Wytwarzanie pianek i mikronośników pochodzących z macierzy zewnątrzkomórkowej jako specyficznych tkankowo platform do hodowli i dostarczania komórek

Ogólnym celem tego protokołu jest pomoc w zwymiarowaniu niechemicznie usieciowanych pianek lub mikronośników pochodzących z tkankowo specyficznej macierzy pozakomórkowej do zastosowań w modelach hodowli komórkowych invitro 3D lub jako rusztowania proregeneracyjne w systemach dostarczania komórek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie stosowanej biologii komórki i inżynierii tkankowej, takie jak to, w jaki sposób mikrośrodowisko komórkowe 3D pośredniczy w funkcjonowaniu komórek i regeneracji tkanek. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona wytwarzanie rusztowań o przestrajalnej geometrii, które naśladują natywny skład ECM specyficzny dla tkanek i są stabilne w długotrwałej hodowli bez dodatkowego sieciowania.

Po liofilizacji ECM pochodzącego z tkanki zgodnie z protokołem tekstowym, użyj ostrych nożyczek chirurgicznych, aby drobno zmielić zdecelularyzowaną tkankę. Aby wykonać kriomill przetworzoną tkankę, napełnij 25-mililitrową komorę mielenia ze stali nierdzewnej dla laboratoryjnego systemu młyna kulowego mielonym liofilizowanym ECM i dodaj dwie 10-mililitrowe kule mielące ze stali nierdzewnej. Zamknij i całkowicie zanurz załadowaną komorę mielenia w ciekłym azocie na trzy minuty.

Następnie miel zamrożoną próbkę w temperaturze 30 Hz przez trzy minuty. Powtarzaj zanurzanie w ciekłym azocie i mielenie, aż ECM zostanie zmielony na drobny proszek. Odważyć 250 miligramów mielonego lub zmielonego kriogenicznie ECM i przenieść go do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.

Dodaj pięć mililitrów 22-molowego buforu NaH2PO4 do probówki wirówkowej i zaznacz poziom cieczy na probówce. Następnie przygotuj roztwór podstawowy alfa-amylazy, dodając 7,5 miligrama alfa-amylazy do jednego mililitra 22-molowego buforu NaH2PO4. Następnie dodać 100 mikrolitrów roztworu podstawowego alfa-amylazy do próbki.

Następnie dodaj 22 molowe NaH2PO4, aby uzyskać końcową objętość 10 mililitrów. Mieszaj zawiesinę w sposób ciągły przy 300 obr./min i temperaturze pokojowej przez 72 godziny. Odwirować zawiesinę w temperaturze 1500 razy G przez 10 minut.

Ostrożnie zebrać i wyrzucić sklarowany sklarat ECM, nie naruszając strawionego osadu ECM. Następnie użyj 10 mililitrów pięcioprocentowego NaCl rozcieńczonego w podwójnie destylowanej wodzie, aby ponownie zawiesić granulowany materiał i mieszać w sposób ciągły przez 10 minut przy 300 obr./min. Powtórz pranie jeszcze dwa razy przed użyciem 10 mililitrów podwójnie destylowanej wody do ponownego zawieszenia granulki.

Następnie mieszać zawiesinę w sposób ciągły z prędkością 300 obr./min w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po ponownym odwirowaniu próbki, ostrożnie zebrać i wyrzucić supernatant, nie naruszając strawionego osadu ECM. Dodaj 2 molowe kwasy octowe do znaku pięciu mililitrów.

I wir. Następnie w sposób ciągły mieszaj zawieszenie przy 120 obr./min i 37 stopniach Celsjusza przez noc. Następnego dnia, za pomocą ręcznego homogenizatora wyposażonego w sondę piłokształtną o szerokości 10 milimetrów, homogenizuj zawiesinę ECM w temperaturze pokojowej w odstępach 10-sekundowych, aż nie pozostaną żadne widoczne fragmenty.

Umieścić zawiesinę w zlewce z zimną wodą między przerwami homogenizacji, aby zapobiec przegrzaniu. Inkubować zawiesinę ECM w temperaturze 37 stopni Celsjusza z ciągłym mieszaniem przy 120 obr./min, aż zawiesina będzie ciepła. Następnie używamy 2 molowego kwasu octowego, aby rozcieńczyć zawiesinę próbki do pożądanego stężenia.

Za pomocą trzymililitrowej strzykawki i igły o rozmiarze 18 napełnij żądaną formę zawiesiną ECM. Pianki mogą być wytwarzane w różnych geometriach w zależności od kształtu formy. Przykryj i zamroź foremki w temperaturze minus 20 lub minus 80 stopni Celsjusza.

Następnie umieść formy w kolbie liofilizatora. Podłącz kolbę do laboratoryjnego systemu liofilizacji i susz formy przez 24 godziny lub do całkowitego wyschnięcia. Inkubować kriomieloną zawiesinę ECM z ciągłym mieszaniem przy 100 obr./min przez noc.

Załadować trzy mililitry zawiesiny ECM do trzymililitrowej strzykawki typu luer lock i przymocować skrzydełkowy zestaw infuzyjny do otworu strzykawki. Zabezpieczyć strzykawkę w pompie strzykawkowej. Następnie przymocuj igłę do stojaka na retortę i ustaw końcówkę igły pionowo w odległości od czterech do sześciu centymetrów od górnej części nisko uformowanej kolby Dewara.

Następnie przymocuj elektrodę zacisku krokodylkowego do końcówki igły, upewniając się również, że zacisk krokodylkowy jest podłączony do dodatniego zacisku zasilacza wysokiego napięcia. Złóż pasek folii aluminiowej na krawędzi kolby próżniowej. Następnie przymocuj drugą elektrodę zacisku krokodylkowego do zewnętrznej krawędzi folii.

Podłącz go do zacisku źródła uziemienia zasilacza. Napełnij kolbę Dewara ciekłym azotem na około jeden centymetr od góry, tak aby trzy czwarte folii było zanurzone. Następnie ustaw pompę strzykawkową na szybkość infuzji 30 mililitrów na godzinę i rozpyl próbki elektro zgodnie z protokołem tekstowym.

Po zakończeniu naparu ostrożnie wylej nadmiar ciekłego azotu z Dewara, pozostawiając mikronośnik zawieszony w około 25 mililitrach ciekłego azotu, aby upewnić się, że pozostaną zamrożone. Natychmiast przenieś mikronośniki z ciekłym azotem do 50-mililitrowej probówki wirówkowej, wlewając jednym płynnym ruchem. Następnie użyj Scoopuli, aby zebrać wszelkie zamrożone mikro nośniki pozostające w Dewarze.

Dodaj je również do wirówki. Aby przygotować się do liofilizacji, przykryj probówkę wirówkową folią aluminiową perforowaną z małymi otworami. Umieścić zakryte probówki wirówkowe w kolbie liofilizatora.

Następnie natychmiast podłączyć kolbę do liofilizatora i wysuszyć próbki przez noc. Delikatnie przenieś liofilizowaną piankę do 50-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej nadmiar absolutnego etanolu. Podobnie, ponownie zawiesić liofilizowane mikronośniki w nadmiarze absolutnego etanolu w oryginalnej probówce wirówkowej używanej do zbierania.

Za pomocą pipety serologicznej przefiltruj mikronośniki przez sito ze stali nierdzewnej o określonym rozmiarze oczek do nowej 50-mililitrowej probówki wirówkowej, aby usunąć wszelkie osady i wybrać żądane zakresy wielkości. Inkubować próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery godziny lub do momentu, gdy piana lub mikronośniki osiądą na dnie probówki wirówkowej. Następnie, pod okapem z przepływem laminarnym z techniką aseptyczną, użyj pipety serologicznej, aby usunąć absolutny etanol z rusztowań i dodać nadmiar 95% etanolu rozcieńczonego sterylnym PBS.

Inkubować rusztowania w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery godziny lub do momentu, gdy rusztowania opadną na dno naczynia nawadniającego. Stopniowo nawadniaj rusztowania za pomocą serii etanolu. Na każdym etapie inkubuj rusztowania w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż opadną na dno naczynia, przed zmianą roztworu.

Zastąp sterylny PBS dodatkowymi dwoma płukaniami, aby usunąć resztki etanolu. Przechowuj próbki w 100% sterylnym PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będą gotowe do hodowli komórkowej. Użyj rusztowań w ciągu jednego do dwóch tygodni po ponownym nawodnieniu.

Poniżej przedstawiono przykłady rodzajów pianek i mikronośników pochodzących z ECM wytwarzanych przy użyciu bezkomórkowego tkanki tłuszczowej. Pozbawiona komórek tkanka skórna świń i lewa komora bez komórek świń. Demonstracja technik może być zastosowana do generowania specyficznych tkankowo biorusztowań przy użyciu różnych zdecelularyzowanych tkanek jako źródeł ECM.

Po kriomieleniu lub mieleniu, trawieniu enzymatycznym i homogenizacji próbki można dozować do miski przed zamrożeniem i liofilizacją. Rysunek ten przedstawia ponownie uwodnione pianki mielone DAT, DDT i DLV, zsyntetyzowane w 48-dołkowej formie do hodowli tkankowej. Te pianki DAT, DDT i DLV zostały wytworzone przy użyciu kriomielonego ECM w stężeniu 35 miligramów na mililitr i temperaturze zamarzania minus 80 stopni Celsjusza.

Aby wytworzyć mikronośniki pochodzące z ECM przy użyciu techniki rozpylania elektrycznego, dla każdego źródła ECM stężenie zawiesiny, szybkość infuzji igłówki i napięcie można dostroić w celu wygenerowania dyskretnych sferycznych mikronośników o średnicy od 350 do 500 mikrometrów po kontrolowanym nawodnieniu. Wreszcie, mikronośniki DAT, DDT i DLV pokazane tutaj przez SEM ujawniają, że rozmiar ultrastruktury może się różnić w zależności od zdekomórkowego źródła ECM. Metody przedstawione w tym filmie można wykorzystać do wytworzenia różnorodnej gamy specyficznych dla tkanek mikronośników i pianek składających się z czystego, niechemicznie usieciowanego ECM przy użyciu pozbawionej komórek tkanki jako źródła matrycy.

Po tych procedurach pianki i mikronośniki mogą być wysiewane komórkami w warunkach statycznych lub dynamicznych i mogą być stosowane jako substrat instruktażowy do hodowli komórkowych in vitro i zastosowań in vivo.