Name: Wspomagana skanowaniem peptydowym identyfikacja liniowego epitopu limfocytów B rozpoznanego przez przeciwciało monoklonalne (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji liniowego epitopu limfocytów B rozpoznawanego przez przeciwciało monoklonalne przy użyciu skanowania peptydowego i hybrydyzacji dot-blot. Protokół ten jest prosty i wydajny, znajdując zastosowanie w badaniach immunologicznych oraz diagnostyce.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Pannie Ching-Chun Lin i Pannie Dianie Lin z Głównego Ośrodka Instytutu Biologii Komórkowej i Organizmów (ICOB) Academia Sinica za zaoferowanie swojej wiedzy na temat syntezy peptydów i sekwencjonowania DNA. Badanie to było wspierane przez Academia Sinica.

1. Przygotowanie przeciwciała monoklonalnego
<ol>
	<li>Hodowla mysich komórek hybrydoma monoklonalnego RG-M56 2 w podłożu bez surowicy w kolbach 175T w temperaturze 37 ºC z dodatkiem 5% CO2 . Zebrać supernatant, gdy kolor podłoża zmieni kolor na żółty po pięciu dniach inkubacji. 
	UWAGA: Komórki hybrydoma hodowano w pożywce bez surowicy, aby uniknąć zanieczyszczenia przeciwciałami płodową surowicą bydlęcą.</li>
	<li>Odwirować supernatant w temperaturze 4 500 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i wyrzucić osad z resztek komórek.</li>
	<li>Dodaj 2 ml białka G agarozy (dostarczanej w postaci 50% zawiesiny) do kolumny o pojemności 5 ml i zrównoważ z 10 objętościami żywicy (10 ml) lodowatego PBS.</li>
	<li>Załadować 200 ml supernatantu przeciwciała (krok 1.2) na kolumnę i odrzucić przepustowość.</li>
	<li>Dodaj 10 ml lodowatego PBS do kolumny, aby ją umyć. Powtórz dwa razy.</li>
	<li>Dodaj 10 ml 50 mM glicyny o pH 2,7 do kolumny, aby wymyć przeciwciało związane z białkiem G. Zebrać 900 μl frakcji w probówce mikrowirówki zawierającej 100 μl 10x buforu neutralizującego (1 M Tris, 1,5 M NaCl i 1 mM EDTA, pH 8,0).</li>
	<li>Oczyszczone przeciwciało należy przechowywać w 50% glicerolu z 0,03% NaN3 w temperaturze -20 ºC.</li>
</ol>
2. Budowa i ekspresja seryjnie ściętych białek rekombinowanych
<ol>
	<li>Przygotuj mieszaninę reakcyjną PCR: 5 μL 10x buforu Pfu, 0,2 mM każdego dNTP, 0,2 μM startera do przodu3, 0,2 μM starter odwrotny3, 2 mM MgSO4, 1 ng pET20b-1A593 plazmidowego DNA i 2,5 U (jednostka) polimerazy Pfu DNA; dodać ddH2O do końcowej objętości 50 μL.
	<ol>
		<li>Badać próbki w automatycznym termocyklerze, stosując następujące parametry: cykl 1 (94 ºC przez 5 minut); cykle 2-36 (94 ºC przez 30 s, 63 ºC przez 30 s i 72 ºC przez 60 s); i cykl 37 (72 ºC przez 7 min).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrahuj produkty reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) za pomocą zestawu do oczyszczania PCR5, aby ułatwić następujące trawienie enzymem restrykcyjnym.</li>
	<li>Trawić fragmenty DNA amplifikowane PCR enzymami restrykcyjnymi NdeI i Xho I i XhoI i ligować każdy z tych fragmentów DNA do wektora pET-20b(+) rozszczepionego enzymem NdeI i XhoI. Przekształć konstrukty w komórki kompetentne Escherichia coli DH-5α6.
	<ol>
		<li>Przygotować mieszaninę wytrawiającą w buforze do wytrawiania (20 mM tris-octanu, 10 mM Mg(CH3COO)2, 50 mM KCH3COO i 1 mM DTT, pH 7,9) z 1 μg DNA amplifikowanego PCR lub wektora pET-20b(+) DNA i 2 U enzymów restrykcyjnych NdeI i XhoI w końcowej objętości 20 μL.</li>
		<li>Delikatnie wymieszaj mieszankę wytrawiającą i szybko odwiruj. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny w suchej kąpieli, aby zapewnić całkowite przecięcie miejsc ograniczenia.</li>
		<li>Ekstrahuj fragmenty DNA trawione przez enzym restrykcyjny za pomocą zestawu do oczyszczania PCR5, aby ułatwić następującą budowę plazmidu.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę ligacyjną w buforze do ligacji (66 mM Tris, 5 mM MgCl2, 1 mM ATP i 5 mM DTT, pH 7,5) ze 100 ng wstępnie strawionego DNA amplifikowanego PCR, 10 ng wstępnie strawionego DNA wektora pET-20b(+) i 5 U ligazy DNA T4 w końcowej objętości 10 μl.</li>
		<li>Delikatnie wymieszaj mieszaninę ligacyjną i szybko odwiruj. Inkubować w temperaturze 16 °C przez 18 godzin w łaźni wodnej.</li>
		<li>Umieścić 10 μl próbek ligacji w 100 μl komórek kompetentnych dla DH-5α i delikatnie wymieszać przed umieszczeniem probówki mikrowirówki na lodzie na 30 minut. Umieścić probówkę mikrowirówki w suchej kąpieli w temperaturze 42 ºC na 90 s, aby wywołać szok cieplny7. Natychmiast przenieś probówkę na lód na 2 minuty.</li>
		<li>Do probówki dodać 900 μl bulionu Luria-Bertani (LB) (1% tryptonu Bacto, 0,5% ekstraktu drożdżowego Bacto i 0,5% NaCl, pH 7,0). Inkubować w temperaturze 37 °C z prędkością 150 obr./min, wytrząsając przez 45 min. Osadzać komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 000 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad z 50 μl bulionu LB i rozprowadzić każdą przemianę na wstępnie podgrzanych płytkach LB zawierających 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.</li>
		<li>Zbierz pojedynczą kolonię za pomocą końcówki o pojemności 200 μl i umieść ją w 3 ml bulionu LB zawierającego 100 μg/ml ampicyliny w luźno zamkniętej probówce o pojemności 15 ml. Inkubować w temperaturze 37 °C z prędkością 150 obr./min, wytrząsając przez 12 godzin.</li>
		<li>Wyekstrahuj plazmid DNA8 z każdej kultury i zsekwencjonuj go za pomocą starterów promotora T7 i terminatora T7, aby potwierdzić sekwencję9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po potwierdzeniu sekwencji przekształć 10 ng DNA z tych plazmidów pET-20b(+) o różnej długości genu białka płaszcza YGNNV w szczep BL-21 (DE3) E. coli za pomocą metody szoku cieplnego7. Wykonaj kroki 2.3.6-2.3.8, aby wykonać transformację.</li>
	<li>Przenieś pojedynczą kolonię z każdej przekształconej komórki E. coli BL-21 do 3 ml bulionu LB zawierającego 100 μg/ml ampicyliny w luźno zamkniętej probówce o pojemności 15 ml. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 150 obr./min.</li>
	<li>Schłodzić kulturę do 25 °C, gdy OD600 w kulturze wynosi około 0,6 i dodać IPTG do końcowego stężenia 0,4 mM w celu wywołania ekspresji rekombinowanego białka. Inkubować kulturę przez dodatkowe 4 godziny w temperaturze 25 °C z wytrząsaniem 200 obr./min.</li>
	<li>Przenieść 1 ml kultury do probówki mikrowirówkowej. Osadzać komórki przez odwirowanie w stężeniu 12 000 x g przez 1 minutę i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 100 μl buforu denaturacyjnego (8 M mocznika, 20 mM fosforanu sodu i 0,5 M NaCl, pH 7,4), pipetując w górę iw dół za pomocą mikropipety. Mieszać przez energiczne wirowanie. 
	UWAGA: Roztwory próbek powinny być teraz półprzezroczyste, lekko lepkie i gotowe do testu hybrydyzacji kropkowej.</li>
</ol>
3. Projektowanie i synteza nakładających się peptydów
<ol>
	<li>Zaprojektuj i zsyntetyzuj3 szeregowe 20-merowe peptydy, z których każdy nakłada się na swój następca o 10 reszt aa z regionu 195-338 aa białka płaszcza YGNNV, aby zawęzić region epitopu mAb RG-M56 za pomocą klombu punktowego.</li>
	<li>Zaprojektuj i zsyntetyzuj 3 trzy 8-merowe peptydy (195VNVSVLCR202, 197VSVLCRWS204 i 199VLCRWSVR206) z nałożeniem 6 reszt aa na następny syntetyczny peptyd, aby zawęzić region epitopu 195-206 aa za pomocą kropkowego blottingu.</li>
	<li>Zaprojektuj i zsyntetyzuj 3 peptydy 7-merowe (196NVSVLCR202 i 195VNVSVLC201), 6-merowe (195VNVSVL200, 196NVSVLC201 i 197VSVLCR202) oraz peptydy 5-merowe (195VNVSV199, 196NVSVL200, 197VSVLC201 i 198SVLCR202) z nakładaniem się odpowiednio 6, 5 i 4 reszt AA na sąsiednie peptydy, aby zminimalizować region epitopu przez plamienie kropkowe.</li>
</ol>
4. Hybrydyzacja punktowo-plamowa
<ol>
	<li>Rozpuścić każdy zsyntetyzowany peptyd w dimetylosulfotlenku (DMSO) do końcowego stężenia 10 mg/ml. 
	UWAGA: Aby przezwyciężyć zróżnicowaną rozpuszczalność peptydów syntetycznych, wszystkie peptydy syntetyczne należy rozpuścić w DMSO. DMSO jest dobrym rozpuszczalnikiem do całkowitego rozpuszczenia peptydów hydrofobowych lub hydrofilowych.</li>
	<li>Namocz membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) w metanolu przez 2 min. 
	UWAGA: membrana PVDF jest do 100% odporna na DMSO; inni mogą tak nie być.</li>
	<li>Zrównoważyć membranę PVDF ze zmodyfikowanym buforem Towbin (25 mM Tris, 192 mM glicyny i 0,1% SDS, pH 8,3) przez 2 minuty 
	UWAGA: 10-20% (v/v) metanolu można dodać do zmodyfikowanego bufora Towbin w celu poprawy wyników transferu.</li>
	<li>Opłucz kawałek bibuły chromatograficznej zmodyfikowanym buforem Towbin. Umieścić membranę PVDF na bibule chromatograficznej. Poczekaj, aż zmodyfikowany bufor pojemnika holowniczego zniknie z powierzchni membrany PVDF, zanim przejdziesz do następnego kroku.</li>
	<li>Dodać 2 μl każdej próbki peptydu do membrany za pomocą końcówki o pojemności 10 μl. Wysuszyć membranę PVDF na bibule chromatograficznej na powietrzu przez 10 minut. Dodawaj każdą próbkę peptydu powoli i stopniowo do membrany, aby uniknąć zbyt dużej dyfuzji.</li>
	<li>Zablokuj membranę w buforze TBST (0,05% (v/v) Tween-20, 20 mM Tris i 150 mM NaCl, pH 7,4) z 5% mlekiem beztłuszczowym przez 30 minut w temperaturze pokojowej delikatnie wstrząsając.</li>
	<li>Dodać mAb RG-M56 w końcowym rozcieńczeniu 1:1,000 w buforze TBST z 5% mlekiem beztłuszczowym do membrany. Inkubować błonę w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, delikatnie wstrząsając.</li>
	<li>Usunąć roztwór przeciwciał. Płukać membranę w buforze TBST przez 5 minut, delikatnie wstrząsając. Powtórz dwa razy.</li>
	<li>Dodać przeciwciało drugorzędowe (kozie przeciwciało anty-mysie IgG, Fc, sprzężona fosfataza alkaliczna) w końcowym rozcieńczeniu 1:5 000 w buforze TBST z 5% mlekiem beztłuszczowym do membrany. Inkubować błonę w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, delikatnie wstrząsając.</li>
	<li>Wyrzucić roztwór przeciwciała. Płukać membranę w buforze TBST przez 5 minut, delikatnie wstrząsając. Powtórz krok prania dwa razy.</li>
	<li>Rozwinąć membranę z roztworem substratu BCIP/NBT w temperaturze pokojowej przez 15 minut w ciemności. Zatrzymaj rozwój, myjąc membranę ddH2O, gdy pojawi się sygnał.</li>
	<li>Wysusz membranę na powietrzu i uchwyć obraz kropkowy za pomocą systemu obrazu.</li>
	<li>Zmierz intensywność każdej plamy punktowej za pomocą oprogramowania do analizy obrazu3.</li>
</ol>
5. Skanowanie i podstawianie alaniny
<ol>
	<li>Zaprojektuj i zsyntetyzuj 3 peptydy substytucji alaniny i metioniny. Zastąp każdą resztę aa alaniną dla 8-merowego peptydu 195VNVSVLCR202 i zsyntetyzuj peptydy 195ANVSVLCR202, 195VAVSVLCR202, 195VNASVLCR202, 195VNVAVLCR202, 195VNVSALCR202, 195VNVSVACR202, 195VNVSVLAR202 i 195VNVSVLCA202. Zamień resztę aa leucyny 200 na metioninę, aby utworzyć peptyd epitopu genotypu SJNNV 195VNVSVMCR202.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z sekcją 4, aby wykonać skanowanie alaniny i mutagenezę punktową mutagenezy.</li>
</ol>

<ol><li>Milstein, C., Kohler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+variations+of+myelomatous+cells+%28proceedings%29%5BTitle%5D)+AND+%22Minerva+Med%22%5BJournal%5D)">Clonal variations of myelomatous cells (proceedings).</a> Minerva Med. 68 (50), 3453(1977).</li>
<li>Lai, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-2761.2001.00293.x/abstract">In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel).</a> J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).</li>
<li>Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+Linear+B-Cell+Epitope+of+Betanodavirus+Coat+Protein+by+RG-M18+Neutralizing+mAB+Inhibits+Giant+Grouper+Nervous+Necrosis+Virus+%28GGNNV%29+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection.</a> PLoS One. 10 (5), 0126121(2015).</li>
<li>Lai, Y. -S., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-2761.2001.00303.x/abstract">Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel), brain tissue.</a> J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).</li>
<li>Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+HLA+typing+designed+for+solid+organ+transplantation%3A+epityping+and+its+application+to+the+HLA-A+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Immunogenet%22%5BJournal%5D)">A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus.</a> Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).</li>
<li>Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+gateway+system+for+double+shRNA+expression+and+Cre%2Flox+based+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression.</a> BMC Biotechnol. 11, 24(2011).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J Vis Exp. (6), e253(2007).</li>
<li>Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Miraprep%3A+A+Protocol+that+Uses+a+Miniprep+Kit+and+Provides+Maxiprep+Yields%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields.</a> PLoS One. 11 (8), e0160509(2016).</li>
<li>Metzker, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+technologies+in+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Emerging technologies in DNA sequencing.</a> Genome Res. 15 (12), 1767-1776 (2005).</li>
<li>Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+ayu+%28Plecoglossus+altivelis%29+Pit-1+in+Escherichia+coli%3A+its+purification+and+immunohistochemical+detection+using+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody.</a> Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).</li>
<li>Atassi, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+structures+of+proteins.+Their+determination+has+revealed+important+aspects+of+immune+recognition+and+generated+strategies+for+synthetic+mimicking+of+protein+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites.</a> Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).</li>
<li>Opuni, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+epitope+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric epitope mapping.</a> Mass Spectrom Rev. , (2016).</li>
<li>Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A. <a target="_blank" href="http://library.wur.nl/WebQuery/clc/1931063">The Aquaculture of Groupers</a>. Liao, I. C., Leaño, E. M. , Taiwan Asian Fisheries Society, World Aquaculture Society, The Fisheries Society of Taiwan, National Taiwan Ocean University, Taiwan Press. 207-224 (2008).</li>
<li>Conti-Tronconi, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-bungarotoxin+and+the+competing+antibody+WF6+interact+with+different+amino+acids+within+the+same+cholinergic+subsite%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite.</a> Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).</li>
<li>Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+specificity+of+antibody+recognition+of+carcinoma-associated+epithelial+mucins%3A+antibody+binding+to+synthetic+peptide+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes.</a> Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).</li>
<li>Chen, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structures+of+a+Piscine+Betanodavirus%3A+Mechanisms+of+Capsid+Assembly+and+Viral+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection.</a> PLoS Pathog. 11 (10), e1005203(2015).</li>
<li>Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+entry+inhibitors+of+enveloped+viruses%3A+The+importance+of+interfacial+hydrophobicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity.</a> Biochim Biophys Acta. , (2014).</li>
<li>Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+putative+cellular+receptor+for+HIV-1+transmembrane+glycoprotein+using+synthetic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides.</a> AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konfliktu interesów w związku z niniejszym raportem.

Protokół ten oferuje szybką i prostą technikę identyfikacji epitopu liniowego rozpoznawanego przez mAb. Biorąc pod uwagę koszt syntezy peptydów i wydajność produkcji peptydów syntezujących, region antygenowy białka płaszcza wirusa został zmniejszony poprzez ekspresję seryjnie skróconych białek rekombinowanych przed analizą skanowania peptydów. W związku z tym niezawodny i wydajny system ekspresji pET E. coli został wykorzystany do produkcji tych seryjnie skróconych białek rekombinowanych, ponieważ rekombinowane ...

W układzie odpornościowym rekombinacja segmentów V, D i J pozwala przeciwciałom na tworzenie ogromnych różnic w regionach determinujących komplementarność (CDR) do wiązania się z różnymi antygenami w celu ochrony gospodarza przed patogenną infekcją. Obrona neutralizująca przeciwciał przeciwko antygenom zależy od komplementarności przestrzennej między CDR przeciwciał a epitopami antygenów. W związku z tym zrozumienie tej interakcji molekularnej pomoże w projektowaniu szczepionek profilaktycznych i opracowywaniu terapeutycznych leków peptydowych. Jednak na tę interakcję neutralizacyjną może wpływać zarówno wiele domen antygenowych z jednego antygenu, jak i wiele CDR przeciwciał, co w konsekwencji sprawia, że proces oznaczania epitopów jest bardziej złożony. Na szczęście rozwój technologii hybrydoma, która łączy pojedyncze komórki wytwarzające przeciwciała z komórkami szpiczaka, pozwala na to, aby stale dzieląca się partia komórek wydzielała jedno specyficzne przeciwciało, znane jako przeciwciało monoklonalne (mAb)1. Komórki hybrydoma wytwarzają te czyste przeciwciała monoklonalne o wysokim powinowactwie, aby związać się z pojedynczą domeną antygenową określonego antygenu. Po ustaleniu relacji antygen-przeciwciało, można zastosować kilka podejść, w tym skanowanie peptydowe, w celu określenia epitopu antygenu za pomocą odpowiadającego mu mAb. Ostatnie osiągnięcia w technologii syntetycznych peptydów sprawiły, że technika skanowania peptydów jest bardziej dostępna i wygodniejsza do wykonania. Krótko mówiąc, zestaw nakładających się na siebie syntetycznych peptydów jest wytwarzany zgodnie z docelową sekwencją antygenu i jest powiązany z błoną podpartą ciałem stałym w celu hybrydyzacji mAb. Skanowanie peptydowe nie tylko oferuje prosty sposób mapowania regionu wiązania przeciwciała, ale także ułatwia mutagenezę aminokwasów (aa) poprzez skanowanie reszt lub substytucję w celu oceny interakcji wiązania między każdą resztą aa peptydu epitopowego a CDR przeciwciała.
Tutaj, niniejsze badanie opisuje protokół skutecznej identyfikacji liniowego epitopu białka płaszcza wirusa żółtej frakcji nerwowej (YGNNV) za pomocą neutralizującego mAb2,3,4. Protokół obejmuje przygotowanie mAb, konstrukcję i ekspresję seryjnie skróconych białek rekombinowanych, syntetyczny projekt nakładających się peptydów, hybrydyzację kropka-blot, skanowanie alaniny i mutagenezę substytucyjną. Biorąc pod uwagę wysoki koszt syntezy peptydów, etap seryjnego obcinania rekombinowanych białek pożądanego białka docelowego został zmodyfikowany, a region antygenowy został zawężony do około 100 do 200 reszt aa przed przeprowadzeniem analizy dot-blot z syntetyczną matrycą peptydów.

<table><tbody><tr><td>Pożywka hybrydowa SFM</td><td>Gibco</td><td>12045-076</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbeccosa (PBS)</td><td>Gibco</td><td>21600-069</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Pfu&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>EP0502&nbsp;</td><td>Łącznie z</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaze</td><td>Roche</td><td>10799009001</td><td>W tym</td></tr><tr><td>NdeI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td>W tym</td></tr><tr><td>XhoI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>W tym</td></tr><tr><td>pET-20b(+) wektor</td><td>Novagen, Merck Millipore</td><td>69739</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH-5&alpha; kompetentna komórka</td><td>RBC Bioscience</td><td>RH617</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BL-21(DE3) kompetentna komórka</td><td>RBC Bioscience</td><td>RH217</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Amresco</td><td>0339-25G</td><td></td></tr><tr><td>Rosół LB&nbsp;</td><td>Invitrongen</td><td>12780-052</td><td></td></tr><tr><td>Izopropylotio-&beta;-D-tiogalaktozyd (IPTG)</td><td>MDBio, Inc.</td><td>101-367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck Millipore</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>Polioksyetylenu 20 Monolaurynian sorbitanu (Tween-20)</td><td>J.T.Baker</td><td>X251-07</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Amresco</td><td>0167-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Affymetrix, USB</td><td>75825</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Amresco</td><td>0241-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Amresco</td><td>0105-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Amresco</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma</td><td>S2002-500G</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL937001PK</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgG, Fc</td> fragment przeciwciało <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-055-008</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P (polifluorek winylidenu, PVDF)</td><td>Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Białko G Agaroza Szybki przepływ</td><td>Merck Millipore</td><td>16-266</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Zestaw oczyszczający</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>UVP BioSpectrum 600 System obrazowania</td><td>UVP</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy VisionWorks LS Ver 6.8</td><td>UVP</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler MyCycler</td><td>BioRad</td><td>1709713</td><td></td></tr></tbody></table>

wspomagana skanowaniem peptydowym identyfikacja liniowego epitopu limfocytów b rozpoznanego przez przeciwciało monoklonalne

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

Identyfikacja epitopu antygenowego przez układ odpornościowy pozwala na zrozumienie ochronnego mechanizmu przeciwciał neutralizujących, które mogą ułatwić rozwój szczepionek i leków peptydowych. Skanowanie peptydowe to prosta i skuteczna metoda, która w prosty sposób mapuje liniowy epitop rozpoznawany przez przeciwciało monoklonalne (mAb). W tym miejscu autorzy przedstawiają metodologię oznaczania epitopów obejmującą seryjnie skrócone białka rekombinowane, konstrukcję syntetycznego peptydu i hybrydyzację kropkową w celu antygenowego rozpoznawania białka płaszcza wirusa martwicy nerwów przy użyciu neutralizującego mAb. Technika ta opiera się na hybrydyzacji kropkowo-plamowej syntetycznych peptydów i mAb na membranie z polifluorku winylidenu (PVDF). Minimalny region antygenowy białka płaszcza wirusowego rozpoznawanego przez mAb RG-M56 można zawęzić przez mapowanie peptydów krok po kroku na epitopie peptydu 6-merowego. Ponadto można przeprowadzić mutagenezę skaningową alaniny i substytucję reszt w celu scharakteryzowania znaczenia wiązania każdej reszty aminokwasowej tworzącej epitop. Stwierdzono, że reszty flankujące miejsce epitopu odgrywają kluczową rolę w regulacji konformacji peptydów. Zidentyfikowany peptyd epitopowy może być wykorzystany do tworzenia kryształów kompleksów peptyd-przeciwciało epitopu do badania dyfrakcji rentgenowskiej i konkurencji funkcjonalnej lub do terapii.

Celem niniejszego eksperymentu była identyfikacja epitopu za pomocą techniki dot blotting przy użyciu przeciwciała mAb. Aby szybko i efektywnie zawęzić obszar antygenowy rozpoznawany przez mAb, pełnowymiarowe i seryjnie skrócone rekombinowane białka kapsydu YGNNV z tagiem 6xHis na końcu C-końcowym wyekspresowano w systemie ekspresyjnym E. coli PET10 (Rysunek 1A). Otrzymane białka rekombinowane naniesiono na membranę PVDF, wykorzystując mAb...

Tutaj autorzy prezentują prosty i skuteczny protokół definiowania liniowego epitopu antygenowego za pomocą oczyszczonego przeciwciała monoklonalnego i skanowania peptydowego poprzez hybrydyzację kropkowo-plamową. Zidentyfikowany epitop może być następnie wykorzystany w zastosowaniach terapeutycznych i diagnostycznych.

Wspomagana skanowaniem peptydowym identyfikacja liniowego epitopu limfocytów B rozpoznanego przez przeciwciało monoklonalne

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest identyfikacja linearnego epitopu limfocytów B rozpoznawanego przez przeciwciało monoklonalne z wykorzystaniem seryjnie skróconych białek rekombinowanych oraz skanowania peptydowego metodą hybrydyzacji dot-blot. Metoda ta pozwala na udzielenie odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące oddziaływań molekularnych między antygenem a przeciwciałem. Głównymi zaletami tej techniki są jej prostota i efektywność.Zidentyfikowany epitop może następnie zostać wykorzystany w bardziej szczegółowych badaniach, na przykład w zastosowaniach terapeutycznych i diagnostycznych. Procedurę zaprezentuje Chien-Wen Chen, stażysta podoktorski z mojego laboratorium. Aby rozpocząć, należy hodować mysie monoclonalne komórki hybridoma RGM56 w hybrydowym medium bezsurowiczym.Hodowle komórkowe należy utrzymywać w kolbach T175 w temperaturze 37°C i 5% dwutlenku węgla. Po pięciu dniach inkubacji, gdy pożywka zmieni kolor na żółty, należy ją zebrać, a nadsącz odwirować z prędkością 4 500 ×g przez 30 minut w temperaturze 4°C. Następnie należy usunąć osad z resztek komórkowych, aby uzyskać przeciwciała w roztworze.Następnie należy dodać dwa mililitry 50% zawiesiny białka G (protein G agro slurry) do kolumny o pojemności pięciu mililitrów i zrównoważyć żywicę za pomocą 10 mililitrów lodowatego PBS, co odpowiada 10 objętościom wstępnie załadowanej żywicy. Na zrównoważoną kolumnę należy nałożyć 200 mililitrów wcześniej przygotowanego roztworu przeciwciał i odrzucić frakcję, która przejdzie przez kolumnę. Kolumnę należy przemyć dwukrotnie, używając 10 mililitrów lodowatego PBS.Na koniec, aby eluiować przeciwciało z żywicy, należy dodać do kolumny 10 ml milimolowego roztworu gliceryny o pH 2,7. Należy zbierać frakcje o objętości 900 µl do probówek do mikrocentryfugi uprzednio wypełnionych 100 µl 10X buforu neutralizującego. Oczyszczone przeciwciało należy przechowywać w 50% roztworze glicerolu z dodatkiem azotku sodu w temperaturze -20 °C.Przygotować konstrukty i przeprowadzić transformację komórek E.coli BL21 zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie przenieść pojedynczą kolonię do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 3 ml bulionu LB uzupełnionego o 100 µg/ml ampicyliny i lekko zakręcić probówkę. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C przy wstrząsaniu z prędkością 150 RPM.Monitoruj gęstość optyczną hodowli przy 600 nanometrach. Gdy osiągnie ona wartość około 0,6, schłodź hodowlę do 25 stopni Celsjusza. Następnie dodaj IPTG do stężenia końcowego 0,4 milimolara, aby indukować ekspresję rekombinowanego białka.Inkubować kulturę przez kolejne cztery godziny w temperaturze 25 °C przy wytrząsaniu z prędkością 200 RPM. Po inkubacji przenieść 1 mL kultury bakteryjnej do probówki do mikrowirówki. Wirować komórki z prędkością 12 000 ×g przez jedną minutę, a następnie odlać nadsącz.Używając mikropipety, resuspenduj osad komórkowy w 100 µL buforu denaturującego poprzez pipetowanie w górę i w dół. Następnie wymieszaj otrzymaną zawiesinę za pomocą intensywnego wstrząsania w wortexie, aby uzyskać gotową do użycia próbkę białka rekombinowanego. W celu przeprowadzenia hybrydyzacji dot-blot rozpuść każdy syntetyczny peptyd w DMSO, aby otrzymać roztwory o stężeniu 10 mg/mL.Następnie aktywuj membranę PVDF w metanolu przez dwie minuty i równoważ ją w zmodyfikowanym buforze Towbina przez kolejne dwie minuty. Przepłucz kawałek papieru chromatograficznego zmodyfikowanym buforem Towbina i połóż na nim zrównoważoną membranę PVDF. Pozostaw membranę do czasu, aż bufor zniknie z jej powierzchni.Za pomocą końcówki 10 µL nanieś 2 µL każdej próbki peptydu lub białka rekombinowanego na membranę i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut. Naniesienie próbki na membranę jest najważniejszym etapem tego protokołu. Precyzyjne nałożenie określonej ilości próbki na niewielki obszar membrany PVDF wymaga szczególnej uwagi.Następnie należy zablokować membranę w buforze TBST z dodatkiem 5% odtłuszczonego mleka przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy delikatnym wstrząsaniu. Przeciwciało monoklonalne RGM56 należy rozcieńczyć w buforze TBST z dodatkiem 5% odtłuszczonego mleka, a następnie nanieść roztwór przeciwciał na membranę.Inkubować membranę w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę przy łagodnym wstrząsaniu. Po inkubacji usunąć roztwór przeciwciał. Następnie przemyć membranę dwukrotnie w buforze TBST przez pięć minut przy łagodnym wstrząsaniu.Następnie na membranę nanosi się roztwór przeciwciała wtórnego rozcieńczonego w buforze TBST z 5% odtłuszczonym mlekiem. Membranę inkubuje się przez jedną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy delikatnym wstrząsaniu. Po inkubacji roztwór przeciwciał należy odlać, a membranę przemyć dwukrotnie w buforze TBST przez pięć minut przy delikatnym wstrząsaniu.Następnie należy przeprowadzić detekcję membrany za pomocą roztworu substratu w temperaturze pokojowej przez 15 minut w ciemności. Po pojawieniu się sygnału reakcję należy przerwać, przemywając membranę wodą dwukrotnie destylowaną. Po wysuszeniu membrany na powietrzu należy wykonać obraz dot-blot za pomocą systemu obrazowania.Na koniec, przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu, zmierzono intensywność każdego dot-blotu. Przedstawiono tutaj białko kodowe wirusa nekrozy nerwów (nervous necrosis virus) o pełnej długości, obejmujące aminokwasy od 1 do 338, wraz z jego seryjnie skróconymi wariantami. Aby potwierdzić ekspresję białek w transformowanych komórkach bakteryjnych, przeprowadzono analizę dot-blot z użyciem przeciwciała anty-6XHis, która wykazała obecność wszystkich badanych białek.Następnie białka rekombinowane poddano analizie metodą hybrydyzacji dot-blot z użyciem przeciwciała monoklonalnego RG-M56. Analiza wykazała, że epitop białkowy rozpoznawany przez przeciwciało znajduje się w peptydzie od 195 do 338. Ostatecznie, za pomocą skanowania peptydowego zidentyfikowano epitop składający się z 20 lub ośmiu reszt aminokwasowych.Skanowanie alaniną wykazało, że podstawienie reszt waliny w pozycjach 197 i 199, a także cystyny w pozycji 201, zniosło zdolność wiązania epitopu oraz hybrydyzację w metodzie dot-blot. Podobnie, w analizie intensywności wiązania zaobserwowano spadek powinowactwa wiązania, co potwierdza, że zidentyfikowane reszty są niezbędne do wiązania epitopu z przeciwciałem monoklonalnym RGM56. Ta technika identyfikacji peptydów może być wykorzystana do opracowywania terapeutycznych leków peptydowych lub preparatów peptydowych.

peptide-scanning-assisted-identification-monoclonal-antibody

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie tetramerów peptyd:MHC oraz magnetycznych mikrokulek do izolacji populacji limfocytów T specyficznych dla epitopu o niskiej częstotliwości oraz ich analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta umożliwia bezpośrednie badanie endogennych populacji limfocytów T w systemach eksperymentalnych in vivo.

Wzbogacanie limfocytów T swoistych dla epitopu z wykorzystaniem tetramerów peptyd-MHC

Ten film demonstruje technikę, która wykorzystuje technologię mikromacierzy peptydowych do profilowania specyficzności przeciwciał rozpoznających modyfikacje potranslacyjne (PTM) na peptydach histonowych. Szkiełko mikromacierzy zawierające unieruchomione peptydy histonowe sprzężone z fluoroforem ze znanymi kombinacjami PTM poddaje się działaniu docelowych przeciwciał specyficznych dla PTM. Proces ten pomaga zidentyfikować swoistość przeciwciała dla celu i jego potencjalną reaktywność krzyżową z...

Technologia mikromacierzy peptydowych do profilowania swoistości przeciwciał

Testy biochemiczne z rekombinowanymi ludzkimi cząsteczkami MHC II mogą dostarczyć szybkich, ilościowych wglądów w identyfikację, delecję lub projektowanie epitopów immunogennych. Tutaj opisany jest test wiązania peptyd-MHC II skalowany do płytek 384-dołkowych. Ten opłacalny format powinien okazać się przydatny w dziedzinie deimmunizacji białek oraz projektowania i opracowywania szczepionek.

Wysokoprzepustowy test wiązania MHC II do analizy ilościowej epitopów peptydowych

Ten protokół opisuje rozwój dwóch przeciwciał monoklonalnych klasy IgG (mAb) silnie reaktywnych na mioglobinę u waleni. Te mAb są nakładane na koloidalny złoty immunochromatograficzny pasek testowy oparty na formacie kanapkowym w celu odróżnienia Mb waleni od fok i innych zwierząt.

Opracowanie immunochromatograficznego paska testowego na bazie złota koloidalnego do wykrywania mioglobiny waleni

Biblioteki wyświetlania bakterii w biopanowaniu to sprawdzona technika odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego, solidna alternatywa dla przeciwciał. Półautomatyczna metoda sortowania usprawniła biopanoramowanie w celu zmniejszenia występowania wyników fałszywie dodatnich. Poniżej ilustrujemy proces myślowy i techniki stosowane w ocenie kandydatów i minimalizacji dalszej analizy.

Półautomatyczne biopanowanie bakteryjnych bibliotek wyświetlających w celu odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego i analizy otrzymanych izolatów

Niezgodności w sekwencjach ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA) między parami dawców i biorców narządów są główną przyczyną odrzucenia przeszczepu narządów za pośrednictwem przeciwciał. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie niestandardowych macierzy antygenowych, które są oparte na sekwencjach HLA poszczególnych dawców, do badania alloprzeciwciał HLA przeciwko dawcom u biorców narządów.

Spersonalizowane macierze peptydowe do wykrywania alloprzeciwciał HLA w przeszczepach narządów

Qa-1 (HLA-E u człowieka) należy do grupy nieklasycznych cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej 1b. Wykazano, że immunizacja epitopami wiążącymi Qa-1 zwiększa tkankową regulację immunologiczną i łagodzi kilka chorób autoimmunologicznych. W niniejszym artykule opisujemy nakładającą się strategię biblioteki peptydów do identyfikacji epitopów Qa-1 w białku.

Nakładająca się biblioteka peptydów do mapowania epitopów Qa-1 w białku

Opisujemy metodę produkcji ludzkich przeciwciał specyficznych dla interesującego nas antygenu, zaczynając od rzadkich limfocytów B krążących w ludzkiej krwi. Wytwarzanie tych naturalnych przeciwciał jest wydajne i szybkie, a uzyskane przeciwciała mogą rozróżniać wysoce spokrewnione antygeny.

Wytwarzanie dyskryminujących ludzkich przeciwciał monoklonalnych z rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu B krążących we krwi

Metoda BSelex do identyfikacji i odzyskiwania pojedynczych przeciwciał specyficznych dla antygenu z komórek jednojądrzastych ludzkiej krwi obwodowej łączy cytometrię przepływową z PCR pojedynczych komórek i klonowaniem.

Metoda przesiewowa pojedynczych komórek w celu selekcji i odzyskiwania przeciwciał o pożądanej swoistości ze wzbogaconych populacji komórek B ludzkiej pamięci

Na podstawie matrycy peptydowej pochodzącej z wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV), odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficzne dla HBV mogą być oceniane równolegle z identyfikacją epitopów limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV.

Analiza odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV i identyfikacja epitopów komórek T CD4 ograniczonych do HLA-DR na podstawie matrycy peptydowej

Poznaj metodę identyfikacji liniowego epitopu limfocytów B rozpoznawanego przez przeciwciało monoklonalne przy użyciu skanowania peptydowego i hybrydyzacji dot-blot. Protokół ten jest prosty i wydajny, znajdując zastosowanie w badaniach immunologicznych oraz diagnostyce.

Wspomagana skanowaniem peptydowym identyfikacja liniowego epitopu limfocytów B rozpoznanego przez przeciwciało monoklonalne

Przeglądaj więcej filmów