Wykorzystanie bioczujników opartych na enzymach do pomiaru toniku i glutaminianu fazowego w mysich modelach choroby Alzheimera

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar tonicznych i fazowych zewnątrzkomórkowych zmian glutaminianu in vivo przy użyciu układów mikroelektrod połączonych z enzymami. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak to, czy poziomy neuroprzekaźników zewnątrzkomórkowych oraz szybka dynamika uwalniania i usuwania neuroprzekaźników są zmienione w stanach chorobowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że matryce mikroelektrod mogą mierzyć określone zmiany neuroprzekaźników w dyskretnych obszarach mózgu, dzięki czemu jest to podejście precyzyjne przestrzennie i czasowo, a jednocześnie minimalnie inwazyjne.

Procedurę zademonstrują Holly Hunsberger i Ryan Heslin z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, pokryj parę miejsc zapisu na MEA pożądanym enzymem, a inną parę miejsc zapisu nieaktywną matrycą białkową. Następnie narysuj oksydazę glutaminianu lub matrycę białkową za pomocą 10-mikrolitrowej strzykawki Hamiltona.

Delikatnie nacisnąć tłok, aby nabrać małą kulkę roztworu na końcówkę strzykawki. Aby celować w miejsca rejestracji MEA, pod mikroskopem preparacyjnym nałóż roztwór na odpowiednie miejsca rejestracji, krótko kontaktując się z miejscami rejestracji z kroplą roztworu, która reprezentuje jedną warstwę. Ustaw minutnik na jedną minutę między nakładaniem powłoki w miejscach nagrywania.

Teraz umieść elektrodę odniesienia przez otwór w plastikowym ramieniu. Opuścić elektrodę odniesienia do zlewki zawierającej PBS i upewnić się, że nie styka się z dnem zlewki. Następnie podłącz elektrodę odniesienia do stopnia głowicy i podłącz MEA do mPD platerowanego do stopnia głowicy.

Opuścić MEA do zlewki z roztworem tak, aby tylko końcówka MEA była zanurzona w roztworze. Nie zanurzaj końcówki MEA w płynie poza czarną bańką. Może to spowodować uszkodzenie MEA.

Następnie wybierz ikonę galwanizacji na pulpicie. W menu narzędzia do galwanizacji sprawdź, czy zostały wprowadzone prawidłowe ustawienia. Następnie wybierz oprogramowanie wyjściowe, aby zakończyć galwanizację.

Opłucz końcówki elektrod pokrytych mPD wodą DI i przechowuj przez 24 godziny przed kalibracją. W tej procedurze włącz poduszkę grzewczą o temperaturze 37 stopni Celsjusza i podłącz stopień głowicy do systemu sterowania nagrywaniem. Następnie włóż końcówkę MEA do 40 mililitrów wymieszanego 0,5 molowego PBS.

Następnie podłącz elektrodę odniesienia do stopnia głównego. Przesuń końcówkę elektrody referencyjnej, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Następnie otwórz program do nagrywania, upewnij się, że ustawienia są poprawne, wybierz numer MEA, kliknij Kalibracja i naciśnij start.

Odczekaj od pięciu do 10 minut na wyrównanie i rozpocznij kalibrację, gdy linia bazowa się ustabilizuje. Następnie wybierz Linia bazowa i dodaj 500 mikrolitrów kwasu askorbinowego. Następnie wybierz opcję Interferencja, gdy prąd osiągnie nowy stały plateau.

Jeśli MEA jest prawidłowo galwanizowany, nie należy zaobserwować żadnych zmian. Następnie dodaj 40 mikrolitrów 20-milimolowego L-glutaminianu. Gdy prąd osiągnie nowy stały poziom, oznacz pierwszy dodatek jako analit.

Powtórz trzy razy, co daje w sumie trzy dodatki glutaminianu. Następnie dodaj 40 mikrolitrów dopaminy. I wybierz substancję badaną.

Następnie dodaj 40 mikrolitrów nadtlenku. Wybierz substancję badaną i kliknij przycisk stop po zakończeniu kalibracji. Na tym etapie umieść mikropipetę centralnie między wszystkimi czterema miejscami zapisu platyny i zamontuj ją na wysokości od 50 do 100 mikrometrów nad MEA za pomocą lepkiego wosku i plasteliny.

Za pomocą zasilacza prądu stałego clamp czerwony przewód dodatni do przygotowanego srebrnego przewodu po stronie złotego pinu i clamp przewód ujemny do platynowej katody kąpieli. Następnie podłącz zasilacz prądu stałego i poszukaj prawidłowego procesu powlekania. Na elektrodzie do kąpieli powinny pojawić się pęcherzyki, a elektroda referencyjna powinna zmienić kolor na srebrnoszary.

W tej procedurze umieść zwierzę w urządzeniu stereotaktycznym i użyj nauszników, aby ustabilizować jego głowę. Upewnij się, że zwierzę jest zabezpieczone, a głowa się nie porusza. Następnie nałóż maść na oczy za pomocą sterylnego bawełnianego aplikatora.

Następnie ogol głowę trymerem. I usuń sierść w pobliżu uszu za pomocą małych nożyczek chirurgicznych. Następnie nałóż jod, a następnie alkohol na skórę głowy trzy razy na przemian.

Następnie wykonaj nacięcie na środku skóry głowy i rozprowadź skórę. Nasącz krew sterylną bawełnianą końcówką i nałóż nadtlenek wodoru, aby ułatwić pojawienie się bregmy i lambdy. Upewnij się, że głowa jest prawidłowo ustawiona, mierząc grzbietowo-brzuszną i przyśrodkowo-boczną bregmę i lambdę.

Ustaw współrzędne w bregma na zero i zaznacz współrzędne docelowe. Następnie wywierć wokół znaku. Następnie przymocuj MEA do stopnia głównego.

Ponownie napełnij pipetę pierwszym pożądanym roztworem. Należy pamiętać o pozostawieniu szczeliny w pipecie bez roztworu, aby można było zbadać wydmuchiwany roztwór. Następnie podłącz rurkę do szklanej mikropipety.

Znajdź bregmę z dołączonym MEA i ustaw współrzędne na zero. Przesuń MEA do żądanych współrzędnych i powoli opuść MEA, aż końcówka dotknie mózgu. Następnie wyzeruj współrzędną grzbietowo-brzuszną, a następnie powoli opuść MEA do mózgu.

Umieść elektrodę odniesienia w odległym miejscu od MEA, tak aby nadal miała kontakt z mózgiem w płynie, aby zakończyć obwód. W programie do nagrywania kliknij żądaną skalibrowaną elektrodę, a następnie kliknij wykonaj eksperyment, aby rozpocząć nagrywanie. Po uzyskaniu stabilnej linii bazowej ustaw eżektor ciśnienia na 0.6 sekundy i 0.5 psi i naciśnij czerwony przycisk na eżektorze ciśnienia, aby wysunąć.

Zapisuj czas i ciśnienie, a także takty objętości przesunięte na arkuszu iniekcji i w razie potrzeby rób notatki. Następnie wyjmij MEA z dołączoną mikropipetą, spłucz ją wodą DI i zanurz w PBS przez noc, aż cała krew zniknie. W regionach CA3 i CA1 hipokampa poziomy glutaminianu toniku były znacznie zwiększone u myszy TauP301L leczonych nośnikiem, efekt ten został osłabiony przez leczenie ryluzolem.

W tym przypadku dopasowane do wartości wyjściowej reprezentatywne zapisy uwalniania glutaminianu wywołanego chlorkiem potasu w CA3 wykazały, że leczenie riluzolem osłabiło znaczny wzrost amplitudy uwalniania glutaminianu obserwowany u myszy Vehicle-TauP301L. Miejscowe stosowanie chlorku potasu spowodowało znaczny wzrost zewnątrzkomórkowego glutaminianu, który szybko powrócił do poziomu tonizującego. Znacznie zwiększone uwalnianie glutaminianu chlorku potasu w DG, CA3 i CA1 obserwowane u myszy TauP301L leczonych nośnikiem po miejscowym zastosowaniu chlorku potasu zostało osłabione leczeniem riluzolem.

Ten zabarwiony na fioletowo krezylowy fragment hipokampa potwierdza lokalizację śladów MEA w CA3 i CA1. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o krokach rozwiązywania problemów wymienionych w manuskrypcie. Na przykład, aby zredukować hałaśliwe sygnały, pamiętaj o uziemieniu systemu i postępuj zgodnie z instrukcjami w odpowiednim czasie.