Name: Wstępna ocena koniugatów przeciwciał zmodyfikowanych peptydami pochodzącymi z wirusów w celu zwiększenia akumulacji komórkowej i poprawy celowania w guz (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Poznaj metodę oceny koniugatów przeciwciał w komórkach TF1A przy użyciu obrazowania PET. Technika ta pozwala badać akumulację wewnątrzkomórkową i lokalizację jądrową w celu poprawy terapii nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Towarzystwo Badań nad Rakiem (Kanada) i CIMS. Autorzy dziękują dr Samii Ait-Mohand i Jean-Francois Beaudoinowi za pomoc. Dr Angel Lopez (Uniwersytet Australii Południowej) za mAb A14.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Głównymi celami ogólnoustrojowego dostarczania środków przeciwnowotworowych jest zwiększenie akumulacji w miejscu guza i wychwytu w komórkach nowotworowych oraz zmniejszenie niepożądanych skutków ubocznych w zdrowych tkankach. Ukierunkowane dostarczanie ładunków molekularnych AC do komórek nowotworowych jest bardzo obiecującym podejściem do leczenia i wykrywania nowotworów. Jednak brak skuteczności spowodowany uwięzieniem endosomów i degradacją lizosomów pozostaje ważnym wyzwaniem. Chociaż protokół ten wykorzystuje pepty...

Koniugaty przeciwciał (AC) to biofarmaceutyki, które dojrzewają do transformacyjnej klasy skutecznych leków do ulepszania leczenia raka i wykrywania nowotworów. Złożone z przeciwciała monoklonalnego (mAb) sprzężonego z ładunkami molekularnymi, takimi jak radioizotopy, małe cząsteczki i toksyny biologiczne, AC są w stanie dostarczyć te ładunki do komórek rakowych z wyjątkowym powinowactwem i swoistością do antygenu docelowego. W związku z tym AC mają potencjał do znacznego zmniejszenia nieswoistej toksyczności i zwiększenia aktywności ładunku w miejscu guza. Terapeutycznie, AC transportujące cytotoksyczne małe cząsteczki (powszechnie określane jako koniugaty przeciwciało-lek) zostały zatwierdzone do leczenia pacjentów z rakiem piersi i chłoniakiem Hodgkina, u których nie powiodło się konwencjonalne leczenie 1,2. Ponadto opracowywane są również AC transportujące izotopy promieniotwórcze (potocznie nazywane radioimmunokoniugatami). Klimatyzator transportujący radioizotop do obrazowania jest dopuszczony do identyfikacji przerzutów raka gruczołu krokowego 3. Z wieloma innymi terapeutycznymi AC złożonymi do zatwierdzenia 4, optymizm jest wysoki co do przyszłości AC w celu poprawy opieki onkologicznej 5.
Mimo to, podczas dostarczania chemioterapeutyków lub radioizotopów, AC mają trudności z efektywnym gromadzeniem tych ładunków wewnątrz komórek docelowych. Ten aspekt w wielu przypadkach znacząco przyczynia się do niezdolności AC do zapewnienia długotrwałego przeżycia wolnego od choroby lub obrazowania guza z wysokim kontrastem 6,7. Ogólnie rzecz biorąc, gdy AC zwiążą swój docelowy antygen, są internalizowane w procesie znanym jako endocytoza za pośrednictwem receptora. Prądy przemienne są następnie uwięzione w endosomach i transportowane do lizosomów w celu degradacji i uwolnienia ładunku 8. Proces transportu wewnątrzkomórkowego stanowi wyzwanie dla AC, aby osiągnąć wysoką swoistość ładunku i skuteczność przeciwko docelowym komórkom nowotworowym. Na przykład wiele antygenów, takich jak Her2 (cel terapeutyczny AC Trastuzumab-emtanzyna) może przetwarzać do 85% związanych przeciwciał w ciągu pierwszych 30 minut 9. Ponadto, gdy dojdzie do degradacji, uwolnione chemioterapeutyki i radioizotopy mogą być aktywnie eksportowane przez zwiększoną ekspresję i/lub aktywność białek transportowych związanych z błoną 10,11. Degradacja lizosomów utrudnia również dostarczanie nowych ładunków biologicznych, takich jak enzymy terapeutyczne i oligonukleotydy, które można dezaktywować 12,13. W istocie, komórka rakowa jest wysoce skuteczna w znoszeniu niezbędnej wewnątrzkomórkowej akumulacji ładunków dostarczanych przez AC.
Ten protokół opisuje, jak wdrożyć koncepcję AC sprzężonych z peptydami pochodzącymi od wirusa, szczególnie w celu uniknięcia uwięzienia endosomu i lokalizacji w jądrze komórkowym. Przy takim wyrafinowaniu w manipulowaniu systemami komórkowymi gospodarza, nie jest zaskakujące, że rozwój białek i peptydów pochodzących z wirusów jako potencjalnych biofarmaceutyków od dawna jest zakorzeniony w badaniach terapeutycznych 14. Przez miliony lat wirusy ewoluowały, aby zdobyć wyjątkowy zbiór białek zdolnych do wykorzystania normalnych fizjologicznych systemów komórkowych ssaków w celu skutecznego wniknięcia do komórek gospodarza. W przypadku wirusów, które są internalizowane przez endocytozę za pośrednictwem receptora, mają one również trudności z ucieczką przed transportem do lizosomu, gdzie atak zlokalizowanego stężenia proteaz może być problematyczny dla przetrwania. Dobrze scharakteryzowanym peptydem pochodzenia wirusowego, wykorzystywanym w dostarczaniu leków do ucieczki z uwięzienia endosomu, jest białkiem transaktywatora transkrypcji (Tat) ludzkiego wirusa niedoboru odporności 15. Tat jest w stanie uciec z uwięzienia endosomu poprzez wyczuwanie niskiego pH, w którym to momencie zachodzą zmiany konformacyjne białka, które umożliwiają Tat wstawienie się i zakłócenie błony endosomalnej 16. Powoduje to, że koniugaty Tat-payload są w stanie uzyskać dostęp do cytoplazmy. Drugim elementem manipulacji wirusowej związanym z tym protokołem jest podejście stosowane do dostarczania genów terapeutycznych i leków do jądra 17. Wirusy ewoluowały, aby skutecznie manipulować maszynerią komórek gospodarza w celu przejścia przez błonę jądrową poprzez przejście przez kompleks porów jądrowych (NPC). Makrocząsteczki komórkowe zawierają (lub wiążą się z białkami, które zawierają) sygnały lokalizacji jądrowej (NLS) niezbędne do wiązania się z białkami transportu jądrowego (np. karioferyny α i β), które zapewniają wymagane ruchy przez NPC. Wirusy rozwinęły białka zawierające sekwencje NLS, które zapewniają im zdolność do wykorzystywania białek transportowych komórek gospodarza do transportu do jądra 18.
Wiele AC zostało wcześniej sfunkcjonalizowanych peptydami pochodzącymi z Tat- i NLS i przetestowanych pod kątem ich zdolności do gromadzenia się wewnątrz komórek rakowych i do zwalczania nowotworów 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 (Tabela 1). Badania dostarczające ładunki cytotoksyczne wykazały, że AC zmodyfikowane peptydami pochodzącymi z wirusa są w stanie znacznie zwiększyć akumulację komórkową, cytotoksyczność i zabijanie guzów w porównaniu z niezmodyfikowanymi AC 22,26. Cechą wspólną dla tej nowatorskiej klasy AC jest ich budowa. Zazwyczaj peptydy zawierają końcową cysteinę zapewniającą wolną grupę sulfhydrylową. MAb są najpierw poddawane reakcji z nierozszczepialnym dwufunkcyjnym środkiem sieciującym zawierającym grupy N-hydroksysukcynimidu (NHS) i maleimidowe na przeciwległych końcach. Estry NHS reagują z aminami pierwszorzędowymi na mAb, tworząc wiązania amidowe. Przereagowany mAb z wolnymi grupami maleimidowymi jest następnie poddawany reakcji z grupami sulfhydrylowymi na peptydach, tworząc wiązanie tioestrowe, a tym samym łącząc peptyd i mAb. Chociaż homobifunkcyjne środki sieciujące były używane 28, heterobifunkcjonalne środki sieciujące są częściej używane w budowie peptydów pochodzących z wirusów-AC 22,23,26,31,32. Protokół ten w szczególności wykorzystuje środek sieciujący sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylan (sulfo-SMCC) ze względu na łatwość użycia i dlatego, że jest on stosowany w zatwierdzonym koniugacie przeciwciało-lek Trastuzumab-emtanzyna oraz w wielu peptydach-AC pochodzących z wirusów 8,22,23,26,31,32. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) jest podstawową metodą wstępnego określania wydajności koniugacji i półilościowego określania liczby peptydów na mAb. Mikroskopia konfokalna z użyciem znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowego specyficznego dla mAb jest zazwyczaj metodą wstępnej oceny właściwości dystrybucji wewnątrzkomórkowej AC zmodyfikowanych peptydami pochodzącymi z wirusa. Do tej pory radioizotopy są głównymi ładunkami dostarczanymi przez AC modyfikowane peptydami pochodzącymi z wirusów. Izotopy promieniotwórcze są korzystne, ponieważ radioaktywność w komórkach można łatwo określić ilościowo za pomocą zliczania promieniowania gamma. Ponadto AC, które są tłumaczone na mysie modele ludzkich nowotworów, zapewniają naukowcom możliwość oceny celowania w guz przy użyciu modalności obrazowania molekularnego, takich jak tomografia komputerowa z emisją pojedynczych fotonów i pozytonowa tomografia emisyjna (PET) 23,32,33. Ogólnie rzecz biorąc, metody konstruowania i walidacji stosowane głównie przez badaczy zapewniają bardzo dobrą ocenę AC zmodyfikowanych peptydami pochodzącymi z wirusa na początkowym etapie rozwoju, aby skutecznie wnikać i dostarczać ładunek do komórek docelowych i do guzów.
Zmodyfikowane przez Tat- i NLS AC oświetliły kluczowe obszary dla dalszej poprawy dostarczania ładunku do wnętrza komórek rakowych i do guzów. W odniesieniu do AC zmodyfikowanych przez NLS, wydajność akumulacji wewnątrzkomórkowej może być niewielka 23,31,34. Nieefektywna akumulacja wewnątrzkomórkowa jest spowodowana ciągłym uwięzieniem endosomalnym. Celowanie w guz in vivo można również zmniejszyć zarówno za pomocą AC zmodyfikowanych Tat, jak i NLS. Aktywne sekwencje Tat i NLS zawierają kilka dodatnio naładowanych reszt. Po przyłączeniu do mAb, całkowity ładunek kationowy może być znacznie zwiększony 35. W konsekwencji AC zmodyfikowane przez Tat i NLS zwiększyły wychwyt w zdrowych tkankach i zwiększyły szybki klirens krwi.
Nasza grupa opracowała złożony związek składający się z kwasu cholowego połączonego z NLS (ChAcNLS; Rysunek 1). AC modyfikowane ChAcNLS są w stanie zwiększyć wewnątrzkomórkową akumulację dostarczonych izotopów promieniotwórczych i poprawić celowanie guza w porównaniu do zmodyfikowanych NLS i tradycyjnych AC 33,34. Mechanizm stojący za kwasem cholowym jest inspirowany zdolnością wybranych wirusów bezotoczkowych, które nie mogą polegać na fuzji błonowej, do wykorzystania kwasu cholowego do wywołania ucieczki endosomu poprzez tworzenie ceramidu. Na przykład wirus jelitowy świń rekrutuje kwas cholowy, który aktywuje sfingomielinazę, która katalizuje hydrolizę sfingomieliny do ceramidu 36,37,38. To destabilizuje błonę endosomalną i umożliwia ucieczkę wirusa. Tak więc kwas cholowy jest kolejnym składnikiem pochodzącym z wirusa, który uzupełnia NLS.
Ponieważ ta dziedzina się naprzód i w przyszłości pojawiają się postępy w dostarczaniu ładunków przez AC zmodyfikowane peptydami pochodzącymi z wirusa, jest to odpowiedni czas, aby dostarczyć wizualne demonstracje ich biochemicznych i funkcjonalnych cech podczas początkowego rozwoju. W tym miejscu opisujemy nasz protokół wstępnej oceny AC modyfikowanych peptydami pochodzącymi z wirusa w celu skutecznego, ale prostego określenia akumulacji wewnątrzkomórkowej i celowania w guz na wczesnym etapie rozwoju. Jako przykładowe systemy modelowe wykorzystujemy dostępne na rynku mAb 7G3 i A14. Procedura 1 opisuje użycie SDS-PAGE jako metody, która pozwala na podejmowanie decyzji "go/no go" dla skonstruowanych AC. Procedura 2 opisuje metodę wykorzystującą trypsynizację pozwalającą na lepszą wizualizację wewnątrzkomórkowej dystrybucji i akumulacji AC. Procedura 3 opisuje metodę ulepszonego frakcjonowania wewnątrzkomórkowego w celu dokładnego określenia lokalizacji jądrowej. W tej procedurze wykorzystujemy ładunek 64Cu (t1/2 = 12,7 h), ponieważ jest on podatny na wypływ komórkowy i jest emiterem pozytonów 10. W związku z tym Procedura 4 opisuje charakterystykę ukierunkowania guza in vivo za pomocą obrazowania PET w celu wizualizacji wychwytu guza w stosunku do tła (tj. zdrowych tkanek niedocelowych) i określenia, czy przykładowy AC może specyficznie i skutecznie celować w nowotwory. Metody te są wystarczające dla badaczy opracowujących AC zmodyfikowane peptydami pochodzącymi z wirusa w celu zidentyfikowania kandydatów do dalszego rozwoju.

<table><tbody><tr><td>Sulfo-SMCC</td><td>Thermo Scientific</td><td>22122</td><td>Do wyboru jest wiele homo- i hetero-bifunkcyjnych sieciowników maleimidowych.</td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-0,5 ml</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC505096</td><td>Dostępne są opakowania po 8, 24 i 96 ml. Wybierz zgodnie ze swoimi potrzebami.</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards</td><td>BioRad</td><td>1610375EDU</td><td>Mulicolor rekombinowane białka od 10 do 250 kDa.</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200056</td><td>objętości 100 lub 500 ml do wyboru.</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało drugorzędowe anty-mysie IgG (H + L), koniugat Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-21235</td><td>1 - 10 &mu; g / ml zalecane</td></tr><tr><td>NOTA-NHS</td><td>CheMatech</td><td>C100</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Lamin A/C (N-18)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-6215</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Rab7</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-376362</td><td></td></tr><tr><td>A14 mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>555902</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Bufor do próbek (4x)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>2- Merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwa TF-1a</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-2003</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>ATCC</td><td>ATCC 30-2001</td><td></td></tr><tr><td>RIPA bufor do lizy i ekstrakcji</td><td>Thermo Scientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>AMIDE oprogramowanie do obrazowania medycznego</td><td>dostępne pod adresem amide.sourceforge.net</td><td></td><td>Całkowicie za darmo do pobrania</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny FluoView FV1000</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Fluoview</td><td>Paski Olympus</td><td></td><td>www.olympus-lifescience.com</td></tr><tr><td>ITLC Biodex</td><td></td><td>150-771</td><td></td></tr></tbody></table>

wstępna ocena koniugatów przeciwciał zmodyfikowanych peptydami pochodzącymi z wirusów w celu zwiększenia akumulacji komórkowej i poprawy celowania w guz

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Koniugaty przeciwciał (AC) zmodyfikowane peptydami pochodzącymi z wirusów są potencjalnie potężną klasą czynników dostarczających komórki nowotworowe dla ładunków molekularnych stosowanych w leczeniu raka i obrazowaniu, ze względu na zwiększoną akumulację komórkową w stosunku do obecnych AC. Podczas wczesnego rozwoju AC in vitro techniki fluorescencyjne i testy radioimmunologiczne są wystarczające do określenia lokalizacji wewnątrzkomórkowej, wydajności akumulacji i swoistości komórek docelowych. Obecnie nie ma konsensusu co do znormalizowanych metod przygotowania komórek do oceny wewnątrzkomórkowej akumulacji i lokalizacji AC. Wstępne testy AC zmodyfikowanych peptydami pochodzącymi z wirusa mają kluczowe znaczenie, zwłaszcza jeśli skonstruowano kilku kandydatów. Określenie akumulacji wewnątrzkomórkowej za pomocą fluorescencji może być zakłócone przez sygnał tła z AC na powierzchni komórki i komplikować interpretację akumulacji. W przypadku testów radioimmunologicznych zazwyczaj leczone komórki są frakcjonowane, a radioaktywność w różnych przedziałach komórkowych mierzona. Jednak liza komórek różni się w zależności od komórki i często przedziały jądrowe i cytoplazmatyczne nie są odpowiednio izolowane. Może to prowadzić do uzyskania wprowadzających w błąd danych na temat właściwości dostarczania ładunku. Dożylne wstrzyknięcie znakowanych radioaktywnie modyfikowanych peptydami wirusa AC u myszy z nowotworem, a następnie obrazowanie radionuklidów jest potężną metodą określania właściwości celowania w guz i dostarczania ładunku w fazie rozwoju in vivo. Jest to jednak stosunkowo niedawny postęp i niewiele grup oceniło w ten sposób AC zmodyfikowane peptydami pochodzącymi z wirusów. Opisujemy przetwarzanie leczonych komórek w celu dokładniejszej oceny akumulacji AC zmodyfikowanej peptydem pochodzącym z wirusa przy użyciu mikroskopii konfokalnej i testów radioimmunologicznych. W szczególności metoda trypsynizacji komórek w celu usunięcia AC związanych z powierzchnią komórki. Udostępniamy również metodę poprawy frakcjonowania komórkowego. Wreszcie, protokół ten zapewnia metodę in vivo wykorzystującą pozytonową tomografię emisyjną (PET) do oceny początkowych właściwości celowania w guz u myszy z nowotworem. Jako przykładowy ładunek użyteczny w tym protokole używamy radioizotopu 64Cu (t1/2 = 12,7 h).

W przypadku procedury 1 konstrukcja 7G3 zmodyfikowanego ChAcNLS z użyciem sulfo-SMCC jako czynnika sieciującego jest bardzo niezawodna. Zazwyczaj, po nałożeniu na żel 12% i analizie metodą SDS-PAGE, prowadzi to do wyraźnych, stopniowych wzrostów MW proporcjonalnie do stosowanych stosunków sulfo-SMCC do 7G3, co pozwala na indywidualną ocenę koniugacji ChAcNLS dla łańcuchów ciężkich i lekkich (Rysunek 3). Reakcja 7G3 przy stosunkach sulfo-SMCC do 7G3 wynoszących odpowiednio...

Peptydy pochodzenia wirusowego sprzężone z koniugatami przeciwciał (AC) to podejście, które nabiera rozpędu ze względu na potencjał dostarczania ładunków molekularnych ze zwiększoną akumulacją komórek nowotworowych. Wykorzystując powszechne metody oceny koniugacji peptydów, akumulacji wewnątrzkomórkowej AC i ładunku oraz celowania w guz, protokół ten pomaga naukowcom w kluczowych początkowych fazach rozwoju.

Wstępna ocena koniugatów przeciwciał zmodyfikowanych peptydami pochodzącymi z wirusów w celu zwiększenia akumulacji komórkowej i poprawy celowania w guz

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Ogólnym celem tych procedur jest ocena swoistości i skuteczności koniugatów przeciwciał w gromadzeniu się wewnątrz komórek docelowych i guzów w początkowych stadiach rozwoju, tak aby ostatecznie można je było zastosować w klinice. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie dotyczące odpowiedzi na pola sprzężone, takie jak wydajność lokalizacji jądrowej i ogólna akumulacja międzykomórkowa. Zaletą tej techniki jest to, że za pomocą obrazowania PET naukowcy mogą ocenić skuteczność i selektywność kandydujących koniugatów przeciwciał.Implikacje tych technik rozciągają się na terapię i diagnostykę raka, ponieważ nieskuteczna akumulacja komórek nowotworowych jest głównym ograniczeniem w przypadku tych zastosowań dla koniugatów przeciwciał. Po zsyntetyzowaniu koniugatu przeciwciała przeciwko sekwencji lokalizacji jądrowej kwasu kolkowego zgodnie z protokołem tekstowym, potraktuj docelowe komórki TF1A 200 nanomolowymi koniugatami przeciwciał MLS przeciwko kolce 7G3. Obejmują komórki poddane działaniu zmodyfikowanych kontrolnych przeciwciał monoklonalnych.Inkubować pięć razy po 10 do szóstych komórek dodatnich antygenem z koniugatami w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Następnie usuń supernatant i użyj jednego mililitra lodowatego PBS do trzykrotnego przemycia komórek. Dodaj świeżą pożywkę i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dodatkową godzinę.Następnie dodaj 0,5 mililitra PBS, zawierającego 0,25% trypsyny i EDTA, i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez maksymalnie 30 minut. Następnie użyj 1,5 mililitra pożywki RPMI1640 z 10% FBS, aby zneutralizować trypsynę. Odwirować komórki w temperaturze 500 razy G przez pięć minut, usunąć supernatant i użyć 0,5 mililitra lodowatego PBS do ponownego trzykrotnego przemycia komórek.Dodaj 0,5 mililitra 1% PFA i 1% sacharozy i PBS do komórek i umieść je na lodzie na 30 minut, aby je utrwalić. Następnie użyj 0,5 mililitra lodowatego PBS do trzykrotnego umycia komórek i odwiruj próbki w temperaturze 250 razy G przez pięć minut. Następnie dodaj 0,15% Triton X-100 i PBS do komórek i przepuszczaj je na lodzie przez pięć minut.Następnie, za pomocą lodowatego PBS, umyj komórki i powtórz wirowanie. Zawieś komórki w 0,1 mililitra PBS, zawierającym dwa mikrogramy na mililitr antylustrzanego drugorzędowego przeciwciała poliklonalnego FC sprzężonego z Alexa Fluor 647 i inkubuj próbki w ciemności w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Odwiruj komórki w temperaturze 250 razy G przez pięć minut i użyj 0,5 mililitra lodowatego PBS do trzykrotnego umycia komórek.Następnie zawieś komórki w 0,5 mililitra PBS. Dodaj 10 mikrogramów na mililitr jodku propidyny do komórek. Następnie za pomocą podłoża montażowego zamontuj jedną od 10 do piątej komórki na szkiełkach podstawowych przed przykryciem próbki szklanym szkiełkiem nakrywkowym.Zbadaj komórki za pomocą obiektywu olejowego Plan APO 60X, apertura numeryczna 1,42, na odwróconym laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym. Wykrywanie fluorescencji PI za pomocą 488-nanometrowego lasera argonowego i pryzmatu skanującego spektralnego ustawionego na 600 do 650 nanometrów. Do fluorescencji AF 647 użyj lasera helowo-neonowego o długości fali 633 nm i zestawu pryzmatów spektralno-skanujących o długości od 650 do 700 nanometrów.Zbieraj obrazy z PI i AF 647 sekwencyjnie, 1024 na 1024 piksele, z 2-krotnym uśrednianiem linii, wykonane w odstępach 0,5 mikrona na całej grubości komórki. Prezentuj obrazy jako projekcje Z. Aby przeanalizować komórki, oceń i zapisz, czy fluorescencja wewnątrzkomórkowa w cytoplazmie jest zgrupowana i blisko powierzchni komórki, czy rozproszona i jednorodna.Oceń również względną intensywność fluorescencji na komórkę. Po przygotowaniu i zagęszczeniu znakowanego radioaktywnie koniugatu przeciwciała przeciwko kwasowi kolkowemu NLS zgodnie z protokołem tekstowym, należy określić skuteczność znakowania radioizotopowego, nakładając 0,5 mikrolitra 0,1-molowego cytrynianu sodu PH5,5 lub eluentu ITLC na pasek ITLC. Zrób autoradiogram paska i uzyskaj obraz cyfrowy.Przeprowadzić densytometrię, aby uzyskać proporcję miedzi związanej i wolnej-64. Jeśli zawartość wolnej miedzi-64 jest większa niż 5%, należy zagęścić próbkę dalej. W przypadku badań akumulacji komórkowej miedzi-64 należy traktować komórki 100 nanomolami koniugatów A14 znakowanych miedzią-64 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną, sześć i 24 godziny, jak opisano wcześniej.Potraktuj komórki niezmodyfikowanym A14, aby zablokować alfacyty IL5R i w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zablokować internalizację za pośrednictwem receptora. Po umyciu komórek i inkubacji ze świeżą pożywką, jak pokazano wcześniej w tym filmie, dodaj 0,5 mililitra PBS zawierającego 0,25% trypsyny i EDTA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie, po zneutralizowaniu i umyciu komórek jak poprzednio, dodaj do komórek bufor do lizy błony plazmatycznej i inkubuj je na lodzie przez 10 minut.Odwirować komórki zlizatywowane błoną plazmatyczną w temperaturze 90 razy G przez pięć minut. Usunąć supernatant i przenieść go do nowej probówki. Reprezentuje to frakcję cytoplazmatyczną.Następnie użyj lodowatego PBS, aby trzykrotnie przemyć jądra i dodaj popłuczyny do frakcji cytoplazmatycznej. Upewnij się, że fiolki zawierające frakcje jądrową i cytoplazmatyczną są szczelnie zamknięte, a następnie umieść je w liczniku gamma skalibrowanym dla miedzi-64 w celu przeliczenia surowych liczb na megabecaryl. Określenie jakości izolacji jąder, wykonując analizę Western-Blot dla laminy AC, ograniczonego białka jądrowego; i Rab-7, obfite białko cytoplazmatyczne, na hurtowych frakcjach lizaty, jądrowych i cytoplazmatycznych.Potraktuj pięć razy 10 do sześciu komórek za pomocą 500 mikrolitrów testu strącania radio-aminowego lub buforu RIPA i buforu do lizy plazmatyczno-błonowej zawierającego 1%2% i 4%NP-40. Ponadto izolowane jądra należy potraktować 500 mikrolitrami buforu RIPA w celu uzyskania izolowanych białek jądrowych. Dodać czterokrotność objętości próbki zimnego acetonu do wyizolowanych białek jądrowych, cytoplazmatycznych i hurtowych i inkubować przez 60 minut w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Odwirować próbki w temperaturze 13 000 razy G przez 10 minut. Zdekantować supernatant, uważając, aby nie usunąć osadu białka. Następnie dodaj 100 mikrolitrów PBS, aby rozpuścić białka.Po wykonaniu Western Blotting zgodnie z wcześniejszym opisem, przeciąć błonę na pół przy 40-kilodaltonowym markerze masy cząsteczkowej. Użyj przeciwciał specyficznych dla laminy-AC do zbadania blot zawierającego białka o wyższej masie cząsteczkowej i użyj przeciwciał specyficznych dla Rab-7 do zbadania dolnej połowy błony. W grupach zawierających cztery myszy nodskit wstrzyknąć do żyły ogonowej od 20 do 30 mikrogramów znakowanego radioaktywnie koniugatu przeciwciała przeciw kolce NLS A14, znakowanego radioaktywnie A14 NLS i znakowanego radioaktywnie A14.Tego samego dnia umieść cylindryczny fantom zawierający pięć megabekaryli miedzi-64 w skanerze PET, aby przeliczyć liczbę radioaktywnych substancji na sekundę na wstrzykniętą dawkę na gram tkanki. 48 godzin później, po znieczuleniu myszy zgodnie z protokołem tekstowym, szybko przenieś mysz na stół skanera PET w pozycji leżącej głową do przodu z nosem dla izofluranu. Rozpocznij akwizycję danych PET przy użyciu zwykłego ustawienia trybu próbkowania i okna energetycznego od 250 do 650 kiloelektronowoltów.Po zakończeniu skanowania wyjmij mysz ze skanera i umieść ją z powrotem w klatce. Jak pokazano na tym rysunku, strzałki pokazują różnicę podczas oceny akumulacji sprzężonego przeciwciała z trypsynizacją i bez niej. W komórkach, które nie są trypsynizowane, akumulacja i dystrybucja wewnątrzkomórkowa jest trudna do oceny ze względu na nadmierną ekspresję receptorów powierzchniowych komórki docelowej.Strzałki pokazują różnicę w wewnątrzkomórkowej akumulacji i dystrybucji dwóch kandydatów na koniugat przeciwciał, gdy komórki są prawidłowo trypsynizowane. Znakowany radioaktywnie koniugat przeciwciała NLS przeciwko kwasowi kolkowemu A14 wykazuje powinowactwo nanomolowe do IL5R alfa. Wraz ze wzrostem stężeń znakowanego radioaktywnie koniugatu przeciwciała NLS przeciwko kwasowi kolkowemu A14, specyficzne wiązanie koniugatu przeciwciała przeciwko kokolce NLS kwasu kolkowego A14 zbliżało się do wysycenia przy stężeniach 3,5 nanomola zarówno w komórkach HT-1376, jak i HT-B9.Zliczanie promieniowania gamma ujawnia, że wzrost radioaktywności w jądrze i cytoplazmie ze znakowanego radioaktywnie koniugatu przeciwciała przeciw kolce NLS A14 jest specyficzny i zwiększa się w czasie. Komórki HT-1376 i HT-B9 inkubowano z buforem do lizy błony plazmatycznej zawierającym 1%2%lub 4%NP-40. W przypadku komórek HT-1376 i HT-B9 bufor do lizy zawierający jeden lub 2% NP-40 Rap-7 nie został wykryty we frakcji jądrowej, a lamina AC nie została wykryta we frakcji cytoplazmatycznej.Obrazowanie PET pozwala na ocenę kandydujących koniugatów przeciwciał pod kątem ich zdolności do celowania w nowotwory antygenowo-dodatnie, czerwone i niebieskie strzałki oraz związanych z nimi właściwości biodystrybucji w porównaniu z macierzystym przeciwciałem niemodyfikowanym peptydami. Można zobaczyć akumulację sygnału w guzie, aby pomóc w selekcji potencjału dla rozwiniętego koniugatu przeciwciała. Obrazowanie PET pozwala również na ocenę wychwytu potencjalnego koniugatu przeciwciał w zdrowych tkankach, takich jak wątroba.Po opanowaniu tych technik naukowcy zajmujący się celowanym dostarczaniem ładunków molekularnych do guza będą mogli zbadać dodatkowe czynniki, w przypadku których akumulacja komórek nowotworowych jest utrudniona z powodu uwięzienia endosomu.

initial-evaluation-antibody-conjugates-modified-with-viral-derived

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film pokazuje proces oceny wewnątrzkomórkowej dystrybucji koniugatów przeciwciał modyfikowanych peptydami pochodzącymi z wirusa za pomocą mikroskopii konfokalnej. Sekwencja lokalizacji jądrowej pochodząca z wirusa kieruje koniugatami przeciwciał w cytoplazmie, co potwierdza się za pomocą barwienia immunologicznego i pomiaru fluorescencji.

Ocena wewnątrzkomórkowej dystrybucji koniugatów przeciwciał zmodyfikowanych peptydami pochodzącymi z wirusa

Tutaj autorzy prezentują prosty i skuteczny protokół definiowania liniowego epitopu antygenowego za pomocą oczyszczonego przeciwciała monoklonalnego i skanowania peptydowego poprzez hybrydyzację kropkowo-plamową. Zidentyfikowany epitop może być następnie wykorzystany w zastosowaniach terapeutycznych i diagnostycznych.

Wspomagana skanowaniem peptydowym identyfikacja liniowego epitopu limfocytów B rozpoznanego przez przeciwciało monoklonalne

Zaprojektowaliśmy białko kapsydu wirusa zapalenia wątroby typu E jako nanocząstkę teranostyczną (HEVNP). HEVNP samoorganizuje się w stabilną klatkę dwudziestościenną podczas dostarczania błony śluzowej. W tym miejscu opisujemy modyfikację HEVNP do celowania w guz poprzez mutację reszt wystawionych na powierzchni do cystein, które sprzęgają syntetyczne ligandy, które specyficznie wiążą komórki nowotworowe.

Funkcjonalizacja powierzchni nanocząstek wirusa zapalenia wątroby typu E przy użyciu metod koniugacji chemicznej

Włączenie pochodnej cyklopropenu lizyny do przeciwciał pozwala na specyficzne dla miejsca, szybkie i efektywne połączenie cząsteczek zawierających tetrazynę w celu wytworzenia koniugatów przeciwciało-lek.

Kodowanie genetyczne niekanonicznego aminokwasu do wytwarzania koniugatów przeciwciało-lek w drodze szybkiej reakcji bioortogonalnej

Ten protokół opisuje szczegółowy proces generowania i charakterystyki ex vivo wirusów onkolitycznych do ekspresji immunomodulatorów, używając jako przykładu wirusów odry kodujących bispecyficzne aktywatory limfocytów T. Zastosowanie i adaptacja do innych platform wektorowych i transgenów przyspieszy rozwój nowych immunowirusoterapeutyków do translacji klinicznej.

Paramyksowirusy w immunomodulacji ukierunkowanej na nowotwór: projektowanie i ocena ex vivo

W tym protokole opiszemy syntezę PODS, odczynnika na bazie fenyoksadiazolylu metylosulfonu do selektywnego przyłączania ładunków do tioli biomolekuł, szczególnie przeciwciał. Ponadto opiszemy syntezę i charakterystykę dwufunkcyjnego chelatora nośnego POD oraz jego koniugację z modelowym przeciwciałem.

Synteza i biokoniugacja odczynników tiolowo-reaktywnych do tworzenia immunokoniugatów modyfikowanych selektywnie

Metoda lokalizacji immunofluorescencji in vivo (IVIL) może być użyta do badania in vivo biodystrybucji przeciwciał i koniugatów przeciwciał do celów onkologicznych w organizmach żywych przy użyciu kombinacji metod celowania w nowotwory in vivo i barwienia immunologicznego ex vivo.

Lokalizacja immunofluorescencji in vivo do oceny terapeutycznej i diagnostycznej biodystrybucji przeciwciał w badaniach nad rakiem

Tutaj prezentujemy protokół do badania lokalizacji in vivo przeciwciał w modelach ksenoprzeszczepów guza myszy.

Analiza rozmieszczenia nowotworów i tkanek przeciwciała terapeutycznego specyficznego dla antygenu docelowego

Opisujemy protokół chemicznej koniugacji modelowego antygenu albuminy jaja kurzego z przeciwciałem specyficznym dla receptora endocytozy do celowania in vivo w komórki dendrytyczne. Protokół obejmuje oczyszczenie przeciwciała, chemiczne sprzęgnięcie antygenu, a także oczyszczenie koniugatu i weryfikację sprawnej koniugacji.

Chemiczna koniugacja oczyszczonego przeciwciała skierowanego przeciwko DEC-205 z białkiem o pełnej długości do celowania w mysie komórki dendrytyczne in vitro i in vivo

Tutaj prezentujemy metodę identyfikacji związków, które modulują mechanizm ADCC, ważny mechanizm zabijania komórek nowotworowych przez przeciwciała przeciwnowotworowe. Działanie cytotoksyczne komórek NK mierzy się w sferoidach komórek raka piersi w obecności trastuzumabu. Analiza obrazu identyfikuje żywe i martwe komórki zabójcze i docelowe w sferoidach.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał w modelu sferoidalnym guza: zastosowanie do odkrywania leków

Poznaj metodę oceny koniugatów przeciwciał w komórkach TF1A przy użyciu obrazowania PET. Technika ta pozwala badać akumulację wewnątrzkomórkową i lokalizację jądrową w celu poprawy terapii nowotworowych.

Wstępna ocena koniugatów przeciwciał zmodyfikowanych peptydami pochodzącymi z wirusów w celu zwiększenia akumulacji komórkowej i poprawy celowania w guz (Wideo) | JoVE Journal

Wstępna ocena koniugatów przeciwciał zmodyfikowanych peptydami pochodzącymi z wirusów w celu zwiększenia akumulacji komórkowej i poprawy celowania w guz

Przeglądaj więcej filmów