Name: Analiza zakończenia transkrypcji przy użyciu podejścia TRO (Thread-specificion Transcription Run-on) BrUTP (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Poznaj metodę TRO z zastosowaniem BrUTP do analizy zakończenia transkrypcji przez polimerazę RNA II w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Technika ta pozwala odróżnić polimerazy transkrybujące mRNA od polimeraz pervazywnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania w laboratorium Ansari były wspierane przez grant badawczy (No. MCB 1020911) z Narodowej Fundacji Nauki.

UWAGA: Ta metoda została użyta w artykule badawczym opisanym w Medler, S and Ansari, A.2.
1. Hodowla i zbieranie komórek
<ol>
	<li>Rozpocznij hodowlę komórek w pożywce YPD o pojemności 5 ml (10 g/l ekstraktu drożdżowego, 20 g/l peptonu, 2% dekstrozy) ze świeżo pokrytej płytką Saccharomyces cerevisiae.</li>
	<li>Hoduj komórki przez noc w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 30 °C i 250 obr./min.</li>
	<li>Rozcieńczyć wyhodowaną przez noc kulturę 100 razy do końcowej objętości 100 ml w pożywce YPD w kolbie z przegrodami o pojemności 250 ml. 
	UWAGA: Na reakcję TRO potrzeba łącznie 100 ml kultury; Jeśli potrzebnych jest wiele reakcji, należy użyć większej objętości kultury.</li>
	<li>Wyhoduj komórki do gęstości optycznej 0,8 - 1,0 przy 600 nm (A600 ~ 0,8 - 1,0).</li>
	<li>Zebrać komórki przez odwirowanie przy 820 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 10 ml lodowatego buforu TMN (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl) i inkubować na lodzie przez 5 minut.</li>
	<li>Wirować przy 820 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek. Delikatnie usunąć supernatant przez aspirację.</li>
</ol>
2. Przepuszczalność i przygotowanie komórek do testu rozbiegowego
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1 ml 0,6% roztworu sarkozylu, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą ściętej końcówki P1000. Przenieść zawiesinę komórek do schłodzonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Delikatnie wstrząsać komórkami w temperaturze 4 °C przez 25 minut na wytrząsarce platformowej. 
	UWAGA: Probówki do mikrowirówek powinny być umieszczone w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z lodem, aby utrzymać niską temperaturę, unikając możliwości wystąpienia jakichkolwiek nowych zdarzeń inicjacyjnych w promotorze na tym etapie.</li>
	<li>Odwirować komórki przy sile 1 200 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C za pomocą wirówki stołowej z chłodzeniem.</li>
	<li>Delikatnie zassać supernatant, aby usunąć nadmiar płynu z permeabilizowanej osadki komórek.</li>
</ol>
3. Reakcja na transkrypcję
<ol>
	<li>Dodaj 150 μl buforu transkrypcyjnego (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT (ditiotreitol), po 0,75 mM ATP, CTP, GTP i BrUTP, inhibitor RNazy 200 U) do permeabilizowanego osadu komórkowego.</li>
	<li>Delikatnie mieszać, pipetując w górę i w dół za pomocą ściętej końcówki P200. 
	UWAGA: W przypadku przetwarzania wielu próbek trzymaj wszystko na lodzie, aż wszystkie próbki będą gotowe, a następnie przejdź do następnego kroku.</li>
	<li>Inkubować przez 5 minut w temperaturze 30 °C w łaźni wodnej. 
	UWAGA: Dostosuj czas inkubacji w zakresie od 1 do 5 minut, aby zapewnić optymalne włączenie BrUTP do powstającego RNA.</li>
	<li>Zatrzymaj reakcję, dodając 500 μl zimnego, gotowego do użycia odczynnika do izolacji RNA. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
4. Ekstrakcja RNA
<ol>
	<li>Dodać 200 μl przemytych kwasem kulek szklanych do zawiesiny komórek (krok 3.4) i wstrząsać energicznie przez 20 minut w temperaturze 4 °C w mieszalniku wirowym.</li>
	<li>Nakłuć spód probówki do mikrowirówki za pomocą gorącej igły o sile 22 G i umieścić ją na górze sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C w celu zebrania lizatu komórkowego. Przenieś lizat komórkowy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Do lizatu komórkowego dodać 500 μl odczynnika do izolacji zimnego RNA i 200 μl chloroformu. Mieszać zawartość w mieszalniku wirowym i odwirowywać przy 16,168 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Dodać równą objętość zimnego fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (125:24:1) o pH 4-5. Wstrząsnąć energicznie na mieszalniku wirowym i odwirować przy 16,168 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść górną fazę wodną zawierającą RNA do nowej probówki do mikrowirówki. Powtórz krok 4.6 jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Do końcowej fazy wodnej zawierającej RNA dodaj 5 M NaCl, aby uzyskać końcowe stężenie 0,3 M. Dodaj 3-krotność objętości zimnego etanolu, aby wytrącić RNA.
	<ol>
		<li>Inkubować przez 1 godzinę lub przez noc w temperaturze -20 °C. 
		UWAGA: Wykonaj kroki 4.9 - 4.11, podczas gdy kulki anty-BrdU są inkubowane w celu zablokowania (patrz krok 5.3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wirować przy 16,168 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad RNA w 100 μl wody DEPC (dietylowęglan węglanu).</li>
	<li>Użyj mini zestawu do izolacji RNA, aby oddzielić RNA od nieinkorporowanych nukleotydów BrUTP. Odeluj RNA z kolumny za pomocą 100 μl wody wolnej od RNaz.</li>
	<li>Inkubować RNA w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C przez 5 minut, a następnie przenieść do lodu na co najmniej 2 minuty.</li>
</ol>
5. Oczyszczanie powinowactwa RNA znakowanego BrUTP
<ol>
	<li>Do 25 μl osadzonych kulek anty-BrdU dodać 500 μl 0,25x buforu wiążącego SSPE (Sodium Saline Phosphate EDTA) (20x SSPE: 3 M NaCl, 0,2 M NaH2PO4, 0,02 M EDTA, pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,05% Tween, 37,5 mM NaCl). Wirować przy 200 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.</li>
	<li>Powtórz krok 5.1 trzy razy.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu blokującego (1x bufor wiążący, 0,1% poliwinylopirolidonu, 1 mg ultraczystej albuminy surowicy bydlęcej (BSA)) do kulek i delikatnie wstrząsać przez 1-2 godziny w temperaturze 4 °C na wytrząsarce platformowej.</li>
	<li>Umyj kulki jeszcze dwa razy za pomocą 500 μl buforu wiążącego, jak opisano w kroku 5.1.</li>
	<li>Dodać 400 μl buforu wiążącego do kulek.</li>
	<li>Przenieś 100 μl RNA (z kroku 4.11) bezpośrednio do kulek. Inkubować z delikatnym wstrząsaniem przez 1-2 godziny w temperaturze 4 °C na wytrząsarce platformowej.</li>
	<li>Przemyj kulki sekwencyjnie 500 μl buforu wiążącego, 500 μl buforu o niskiej zawartości soli (0,2x SSPE, 1 mM EDTA, 0,05% Tween), 500 μl buforu o wysokiej zawartości soli (0,25x SSPE, 1 mM EDTA, 0,05% Tween, 100 mM NaCl) i dwukrotnie 500 μl buforu TET (1x TE, 0,05% Tween), wirując z prędkością 200 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C pomiędzy każdym praniem.</li>
	<li>Eluować RNA znakowane BrUTP z kulek sekwencyjnie, dwukrotnie za pomocą 150 μl i raz za pomocą 200 μl buforu elucyjnego (20 mM DTT, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1% SDS), inkubując przez 4 minuty w temperaturze 42 °C w łaźni wodnej, a następnie wykonując krótkie wirowanie w celu oddzielenia kulek od supernatantu.</li>
</ol>
6. Wytrącanie RNA znakowanego BrUTP
<ol>
	<li>Dodać 500 μl zimnego fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (125:24:1) pH 4 - 5 do oczyszczonego RNA znakowanego BrUTP o powinowactwie. Mieszać w mieszalniku wirowym i odwirowywać przy 16,168 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Dodaj 5 M NaCl, aby uzyskać końcowe stężenie 0,3 M i 3-krotność objętości zimnego etanolu, aby wytrącić RNA.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze -20 °C przez noc.</li>
	<li>Zebrać wytrącony RNA przez odwirowanie w temperaturze 16,168 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i pozostawić granulkę do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut.</li>
	<li>Zawiesić osad RNA w 26 μl wody DEPC.</li>
	<li>Oznaczyć końcowe stężenie RNA, mierząc absorbancję przy 260 nm za pomocą spektrofotometru. Określ również stosunek 260/280. Stosunek ~2 wskazuje na czystą próbkę RNA.</li>
	<li>Próbki RNA należy przechowywać w podwielokrotnościach w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą potrzebne do syntezy cDNA.</li>
</ol>
7. Odwrotna transkrypcja RNA znakowanego BrUTP
<ol>
	<li>Dostosuj stężenie RNA do 100 ng/μl za pomocą wody DEPC. Użyj 0,5 μg RNA do każdej reakcji syntezy cDNA. 
	UWAGA: Stężenie matrycy RNA może wahać się od 0,5 do 1,0 μg, aby osiągnąć optymalną syntezę cDNA.</li>
	<li>Odwrotna transkrypcja RNA przy użyciu wielu odwróconych starterów zaprojektowanych za miejscem poli(A) (miejscem terminacji), jak pokazano na rysunku 3A.</li>
	<li>Do każdej reakcji odwrotnej transkrypcji dodać 5 μl matrycy RNA (0,5 μg), 1 μl mieszanki dNTP (10 mM każdy), 2 μl odwróconego startera C, D, E, F lub G (50 μM każdy) (patrz rysunek 3A) i wodę wolną od nukleaz. Końcowa objętość reakcyjna w każdej probówce wynosi 13 μL. 
	UWAGA: Liczba reakcji odwrotnej transkrypcji będzie zależeć od liczby starterów odwrotnych użytych do syntezy cDNA. Na przykład w przypadku ASC1 użyto pięciu starterów odwrotnych, a zatem zapoczątkowano pięć reakcji odwrotnej transkrypcji. Oznacz probówki jako C, D, E, F i G na podstawie odwrotnego startera używanego do syntezy cDNA.</li>
	<li>Inkubować probówki zawierające matrycę RNA, mieszaninę dNTP i startery w termocyklerze w temperaturze 65 °C przez 5 minut w celu usunięcia wszelkich wtórnych konformacji strukturalnych, a następnie schłodzić do 4 °C przez co najmniej 2 minuty.</li>
	<li>Dodać 1 μl odwrotnej transkryptazy (200 U/μL), 4 μl buforu i 2 μl 0,1 M DTT do każdej probówki zawierającej matrycę RNA i starter (krok 7.4). Mieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Przeprowadzić odwrotną transkrypcję, inkubując mieszaninę reakcyjną w termocyklerze w temperaturze 42 °C przez 60 minut.</li>
	<li>Dezaktywować odwrotną transkryptazę w temperaturze 65 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Przechowuj cDNA w temperaturze -20 °C lub przejdź do następnego kroku.</li>
</ol>
8. Amplifikacja cDNA
<ol>
	<li>Przeprowadzić reakcję PCR w celu amplifikacji każdego preparatu cDNA (znakowanego C, D, E, F i G dla ASC1) z kroku 7.8 w następujący sposób: 3,0 μl matrycy cDNA z kroku 7.8, 1,0 μl startera B (10 μM), 1,0 μl startera odwróconego C lub D lub E lub F lub G (10 μM), 2,5 μl 10x bufor polimerazy PCR, 0,5 μl mieszanki dNTP (po 10 mM), 1,0 μl MgCl2 (2,5 mM), 15,5 μl wody klasy PCR i 0,5 μl termostabilnego enzymu polimerazy. 
	UWAGA: Należy przetestować różne rozcieńczenia matrycy cDNA w zakresie od 1:5 do 1:100 w celu optymalizacji wydajności produktu PCR. Pojedynczy promotor-proksymalny starter do przodu zostanie użyty do amplifikacji cDNA uzyskanego przy użyciu różnych starterów odwrotnych. Na przykład pojedynczy starter B do przodu znajdujący się w pobliżu promotora został użyty w połączeniu z pięcioma starterami odwrotnymi od C do G dla ASC1. B-C, B-D, B-E, B-F i B-G zastosowano w probówkach oznaczonych odpowiednio jako C, D, E, F i G, jak pokazano na rysunku 3A.</li>
	<li>Uruchom PCR, stosując następujące parametry cykli termicznych: 1 cykl 95 °C przez 2 minuty (gorący start w celu aktywacji polimerazy), 30 - 40 cykli 95 °C przez 30 s (denaturacja), 54 °C przez 15 s (wyżarzanie), 68 °C przez 1 minutę (przedłużenie) i 1 cykl 68 °C przez 5 minut (końcowe przedłużenie). 
	UWAGA: Temperatura wyżarzania będzie się różnić w zależności od konkretnych użytych podkładów, a czas przedłużania będzie się różnić w zależności od oczekiwanego rozmiaru produktu.</li>
	<li>Oddzielić produkt PCR przez elektroforezę na 0,8%, 1,5% lub 2% żelach agarozowych, w zależności od oczekiwanej wielkości produktu.</li>
	<li>Określ ilościowo produkt PCR zgodnie z opisem w El Kaderi et al., 201211. 
	UWAGA: Alternatywnie, użyj strategii RT-qPCR w czasie rzeczywistym, aby określić ilościowo ilość powstających transkryptów.</li>
</ol>

<ol><li>Birse, C. E., Minvielle-Sebastia, L., Lee, B. A., Keller, W., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+termination+of+transcription+to+messenger+RNA+maturation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coupling termination of transcription to messenger RNA maturation in yeast.</a> Science. 280 (5361), 298-301 (1998).</li>
<li>Medler, S., Ansari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+looping+facilitates+TFIIH+kinase-mediated+termination+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Gene looping facilitates TFIIH kinase-mediated termination of transcription.</a> Sci Rep. 5, 12586(2015).</li>
<li>Richard, P., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+termination+by+nuclear+RNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcription termination by nuclear RNA polymerases.</a> Genes Dev. 23 (11), 1247-1269 (2009).</li>
<li>Mischo, H. E., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disengaging+polymerase%3A+terminating+RNA+polymerase+II+transcription+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Disengaging polymerase: terminating RNA polymerase II transcription in budding yeast.</a> Biochim Biophys Acta. 1829 (1), 174-185 (2013).</li>
<li>Porrua, O., Libri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+termination+and+the+control+of+the+transcriptome%3A+why%2C+where+and+how+to+stop%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcription termination and the control of the transcriptome: why, where and how to stop.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (3), 190-202 (2015).</li>
<li>Jacquier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+eukaryotic+transcriptome%3A+unexpected+pervasive+transcription+and+novel+small+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The complex eukaryotic transcriptome: unexpected pervasive transcription and novel small RNAs.</a> Nat Rev Genet. 10 (12), 833-844 (2009).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+promoters+generate+pervasive+transcription+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bidirectional promoters generate pervasive transcription in yeast.</a> Nature. 457 (7232), 1033-1037 (2009).</li>
<li>Neil, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+bidirectional+promoters+are+the+major+source+of+cryptic+transcripts+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread bidirectional promoters are the major source of cryptic transcripts in yeast.</a> Nature. 457 (7232), 1038-1042 (2009).</li>
<li>Clark, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reality+of+pervasive+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The reality of pervasive transcription.</a> PLoS Biol. 9 (7), e1000625(2011).</li>
<li>Goodman, A. J., Daugharthy, E. R., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pervasive+antisense+transcription+is+evolutionarily+conserved+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Pervasive antisense transcription is evolutionarily conserved in budding yeast.</a> Mol Biol Evol. 30 (2), 409-421 (2013).</li>
<li>El Kaderi, B., Medler, S., Ansari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+interactions+between+genomic+loci+through+Chromosome+Conformation+Capture+%283C%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of interactions between genomic loci through Chromosome Conformation Capture (3C).</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 22, Unit22 15(2012).</li>
<li>Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+RNA+sequencing+reveals+widespread+pausing+and+divergent+initiation+at+human+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters.</a> Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zastosowany tutaj protokół TRO specyficzny dla nici został zaadaptowany z protokołu używanego do analizy GRO-Seq (Global Run On-Sequencing) w komórkach ssaków12. Udało nam się zmodyfikować protokół, aby zbadać powstającą transkrypcję w pączkujących drożdżach. Aby dokładnie przeanalizować defekt zakończenia transkrypcji, dostosowaliśmy protokół jeszcze bardziej, pozbywając się etapu hydrolizy RNA. Pozwoliło nam to na specyficzne wykrycie powstających transkryptów o pełnej długości, które rozpoczęły...

Cykl transkrypcji eukariotycznej składa się z trzech głównych etapów: inicjacji, wydłużenia i zakończenia. Zakończenie transkrypcji przez polimerazę RNA II składa się z dwóch odrębnych, współzależnych etapów3. Pierwszy etap obejmuje rozszczepienie, poliadenylację i uwolnienie mRNA z matrycy, a zaraz po nim następuje drugi etap, charakteryzujący się odłączeniem polimerazy od matrycy. Prawidłowe zakończenie ma kluczowe znaczenie dla recyklingu polimerazy podczas inicjacji/reinicjacji transkrypcji, dla zapobiegania interferencji transkrypcji dalszych genów oraz dla utrzymania nieprawidłowej transkrypcji w ryzach poprzez ograniczenie transkrypcji wszechobecnego niekodującego RNA4,5. Pomimo ostatnich postępów, terminacja jest zdecydowanie najmniej zrozumiałym etapem cyklu transkrypcji polimerazy II RNA. Wiarygodny test terminacji jest niezbędny do badania mechanizmu leżącego u podstaw zakończenia transkrypcji przez polimerazę RNA II in vivo.
Stosuje się wiele eksperymentalnych podejść do wykrywania defektu zakończenia w aktywnie transkrybującym genie w warunkach fizjologicznych. Należą do nich Northern blot, czynnik zakończenia ChIP (immunoprecypitacja chromatyny) i tradycyjny test TRO. Każda z tych technik ma pewne zalety i wady. Tradycyjny test TRO był najbardziej wiarygodnym i czułym podejściem do wykrywania defektu zakończenia transkrypcji in vivo1. Ten test lokalizuje aktywne transkrypcyjnie cząsteczki polimerazy w różnych regionach genu wewnątrz komórki. W normalnych warunkach test pokazuje cząsteczki polimerazy zaangażowane transkrypcyjnie, ściśle rozmieszczone między regionem promotora i terminatora genu (ryc. 1A). Jednak po wadliwym zakończeniu polimeraza nie jest w stanie odczytać sygnału zakończenia i jest wykrywana w regionie poniżej końca 3′ genu (Figura 1B).
Defekt zakończenia transkrypcji objawia się obecnością polimerazy transkrybującej zmysły, która rozpoczęła się z obszaru promotora-proksymalnej, a nie będąc w stanie odczytać sygnału zakończenia, kontynuuje transkrypcję regionu poniżej końca 3′ genu, jak pokazano na rysunku 2A. Wraz ze zrozumieniem, że genom eukariotyczny wykazuje przytłaczającą, wszechobecną transkrypcję zarówno w kierunkach zmysłowych, jak i antysensownych w genie i wokół niego 6,7,8,9,10, wkrótce stało się jasne, że tradycyjny test TRO nie może wykryć, czy sygnał polimerazy za genem reprezentuje transkrypt zainicjowany przez promotor (Figura 2A) lub nieprawidłowy RNA, który zainicjował się gdzieś w środku genu lub za elementem terminatora (Figura 2B), lub polimeraza transkrybująca w kierunku antysensownym od końca 3′ genu (Figura 2C). Opisany tutaj test TRO specyficzny dla nici przy użyciu BrUTP może rozróżnić, czy obserwowany sygnał polimerazy odczytu reprezentuje mRNA o rozszerzonym znaczeniu inicjowanym przez promotor, czy transkrypt antysensowny, który zainicjował się za badanym genem. Z powodzeniem zastosowaliśmy to podejście, aby zademonstrować rolę kinazy Kin28 w przerywaniu transkrypcji u pączkujących drożdży2. Stosując to podejście, pokazujemy, że Rna14 jest wymagany do zakończenia transkrypcji ASC1 w pączkujących drożdżach.

<table><tbody><tr><td>Mieszanina fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77619</td><td>Odczynnik TRIzol pH 4-5</td></tr><tr><td></td><td>Technologie życia</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy, ludzkie łożysko</td><td>New England Biolabs</td><td>M0307S</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki anty-BrdU</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-32323AC</td><td></td></tr><tr><td>Protoscript II</td><td>New England Biolabs</td><td>M03368L</td><td>lub równoważny enzym</td></tr><tr><td>Advantage 2 polimeraza Mix</td><td>Clontech</td><td>639201</td><td>lub równoważny enzym</td></tr><tr><td>5-bromourydyna 5' trifosforan soli sodowej</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-214314A</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0451AA</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td></td><td>N0454AA</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td></td><td>N0452AA</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-czysta albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>MC Labs</td><td>UBSA-100</td><td></td></tr><tr><td>Asc1 B</td><td></td><td></td><td>AGATTCGTCGGTCACAAGTCC</td></tr><tr><td>Asc1 C</td><td></td><td></td><td>GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC</td></tr><tr><td>Asc1 D</td><td></td><td></td><td>TGTACATATGTATTTTCGCAGCA</td></tr><tr><td>Asc1 E</td><td></td><td></td><td>GCCAAGGAGACTGAATTTAATG</td></tr><tr><td>Asc1 F</td><td></td><td></td><td>CTATGGAATGGGGGTTTTAAG</td></tr><tr><td>Asc1 G</td><td></td><td></td><td>GGTTATGGCAGACATGCCAC</td></tr><tr><td>5s cDNA</td><td></td><td></td><td>AGATTGCAGCACCTGAGT</td></tr><tr><td>5' 5s odwrotny</td><td></td><td></td><td>GGTTGCGGCCATATCTAC</td></tr><tr><td>3' 5s odwrócony</td><td></td><td></td><td>TGAGTTTCGCGTATGGTC</td></tr></tbody></table>

analiza zakończenia transkrypcji przy użyciu podejścia tro (thread-specificion transcription run-on) brutp

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Ten manuskrypt opisuje protokół wykrywania defektu zakończenia transkrypcji in vivo. Opisany tutaj protokół TRO specyficzny dla nici wykorzystujący BrUTP jest potężnym eksperymentalnym podejściem do analizy defektu zakończenia transkrypcji w warunkach fizjologicznych. Podobnie jak tradycyjny test TRO, opiera się na obecności aktywnej transkrypcyjnie polimerazy poza końcem 3′ genu jako wskaźniku defektu zakończenia transkrypcji1. Rozwiązuje on dwa główne problemy napotkane w tradycyjnym teście TRO. Po pierwsze, może wykryć, czy polimeraza odczytująca sygnał zakończenia jest tą, która zainicjowała transkrypcję z regionu proksymalnego promotora, czy też po prostu reprezentuje wszechobecną transkrybującą polimerazę, która zainicjowała się niespecyficznie z miejsca w ciele lub końca 3′ genu. Po drugie, może odróżnić, czy transkrypcyjnie aktywny sygnał polimerazy poza regionem terminatora jest naprawdę transkrybującym mRNA transkrybującym polimerazę mRNA, czy też zainicjowany przez terminator, niekodujący antysensowny sygnał RNA. Krótko mówiąc, protokół obejmuje przenikanie wykładniczo rosnących komórek drożdży, umożliwiając wydłużenie transkryptów, które zainicjowały się in vivo, w obecności nukleotydu BrUTP, oczyszczanie RNA znakowanego BrUTP metodą powinowactwa, odwrotną transkrypcję oczyszczonego powstającego RNA i amplifikację cDNA za pomocą starterów specyficznych dla nici flankujących regiony promotora i terminatora genu2.

Aby zademonstrować przydatność procedury BrUTP-strand-specific TRO w wykrywaniu defektu terminacji transkrypcji, zastosowaliśmy temperaturoczuły mutant RNA14 z defektem terminacji, nazwany rna14-1. Rola Rna14 w terminacji transkrypcji przez polimerazę RNA II została wykazana przy użyciu tradycyjnego testu TRO, który wykrywał RNA w regionie proksymalnym do terminatora wybranych genów1. Wykrycie sygnału RNA poza regionem terminatora u mutanta rn...

Opisujemy podstawowe eksperymentalne podejście do analizy zakończenia transkrypcji przez polimerazę RNA II in vivo przy użyciu BrUTP metodą TRO (swoistą dla nici) w pączkujących drożdżach. Protokół ten można rozszerzyć o badanie terminacji transkrypcji przez inne polimerazy RNA zarówno u drożdży, jak i wyższych eukariontów.

Analiza zakończenia transkrypcji przy użyciu podejścia TRO (Thread-specificion Transcription Run-on) BrUTP

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie zakończenia transkrypcji przez polimerazę RNA do drożdży pączkujących w warunkach in vivo przez transkrypcję specyficzną dla nici przebieg przy podejściu. Metoda ta pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytanie, czy aktywna transkrypcyjnie polimeraza wykryta poza trzema głównymi końcami genu jest tą, która została zainicjowana z regionu promotorowego. Główną zaletą tej metody jest to, że może ona odróżnić polimerazę transkrybującą MRNA od polimerazy transkrybującej całościowo, która zainicjowała transkrypcje i będzie znajdować się na trzech głównych końcach genu.Technika ta może być rozszerzona o badanie zakończenia transkrypcji przez inne polimerazy RNA i drożdże ze względu na zachowawczą naturę terminacji przez różne polimerazy. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat dokładnej roli czynników terminacji w cyklu transkrypcji drożdży, można ją również rozszerzyć na badanie terminacji u wyższych eukariontów. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą zmagać się z przenikaniem komórek i transkrypcją przebiegającą na przystankach, ponieważ wymagają one starannego wykonania, a powstające transkrypty mogą być również trudne do oczyszczenia.Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody z podejścia GRO seek, które daje szeroki obraz genomu pozycji polimeraz aktywnych transkrypcyjnie w sposób specyficzny dla nici. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ przebieg transkrypcji i oczyszczanie RNA są trudne do przeprowadzenia ze względu na małą ilość i niestabilny charakter powstających transkryptów. Przed rozpoczęciem transkrypcji należy przeprowadzić reakcję, wyhodować, zebrać i przeniknąć wykładniczo rosnące komórki drożdży, aby uzyskać przepuszczalną paletę komórek.Aby rozpocząć reakcję, dodaj 150 mikrolitrów transkrypcji przebieg na buforze do przepuszczalnej palety komórek. Używając ściętej końcówki P-200, delikatnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Umieścić próbkę na lodzie.Po ponownym zawieszeniu wszystkich próbek w przebiegu transkrypcji w buforze, inkubować próbki przez pięć minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Zatrzymaj reakcję, dodając 500 mikrolitrów zimnego gotowego do użycia odczynnika izolacyjnego RNA do każdej próbki. Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Rozpocznij procedurę ekstrakcji RNA, dodając 200 mikrolitrów szklanych kulek przemytych kwasem do każdej zawiesiny komórek i energicznie wstrząsając w mieszalniku wirowym przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po 20 minutach użyj gorącej igły o rozmiarze 22, aby przekłuć dno każdej probówki do mikrowirówki i umieść probówkę na górze 15-mililitrowej sterylnej stożkowej probówki. Wirować przy 300 razy G przez jedną minutę w czterech stopniach Celsjusza i przenieść lizat komórkowy do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej.Dodaj 500 mikrolitrów zimnego odczynnika do izolacji RNA i 200 mikrolitrów chloroformu do lizatu komórkowego. Wymieszaj zawartość w mieszalniku wirowym, a następnie odwiruj w temperaturze 16, 168 razy G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki do mikrowirówki.Dodać równą objętość zimnego alkoholu fenolowo-chloroformowego izoamylowego. Wstrząsnąć energicznie na mieszalniku wirowym, a następnie odwirować w temperaturze 16, 168 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść górną fazę wodną zawierającą RNA do nowej probówki do mikrowirówki.Dodać równą objętość zimnego fenolu chloroformu izoamylowego, ponownie odwirować i odwirować. Do końcowego RNA zawierającego fazę wodną dodać odpowiednią objętość pięciomolowego roztworu chlorku sodu, aby uzyskać końcowe stężenie 0,3 mola. Dodaj trzykrotność objętości zimnego etanolu, aby wytrącić RNA.Inkubować przez godzinę lub noc w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Po zakończeniu wytrącania RNA odwirować w temperaturze 16, 168 razy G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić paletę RNA w 100 mikrolitrach wody DEPC.Użyj zestawu do izolacji RNA, aby oddzielić RNA od nieinkorporowanych nukleotydów trifosforanu bromourydyny i wymyć RNA z kolumny za pomocą 100 mikrolitrów wody wolnej od RNAzy. Inkubuj RNA w łaźni wodnej o temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut. A następnie przenieś na lód na co najmniej dwie minuty.Rozpocznij tę procedurę od przygotowania kulek anty bromo DU podczas wytrącania RNA. Do każdej próbki dodać 500 mikrolitrów buforu wiążącego EDTA 0,25 X fosforan soli sodowej do 25 mikrolitrów osiadłych kulek. Wirować w temperaturze 200 razy G przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant.Umyj koraliki trzykrotnie buforem do wiązania. Po usunięciu supernatantu z trzeciego płukania dodać 500 mikrolitrów buforu blokującego do kulek i delikatnie wstrząsać przez jedną do dwóch godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wytrząsarce platformowej. Umyj koraliki jeszcze dwa razy za pomocą 500 mikrolitrów bufora wiążącego.Usunąć supernatant z drugiego płukania i dodać 400 mikrolitrów buforu wiążącego do kulek. Przenieś 100 mikrolitrów RNA bezpośrednio do kulek. Inkubować z delikatnym potrząsaniem przez jedną do dwóch godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wytrząsarce platformowej.Wirować z prędkością 200 razy G przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie usunąć supernatant. Następnie dodaj 500 mikrolitrów buforu wiążącego do kulek. Wirować z prędkością 200 razy G przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant.W ten sposób przemyj kulki kolejno buforem wiążącym, buforem o niskiej zawartości soli, buforem o wysokiej zawartości soli i dwukrotnie buforem TET. Aby wymyć RNA znakowane trifosforanem bromourydyny z kulek, dodaj 150 mikrolitrów buforu elucyjnego i inkubuj przez cztery minuty w temperaturze 42 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Odkręć na chwilę i zbierz supernatant.W ten sposób eluować sekwencyjnie dwa razy za pomocą 150 mikrolitrów i raz za pomocą 200 mikrolitrów buforu elucyjnego. Z każdej próbki należy uzyskać około 500 mikrolitrów oczyszczonego RNA znakowanego trifosforanem bromourydyny o powinowactwie. Aby wytrącić powinowactwo, oczyszczony trifosforan bromourydyny znakowany RNA, dodaj 500 mikrolitrów zimnego fenolu, chloroformu, alkoholu izoamylowego do każdej próbki.Wirować i wirować w temperaturze 16, 168 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki do mikrowirówki. Dodać odpowiednią objętość pięciomolowego roztworu chlorku sodu, aby uzyskać końcowe stężenie 0,3 mola.Następnie dodaj trzykrotność objętości zimnego etanolu. Inkubuj w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez noc, aby wytrącić RNA. Następnego dnia zebrać wytrącony RNA przez odwirowanie w temperaturze 16, 168 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Usuń supernatant i pozostaw paletę do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut. Ponownie zawiesić paletę RNA w 26 mikrolitrach wody DEPC. Określić końcowe stężenie RNA, mierząc absorbancję przy 260 nanometrach za pomocą spektrofotometru.Przechowuj próbki RNA i podwielokrotności w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aż będą potrzebne do syntezy cDNA. Do zbadania zapotrzebowania na RNA 14 do zakończenia transkrypcji genu ASC1 u pączkujących drożdży wykorzystano specyficzną dla nici trifosforanu bromourydyny transkrypcję w zależności od pączkowania. Znakowany trifosforanem bromourydyny RNA z mutanta RNA 14-1 i jego izogenicznych komórek typu dzikiego oczyszczono i poddano odwrotnej transkrypcji starterami C, D, E, F i G. Odpowiednie cDNA amplifikowano metodą PCR przy użyciu par starterów B i C, B i D, B i E, B i F oraz B i G i frakcjonowano na żelach agarozowych.Obecność produktów amplifikowanych PCR z par starterów B i E, B i F oraz B i G w mutancie odzwierciedla fenotyp odczytu terminacji. Jednak w komórkach typu dzikiego przebieg transkrypcji sygnału był ograniczony do elementu terminatora i nie było wykrywalnej transkrypcji przebiegu sygnału poza regionem terminatora. Ten wykres przedstawia kwantyfikację żeli z pięcioma S RNA jako kontrolą normalizacji.Wykrycie inicjowanych przez promotor powstających transkryptów, które odczytują sygnał terminacji w mutancie, ale nie w komórkach typu dzikiego, potwierdza, że RNA 14 jest czynnikiem terminacji. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech dni. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że przebieg transkrypcji reakcji ma kluczowe znaczenie dla uzyskania pomyślnego wyniku.Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak wyszukiwanie GRO, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak rola czynnika w całym genomie w terminacji. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się transkrypcją do zbadania terminacji przez inne polimerazy RNA w drożdżach i wyższych układach eukariotycznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać transkrypcję, uruchamiać reakcje i oczyszczać powstające oznaczone transkrypcje.Nie zapominaj, że RNA może być bardzo niestabilne i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek, utrzymywanie temperatury około czterech stopni Celsjusza i stosowanie wolnych czynników RNAza.

analysis-termination-transcription-using-brutp-strand-specific

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Telomery są niezbędne dla stabilności chromosomów, a struktura nawisu G telomeru jest kluczowa dla utrzymania telomerów za pośrednictwem telomerazy. Wprowadziliśmy niedawno dwie metody wykrywania struktury nawisu G telomeru w Trypanosoma brucei, którymi są natywna hybrydyzacja w żelu oraz wydłużanie startera za pomocą ligacji, które zostaną w niniejszym opracowaniu opisane.

Badanie struktury G-overhangu telomerów w Trypanosoma brucei

RNA polimeraza II syntetyzuje prekursorowy RNA, który wykracza poza koniec 3' dojrzałego mRNA. Koniec dojrzałego RNA jest generowany kotranskrypcyjnie, w miejscu dyktowanym przez sekwencje RNA, poprzez aktywność endonukleazy kompleksu rozszczepienia. Tutaj szczegółowo opisujemy metodę badania reakcji rozszczepienia in vitro.

Analiza reakcji przetwarzania RNA przy użyciu systemów bezkomórkowych: 3' końcowe rozszczepienie substratów pre-mRNA in vitro

Opisujemy tutaj metodę rozszerzania startera opartą na fluorescencji, aby określić punkty początkowe transkrypcji na podstawie bakteryjnych transkryptów i przetwarzania RNA in vivo za pomocą automatycznego sekwenatora żelowego.

Technika rozszerzania starterów oparta na fluorescencji w celu określenia punktów wyjściowych transkrypcji i miejsc cięcia RNaz in vivo

Ten protokół wykorzystuje Golden Gate Assembly i plazmid pGR-blue do szybkiego ilościowego określenia siły terminatorów znalezionych w silico.

Szybka weryfikacja terminatorów za pomocą plazmidu pGR-Blue i zespołu Golden Gate

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Toeprinting ma na celu zmierzenie zdolności transkrybowanego RNA in vitro do tworzenia kompleksów inicjujących translację z rybosomami w różnych warunkach. Protokół ten opisuje metodę odciskania palca RNA ssaków i może być stosowany do badania translacji zarówno zależnej od czapeczki, jak i sterowanej przez IRES.

Analiza odcisków palców u nóg tworzenia kompleksu inicjacji translacji na mRNA ssaków

Prezentujemy strategię opartą na cyrkularnym RT-PCR, łączącą cyrkularny RT-PCR, ilościowy RT-PCR, leczenie polifosfatazą 5' RNA i Northern blot. Protokół ten obejmuje etap normalizacji w celu zminimalizowania wpływu niestabilnego trifosforanu 5' i nadaje się do rozróżniania i mapowania pierwotnych i przetworzonych transkryptów stabilnie zgromadzonych w mitochondrium kukurydzy.

Rozróżnianie i mapowanie pierwotnych i przetworzonych transkryptów w mitochondrium kukurydzy przy użyciu cyrkularnej strategii opartej na RT-PCR

Domeny wewnętrznie nieuporządkowane są ważne dla funkcji czynnika transkrypcyjnego fuzji onkogennej. Aby terapeutycznie ukierunkować te białka, konieczne jest bardziej szczegółowe zrozumienie mechanizmów regulacyjnych stosowanych przez te domeny. Tutaj używamy transkryptomiki do mapowania ważnych cech strukturalnych wewnętrznie nieuporządkowanej domeny EWS w mięsaku Ewinga.

Mapowanie zależności struktura-funkcja zaburzonych onkogennych czynników transkrypcyjnych za pomocą analizy transkryptomicznej

Ten protokół prowadzi początkujących bioinformatyków przez wprowadzający potok analizy CUT&amp;RUN, który umożliwia użytkownikom przeprowadzenie wstępnej analizy i walidacji danych sekwencjonowania CUT&amp;RUN. Wykonanie opisanych tutaj kroków analizy, w połączeniu z adnotacją pików, pozwoli użytkownikom na uzyskanie mechanistycznego wglądu w regulację chromatyny.

Wstępna analiza i walidacja danych sekwencjonowania CUT&RUN

W tym manuskrypcie opisujemy protokół do funkcjonalnego badania transkrypcji i hamującej aktywności środków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na bakteryjną transkrypcję.

In vitro Testy transkrypcji i ich zastosowanie w odkrywaniu leków

Poznaj metodę TRO z zastosowaniem BrUTP do analizy zakończenia transkrypcji przez polimerazę RNA II w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Technika ta pozwala odróżnić polimerazy transkrybujące mRNA od polimeraz pervazywnych.

Analiza zakończenia transkrypcji przy użyciu podejścia TRO (Thread-specificion Transcription Run-on) BrUTP

Przeglądaj więcej filmów