Wytwarzanie pianek i mikronośników pochodzących z macierzy zewnątrzkomórkowej jako specyficznych tkankowo platform do hodowli i dostarczania komórek

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest pomoc w dostosowaniu rozmiaru pianek lub mikronośników niewiązanych chemicznie, pochodzących z tkankowo specyficznej macierzy zewnątrzkomórkowej, do zastosowań w 3D in vitro modelach kultur komórkowych lub jako rusztowania pro-regeneracyjne w systemach dostarczania komórek. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinach biologii komórki stosowanej i inżynierii tkankowej, takich jak wpływ 3D mikrośrodowiska komórkowego na funkcje komórek i regenerację tkanek. Główną zaletą tej techniki jest umożliwienie wytwarzania rusztowań o regulowanej geometrii, które naśladują skład natywnej, specyficznej dla danej tkanki ECM i pozostają stabilne w długotrwałej hodowli bez konieczności dodatkowego sieciowania.

Po liofilizacji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) pochodzącej z tkanki zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć ostrych nożyczek chirurgicznych, aby drobno posiekać zdekularyzowaną tkankę. W celu kriomielenia przetworzonej tkanki, należy wypełnić 25 mililitrową stalową komorę mielącą systemu laboratoryjnej młynka kulowego posiekaną liofilizowaną ECM, a następnie dodać dwie 10 mililitrowe stalowe kule mielące. Zamknij i całkowicie zanurz załadowaną komorę mielącą w ciekłym azocie na trzy minuty.

Następnie należy mielić zamrożoną próbkę przy 30 Hz przez trzy minuty. Powtarzać zanurzanie w ciekłym azocie oraz mielenie do momentu, aż ECM zostanie zmielona na drobny proszek. Odważyć 250 mg posiekanej lub zmielonej metodą kriogeniczną ECM i przenieść ją do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.

Do probówki wirnikowej należy dodać 5 ml buforu NaH2PO4 o stężeniu 22 M i zaznaczyć poziom cieczy na probówce. Następnie przygotować roztwór zapasowy alfa-amylazy, dodając 7,5 mg alfa-amylazy do 1 ml buforu NaH2PO4 o stężeniu 22 M. Następnie do próbki należy dodać 100 µL roztworu zapasowego alfa-amylazy.

Następnie dodać NaH2PO4 o stężeniu 22 M, aby uzyskać końcową objętość 10 mililitrów. Zawiesinę mieszać w sposób ciągły przy 300 RPM w temperaturze pokojowej przez 72 godziny. Zawiesinę wirować przy 1500 ×g przez 10 minut.

Ostrożnie zebrać i odrzucić nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu trawionej ECM. Następnie użyć 10 mililitrów pięcioprocentowego NaCl rozcieńczonego w wodzie podwójnie destylowanej, aby ponownie zawiesić materiał w osadzie, i mieszać w sposób ciągły przez 10 minut przy 300 RPM. Powtórzyć etap płukania jeszcze dwukrotnie, a następnie użyć 10 mililitrów wody podwójnie destylowanej do ponownego zawieszenia osadu.

Następnie zawiesinę należy mieszać nieprzerwanie przy 300 RPM w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po ponownym odwirowaniu próbki należy ostrożnie zebrać i usunąć nadsącz, nie naruszając osadu z trawionej ECM. Dodać kwas octowy 2 M do kreski 5 ml.

Następnie wymieszać na vortexie. Potem zawiesinę należy nieustannie agitować przy 120 RPM i 37 °C przez noc. Następnego dnia, używając ręcznego homogenizatora wyposażonego w ząbkowaną sondę o szerokości 10 mm, homogenizować zawiesinę ECM w temperaturze pokojowej w interwałach 10 sekundowych, aż do momentu, gdy nie pozostaną żadne widoczne fragmenty.

Aby zapobiec przegrzaniu, pomiędzy interwałami homogenizacji umieszczaj zawiesinę w zlewce z zimną wodą. Inkubuj zawiesinę ECM w temperaturze 37 °C przy ciągłym mieszaniu z prędkością 120 RPM, aż zawiesina się ogrzeje. Następnie użyj 2 M kwasu octowego, aby rozcieńczyć zawiesinę próbki do pożądanego stężenia.

Za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml i igły o rozmiarze 18 G napełnij wybraną formę zawiesiną ECM. Pianki mogą być wytwarzane w różnych geometriach, zależnie od kształtu formy. Przykryj formy i zamroź je w temperaturze -20 lub -80 °C.

Następnie umieść formy w kolbie do liofilizatora. Podłącz kolbę do laboratoryjnego systemu liofilizacji i susz formy przez 24 godziny lub do czasu całkowitego wyschnięcia. Inkubuj zawiesinę ECM poddaną kriomieleniu w warunkach ciągłego mieszania przy 100 RPM przez noc.

Napełnij strzykawkę z przyłączem Luer Lock o pojemności trzech mililitrów trzema mililitrami zawiesiny ECM, a następnie przymocuj do otworu strzykawki zestaw do infuzji z tzw. skrzydłami. Umieść strzykawkę w pompie strzykawkowej. Następnie przymocuj igłę do statywu laboratoryjnego i ustaw końcówkę igły pionowo, w odległości od czterech do sześciu centymetrów od górnej krawędzi niskiej kolby Dewara.

Następnie przymocuj elektrodę z klipsem typu „krokodylka” do końcówki igły, upewniając się, że klips jest podłączony do dodatniego bieguna zasilacza wysokiego napięcia. Zegnij pasek folii aluminiowej nad krawędzią kolby próżniowej. Następnie przymocuj drugą elektrodę z klipsem typu „krokodylka” do zewnętrznej krawędzi folii.

Podłącz urządzenie do terminala masy zasilacza. Napełnij naczynie Dewara ciekłym azotem do poziomu około jednego centymetra od górnej krawędzi, tak aby trzy czwarte folii było zanurzone. Następnie ustaw pompę strzykawkową na szybkość infuzji 30 ml/h i przeprowadź elektrorozprysk próbek zgodnie z protokołem tekstowym.

Po zakończeniu infuzji ostrożnie odlej nadmiar ciekłego azotu z naczynia Dewara, pozostawiając mikronośniki w około 25 mililitrach ciekłego azotu, aby zapewnić ich stałe zamrożenie. Natychmiast przelej mikronośniki wraz z ciekłym azotem do probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów jednym płynnym ruchem. Następnie użyj Scoopuli, aby zebrać wszystkie zamrożone mikronośniki pozostałe w naczyniu Dewara.

Dodaj je również do wirówki. W celu przygotowania do liofilizacji przykryj probówkę wirówkową folią aluminiową z wykonanymi małymi otworami. Umieść przykryte probówki wirówkowe w kolbie liofilizatora.

Następnie niezwłocznie podłącz kolbę do liofilizatora i susz próbki przez noc. Ostrożnie przenieś liofilizowaną piankę do probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów zawierającej nadmiar absolutnego etanolu. W podobny sposób resuspenduj liofilizowane mikronośniki w nadmiarze absolutnego etanolu w oryginalnej probówce wirówkowej użytej do zbierania.

Za pomocą pipety serologicznej przefiltruj mikronośniki przez stalowe sito o określonej wielkości oczek do nowej probówki do wirowania o pojemności 50 ml, aby usunąć wszelkie agregaty i wyselekcjonować pożądane zakresy wielkości. Inkubuj próbkę w temperaturze 4 °C przez cztery godziny lub do czasu, aż piana lub mikronośniki osiądą na dnie probówki do wirowania. Następnie, pracując pod komorą z laminarnym przepływem powietrza z zachowaniem zasad aseptyki, użyj pipety serologicznej, aby usunąć absolutny etanol z rusztowań i dodaj nadmiar 95% etanolu rozcieńczonego sterylnym PBS.

Inkubuj rusztowania w temperaturze 4°C przez cztery godziny lub do czasu, aż opadną one na dno naczynia do rehydratacji. Stopniowo rehydratuj rusztowania, stosując serię roztworów etanolu. Na każdym etapie inkubuj rusztowania w temperaturze 4°C do momentu ich opadnięcia na dno naczynia, przed zmianą roztworu.

Zastąp sterylny PBS dodatkowymi dwoma płukaniami, aby usunąć pozostałości etanolu. Przechowuj próbki w 100% sterylnym PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu rozpoczęcia hodowli komórkowej. Wykorzystaj rusztowania w ciągu jednego do dwóch tygodni po rehydratacji.

Przedstawione tutaj przykłady typów pianek i mikronośników pochodzących z ECM, wykonanych z decelularyzowanej tkanki tłuszczowej. Przedstawiono również decelularyzowaną tkankę skórną świni oraz decelularyzowaną lewą komorę serca świni. Wykazano, że opisane techniki można zastosować do wytwarzania specyficznych dla danej tkanki rusztowań biologicznych, wykorzystując różne tkanki decelularyzowane jako źródła ECM.

Po kriomieleniu lub rozdrabnianiu, trawieniu enzymatycznym i homogenizacji, próbki można przenieść do misy przed zamrożeniem i liofilizacją. Rysunek przedstawia rehydratyzowane pianki DAT, DDT i DLV, otrzymane w formie formy 48-dołkowej płytki do hodowli tkanek. Pianki DAT, DDT i DLV zostały wytworzone z kriomielonej ECM o stężeniu 35 mg/mL i temperaturze zamrażania -80 °C.

W celu wytworzenia mikronośników pochodnych ECM przy użyciu techniki elektrosprayingu, dla każdego stężenia zawiesiny źródłowej ECM można dostosować rozmiar igły, szybkość infuzji oraz napięcie, aby uzyskać dyskretne sferyczne mikronośniki o średnicy od 350 do 500 micrometers po kontrolowanej rehydratacji. Ostatecznie mikronośniki DAT, DDT i DLV przedstawione tutaj za pomocą SEM wykazują, że ultrastruktura pod względem rozmiaru może się różnić w zależności od źródła decelularyzowanego ECM. Metody przedstawione w tym filmie mogą być wykorzystane do wytwarzania różnorodnej gamy tkankowo specyficznych mikronośników i pianek składających się z czystego, niewiązanego chemicznie ECM, z wykorzystaniem decelularyzowanej tkanki jako źródła macierzy.

Po przeprowadzeniu tych procedur pianki i mikronośniki można zasiać komórkami w warunkach statycznych lub dynamicznych, a następnie zastosować jako podłoże instruujące komórki w hodowlach in vitro oraz w zastosowaniach in vivo.