Wstępna ocena koniugatów przeciwciał zmodyfikowanych peptydami pochodzącymi z wirusów w celu zwiększenia akumulacji komórkowej i poprawy celowania w guz

Ogólnym celem tych procedur jest ocena swoistości i skuteczności koniugatów przeciwciał w gromadzeniu się wewnątrz komórek docelowych i guzów w początkowych stadiach rozwoju, tak aby ostatecznie można je było zastosować w klinice. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie dotyczące odpowiedzi na pola sprzężone, takie jak wydajność lokalizacji jądrowej i ogólna akumulacja międzykomórkowa. Zaletą tej techniki jest to, że za pomocą obrazowania PET naukowcy mogą ocenić skuteczność i selektywność kandydujących koniugatów przeciwciał.

Implikacje tych technik rozciągają się na terapię i diagnostykę raka, ponieważ nieskuteczna akumulacja komórek nowotworowych jest głównym ograniczeniem w przypadku tych zastosowań dla koniugatów przeciwciał. Po zsyntetyzowaniu koniugatu przeciwciała przeciwko sekwencji lokalizacji jądrowej kwasu kolkowego zgodnie z protokołem tekstowym, potraktuj docelowe komórki TF1A 200 nanomolowymi koniugatami przeciwciał MLS przeciwko kolce 7G3. Obejmują komórki poddane działaniu zmodyfikowanych kontrolnych przeciwciał monoklonalnych.

Inkubować pięć razy po 10 do szóstych komórek dodatnich antygenem z koniugatami w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Następnie usuń supernatant i użyj jednego mililitra lodowatego PBS do trzykrotnego przemycia komórek. Dodaj świeżą pożywkę i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dodatkową godzinę.

Następnie dodaj 0,5 mililitra PBS, zawierającego 0,25% trypsyny i EDTA, i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez maksymalnie 30 minut. Następnie użyj 1,5 mililitra pożywki RPMI1640 z 10% FBS, aby zneutralizować trypsynę. Odwirować komórki w temperaturze 500 razy G przez pięć minut, usunąć supernatant i użyć 0,5 mililitra lodowatego PBS do ponownego trzykrotnego przemycia komórek.

Dodaj 0,5 mililitra 1% PFA i 1% sacharozy i PBS do komórek i umieść je na lodzie na 30 minut, aby je utrwalić. Następnie użyj 0,5 mililitra lodowatego PBS do trzykrotnego umycia komórek i odwiruj próbki w temperaturze 250 razy G przez pięć minut. Następnie dodaj 0,15% Triton X-100 i PBS do komórek i przepuszczaj je na lodzie przez pięć minut.

Następnie, za pomocą lodowatego PBS, umyj komórki i powtórz wirowanie. Zawieś komórki w 0,1 mililitra PBS, zawierającym dwa mikrogramy na mililitr antylustrzanego drugorzędowego przeciwciała poliklonalnego FC sprzężonego z Alexa Fluor 647 i inkubuj próbki w ciemności w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Odwiruj komórki w temperaturze 250 razy G przez pięć minut i użyj 0,5 mililitra lodowatego PBS do trzykrotnego umycia komórek.

Następnie zawieś komórki w 0,5 mililitra PBS. Dodaj 10 mikrogramów na mililitr jodku propidyny do komórek. Następnie za pomocą podłoża montażowego zamontuj jedną od 10 do piątej komórki na szkiełkach podstawowych przed przykryciem próbki szklanym szkiełkiem nakrywkowym.

Zbadaj komórki za pomocą obiektywu olejowego Plan APO 60X, apertura numeryczna 1,42, na odwróconym laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym. Wykrywanie fluorescencji PI za pomocą 488-nanometrowego lasera argonowego i pryzmatu skanującego spektralnego ustawionego na 600 do 650 nanometrów. Do fluorescencji AF 647 użyj lasera helowo-neonowego o długości fali 633 nm i zestawu pryzmatów spektralno-skanujących o długości od 650 do 700 nanometrów.

Zbieraj obrazy z PI i AF 647 sekwencyjnie, 1024 na 1024 piksele, z 2-krotnym uśrednianiem linii, wykonane w odstępach 0,5 mikrona na całej grubości komórki. Prezentuj obrazy jako projekcje Z. Aby przeanalizować komórki, oceń i zapisz, czy fluorescencja wewnątrzkomórkowa w cytoplazmie jest zgrupowana i blisko powierzchni komórki, czy rozproszona i jednorodna.

Oceń również względną intensywność fluorescencji na komórkę. Po przygotowaniu i zagęszczeniu znakowanego radioaktywnie koniugatu przeciwciała przeciwko kwasowi kolkowemu NLS zgodnie z protokołem tekstowym, należy określić skuteczność znakowania radioizotopowego, nakładając 0,5 mikrolitra 0,1-molowego cytrynianu sodu PH5,5 lub eluentu ITLC na pasek ITLC. Zrób autoradiogram paska i uzyskaj obraz cyfrowy.

Przeprowadzić densytometrię, aby uzyskać proporcję miedzi związanej i wolnej-64. Jeśli zawartość wolnej miedzi-64 jest większa niż 5%, należy zagęścić próbkę dalej. W przypadku badań akumulacji komórkowej miedzi-64 należy traktować komórki 100 nanomolami koniugatów A14 znakowanych miedzią-64 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną, sześć i 24 godziny, jak opisano wcześniej.

Potraktuj komórki niezmodyfikowanym A14, aby zablokować alfacyty IL5R i w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zablokować internalizację za pośrednictwem receptora. Po umyciu komórek i inkubacji ze świeżą pożywką, jak pokazano wcześniej w tym filmie, dodaj 0,5 mililitra PBS zawierającego 0,25% trypsyny i EDTA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie, po zneutralizowaniu i umyciu komórek jak poprzednio, dodaj do komórek bufor do lizy błony plazmatycznej i inkubuj je na lodzie przez 10 minut.

Odwirować komórki zlizatywowane błoną plazmatyczną w temperaturze 90 razy G przez pięć minut. Usunąć supernatant i przenieść go do nowej probówki. Reprezentuje to frakcję cytoplazmatyczną.

Następnie użyj lodowatego PBS, aby trzykrotnie przemyć jądra i dodaj popłuczyny do frakcji cytoplazmatycznej. Upewnij się, że fiolki zawierające frakcje jądrową i cytoplazmatyczną są szczelnie zamknięte, a następnie umieść je w liczniku gamma skalibrowanym dla miedzi-64 w celu przeliczenia surowych liczb na megabecaryl. Określenie jakości izolacji jąder, wykonując analizę Western-Blot dla laminy AC, ograniczonego białka jądrowego; i Rab-7, obfite białko cytoplazmatyczne, na hurtowych frakcjach lizaty, jądrowych i cytoplazmatycznych.

Potraktuj pięć razy 10 do sześciu komórek za pomocą 500 mikrolitrów testu strącania radio-aminowego lub buforu RIPA i buforu do lizy plazmatyczno-błonowej zawierającego 1%2% i 4%NP-40. Ponadto izolowane jądra należy potraktować 500 mikrolitrami buforu RIPA w celu uzyskania izolowanych białek jądrowych. Dodać czterokrotność objętości próbki zimnego acetonu do wyizolowanych białek jądrowych, cytoplazmatycznych i hurtowych i inkubować przez 60 minut w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Odwirować próbki w temperaturze 13 000 razy G przez 10 minut. Zdekantować supernatant, uważając, aby nie usunąć osadu białka. Następnie dodaj 100 mikrolitrów PBS, aby rozpuścić białka.

Po wykonaniu Western Blotting zgodnie z wcześniejszym opisem, przeciąć błonę na pół przy 40-kilodaltonowym markerze masy cząsteczkowej. Użyj przeciwciał specyficznych dla laminy-AC do zbadania blot zawierającego białka o wyższej masie cząsteczkowej i użyj przeciwciał specyficznych dla Rab-7 do zbadania dolnej połowy błony. W grupach zawierających cztery myszy nodskit wstrzyknąć do żyły ogonowej od 20 do 30 mikrogramów znakowanego radioaktywnie koniugatu przeciwciała przeciw kolce NLS A14, znakowanego radioaktywnie A14 NLS i znakowanego radioaktywnie A14

Tego samego dnia umieść cylindryczny fantom zawierający pięć megabekaryli miedzi-64 w skanerze PET, aby przeliczyć liczbę radioaktywnych substancji na sekundę na wstrzykniętą dawkę na gram tkanki. 48 godzin później, po znieczuleniu myszy zgodnie z protokołem tekstowym, szybko przenieś mysz na stół skanera PET w pozycji leżącej głową do przodu z nosem dla izofluranu. Rozpocznij akwizycję danych PET przy użyciu zwykłego ustawienia trybu próbkowania i okna energetycznego od 250 do 650 kiloelektronowoltów.

Po zakończeniu skanowania wyjmij mysz ze skanera i umieść ją z powrotem w klatce. Jak pokazano na tym rysunku, strzałki pokazują różnicę podczas oceny akumulacji sprzężonego przeciwciała z trypsynizacją i bez niej. W komórkach, które nie są trypsynizowane, akumulacja i dystrybucja wewnątrzkomórkowa jest trudna do oceny ze względu na nadmierną ekspresję receptorów powierzchniowych komórki docelowej.

Strzałki pokazują różnicę w wewnątrzkomórkowej akumulacji i dystrybucji dwóch kandydatów na koniugat przeciwciał, gdy komórki są prawidłowo trypsynizowane. Znakowany radioaktywnie koniugat przeciwciała NLS przeciwko kwasowi kolkowemu A14 wykazuje powinowactwo nanomolowe do IL5R alfa. Wraz ze wzrostem stężeń znakowanego radioaktywnie koniugatu przeciwciała NLS przeciwko kwasowi kolkowemu A14, specyficzne wiązanie koniugatu przeciwciała przeciwko kokolce NLS kwasu kolkowego A14 zbliżało się do wysycenia przy stężeniach 3,5 nanomola zarówno w komórkach HT-1376, jak i HT-B9.

Zliczanie promieniowania gamma ujawnia, że wzrost radioaktywności w jądrze i cytoplazmie ze znakowanego radioaktywnie koniugatu przeciwciała przeciw kolce NLS A14 jest specyficzny i zwiększa się w czasie. Komórki HT-1376 i HT-B9 inkubowano z buforem do lizy błony plazmatycznej zawierającym 1%2%lub 4%NP-40. W przypadku komórek HT-1376 i HT-B9 bufor do lizy zawierający jeden lub 2% NP-40 Rap-7 nie został wykryty we frakcji jądrowej, a lamina AC nie została wykryta we frakcji cytoplazmatycznej.

Obrazowanie PET pozwala na ocenę kandydujących koniugatów przeciwciał pod kątem ich zdolności do celowania w nowotwory antygenowo-dodatnie, czerwone i niebieskie strzałki oraz związanych z nimi właściwości biodystrybucji w porównaniu z macierzystym przeciwciałem niemodyfikowanym peptydami. Można zobaczyć akumulację sygnału w guzie, aby pomóc w selekcji potencjału dla rozwiniętego koniugatu przeciwciała. Obrazowanie PET pozwala również na ocenę wychwytu potencjalnego koniugatu przeciwciał w zdrowych tkankach, takich jak wątroba.

Po opanowaniu tych technik naukowcy zajmujący się celowanym dostarczaniem ładunków molekularnych do guza będą mogli zbadać dodatkowe czynniki, w przypadku których akumulacja komórek nowotworowych jest utrudniona z powodu uwięzienia endosomu.