Wspomagana skanowaniem peptydowym identyfikacja liniowego epitopu limfocytów B rozpoznanego przez przeciwciało monoklonalne

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest identyfikacja linearnego epitopu limfocytów B rozpoznawanego przez przeciwciało monoklonalne z wykorzystaniem seryjnie skróconych białek rekombinowanych oraz skanowania peptydowego metodą hybrydyzacji dot-blot. Metoda ta pozwala na udzielenie odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące oddziaływań molekularnych między antygenem a przeciwciałem. Głównymi zaletami tej techniki są jej prostota i efektywność.

Zidentyfikowany epitop może następnie zostać wykorzystany w bardziej szczegółowych badaniach, na przykład w zastosowaniach terapeutycznych i diagnostycznych. Procedurę zaprezentuje Chien-Wen Chen, stażysta podoktorski z mojego laboratorium. Aby rozpocząć, należy hodować mysie monoclonalne komórki hybridoma RGM56 w hybrydowym medium bezsurowiczym.

Hodowle komórkowe należy utrzymywać w kolbach T175 w temperaturze 37°C i 5% dwutlenku węgla. Po pięciu dniach inkubacji, gdy pożywka zmieni kolor na żółty, należy ją zebrać, a nadsącz odwirować z prędkością 4 500 ×g przez 30 minut w temperaturze 4°C. Następnie należy usunąć osad z resztek komórkowych, aby uzyskać przeciwciała w roztworze.

Następnie należy dodać dwa mililitry 50% zawiesiny białka G (protein G agro slurry) do kolumny o pojemności pięciu mililitrów i zrównoważyć żywicę za pomocą 10 mililitrów lodowatego PBS, co odpowiada 10 objętościom wstępnie załadowanej żywicy. Na zrównoważoną kolumnę należy nałożyć 200 mililitrów wcześniej przygotowanego roztworu przeciwciał i odrzucić frakcję, która przejdzie przez kolumnę. Kolumnę należy przemyć dwukrotnie, używając 10 mililitrów lodowatego PBS.

Na koniec, aby eluiować przeciwciało z żywicy, należy dodać do kolumny 10 ml milimolowego roztworu gliceryny o pH 2,7. Należy zbierać frakcje o objętości 900 µl do probówek do mikrocentryfugi uprzednio wypełnionych 100 µl 10X buforu neutralizującego. Oczyszczone przeciwciało należy przechowywać w 50% roztworze glicerolu z dodatkiem azotku sodu w temperaturze -20 °C.

Przygotować konstrukty i przeprowadzić transformację komórek E.coli BL21 zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie przenieść pojedynczą kolonię do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 3 ml bulionu LB uzupełnionego o 100 µg/ml ampicyliny i lekko zakręcić probówkę. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C przy wstrząsaniu z prędkością 150 RPM.

Monitoruj gęstość optyczną hodowli przy 600 nanometrach. Gdy osiągnie ona wartość około 0,6, schłodź hodowlę do 25 stopni Celsjusza. Następnie dodaj IPTG do stężenia końcowego 0,4 milimolara, aby indukować ekspresję rekombinowanego białka.

Inkubować kulturę przez kolejne cztery godziny w temperaturze 25 °C przy wytrząsaniu z prędkością 200 RPM. Po inkubacji przenieść 1 mL kultury bakteryjnej do probówki do mikrowirówki. Wirować komórki z prędkością 12 000 ×g przez jedną minutę, a następnie odlać nadsącz.

Używając mikropipety, resuspenduj osad komórkowy w 100 µL buforu denaturującego poprzez pipetowanie w górę i w dół. Następnie wymieszaj otrzymaną zawiesinę za pomocą intensywnego wstrząsania w wortexie, aby uzyskać gotową do użycia próbkę białka rekombinowanego. W celu przeprowadzenia hybrydyzacji dot-blot rozpuść każdy syntetyczny peptyd w DMSO, aby otrzymać roztwory o stężeniu 10 mg/mL.

Następnie aktywuj membranę PVDF w metanolu przez dwie minuty i równoważ ją w zmodyfikowanym buforze Towbina przez kolejne dwie minuty. Przepłucz kawałek papieru chromatograficznego zmodyfikowanym buforem Towbina i połóż na nim zrównoważoną membranę PVDF. Pozostaw membranę do czasu, aż bufor zniknie z jej powierzchni.

Za pomocą końcówki 10 µL nanieś 2 µL każdej próbki peptydu lub białka rekombinowanego na membranę i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut. Naniesienie próbki na membranę jest najważniejszym etapem tego protokołu. Precyzyjne nałożenie określonej ilości próbki na niewielki obszar membrany PVDF wymaga szczególnej uwagi.

Następnie należy zablokować membranę w buforze TBST z dodatkiem 5% odtłuszczonego mleka przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy delikatnym wstrząsaniu. Przeciwciało monoklonalne RGM56 należy rozcieńczyć w buforze TBST z dodatkiem 5% odtłuszczonego mleka, a następnie nanieść roztwór przeciwciał na membranę.

Inkubować membranę w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę przy łagodnym wstrząsaniu. Po inkubacji usunąć roztwór przeciwciał. Następnie przemyć membranę dwukrotnie w buforze TBST przez pięć minut przy łagodnym wstrząsaniu.

Następnie na membranę nanosi się roztwór przeciwciała wtórnego rozcieńczonego w buforze TBST z 5% odtłuszczonym mlekiem. Membranę inkubuje się przez jedną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy delikatnym wstrząsaniu. Po inkubacji roztwór przeciwciał należy odlać, a membranę przemyć dwukrotnie w buforze TBST przez pięć minut przy delikatnym wstrząsaniu.

Następnie należy przeprowadzić detekcję membrany za pomocą roztworu substratu w temperaturze pokojowej przez 15 minut w ciemności. Po pojawieniu się sygnału reakcję należy przerwać, przemywając membranę wodą dwukrotnie destylowaną. Po wysuszeniu membrany na powietrzu należy wykonać obraz dot-blot za pomocą systemu obrazowania.

Na koniec, przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu, zmierzono intensywność każdego dot-blotu. Przedstawiono tutaj białko kodowe wirusa nekrozy nerwów (nervous necrosis virus) o pełnej długości, obejmujące aminokwasy od 1 do 338, wraz z jego seryjnie skróconymi wariantami. Aby potwierdzić ekspresję białek w transformowanych komórkach bakteryjnych, przeprowadzono analizę dot-blot z użyciem przeciwciała anty-6XHis, która wykazała obecność wszystkich badanych białek.

Następnie białka rekombinowane poddano analizie metodą hybrydyzacji dot-blot z użyciem przeciwciała monoklonalnego RG-M56. Analiza wykazała, że epitop białkowy rozpoznawany przez przeciwciało znajduje się w peptydzie od 195 do 338. Ostatecznie, za pomocą skanowania peptydowego zidentyfikowano epitop składający się z 20 lub ośmiu reszt aminokwasowych.

Skanowanie alaniną wykazało, że podstawienie reszt waliny w pozycjach 197 i 199, a także cystyny w pozycji 201, zniosło zdolność wiązania epitopu oraz hybrydyzację w metodzie dot-blot. Podobnie, w analizie intensywności wiązania zaobserwowano spadek powinowactwa wiązania, co potwierdza, że zidentyfikowane reszty są niezbędne do wiązania epitopu z przeciwciałem monoklonalnym RGM56. Ta technika identyfikacji peptydów może być wykorzystana do opracowywania terapeutycznych leków peptydowych lub preparatów peptydowych.