dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zapewnia modułową platformę biosensorową, którą można dostosować do nowych celów i fragmentów przeciwciał.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i przyspiesza przepływy pracy w analizach biosensorowych dzięki skalowalnym i wielokrotnego użytku komponentom.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie szybkiego, ilościowego screeningu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz wdrażanie zwalidowanych celów i binderów.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w inżynierii białek oraz w konfiguracji testów z użyciem biosensorów.
- Wymaga dostępu do instrumentacji do pomiarów konduktometrycznych oraz infrastruktury analizy danych.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji przygotowania elektrod i warunków testowych między zespołami.
- Metoda jest dostosowana do różnych wstawień nanociał lub fragmentów białek, jednak funkcjonalność konstruktu musi zostać potwierdzona empirycznie.
- Jakość danych zależy od aktywności białka chimerycznego i wydajności elektrod, co wymaga starnej optymalizacji.
