Name: Zastosowanie testu konduktometrycznego biosensora na bazie β-laktamazy do wykrywania oddziaływań biomolekularnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Poznaj konduktometryczny biosensor oparty na hybrydowej β-laktamazie do wykrywania interakcji antygen-przeciwciało. Ta metoda mierzy uwalnianie protonów, oferując szybszą i tańszą alternatywę dla tradycyjnych immunosensorów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Regionowi Walonii Belgii w ramach projektów badawczych SENSOTEM i NANOTIC, a także Narodowym Funduszom Badań Naukowych (F.R.S.-F.N.R.S) za ich wsparcie finansowe.

1. Przygotowanie próbki białka
<ol>
	<li>Wyprodukuj i oczyść białko hybrydowe BlaP-cAb-Lys3, jak opisano w naszym poprzednim badaniu15. Przechowywać białko w 50 mM buforze fosforanowym o pH 7,4 o następującym składzie: 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 i 0,24 g KH2PO4 rozpuszczone w 800 ml wody destylowanej Ustalić pH roztworu na 7,4 przed dostosowaniem końcowej objętości roztworu do 1 l. Przefiltrować wysterylizować roztwór białka.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy lizozymu białka jaja kurzego (HEWL). Rozpuścić 100 mg (40 000 jednostek/mg) zakupionego w handlu HEWL w 10 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS, patrz krok 2.1.1). Wysterylizuj roztwór białkowy przez filtrację za pomocą filtrów z odcięciem 0,22 μm.</li>
</ol>
2. Testy biosensorów
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu i buforu
	<ol>
		<li>Przygotować 50 mM PBS, rozpuszczając 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 i 0,24 g KH2PO4 w 800 ml wody destylowanej. Doprowadzić do pH 7,4 za pomocą 1 N HCl lub 1 N NaOH przed dostosowaniem objętości roztworu do 1 l. Przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować roztwór nasycający/blokujący, rozpuszczając 3 g hydrolizatu kazeiny w 100 ml PBS przygotowanego w sposób opisany powyżej (patrz krok 2.1.1). Przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować roztwór wiążący, rozpuszczając 1 g hydrolizatu kazeiny w 100 ml PBS przygotowanego w sposób opisany powyżej (patrz krok 2.1.1). Przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować roztwór do przemywania (0,1% Tween - PBS), dodając 100 μL Tween 20 (100%) do 100 ml PBS przygotowanego w sposób opisany powyżej (patrz krok 2.1.1). Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować roztwór do przygotowania elektrody (1% Triton X-100 - PBS), dodając 1 ml Triton X-100 (100%) do 100 ml PBS przygotowanego w sposób opisany powyżej (patrz krok 2.1.1). Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować roztwór do regeneracji elektrod (3,5 M KCl), rozpuszczając 26 g KCl w wodzie destylowanej do końcowej objętości 100 ml. Filtr wysterylizowany i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować 5 mM roztwór NaCl, rozpuszczając 0,29 g NaCl w wodzie destylowanej do końcowej objętości 1 l. Przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C. Następnie należy przygotować roztwór detekcyjny (4 mM penicyliny benzylowej), rozpuszczając 26,7 mg penicyliny benzylowej w 20 ml 5 mM roztworu NaCl. Filtrować, sterylizować i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie i regeneracja czujnika 
	Uwaga: Chipy czujników pokryte polianiliną zostały opracowane i dostarczone przez dr P. Bogaertsa, dr S. Yunusa i prof. Y. Glupczynskiego (Katolicki Uniwersytet w Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne). Opis czujnika, jak również protokoły elektropolimeryzacji polianiliny używane do syntezy tych czujników, są szczegółowo opisane w ich poprzedniej pracy17. Krótko mówiąc, system ten wykorzystuje czujniki wielokrotnego użytku składające się z ośmiu pojedynczych chipów, które zostały wyprodukowane przy użyciu klasycznych technik obwodów drukowanych (PCB). Poszczególne wióry składają się z trzech okrągłych punktów elektrody. Górna z nich to elektroda robocza, na której elektrosyntezowano polianilinę. Środkowa z nich to elektroda odniesienia, a dolna elektroda stanowi przeciwelektrodę. Zarówno elektroda referencyjna, jak i przeciwelektroda są funkcjonalizowane za pomocą stałego amalgamatu Ag/AgCl na wierzchu warstwy węglowej.
	<ol>
		<li>Wykonać 3 płukania elektrod, zanurzając końcówki w dołkach 96-dołkowej płytki zawierającej 300 μl/studzienkę roztworu do przygotowania elektrod (1% Triton X-100 - PBS, patrz krok 2.1.5.). Wykonuj każde pranie przez 2 minuty z delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przepłukać elektrody, zanurzając końcówki w studzienkach 96-dołkowej płytki zawierającej 300 μl/studzienkę wody destylowanej na 2 minuty z delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zregenerować elektrody, zanurzając końcówki w studzienkach 96-dołkowej płytki zawierającej 300 μl/studzienkę roztworu regeneracyjnego (3,5 M KCl, patrz krok 2.1.6) przez noc w temperaturze 4 °C lub 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wykonać 3 płukania elektrod, zanurzając końcówki w studzienkach 96-dołkowej płytki zawierającej 300 μl/studzienkę soli fizjologicznej buforu fosforanowego (patrz krok 2.1.1.). Wykonuj każde pranie przez 2 minuty z delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test wiązania przeprowadzony na czujniku
	<ol>
		<li>Pokryj HEWL na powierzchni PANI (polianiliny) elektrody, nanosząc na powierzchnię elektrody kroplę 15 μl 40 μg/ml HEWL przygotowanej w PBS. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C lub 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wykonać trzy płukanie elektrod solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (patrz krok 2.1.1), zanurzając części elektrod chipów czujnika w studzienkach 96-dołkowej płytki zawierającej 300 μl/studzienkę soli fizjologicznej buforu fosforanowego. Wykonuj każde pranie przez 2 minuty z delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Nasycić elektrody, dodając 50 μl kropli roztworu blokującego (patrz krok 2.1.2) na powierzchnię elektrody. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie umyj trzy razy, jak opisano w poprzednim kroku (patrz krok 2.3.2).</li>
		<li>Rozcieńczyć roztwór BlaP-cAb-Lys3 do 20 μg/ml w roztworze wiążącym (patrz krok 2.1.3) i nanieść 15 μl kropli tego rozcieńczonego roztworu na elektrody. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po reakcji antygen-nanobody przemyć trzykrotnie, jak opisano w poprzednim kroku, roztworem do przemywania (patrz krok 2.1.4). Następnie przepłukać elektrodę raz PBS (patrz krok 2.1.1).</li>
		<li>W celu wykrycia podłącz chip czujnika za pomocą części miedzianej do multimetru cyfrowego. Następnie zainicjuj reakcję czujnika, nakładając kroplę roztworu detekcyjnego o wielkości 50 μl (patrz krok 2.1.7) na elektrody dodatnie i nanosząc kroplę 50 μl roztworu NaCl 5 mM na elektrody ujemne (patrz krok 2.1.7). Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Monitoruj przewodność za pomocą multimetru cyfrowego. 
		Uwaga: Multimetr został dostarczony przez dr P. Bogaertsa, dr S. Yunusa i prof. Y. Glupczynskiego (Katolicki Uniwersytet w Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne. Ten potencjostat jest sterowany komputerowo przez port USB i jednocześnie analizuje osiem różnych chipów czujnika. Oprogramowanie stworzone przez Yunusa i współpracowników17 tworzy wykres w czasie rzeczywistym, który przedstawia pomiary różnicy przewodności między elektrodą odniesienia a elektrodą próbki w czasie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Higgins, I. J., Lowe, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+the+principles+and+applications+of+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Introduction to the principles and applications of biosensors.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).</li>
<li>Byrne, B., Stack, E., Gilmartin, N., O'Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-based+sensors%3A+principles%2C+problems+and+potential+for+detection+of+pathogens+and+associated+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Antibody-based sensors: principles, problems and potential for detection of pathogens and associated toxins.</a> Sensors (Basel). 9, 4407-4445 (2009).</li>
<li>Huston, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+of+antibody+binding+sites%3A+recovery+of+specific+activity+in+an+anti-digoxin+single-chain+Fv+analogue+produced+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5879-5883 (1988).</li>
<li>Mechaly, A., Zahavy, E., Fisher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+implementation+of+a+single-chain+Fv+antibody+for+specific+detection+of+Bacillus+anthracis+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and implementation of a single-chain Fv antibody for specific detection of Bacillus anthracis spores.</a> Appl Environ Microbiol. 74, 818-822 (2008).</li>
<li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li>
<li>Sheriff, S., Constantine, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+the+minimal+antigen-binding+fragment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Redefining the minimal antigen-binding fragment.</a> Nat Struct Biol. 3, 733-736 (1996).</li>
<li>Stijlemans, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+conserved+cryptic+epitopes+of+infectious+agents+by+single+domain+antibodies.+African+trypanosomes+as+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of conserved cryptic epitopes of infectious agents by single domain antibodies. African trypanosomes as paradigm.</a> J Biol Chem. 279, 1256-1261 (2004).</li>
<li>Thanongsaksrikul, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+V+H+H+that+neutralizes+the+zinc+metalloproteinase+activity+of+botulinum+neurotoxin+type+A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A V H H that neutralizes the zinc metalloproteinase activity of botulinum neurotoxin type A.</a> J Biol Chem. 285, 9657-9666 (2010).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate-specific+antigen+immunosensing+based+on+mixed+self-assembled+monolayers%2C+camel+antibodies+and+colloidal+gold+enhanced+sandwich+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays.</a> Biosens. Bioelectron. 21, 483-490 (2005).</li>
<li>Yolken, R. H., Wee, S. B., Van Regenmortel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+beta-lactamase+in+enzyme+immunoassays+for+detection+of+microbial+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">The use of beta-lactamase in enzyme immunoassays for detection of microbial antigens.</a> J Immunol Methods. 73, 109-123 (1984).</li>
<li>Kojima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+circularly+permutated+beta-lactamase+tethered+to+antibody+domains+by+specific+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of circularly permutated beta-lactamase tethered to antibody domains by specific small molecules.</a> Bioconjug Chem. 22, 633-641 (2011).</li>
<li>Iwai, H., Kojima-Misaizu, M., Dong, J., Ueda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+a+Ligand-Dependent+Enzyme+by+Fusing+Circularly+Permuted+Antibody+Variable+Region+Domains%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Creation of a Ligand-Dependent Enzyme by Fusing Circularly Permuted Antibody Variable Region Domains.</a> Bioconjug Chem. 27, 868-873 (2016).</li>
<li>Vandevenne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bacillus+licheniformis+BlaP+beta-lactamase+as+a+model+protein+scaffold+to+study+the+insertion+of+protein+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">The Bacillus licheniformis BlaP beta-lactamase as a model protein scaffold to study the insertion of protein fragments.</a> Protein Sci. 16, 2260-2271 (2007).</li>
<li>Vandevenne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+easy+development+of+versatile+tools+to+study+protein%2Fligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng+Des+Sel%22%5BJournal%5D)">Rapid and easy development of versatile tools to study protein/ligand interactions.</a> Protein Eng Des Sel. 21, 443-451 (2008).</li>
<li>Crasson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+functionalization+of+a+nanobody+using+protein+insertion+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng+Des+Sel%22%5BJournal%5D)">Enzymatic functionalization of a nanobody using protein insertion technology.</a> Protein Eng Des Sel. 28, 451-460 (2015).</li>
<li>Yunus, S., Attout, A., Vanlancker, G., Bertrand, P., Ruth, N., Galleni, G. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400511002668">A method to probe electrochemically active material state in portable sensor applications.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 156, 35-42 (2011).</li>
<li>Bogaerts, P., Yunus, S., Massart, M., Huang, T. D., Glupczynski, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+BYG+Carba+Test%2C+a+New+Electrochemical+Assay+for+Rapid+Laboratory+Detection+of+Carbapenemase-Producing+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the BYG Carba Test, a New Electrochemical Assay for Rapid Laboratory Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae.</a> J Clin Microbiol. 54, 349-358 (2016).</li>
<li>Wang, L. P., Wang, W., Di, L., Lu, Y. N., Wang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+adsorption+under+electrical+stimulation+of+neural+probe+coated+with+polyaniline%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Protein adsorption under electrical stimulation of neural probe coated with polyaniline.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 80, 72-78 (2010).</li>
<li>Piletsky, S., Piletska, E., Bossi, A., Turner, N., Turner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+functionalization+of+porous+polypropylene+membranes+with+polyaniline+for+protein+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Surface functionalization of porous polypropylene membranes with polyaniline for protein immobilization.</a> Biotechnol. Bioeng. 82, 86-92 (2003).</li>
<li>Khatkhatay, M. I., Desai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+performances+of+four+enzymes+used+in+ELISA+with+special+reference+to+beta-lactamase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunoassay%22%5BJournal%5D)">A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase.</a> J Immunoassay. 20, 151-183 (1999).</li>
<li>Worn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+in+vitro+stability+and+in+vivo+performance+of+anti-GCN4+intrabodies+as+cytoplasmic+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors.</a> J Biol Chem. 275, 2795-2803 (2000).</li>
<li>Ostermeier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+allosteric+protein+switches+by+domain+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng+Des+Sel%22%5BJournal%5D)">Engineering allosteric protein switches by domain insertion.</a> Protein Eng Des Sel. 18, 359-364 (2005).</li>
<li>Choi, J. H., Laurent, A. H., Hilser, V. J., Ostermeier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+protein+switches+based+on+an+ensemble+model+of+allostery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Design of protein switches based on an ensemble model of allostery.</a> Nat Commun. 6, 6968(2015).</li>
<li>Collinet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+accepted+insertions+of+proteins+within+protein+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functionally accepted insertions of proteins within protein domains.</a> J Biol Chem. 275, 17428-17433 (2000).</li>
<li>Betton, J. M., Jacob, J. P., Hofnung, M., Broome-Smith, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+a+bifunctional+protein+by+insertion+of+beta-lactamase+into+the+maltodextrin-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Creating a bifunctional protein by insertion of beta-lactamase into the maltodextrin-binding protein.</a> Nat Biotechnol. 15, 1276-1279 (1997).</li>
<li>Ay, J., Gotz, F., Borriss, R., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+Bacillus+hybrid+enzyme+GluXyn-1%3A+native-like+jellyroll+fold+preserved+after+insertion+of+autonomous+globular+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the Bacillus hybrid enzyme GluXyn-1: native-like jellyroll fold preserved after insertion of autonomous globular domain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6613-6618 (1998).</li>
<li>Ruth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+vaccination+for+the+priming+of+neutralizing+antibodies+against+non-immunogenic+STa+enterotoxin+from+enterotoxigenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">DNA vaccination for the priming of neutralizing antibodies against non-immunogenic STa enterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Vaccine. 23, 3618-3627 (2005).</li>
<li>Zervosen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+cattle+serum+antibody+responses+against+TEM+beta-lactamase+and+the+nonimmunogenic+Escherichia+coli+heat-stable+enterotoxin+%28STaI%29%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the cattle serum antibody responses against TEM beta-lactamase and the nonimmunogenic Escherichia coli heat-stable enterotoxin (STaI).</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 54, 319-329 (2008).</li>
<li>Chevigne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bifunctional+hybrid+beta-lactamases+for+epitope+mapping+and+immunoassay+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of bifunctional hybrid beta-lactamases for epitope mapping and immunoassay development.</a> J Immunol Methods. 320, 81-93 (2007).</li>
<li>Ke, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+an+engineered+beta-lactamase+maltose+binding+protein+fusion+protein%3A+insights+into+heterotropic+allosteric+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Structure of an engineered beta-lactamase maltose binding protein fusion protein: insights into heterotropic allosteric regulation.</a> PloS One. 7, 39168(2012).</li>
<li>Saeedfar, K., Heng, L. Y., Ling, T. L., Rezayi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiometric+urea+biosensor+based+on+an+immobilised+fullerene-urease+bio-conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Potentiometric urea biosensor based on an immobilised fullerene-urease bio-conjugate.</a> Sensors (Basel). 13, 16851-16866 (2013).</li>
<li>D'Orazio, P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009898103002419">Biosensors in clinical chemistry.</a> Clin Chim Acta. 334, 41-69 (2003).</li>
<li>Szucs, J., Pretsch, E., Gyurcsanyi, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiometric+enzyme+immunoassay+using+miniaturized+anion-selective+electrodes+for+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Potentiometric enzyme immunoassay using miniaturized anion-selective electrodes for detection.</a> Analyst. 134, 1601-1607 (2009).</li>
<li>Ding, J., Wang, X., Qin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+galvanostatic+control+of+a+polymeric+membrane+ion-selective+electrode+for+potentiometric+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Pulsed galvanostatic control of a polymeric membrane ion-selective electrode for potentiometric immunoassays.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 5, 9488-9493 (2013).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polymeric+liquid+membrane+electrode+responsive+to+3%2C3%27%2C5%2C5%27-tetramethylbenzidine+oxidation+for+sensitive+peroxidase%2Fperoxidase+mimetic-based+potentiometric+biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">A polymeric liquid membrane electrode responsive to 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine oxidation for sensitive peroxidase/peroxidase mimetic-based potentiometric biosensing.</a> Anal Chem. 86, 4416-4422 (2014).</li>
<li>Grieshaber, D., MacKenzie, R., Voros, J., Reimhult, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+Biosensors+-+Sensor+Principles+and+Architectures%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Electrochemical Biosensors - Sensor Principles and Architectures.</a> Sensors (Basel). 8, 1400-1458 (2008).</li>
<li>Bakker, E., Pretsch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+potentiometry%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Analyt+Chem%22%5BJournal%5D)">Nanoscale potentiometry.</a> Trends Analyt Chem. 27, 612-618 (2008).</li>
<li>Zhang, D., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensors+and+bioelectronics+on+smartphone+for+portable+biochemical+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection.</a> Biosens Bioelectron. 75, 273-284 (2016).</li>
<li>Nemiroski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+mobile+electrochemical+detector+designed+for+use+in+resource-limited+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Universal mobile electrochemical detector designed for use in resource-limited applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 11984-11989 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.gsma.com/connectedliving/wp-content/uploads/2013/06/Socio-economic_impact-of-mHealth_EU_14062013V2.pdf">Socio-economic impact of mHealth- An assessment report for the European Union</a>. , Price Waterhouse Coopers. Commission, T.E (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszej pracy przedstawiono metodę funkcjonalizacji nanocząsteczki z wykorzystaniem β-laktamazy BlaP jako białka nośnikowego i pokazujemy, że możemy z powodzeniem zaimplementować powstałe białko hybrydowe w potencjometrycznym teście sensorycznym. Głównym innowacyjnym aspektem naszej pracy w porównaniu z innymi testami biosensorów jest kowalencyjne sprzężenie części przeciwciała z aktywnością enzymatyczną, która generuje sygnał elektryczny. Ta tak zwana technologia insercji białek ma zalety i ograniczenia, które będą...

Biosensory to urządzenia analityczne, które łączą interakcję biomolekularną z fizycznymi lub chemicznymi urządzeniami sygnalizacyjnymi określanymi jako przetworniki1. Zarejestrowane sygnały mogą być następnie interpretowane i przekształcane w celu monitorowania interakcji między unieruchomionymi i wolnymi partnerami. Większość biosensorów wykorzystuje przeciwciało do wykrywania analitów, takich jak hormony lub różne markery patogenów2. Można stosować różne formaty czujników, w tym bioczujniki masowe, magnetyczne, optyczne lub elektrochemiczne. Te ostatnie są jednymi z najczęściej używanych czujników, a ich działanie polega na przekształcaniu zdarzenia wiążącego w sygnał elektryczny. Wydajność i czułość wszystkich biosensorów opartych na przeciwciałach są silnie zależne zasadniczo od dwóch parametrów: i) jakości przeciwciała oraz ii) właściwości systemu używanego do generowania sygnału2.
Przeciwciała to wysokocząsteczkowe białka dimeryczne (150–160 kDa), które składają się z dwóch ciężkich łańcuchów i dwóch lekkich łańcuchów. Interakcja między łańcuchami lekkimi i ciężkimi jest w większości stabilizowana przez oddziaływania hydrofobowe, a także konserwatywne wiązanie dwusiarczkowe. Każdy łańcuch zawiera domenę zmienną, która oddziałuje z antygenem zasadniczo za pośrednictwem trzech hiperzmiennych regionów zwanych komplementarnymi regionami determinującymi (CDR1-2-3). Pomimo licznych postępów w tej dziedzinie, ekspresja na dużą skalę pełnowymiarowych przeciwciał za pomocą tanich systemów ekspresji (np. E. coli) często prowadzi do produkcji niestabilnych i zagregowanych białek. Z tego powodu opracowano różne fragmenty przeciwciał, takie jak jednołańcuchowe fragmenty zmienne3 (ScFvs ≈ 25 kDa). Składają się one ze zmiennych domen odpowiednio jednego ciężkiego i jednego lekkiego łańcucha, które są kowalencyjnie połączone syntetyczną sekwencją aminokwasów. Jednak fragmenty te często wykazują słabą stabilność i mają tendencję do agregacji, ponieważ wystawiają dużą część swoich hydrofobowych obszarów na działanie rozpuszczalnika4. W tym kontekście jednołańcuchowe fragmenty przeciwciał wielbłądowatych, określane jako nanociała lub VHH, wydają się być doskonałą alternatywą dla ScFvs. Domeny te odpowiadają domenom zmiennym jednołańcuchowych przeciwciał wielbłądowatych. W przeciwieństwie do konwencjonalnych przeciwciał, przeciwciała wielbłądowate są pozbawione łańcuchów lekkich i zawierają tylko dwa łańcuchy ciężkie5. Dlatego nanociała są najmniejszymi fragmentami przeciwciał monomerycznych (12 kDa) zdolnymi do wiązania się z antygenem o powinowactwie podobnym do powinowactwa konwencjonalnych przeciwciał6. Ponadto wykazują lepszą stabilność i rozpuszczalność w porównaniu z innymi przeciwciałami o pełnej długości lub fragmentami przeciwciał. Wreszcie, ich małe rozmiary i rozszerzone pętle CDR3 pozwalają im rozpoznawać tajemnicze epitopy i wiązać się z miejscami aktywnymi enzymów7,8. Obecnie dziedziny te cieszą się dużym zainteresowaniem i zostały połączone z technologią biosensorów. Na przykład Huang i wsp. opracowali bioczujnik oparty na nanociałach do wykrywania i ilościowego oznaczania ludzkiego antygenu swoistego dla prostaty (PSA)9.
Jak wspomniano powyżej, ważnym parametrem w testach biosensorów jest wydajność systemu używanego do generowania sygnału elektrycznego. Z tego powodu bioczujniki elektrochemiczne oparte na enzymach przyciągają coraz większą uwagę i są szeroko stosowane w różnych zastosowaniach, takich jak opieka zdrowotna, bezpieczeństwo żywności i monitorowanie środowiska. Te bioczujniki opierają się na katalitycznej hydrolizie substratu przez enzym w celu wygenerowania sygnału elektrycznego. W tym kontekście wykazano, że β-laktamazy są bardziej specyficzne, bardziej czułe i łatwiejsze do eksperymentalnego wdrożenia niż wiele innych enzymów, takich jak fosfataza alkaliczna czy peroksydaza chrzanowa10. β-laktamazy to enzymy, które są odpowiedzialne za oporność bakterii na antybiotyki β-laktamowe poprzez ich hydrolizę. Są monomeryczne, bardzo stabilne, wydajne i niewielkich rozmiarów. Co więcej, inserje domena/peptyd do β-laktamaz generują dwufunkcyjne białka chimeryczne, które okazały się skutecznymi narzędziami do badania interakcji białko-ligand. Rzeczywiście, ostatnie badania wykazały, że wprowadzenie zmiennych fragmentów przeciwciała do TEM1 β-laktamazy powoduje powstanie chimerycznego białka, które pozostaje w stanie wiązać się z wysokim powinowactwem do docelowego antygenu. Co ciekawe, wykazano, że wiązanie antygenu indukuje allosteryczne regulowanie aktywności katalitycznej TEM111,12. Ponadto wykazaliśmy w kilku badaniach, że insercja domeny białkowej do permisywnej pętli β-laktamazy Bacillus licheniformis BlaP generuje funkcjonalne białka chimeryczne, które dobrze nadają się do monitorowania interakcji białko-ligand13,14. Niedawno umieściliśmy nanociało o nazwie cAb-Lys3 w tym dopuszczalnym miejscu insercji BlaP15. Wykazano, że ten nanobody wiąże się z lizozymem białka jaja kurzego (HEWL) i hamuje jego aktywność enzymatyczną16. Wykazaliśmy, że wygenerowane białko hybrydowe, nazwane BlaP-cAb-Lys3, zachowało wysoką specyficzność / powinowactwo do HEWL, podczas gdy aktywność β-laktamazy pozostała niezmieniona. Następnie z powodzeniem połączyliśmy hybrydową technologię β-laktamazy z biosensorem elektrochemicznym i wykazaliśmy, że ilość generowanego sygnału elektrycznego jest zależna od interakcji między BlaP-cAb-Lys3 a HEWL unieruchomionym na elektrodzie. Rzeczywiście, hydroliza antybiotyków β-laktamowych przez BlaP indukuje uwalnianie protonów, które można przekształcić w ilościowy sygnał elektryczny. To połączenie hybrydowej technologii β-laktamazy z biosensorem elektrochemicznym jest szybkie, czułe, ilościowe i umożliwia pomiar generowanego sygnału w czasie rzeczywistym. Metodologia ta została opisana w niniejszym dokumencie.

<table><tbody><tr><td><silny>Odczynniki</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>V000225&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>1551128</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tris&ndash; HCl</td><td>Roche</td><td>10812846001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp;</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>NIST2186II</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>alanina</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>HClO4</td><td>Fluka</td><td>34288</td><td>1M roztwór HClO4, dystrybutor: hydrolizat</td></tr><tr><td>kazeiny</td><td>Sigma-Aldricht Sigma-Aldricht</td><td>22090</td><td></td></tr><tr><td>sól sodowa penicyliny benzylowej</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>B0900000</td><td></td></tr><tr><td>lizozym z białka jaja kurzego</td><td>Roche</td><td>10837059001</td><td></td></tr><tr><td>heptan</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>246654</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>roztwór wodorotlenku amonu</td><td>Sigma-Aldricht 380539</td><td></td><td>28% NH3&nbsp; w H2O, oczyszczone przez podwójną destylację (zagęszczone?)</td></tr><tr><td><mocne>Materiały eksploatacyjne laboratoryjne</mocna></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>płytka 6-dołkowa&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657165</td><td>CELLSTAR 6-dołkowa płytka</td></tr><tr><td><mocna>sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pHmetr</td><td>WTW</td><td>1AA110</td><td>Laboratoryjny pH-metr inoLab System</td></tr><tr><td>próżniowy i filtracji</td> pH 7110 <td>Nalgene</td><td>NALG300-4100</td><td>Uchwyty filtrów z odbiornikiem, dystrybutorem :</td></tr><tr><td>Układy</td><td></td><td></td> czujników potencjometrycznych VWR <td>produkowane przez firmę Yunus i koledzy (ref 16)</td></tr><tr><td>PGSTAT30 Autolab</td><td>Metrohm Autolab</td><td></td><td>wycofany, następca Multimetr cyfrowy Autolab PGSTAT302N</td></tr><tr><td>, METRAHit 22M</td><td>Gossen Metrawatt</td><td></td><td>wycofany, następca Metrahit Base</td></tr></tbody></table>

zastosowanie testu konduktometrycznego biosensora na bazie β-laktamazy do wykrywania oddziaływań biomolekularnych

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensory stają się coraz ważniejsze i wdrażane w różnych dziedzinach, takich jak wykrywanie patogenów, diagnostyka molekularna, monitorowanie środowiska i kontrola bezpieczeństwa żywności. W tym kontekście użyliśmy β-laktamaz jako skutecznych enzymów reporterowych w kilku badaniach interakcji białko-białko. Co więcej, ich zdolność do przyjmowania insercji peptydów lub strukturalnych białek/domen zdecydowanie zachęca do stosowania tych enzymów do generowania białek chimerycznych. W niedawnym badaniu wprowadziliśmy fragment przeciwciała z pojedynczą domeną do β-laktamazy Bacillus licheniformis BlaP. Te małe domeny, zwane również nanociałami, definiuje się jako domeny wiążące antygen jednołańcuchowych przeciwciał wielbłądowatych. Podobnie jak powszechne przeciwciała dwułańcuchowe, wykazują wysokie powinowactwo i swoistość dla swoich celów. Otrzymane w ten sposób chimeryczne białko wykazywało wysokie powinowactwo do celu, zachowując jednocześnie aktywność β-laktamazy. Sugeruje to, że ugrupowania nanonomy i β-laktamazy pozostają funkcjonalne. W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowy protokół, który łączy nasz hybrydowy system β-laktamazy z technologią biosensorów. Specyficzne wiązanie nanonika z jego celem można wykryć dzięki konduktometrycznemu pomiarowi protonów uwalnianych przez aktywność katalityczną enzymu.

Projektowanie i inżynieria białka chimerycznego BlaP-cAb-Lys3
Rysunek 1 przedstawia insercję cAb-Lys3 w pętlę dopuszczalną β-laktamazy klasy A BlaP z Bacillus licheniformis. Insercja została przeprowadzona pomiędzy resztami Asp198 a Lys199. Po każdej stronie cAb-Lys3 wprowadzono miejsce cięcia trombiny. Komórki przekształcone plazmidem do ekspresji konstytutywnej kodującym chimeryczne białko BlaP-cAb-Lys3 były zdolne do wz...

W tej pracy opisujemy nową metodę badania interakcji białko-białko za pomocą konduktometrycznego biosensora opartego na technologii hybrydowej β-laktamazy. Metoda ta polega na uwalnianiu protonów w wyniku hydrolizy β-laktamów.

Zastosowanie testu konduktometrycznego biosensora na bazie β-laktamazy do wykrywania oddziaływań biomolekularnych

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

Ogólnym celem niniejszego testu z wykorzystaniem biosensora konduktometrycznego jest wykrywanie oddziaływań biomolekularnych przy użyciu hybrydowej technologii beta-laktamazy. Opisujemy metodę wykrywania oddziaływań przeciwciało-antygen z wykorzystaniem chimerycznego białka beta-laktamazy. Zasada tej metody opiera się na wykrywaniu wiązania poprzez pomiar uwalniania protonów w wyniku aktywności beta-laktamazy.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z konwencjonalnymi immunosensorami jest zastosowanie chimerycznej beta-laktamazy, co pozwala na przeprowadzenie tańszych i szybszych analiz sensorycznych dzięki wykorzystaniu białka hybrydowego do detekcji analitów. Procedurę zaprezentuje Mathieu Dondelinger, doktorant. Należy rozpocząć tę procedurę od przygotowania próbki białka i roztworu zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Elektrodę wielokrotnego użytku przygotowuje się poprzez zanurzenie jej końcówek w dołkach płytki 96-dołkowej zawierającej 300 µL na dołek roztworu do przygotowania elektrod na dwie minuty, przy delikatnym mieszaniu w temperaturze pokojowej.Powtórz ten krok trzy razy. Następnie wypłucz elektrody, zanurzając ich końcówki w studzienkach płytki 96-dołkowej zawierającej 300 µL wody destylowanej na studzienkę przez dwie minuty, delikatnie mieszając w temperaturze pokojowej. Aby zregenerować elektrody, zanurz ich końcówki w studzienkach płytki 96-dołkowej zawierającej 300 µL roztworu regenerującego na studzienkę przez noc w temperaturze 4 °C lub przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Następnie należy trzykrotnie przemyć elektrody, zanurzając ich końcówki w dołkach płytki 96-dołkowej zawierających 300 µL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym w każdym dołku. Każde przemywanie powinno trwać dwie minuty przy łagodnym mieszaniu w temperaturze pokojowej. Następnie należy pokryć powierzchnię polianilinową elektrody lizozymem białka jaja kurzego, nanosząc na powierzchnię elektrody 15 µL kroplę HEWL o stężeniu 40 µg/mL przygotowanego w buforze fosforanowym.Inkubuj elektrodę przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie przeprowadź trzy płukania elektrod buforem fosforanowym, zanurzając części elektrod chipów sensorycznych w studzience płytki 96-dołkowej zawierającej 300 µL buforu fosforanowego na studzienkę. Każde płukanie wykonuj przez dwie minuty, delikatnie mieszając w temperaturze pokojowej.Nasyć elektrody, nakładając kroplę 30 µL roztworu blokującego na powierzchnię elektrody. Inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj trzy razy w ten sam sposób co wcześniej.Rozcieńcz roztwory BlaP-cAb-Lys3 lub BlaP do stężenia 20 µg/mL w buforze wiążącym. Następnie nanieś 15 µL kroplę tak rozcieńczonego roztworu na elektrody. Inkubuj elektrody przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Po reakcji nanoprzeciwciała z antygenem przemyj elektrody trzykrotnie roztworem piorącym. Następnie przemyj elektrody sensora w buforze detekcyjnym, zanurzając je w studzience płytki 96-dołkowej zawierającej 300 µL buforu detekcyjnego na studzienkę. Inkubuj przez jedną minutę.W celu detekcji podłącz cyfrowy multimetr do komputera. Następnie podłącz chip sensoryczny do cyfrowego multimetru za pomocą miedzianych ścieżek obwodu. Wywołaj odpowiedź sensora, nanosząc 50 µL kroplę 4 mM roztworu benzylpenicyliny na elektrody oznaczone znakiem dodatnim.Nanieś kroplę 50 µL roztworu detekcyjnego na elektrody z oznakowaniem negatywnym, aby służyły one jako kontrola negatywna. Monitoruj wartości konduktometryczne za pomocą podłączonego cyfrowego multimetru przez 30 minut. Wizualizuj dane w czasie rzeczywistym bezpośrednio na ekranie lub wyeksportuj dane cyfrowe do pliku tekstowego.Te surowe dane można przedstawić na wykresie w celu uzyskania wyniku graficznego, który reprezentuje pomiary zmian przewodnictwa między elektrodą referencyjną a próbkową w funkcji czasu. Do konstrukcji białka chimerycznego wykorzystano beta-laktamazę klasy A BlaP jako białko nośne. Tutaj reszty katalityczne przedstawiono na czerwono.Miejsce insercji znajdujące się w pętli wyeksponowanej na rozpuszczalnik zaznaczono kolorem żółtym. Fragment przeciwciała wielbłądziego o nazwie cAb-Lys3 został wstawiony do BlaP. Powstałe białko chimeryczne, BlaP-cAb-Lyse3, jest zdolne do wiązania HEWL przy jednoczesnym zachowaniu aktywności beta-laktamazy.HEWL została unieruchomiona na elektrodzie pokrytej polianiliną przed naniesieniem BlaP-cAb-Lys3. Uwolnienie protonów podczas hydrolizy benzylpenicyliny przez unieruchomione białko chimeryczne indukuje zmiany przewodnictwa, które mogą być interpretowane przez użytkownika. Czujniki zawierają osiem chipów zorganizowanych w cztery pary.Każdy chip zawiera trzy elektrody: jedną elektrodę roboczą powleczoną polianiliną, jedną elektrodę odniesienia oraz jedną elektrodę pomocniczą. W każdej parze chip z oznaczeniem „negative” odpowiada kontroli negatywnej, natomiast chip z oznaczeniem „positive” odpowiada badanej próbce. Przedstawione tutaj pomiary konduktancji wykazują specyficzną interakcję BlaP-cAb-Lys3 z HEWL.Zmiany przewodnictwa wynikają z uwalniania protonów indukowanego przez hydrolizę antybiotyku przez unieruchomioną chimeryczną beta-laktamazę. W przypadku kontroli negatywnej, natywnej beta-laktamazy BlaP, nie wykryto wiązania. Po opanowaniu tej techniki, proces ten można przeprowadzić w pół dnia, pod warunkiem prawidłowego wykonania i optymalizacji warunków eksperymentalnych.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ wprowadzenie fragmentu przeciwciała do BlaP jest wymagającym zadaniem. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że jakość uzyskanych danych będzie zależeć od funkcjonalności chimerycznej beta-laktamazy. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody pozwalające na ilościowe określenie wykrytej interakcji, aby wyznaczyć stałą asocjacji równowagowej tej interakcji.Po opracowaniu technika ten utorował drogę badaczom z dziedziny immunobiosensorów do badania oddziaływań molekularnych w różnych próbkach, od organizmów żywych po zróżnicowane środowiska. Zastosowania tej techniki obejmują detekcję licznych biomolekuł, ponieważ technologia chimerycznej beta-laktamazy jest wszechstronnym narzędziem do funkcjonalizacji dowolnego przeciwciała lub fragmentu białka. W związku z tym może ona zostać wykorzystana do opracowania tanich i szybkich narzędzi diagnostycznych w wielu dziedzinach, takich jak zdrowie ludzi i zwierząt.

the-use-lactamase-based-conductimetric-biosensor-assay-to-detect

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy metodę testową z wykorzystaniem czujnika elektrochemicznego do szybkiego wykrywania i identyfikacji bakterii. Badanie wykorzystuje macierz czujników z funkcjonalizowanymi sondami wychwytującymi w postaci oligonukleotydów DNA dla sekwencji specyficznych dla gatunku rybosomalnego RNA (rRNA). Hybrydyzacja typu kanapkowego docelowego rRNA z sondą wychwytującą oraz sondą detekcyjną w postaci oligonukleotydu DNA sprzężonego z peroksydazą chrzanową generuje mierzalny prąd amperometryczny.

Wykrywanie i identyfikacja bakterii z wykorzystaniem czujników elektrochemicznych

Ten film demonstruje test biosensoryczny konduktometryczny do badania interakcji przeciwciała z docelowym antygenem unieruchomionym na chipie przetwornika. Bioczujnik został zaprojektowany tak, aby zawierał dwufunkcyjne białko chimeryczne – enzym β-laktamazy z funkcjonalnym miejscem katalitycznym połączonym z nanolitem w celu związania się z unieruchomionym antygenem docelowym. Po związaniu katalityczna hydroliza substratu antybiotykowego przez enzym β-laktamazę generuje sygnał elektryczny –...

Test biosensoryczny konduktometryczny na bazie β-laktamazy do interakcji białko-białko

Nabyta oporność na antybiotyki jest poważnym problemem publicznej opieki zdrowotnej i jest obecnie klasyfikowana przez WHO jako jedno z największych zagrożeń dla życia ludzkiego. W tym miejscu opisujemy zastosowanie technologii wspornikowej do ilościowego określenia oporności na środki przeciwbakteryjne, co ma kluczowe znaczenie dla odkrycia nowych i skutecznych środków przeciwko bakteriom wielolekoopornym.

Nanomechanika oddziaływań lek-cel i wykrywanie oporności na leki przeciwbakteryjne

Protokoły tutaj opisują kinetyczne testy interakcji białko-białko za pomocą interferometrii warstwy biologicznej. Syntaza ATP typu F, która bierze udział w metabolizmie energii komórkowej, może być hamowana przez swoją ε podjednostka u bakterii. Dostosowaliśmy interferometrię biowarstw do badania oddziaływań kompleksu katalitycznego z hamującą domeną C-końcową ε.

Interferometria biowarstwowa do pomiaru kinetyki oddziaływań białko-białko i efektów ligandów allosterycznych

Opisujemy tutaj protokoły pomiaru powinowactwa i kinetyki wiązania przeciwciało-antygen przy użyciu czterech powszechnie używanych platform biosensorów.

Oznaczanie kinetyki wiązania przeciwciało-antygen o wysokim powinowactwie przy użyciu czterech platform biosensorowych

Platforma mikroprzepływowego biosensoru została zaprojektowana i wykonana przy użyciu taniej technologii fotorezystu z suchą folią do szybkiej i czułej kwantyfikacji różnych analitów. Ten jednorazowy system pozwala na elektrochemiczny odczyt testów enzymatycznych immobilizowanych na chipie za pomocą techniki stop-flow.

Elektrochemiczna platforma biosensorów mikroprzepływowych oparta na suchym filmie fotorezystu: produkcja urządzenia, przygotowanie testu na chipie i obsługa systemu

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania i kwantyfikacji nisko obfitych cząsteczek w złożonych roztworach za pomocą imprintingu molekularnego w połączeniu z biosensorem pojemnościowym.

Ultraczułe wykrywanie biomarkerów za pomocą biosensora pojemnościowego opartego na imprintingu molekularnym

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

To badanie miało na celu przedstawienie strategii identyfikacji interakcji lek-peptyd. Strategia obejmuje biopanowanie krótkich peptydów rozpoznających leki w oparciu o bioczujnik mikrowagi kwarcowej (QCM), a następnie analizę bioinformatyczną w celu ilościowej oceny uzyskanych informacji w celu rozpoznania leku i adnotacji miejsc wiązania leku na białkach.

Oparta na biosensorach strategia wysokoprzepustowej analizy biopanningowej i bioinformatycznej do globalnej walidacji interakcji lek-białko

Ten artykuł opisuje protokół badania interakcji DNA-białko za pomocą systemu interferometrii biowarstwowej (BLI) opartego na streptawidynie. Przedstawiono w nim podstawowe kroki i rozważania dotyczące wykorzystania podstawowej lub zaawansowanej kinetyki wiązania w celu określenia powinowactwa wiązania równowagi (KD) oddziaływania.

Analiza interakcji DNA-białko za pomocą interferometrii biowarstwowej opartej na streptawidynie

Ten protokół przedstawia standardowy przepływ wysokowydajnego przesiewania dla mikroorganizmów przemysłowych. Obejmuje ono konstruowanie biblioteki mutantów poprzez mutagenezę ARTP, przeprowadzanie pozytywnego przesiewania kropel za pomocą zautomatyzowanych mikrofluidów i następnie weryfikację wyników. Niezawodność przepływu została zweryfikowana poprzez przesiewanie wysokowydajnych szczepów B. coagulans.

Przesiewowe badanie wysokowydajne mutantów Bacillus coagulans hiperprodukujących kwas L-mlekowy za pomocą zautomatyzowanej platformy mikrofluidycznej kroplowej

Poznaj konduktometryczny biosensor oparty na hybrydowej β-laktamazie do wykrywania interakcji antygen-przeciwciało. Ta metoda mierzy uwalnianie protonów, oferując szybszą i tańszą alternatywę dla tradycyjnych immunosensorów.

Zastosowanie testu konduktometrycznego biosensora na bazie β-laktamazy do wykrywania oddziaływań biomolekularnych

Przeglądaj więcej filmów