Analiza pojedynczych cząstek w wysokiej rozdzielczości na podstawie obrazów kriomikroskopii elektronowej przy użyciu SPHIRE

Ogólnym celem tej procedury jest określenie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą analizy pojedynczych cząstek danych z kriomikroskopii elektronowej przy użyciu oprogramowania do przetwarzania obrazu SPHIRE. Krio-EM z pojedynczymi cząstkami staje się główną technologią do badania struktur makromolekuł w rozdzielczości bliskiej atomowi. SPHIRE to nowatorski pakiet oprogramowania, który umożliwia półautomatyczne przetwarzanie danych kriogenicznych w sposób przyjazny dla użytkownika.

Główną zaletą SPHIRE jest mechanizm automatycznej walidacji. Większość procedur należy przeprowadzić tylko raz, a wyniki są obiektywne i powtarzalne. Krio-EM o wysokiej rozdzielczości może być używany do umieszczania pojedynczych pozostałości, zapewniając w ten sposób kluczowy wgląd w organizację i funkcję złożonych maszyn mikromolekularnych.

Osoby, które dopiero zaczynają przygodę z tą metodą, powinny pamiętać, że uzyskanie struktury o wysokiej rozdzielczości w dużym stopniu zależy od jakości próbki i danych wejściowych. Aby rozpocząć korzystanie z aplikacji SPPHIRE, otwórz GUI z terminala. Otwórz NARZĘDZIA, aby wyświetlić obraz z kriomikroskopii za pomocą e2display.

Użyj wbudowanego narzędzia pomiarowego, aby zmierzyć najdłuższą oś cząstek w angstremach na piksel. Otwórz Ustawienia projektu. Ustaw rozmiar okna CTF na co najmniej rozmiar pudełka na cząstki.

Ustaw rozmiar pudełka na cząstki na liczbę parzystą, co najmniej 1 1/2 razy średnicę cząstek. Ustaw promień cząstek na co najmniej połowę zmierzonej długości. Wprowadź symetrię grupy punktowej, jeśli jest znana, oraz przybliżoną masę cząsteczkową.

Zarejestruj ustawienia. Następnie w menu MOVIE (Film) otwórz pozycję Micrograph movie alignment (Wyrównanie filmu Micrograph). Ustaw ścieżki plików wykonywalnych unblur i summovie.

Wybierz surowy, niewyrównany film z mikrografią i zastąp zmienną nazwy pliku symbolem wieloznacznym, aby ustawić wzorzec ścieżki wejściowej mikrografii. Nazwij katalog wyjściowy. Wprowadź liczbę klatek filmu, napięcie mikroskopu i ekspozycję na klatkę.

Uruchom proces, aby wygenerować średnie mikrofotografie z korekcją ruchu ważoną dawką i nieważoną dawką. Następnie otwórz menu CTER i wybierz opcję CTF Estimation. Ustaw mikrofotografie bez dawki jako dane wejściowe.

Nazwij katalog wyjściowy i wypełnij parametry zbierania danych. Ustaw najniższą częstotliwość na 0285 angstremów odwrotnych, a najwyższą częstotliwość na 0,285 angstremów odwrotnych. Uruchom proces, aby wygenerować listę parametrów CTF.

Następnie otwórz menu WINDOW (Okno) i wybierz opcję Particle Picking (Wybieranie cząstek). Ustaw mikrofotografie ważone dawką jako dane wejściowe i uruchom narzędzie e2boxer. Wykonuj zbieranie cząstek ręcznie lub automatycznie.

Wyodrębnij wybrane cząstki do stosów obrazów i połącz je w jeden wirtualny stos obrazów w bazie danych BDB. Po wybraniu i ułożeniu cząstek w stos otwórz menu ISAC i wybierz opcję ISAC 2D Clustering (Grupowanie 2D) ISAC. Ustaw stos obrazów wirtualnych w bazie danych BDB jako dane wejściowe.

Oszacuj liczbę obrazów w klasie. Wypełnij pozostałe parametry i wygeneruj średnie klas 2D. Po zakończeniu klasyfikacji 2D użyj narzędzia Wyświetl dane, aby wyświetlić zweryfikowane powtarzalne średnie klas.

Sprawdzić, czy reprezentowanych jest wiele orientacji cząstek, a średnie klas są zadowalającej jakości. Wygeneruj nowy stos obrazów wirtualnych zawierający tylko cząstki należące do zweryfikowanych średnich klas. Następnie otwórz menu VIPER i użyj narzędzia Wyświetl dane, aby wyświetlić średnie klas.

Usuń średnie klasowe o niskiej jakości lub pokazujące identyczne widoki cząstki. Zapisz pozostałe średnie klas w nowym pliku. Następnie wybierz opcję Początkowy model 3D RVIPER i użyj małego wyboru średnich klas jako danych wejściowych.

Uruchom polecenie, aby wygenerować początkowy powtarzalny model 3D białka. Sprawdź model w programie do grafiki molekularnej Chimera. Porównaj model ze znaną strukturą homologicznego białka lub domeny z białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Wróć do menu VIPER w SPHIRE i wybierz opcję Utwórz odniesienie 3D. Wygeneruj początkowy model referencyjny 3D z prawidłowym rozmiarem piksela i maską 3D. Otwórz menu MERIDIEN i wybierz opcję Udoskonalenie 3D.

Wypełnij stos obrazu wejściowego i początkowe ścieżki pliku referencyjnego 3D. Nazwij katalog wyjściowy i ustaw maskę modelu referencyjnego jako maskę 3D. Wybierz opcję Zastosuj twardą maskę 2D.

Ustaw rozdzielczość początkową w zakresie od 20 do 25 angstremów i uruchom udoskonalanie 3D, aby uzyskać niefiltrowane połówki objętości. Następnie wyświetl w niefiltrowanej połowie objętości w Chimerze. Określ próg binaryzacji, w którym wszystkie gęstości białek są połączone, ale artefakty szumu nie są.

Wróć do menu MERIDIEN w SPHIRE i otwórz Adaptacyjną maskę 3D. Wprowadź niefiltrowane wejście o połowie głośności i próg binaryzacji. Nazwij maskę wyjściową i uruchom proces, aby wygenerować maskę 3D o miękkich krawędziach.

Następnie otwórz Wyostrzanie i zaznacz obie niefiltrowane połówki woluminów. Ustawia maskę 3D o połowie objętości z miękkimi krawędziami jako maskę dostarczoną przez użytkownika. Uruchom proces, który scala połówki woluminów, a następnie filtruje i wyostrza scalony wolumin.

Otwórz plik dziennika, aby wyświetlić ostateczne oszacowanie rozdzielczości. Wygeneruj mapę 3D rozkładu kątowego cząstek stosu obrazu wejściowego wygenerowanego podczas udoskonalania 3D. Otwórz wyostrzony i przefiltrowany model 3D w Chimerze.

Sprawdź mapę zagęszczenia i jej funkcje w wysokiej rozdzielczości. Otwórz rozkład kątowy w Chimerze i sprawdź, czy kąty Eulera są rozłożone izotropowo. Otwórz menu SORT3D i wybierz opcję Szacowanie zmienności 3D.

Wygeneruj mapę zmienności 3D na podstawie wirtualnego stosu obrazów cząstek należących do zweryfikowanych średnich klas. Na podstawie tej mapy zmienności wygeneruj binaryzowaną maskę 3D dla późniejszego ukierunkowanego klastrowania 3D. Następnie otwórz RSORT3D Klastrowanie 3D i wybierz katalog poprzedniego uściślenia 3D jako dane wejściowe.

Nazwij katalog wyjściowy i ustaw globalne i skoncentrowane maski 3D. W przypadku dużych zestawów danych należy użyć co najmniej 5 000 do 10 000 obrazów na grupę. Uruchom proces sortowania, aby wygenerować woluminy każdej jednorodnej grupy 3D.

Użyj Chimery, aby zidentyfikować strukturę o najwyższej pozornej rozdzielczości. Wróć do menu SORT3D w programie SPHIRE i otwórz pozycję Lokalne uściślanie podzbiorów. Ustawia ścieżkę pliku tekstowego podzbioru na plik klastra identyfikatora cząstek odpowiadający strukturze o najwyższej rozdzielczości.

Ustaw katalog uściślania 3D na katalog zawierający niefiltrowane połówki woluminów i iterację ponownego uruchamiania do iteracji o najwyższej rozdzielczości z poprzedniego uściślenia 3D. Uruchom polecenie, aby wygenerować lokalne niefiltrowane połówki woluminów. Następnie utwórz maskę 3D o miękkich krawędziach z jednej z lokalnych połówek-objętości.

Scal lokalne połówki woluminów i wyostrz scalony wolumin bez stosowania filtru dolnoprzepustowego. Następnie otwórz menu LOCALRES i kliknij Local Resolution (Rozdzielczość lokalna). Wybierz lokalne połówki woluminów.

Następnie wybierz lokalną maskę o miękkich krawędziach. Ustawia ogólną rozdzielczość na rozdzielczość bezwzględną oszacowaną podczas wyostrzania scalonego woluminu lokalnego. Oblicz lokalną rozdzielczość woluminu.

Następnie otwórz Filtr lokalny 3D. Ustaw zaostrzony niefiltrowany wolumin lokalny jako dane wejściowe. Wybierz lokalną mapę rozdzielczości i maskę 3D o miękkich krawędziach.

Zastosuj filtr rozdzielczości lokalnej do wyostrzonej objętości, aby utworzyć ostateczny model 3D. Otwórz wynikową mapę objętości i rozdzielczości lokalnej w Chimera. Uruchom narzędzie Kolor powierzchni i wybierz objętość z menu oraz opcję pokolorowania powierzchni zgodnie z rozdzielczością lokalną.

Kompleks toksyn TcdA1 zobrazowano za pomocą kriomikroskopii. Wszystkie obrazy ukazywały wyraźnie dostrzegalne pojedyncze cząstki i pierścienie Thona rozciągające się do rozdzielczości lepszej niż cztery angstremy w widmie mocy. Cząstki zostały wybrane za pomocą e2boxera, a następnie wyekstrahowane do stosu obrazów.

Dwuwymiarowe średnie klas zostały wygenerowane za pomocą iteracyjnego stabilnego wyrównania i grupowania (ISAC). Te średnie klas zostały wykorzystane do obliczenia powtarzalnego modelu 3D za pomocą RVIPER. Model ten dobrze zgadzał się z wcześniej rozwiązaną strukturą krystaliczną TcdA1.

Automatyczne udoskonalenie 3D tego modelu przy użyciu MERIDIEN wygenerowało rozdzielczość niemal atomową, map. 3D analiza zmienności wykazała zlokalizowaną elastyczność regionu końcowego N znakowanego histydyną, domen wiążących receptor i domeny wiążącej TcB. Przeprowadzono obliczenia rozdzielczości lokalnej.

Wyostrzony model poddano filtrowaniu lokalnemu i zastosowano skalę kolorów odpowiadającą rozdzielczości lokalnej, wykazując zgodność topologiczną między obszarami o dużej zmienności a obszarami o niskiej rozdzielczości. Ostateczna struktura cryo-EM TcdA1 o rozdzielczości 3,5 angstrema wykazała wyraźne gęstości dla większości łańcuchów bocznych. Mapa gęstości o takim poziomie szczegółowości może być dalej wykorzystywana do budowania modeli atomowych de novo.

Stosując to podejście, strukturę o rozdzielczości zbliżonej do atomowej można uzyskać w ciągu kilku godzin lub kilku dni, bez apriorycznych informacji strukturalnych. Próbując wykonać tę procedurę, korzystaj tylko z danych wysokiej jakości i sprawdzaj wyniki pośrednie. Niejednorodność składu i struktury próbki cryo-EM może być czynnikiem ograniczającym osiągnięcie rozdzielczości bliskiej atomowi.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś teraz dobrze zrozumieć, jak używać SPHIRE do określania struktury cryo-EM. Jak już zaobserwowałeś, procedury grupowania zawarte w SPHIRE pozwolą Ci nie tylko rozwiązać strukturę interesującego Cię białka, ale także zbadać dynamikę konformacyjną i zapewnić kluczowy mechanistyczny wgląd w złożone mechanizmy molekularne.