Analiza zakończenia transkrypcji przy użyciu podejścia TRO (Thread-specificion Transcription Run-on) BrUTP

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie zakończenia transkrypcji przez polimerazę RNA do drożdży pączkujących w warunkach in vivo przez transkrypcję specyficzną dla nici przebieg przy podejściu. Metoda ta pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytanie, czy aktywna transkrypcyjnie polimeraza wykryta poza trzema głównymi końcami genu jest tą, która została zainicjowana z regionu promotorowego. Główną zaletą tej metody jest to, że może ona odróżnić polimerazę transkrybującą MRNA od polimerazy transkrybującej całościowo, która zainicjowała transkrypcje i będzie znajdować się na trzech głównych końcach genu.

Technika ta może być rozszerzona o badanie zakończenia transkrypcji przez inne polimerazy RNA i drożdże ze względu na zachowawczą naturę terminacji przez różne polimerazy. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat dokładnej roli czynników terminacji w cyklu transkrypcji drożdży, można ją również rozszerzyć na badanie terminacji u wyższych eukariontów. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą zmagać się z przenikaniem komórek i transkrypcją przebiegającą na przystankach, ponieważ wymagają one starannego wykonania, a powstające transkrypty mogą być również trudne do oczyszczenia.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody z podejścia GRO seek, które daje szeroki obraz genomu pozycji polimeraz aktywnych transkrypcyjnie w sposób specyficzny dla nici. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ przebieg transkrypcji i oczyszczanie RNA są trudne do przeprowadzenia ze względu na małą ilość i niestabilny charakter powstających transkryptów. Przed rozpoczęciem transkrypcji należy przeprowadzić reakcję, wyhodować, zebrać i przeniknąć wykładniczo rosnące komórki drożdży, aby uzyskać przepuszczalną paletę komórek.

Aby rozpocząć reakcję, dodaj 150 mikrolitrów transkrypcji przebieg na buforze do przepuszczalnej palety komórek. Używając ściętej końcówki P-200, delikatnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Umieścić próbkę na lodzie.

Po ponownym zawieszeniu wszystkich próbek w przebiegu transkrypcji w buforze, inkubować próbki przez pięć minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Zatrzymaj reakcję, dodając 500 mikrolitrów zimnego gotowego do użycia odczynnika izolacyjnego RNA do każdej próbki. Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Rozpocznij procedurę ekstrakcji RNA, dodając 200 mikrolitrów szklanych kulek przemytych kwasem do każdej zawiesiny komórek i energicznie wstrząsając w mieszalniku wirowym przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po 20 minutach użyj gorącej igły o rozmiarze 22, aby przekłuć dno każdej probówki do mikrowirówki i umieść probówkę na górze 15-mililitrowej sterylnej stożkowej probówki. Wirować przy 300 razy G przez jedną minutę w czterech stopniach Celsjusza i przenieść lizat komórkowy do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej.

Dodaj 500 mikrolitrów zimnego odczynnika do izolacji RNA i 200 mikrolitrów chloroformu do lizatu komórkowego. Wymieszaj zawartość w mieszalniku wirowym, a następnie odwiruj w temperaturze 16, 168 razy G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki do mikrowirówki.

Dodać równą objętość zimnego alkoholu fenolowo-chloroformowego izoamylowego. Wstrząsnąć energicznie na mieszalniku wirowym, a następnie odwirować w temperaturze 16, 168 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść górną fazę wodną zawierającą RNA do nowej probówki do mikrowirówki.

Dodać równą objętość zimnego fenolu chloroformu izoamylowego, ponownie odwirować i odwirować. Do końcowego RNA zawierającego fazę wodną dodać odpowiednią objętość pięciomolowego roztworu chlorku sodu, aby uzyskać końcowe stężenie 0,3 mola. Dodaj trzykrotność objętości zimnego etanolu, aby wytrącić RNA.

Inkubować przez godzinę lub noc w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Po zakończeniu wytrącania RNA odwirować w temperaturze 16, 168 razy G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić paletę RNA w 100 mikrolitrach wody DEPC.

Użyj zestawu do izolacji RNA, aby oddzielić RNA od nieinkorporowanych nukleotydów trifosforanu bromourydyny i wymyć RNA z kolumny za pomocą 100 mikrolitrów wody wolnej od RNAzy. Inkubuj RNA w łaźni wodnej o temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut. A następnie przenieś na lód na co najmniej dwie minuty.

Rozpocznij tę procedurę od przygotowania kulek anty bromo DU podczas wytrącania RNA. Do każdej próbki dodać 500 mikrolitrów buforu wiążącego EDTA 0,25 X fosforan soli sodowej do 25 mikrolitrów osiadłych kulek. Wirować w temperaturze 200 razy G przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant.

Umyj koraliki trzykrotnie buforem do wiązania. Po usunięciu supernatantu z trzeciego płukania dodać 500 mikrolitrów buforu blokującego do kulek i delikatnie wstrząsać przez jedną do dwóch godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wytrząsarce platformowej. Umyj koraliki jeszcze dwa razy za pomocą 500 mikrolitrów bufora wiążącego.

Usunąć supernatant z drugiego płukania i dodać 400 mikrolitrów buforu wiążącego do kulek. Przenieś 100 mikrolitrów RNA bezpośrednio do kulek. Inkubować z delikatnym potrząsaniem przez jedną do dwóch godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wytrząsarce platformowej.

Wirować z prędkością 200 razy G przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie usunąć supernatant. Następnie dodaj 500 mikrolitrów buforu wiążącego do kulek. Wirować z prędkością 200 razy G przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant.

W ten sposób przemyj kulki kolejno buforem wiążącym, buforem o niskiej zawartości soli, buforem o wysokiej zawartości soli i dwukrotnie buforem TET. Aby wymyć RNA znakowane trifosforanem bromourydyny z kulek, dodaj 150 mikrolitrów buforu elucyjnego i inkubuj przez cztery minuty w temperaturze 42 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Odkręć na chwilę i zbierz supernatant.

W ten sposób eluować sekwencyjnie dwa razy za pomocą 150 mikrolitrów i raz za pomocą 200 mikrolitrów buforu elucyjnego. Z każdej próbki należy uzyskać około 500 mikrolitrów oczyszczonego RNA znakowanego trifosforanem bromourydyny o powinowactwie. Aby wytrącić powinowactwo, oczyszczony trifosforan bromourydyny znakowany RNA, dodaj 500 mikrolitrów zimnego fenolu, chloroformu, alkoholu izoamylowego do każdej próbki.

Wirować i wirować w temperaturze 16, 168 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki do mikrowirówki. Dodać odpowiednią objętość pięciomolowego roztworu chlorku sodu, aby uzyskać końcowe stężenie 0,3 mola.

Następnie dodaj trzykrotność objętości zimnego etanolu. Inkubuj w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez noc, aby wytrącić RNA. Następnego dnia zebrać wytrącony RNA przez odwirowanie w temperaturze 16, 168 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Usuń supernatant i pozostaw paletę do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut. Ponownie zawiesić paletę RNA w 26 mikrolitrach wody DEPC. Określić końcowe stężenie RNA, mierząc absorbancję przy 260 nanometrach za pomocą spektrofotometru.

Przechowuj próbki RNA i podwielokrotności w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aż będą potrzebne do syntezy cDNA. Do zbadania zapotrzebowania na RNA 14 do zakończenia transkrypcji genu ASC1 u pączkujących drożdży wykorzystano specyficzną dla nici trifosforanu bromourydyny transkrypcję w zależności od pączkowania. Znakowany trifosforanem bromourydyny RNA z mutanta RNA 14-1 i jego izogenicznych komórek typu dzikiego oczyszczono i poddano odwrotnej transkrypcji starterami C, D, E, F i G. Odpowiednie cDNA amplifikowano metodą PCR przy użyciu par starterów B i C, B i D, B i E, B i F oraz B i G i frakcjonowano na żelach agarozowych.

Obecność produktów amplifikowanych PCR z par starterów B i E, B i F oraz B i G w mutancie odzwierciedla fenotyp odczytu terminacji. Jednak w komórkach typu dzikiego przebieg transkrypcji sygnału był ograniczony do elementu terminatora i nie było wykrywalnej transkrypcji przebiegu sygnału poza regionem terminatora. Ten wykres przedstawia kwantyfikację żeli z pięcioma S RNA jako kontrolą normalizacji.

Wykrycie inicjowanych przez promotor powstających transkryptów, które odczytują sygnał terminacji w mutancie, ale nie w komórkach typu dzikiego, potwierdza, że RNA 14 jest czynnikiem terminacji. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech dni. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że przebieg transkrypcji reakcji ma kluczowe znaczenie dla uzyskania pomyślnego wyniku.

Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak wyszukiwanie GRO, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak rola czynnika w całym genomie w terminacji. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się transkrypcją do zbadania terminacji przez inne polimerazy RNA w drożdżach i wyższych układach eukariotycznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać transkrypcję, uruchamiać reakcje i oczyszczać powstające oznaczone transkrypcje.

Nie zapominaj, że RNA może być bardzo niestabilne i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek, utrzymywanie temperatury około czterech stopni Celsjusza i stosowanie wolnych czynników RNAza.