Name: Analiza pojedynczych cząstek w wysokiej rozdzielczości na podstawie obrazów kriomikroskopii elektronowej przy użyciu SPHIRE (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Poznaj analizę pojedynczych cząstek w wysokiej rozdzielczości przy użyciu oprogramowania SPHIRE do przetwarzania obrazów kriomikroskopii elektronowej. Ta metoda umożliwia badaczom wyznaczanie struktur kompleksów makromolekularnych z dokładnością zbliżoną do atomowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy D. Rodererowi za dostarczenie nam mikrofotografii TcdA1. Dziękujemy Steve'owi Ludtke za jego nieustanne wsparcie dla infrastruktury EMAN2. Prace te były wspierane przez fundusze Towarzystwa Maxa Plancka (dla S.R.) i Rady Europejskiej w ramach Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (7PR/2007-2013) (grant nr 615984) (dla S.R.) oraz grant z National Institutes of Health R01 GM60635 dla P.A.P.).

<ol><li>Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+cryo-EM+into+a+mainstream+structural+biology+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique.</a> Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).</li>
<li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li>
<li>Bai, X. -C., Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atomic+structure+of+human+%CE%B3-secretase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An atomic structure of human γ-secretase.</a> Nature. 525 (7568), 212-217 (2015).</li>
<li>Ecken, J. V. D., Heissler, S. M., Pathan-Chhatbar, S., Manstein, D. J., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+a+human+cytoplasmic+actomyosin+complex+at+near-atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of a human cytoplasmic actomyosin complex at near-atomic resolution.</a> Nature. 534 (7609), 724-728 (2016).</li>
<li>von der Ecken, J., Müller, M., Lehman, W., Manstein, D. J., Penczek, P. A., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+F-actin-tropomyosin+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the F-actin-tropomyosin complex.</a> Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).</li>
<li>Tang, G., Peng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN2%3A+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li>
<li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li>
<li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FREALIGN%3A+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).</li>
<li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELION%3A+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li>
<li>Shaikh, T. R., Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li>
<li>Hohn, M., Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPARX%2C+a+new+environment+for+Cryo-EM+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).</li>
<li>Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appion%3A+an+integrated%2C+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li>
<li>de la Rosa-Trevìn, J. M., Quintana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scipion%3A+A+software+framework+toward+integration%2C+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li>
<li>Grant, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+optimal+exposure+for+single+particle+cryo-EM+using+a+2.6+%C3%85+reconstruction+of+rotavirus+VP6%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6.</a> eLife. 4, 06980(2015).</li>
<li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera%3FA+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Chemistry%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera?A visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li>
<li>Penczek, P. A., Fang, J., Li, X., Cheng, Y., Loerke, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTER-rapid+estimation+of+CTF+parameters+with+error+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">CTER-rapid estimation of CTF parameters with error assessment.</a> Ultramicroscopy. 140, 9-19 (2014).</li>
<li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFrank%2C+J+%22Three-Dimensional+Electron+Microscopy+of+Macromolecular+Assemblies%22">Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies</a>. , Oxford University Press. (2006).</li>
<li>Woolford, D., Ericksson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SwarmPS%3A+rapid%2C+semi-automated+single+particle+selection+software%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">SwarmPS: rapid, semi-automated single particle selection software.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 174-188 (2007).</li>
<li>Yang, Z., Fang, J., Chittuluru, J., Asturias, F. J., Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+Stable+Alignment+and+Clustering+of+2D+Transmission+Electron+Microscope+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%2FFolding+and+Design%22%5BJournal%5D)">Iterative Stable Alignment and Clustering of 2D Transmission Electron Microscope Images.</a> Structure/Folding and Design. 20 (2), 237-247 (2012).</li>
<li>Gatsogiannis, C., Merino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+insertion+of+a+Tc+toxin+in+near-atomic+detail%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Publishing+Group%22%5BJournal%5D)">Membrane insertion of a Tc toxin in near-atomic detail.</a> Nature Publishing Group. , (2016).</li>
<li>Gatsogiannis, C., Lang, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+syringe-like+injection+mechanism+in+Photorhabdus+luminescens+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A syringe-like injection mechanism in Photorhabdus luminescens toxins.</a> Nature. 495 (7442), 520-523 (2013).</li>
<li>Meusch, D., Gatsogiannis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Tc+toxin+action+revealed+in+molecular+detail%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Tc toxin action revealed in molecular detail.</a> Nature. 508 (7494), 61-65 (2014).</li>
<li>Penczek, P. A., Frank, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+focused+classification%2C+based+on+the+bootstrap+3D+variance+analysis%2C+and+its+application+to+EF-G-dependent+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation.</a> Journal of Structural Biology. 154 (2), 184-194 (2006).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological+crystallography%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).</li>
<li>Callaway, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+revolution+will+not+be+crystallized%3A+a+new+method+sweeps+through+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology.</a> Nature. 525 (7568), 172-174 (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Pojedynczy cząstek cryo-EM wykazał szybki rozwój w ostatnich latach i dostarczył licznych struktur rozdzielczych kompleksów makromolekularnych o dużym znaczeniu biologicznym25. Aby wesprzeć dużą liczbę początkujących użytkowników, którzy obecnie wkraczają w tę dziedzinę, opracowaliśmy platformę do analizy obrazu pojedynczych cząstek SPHIRE i przedstawiamy tutaj protokół instruktażowy dla całego przepływu pracy, w tym wyrównywania filmów, wybierania cząstek, szacowania CTF, wstępnych obliczeń modelu, analizy niejednorodności 2D i 3D, udoskonalania 3D w wysokiej rozdzielczości oraz szacowania i filtrowania rozdzielczości lokalnej.
Opisany tutaj protokół ma służyć jako krótki przewodnik po określaniu struktury 3D przy użyciu mikrofotografii krio-EM białka będącego przedmiotem zainteresowania oraz przy pomocy narzędzi obliczeniowych dostarczanych przez samodzielny graficzny interfejs użytkownika SPHIRE.
Główną cechą przepływu pracy jest to, że większość procedur musi być uruchomiona tylko raz, ponieważ opierają się one na koncepcji walidacji przez odtwarzalność19 i nie wymagają dostosowywania parametrów. Ten automatyczny mechanizm walidacji jest główną zaletą SPHIRE w porównaniu z innymi pakietami oprogramowania, ponieważ wyniki są zwykle obiektywne, powtarzalne i, co najważniejsze, możliwe do uzyskania przy akceptowalnych kosztach obliczeniowych. Pipeline zapewnia ponadto bogactwo informacji diagnostycznych dla doświadczonych użytkowników w celu przeprowadzenia dalszej niezależnej walidacji i oceny przy użyciu własnych metod. Niemniej jednak początkujący użytkownik, który ma co najmniej elementarne przygotowanie teoretyczne w zakresie biologii strukturalnej i mikroskopii elektronowej, powinien być w stanie uzyskać struktury o rozdzielczości zbliżonej do atomowej przy użyciu własnych danych i zautomatyzowanych procedur walidacji.
Jednak uzyskanie struktury o rozdzielczości zbliżonej do atomowej nie zawsze jest proste, a wynik będzie w dużym stopniu zależał od jakości próbki i danych wejściowych. Dla przedstawionych tutaj procedur zakłada się, że dostępna jest wystarczająca liczba wysokiej jakości niewyrównanych surowych filmów EM, których średnie pokazują wyraźnie dostrzegalne jednorodne i losowo zorientowane pojedyncze cząstki. Ogólnie rzecz biorąc, nie ma ograniczeń dotyczących symetrii, wielkości lub ogólnego kształtu cząsteczki, ale niska masa cząsteczkowa może być czynnikiem ograniczającym, zwłaszcza gdy białko ma pozbawiony cech kształt kulisty. Zazwyczaj analiza większych, dobrze uporządkowanych cząstek o wysokiej symetrii punktowo-grupowej jest mniej wymagająca. Dlatego zdecydowanie zaleca się, aby początkujący użytkownicy najpierw uruchomili obecny protokół z dobrze scharakteryzowanym zestawem danych cryo-EM. Dobrym punktem wyjścia są dane z samouczka SPHIRE (http:/sphire.mpg.de) lub jeden z zestawów danych (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) przesłanych przez EMPIAR z surowymi filmami.
Podczas przetwarzania własnych danych istnieje duże prawdopodobieństwo, że niektóre zbiory danych lub niektóre obrazy nie będą spełniać określonych kryteriów jakościowych. W tym kontekście, oprócz automatycznych kontroli stabilności i odtwarzalności, wykonywanych przez program dla głównych etapów przepływu pracy, nadal zaleca się, aby użytkownicy wizualnie sprawdzali wyniki w określonych "punktach kontrolnych" protokołu, zwłaszcza jeśli ostateczna rekonstrukcja nie jest zadowalająca.
Pierwszą kontrolę wzrokową można przeprowadzić na poziomie mikrofotografii po wyrównaniu filmu (krok 2 protokołu) i oszacowaniu CTF (krok 3 protokołu). Otrzymane średnie skorygowane o ruch powinny pokazywać wyraźnie dostrzegalne i dobrze oddzielone pojedyncze cząstki, a ich widma mocy powinny pokazywać wyraźnie dostrzegalne, izotropowe pierścienie Thon. Częstotliwość przestrzenna, do której są one widoczne, określa w większości przypadków najwyższą rozdzielczość, do której w zasadzie można ostatecznie określić konstrukcję. Przykłady średniej skorygowanej ruchem o wystarczającej jakości i jej spektrum mocy przedstawiono w sekcji "Reprezentatywne wyniki". Obrazy odstające, które mogą mieć negatywny wpływ na wynik końcowy, można usunąć za pomocą narzędzi GUI do oceny dryfu i CTF (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php).
Jeśli chodzi o badania przesiewowe cząstek, kluczowym krokiem w procesie projektowania SPHIRE jest klasyfikacja 2D przy użyciu ISAC (Protocol step 5.2). W tym przypadku użytkownik powinien kontrolować, czy powtarzalne średnie klas 2D identyfikowane automatycznie przez program przyjmują zakres orientacji wystarczający do prawie równomiernego pokrycia przestrzeni kątowej. Jeśli jakość średnich klas nie jest zadowalająca (zaszumione i/lub rozmyte obrazy) i/lub liczba powtarzalnych średnich klas jest bardzo niska, należy rozważyć poprawę jakości automatycznego wybierania, optymalizację obrazowania zestawu danych lub przygotowanie próbki. W większości przypadków nie jest możliwe obliczenie wiarygodnej rekonstrukcji na podstawie zestawu danych, który nie daje dobrych średnich klas 2D. Przykłady wysokiej jakości średnich klas 2D znajdują się w sekcji "Reprezentatywne wyniki".
Do uzyskania wiarygodnego początkowego modelu 3D przy użyciu RVIPER w sposób zautomatyzowany wymaganych jest co najmniej 100 średnich klas (krok 6.1 protokołu). Na tym etapie użytkownik powinien wybrać średnie o najwyższej jakości i uwzględnić jak najwięcej różnych orientacji cząstki. Jakość początkowego modelu ma kluczowe znaczenie dla powodzenia późniejszego udoskonalenia 3D w wysokiej rozdzielczości.
W innych pakietach oprogramowania klasyfikacja 3D jest czasami wykonywana w celu usunięcia "złych" cząstek 8,9. Jednak w SPHIRE większość tych cząstek jest automatycznie eliminowana już podczas klasyfikacji 2D za pomocą ISAC. W związku z tym zaleca się wykonywanie intensywnego obliczeniowo etapu sortowania 3D tylko wtedy, gdy rekonstrukcja i analiza zmienności 3D wskazują na niejednorodność zbioru danych.
Co najważniejsze, użytkownik powinien zawsze dokładnie sprawdzić wynikowe objętości 3D (krok 9.3 protokołu) i upewnić się, że cechy danej gęstości dobrze zgadzają się z rozdzielczością nominalną. Przy rozdzielczości <9 A widoczne stają się gęstości przypominające pręciki odpowiadające α-helisom. Przy rozdzielczości <4,5 A gęstości odpowiadające pasmom w arkuszach β są zwykle dobrze oddzielone i widoczne stają się duże aminokwasy. Mapa o wysokiej rozdzielczości (<3 A) powinna pokazywać wyraźnie dostrzegalne łańcuchy boczne, co pozwoli na zbudowanie dokładnego modelu atomowego.
Uzyskane do tej pory wyniki pokazują, że dzięki zautomatyzowanym testom odtwarzalności SPHIRE i minimalnym kontrolom wizualnym, niniejszy protokół ma ogólne zastosowanie do każdego rodzaju projektu krio-EM z pojedynczymi cząstkami. Reprezentatywne wyniki każdego etapu przetwarzania przedstawiono dla rekonstrukcji toksyny TcdA1 Photorhabdus luminescens 21, która została rozwiązana do rozdzielczości bliskiej atomowi. Mapy gęstości o podobnej jakości mogą być wykorzystywane do konstruowania wiarygodnych modeli atomowych poprzez śledzenie szkieletowe de novo , a także udoskonalanie w przestrzeni odwrotnej lub rzeczywistej, a tym samym zapewniają solidną strukturę strukturalną dla zrozumienia złożonych mechanizmów molekularnych.
KODY AKCEZYJNE:
Współrzędne struktury EM i nieprzetworzonych filmów zostały zdeponowane w Banku Danych Mikroskopii Elektronowej i Archiwum Obrazów Pilotażowych Mikroskopii Elektronowej pod numerami dostępu odpowiednio EMD-3645 i EMPIAR-10089.

Po rozwoju technologii bezpośredniego detektora elektronów, niezwykły postęp w krio-EM pojedynczych cząstek obecnie przekształca biologię strukturalną 1. W porównaniu z krystalografią rentgenowską, technika ta wymaga jedynie niewielkiej ilości materiału białkowego bez konieczności krystalizacji, a jednocześnie stwarza mniej ograniczeń dotyczących czystości próbki i nadal umożliwia oznaczanie struktur w rozdzielczości zbliżonej do atomowej. Co ważne, różne składy lub stany mogą być teraz obliczeniowo oddzielone, a określanie struktury różnych konformacji może być przeprowadzane na niespotykanym dotąd poziomie szczegółowości. Ostatnio udało się stworzyć mapy gęstości trudnych cząsteczek w rozdzielczościach pozwalających na budowanie modeli de novo, a tym samym głębokie zrozumienie ich sposobu działania 2,3,4,5.
W społeczności 3DEM (3D Electron Microscopy) (https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy) dostępna jest szeroka gama pakietów oprogramowania do przetwarzania obrazów, a większość z nich jest stale rozwijana. Rozdzielczość prawie atomowa została osiągnięta dla białek wykazujących różne masy cząsteczkowe i symetrie za pomocą kilku różnych pakietów oprogramowania, w tym EMAN2 6, IMAGIC7, FREALIGN 8, RELION 9, SPIDER 10 i SPARX 11. Każdy pakiet wymaga innego poziomu wiedzy użytkownika i zapewnia inny poziom wskazówek dla użytkownika, automatyzacji i rozszerzalności. Co więcej, podczas gdy niektóre programy zapewniają kompletne środowiska ułatwiające wszystkie etapy analizy obrazu, inne są zaprojektowane w celu optymalizacji określonych zadań, takich jak udoskonalanie parametrów wyrównania, zaczynając od znanej struktury referencyjnej. Ostatnio opracowano kilka platform, w tym APPION 12 i SCIPION 13, które zapewniają pojedynczy potok przetwarzania, który integruje podejścia i protokoły z różnych pakietów oprogramowania wymienionych powyżej.
Aby przyczynić się do obecnego rozwoju cryo-EM, SPARX został ponownie opracowany jako nowa, samodzielna i kompletna platforma do analizy pojedynczych cząstek, zwana SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy). W celu zwiększenia dostępności tej techniki dla początkujących badaczy w tej dziedzinie i poradzenia sobie z dużą ilością danych generowanych przez nowoczesne, w pełni zautomatyzowane, wysokiej klasy mikroskopy elektronowe, proces przetwarzania został przeprojektowany i uproszczony poprzez wprowadzenie łatwego w użyciu graficznego interfejsu użytkownika (GUI) i automatyzację głównych etapów przepływu pracy. Co więcej, dodano nowe algorytmy, które umożliwiają szybkie, powtarzalne i zautomatyzowane określanie struktury na podstawie obrazów kriogenicznych. Ponadto wprowadzono walidację na podstawie odtwarzalności, aby uniknąć typowych artefaktów powstających podczas udoskonalania i analizy heterogeniczności.
Chociaż program został gruntownie zmodyfikowany, jego cenione podstawowe cechy zostały zachowane: prosty kod open-source, nowoczesny projekt zorientowany obiektowo i interfejsy Pythona dla wszystkich podstawowych funkcji. Dzięki temu nie został zamieniony w program typu skrzynka, umożliwiający użytkownikom studiowanie i łatwe modyfikowanie kodu Pythona, tworzenie dodatkowych aplikacji lub modyfikowanie ogólnego przepływu pracy. Jest to szczególnie przydatne w przypadku niestandardowych projektów krio-EM.
Tutaj prezentujemy protokół do uzyskiwania mapy gęstości o niemal atomowej rozdzielczości z obrazów krio-EM za pomocą graficznego interfejsu użytkownika SPHIRE. Opisuje szczegółowo wszystkie kroki wymagane do wygenerowania mapy gęstości z surowych filmów z bezpośredniego detektora cryo-EM i nie jest ograniczony do żadnego konkretnego typu makrocząsteczki. Protokół ten ma na celu przede wszystkim przeprowadzenie nowicjuszy w tej dziedzinie przez przepływ pracy i dostarczenie ważnych informacji na temat kluczowych etapów przetwarzania, a także niektórych możliwych pułapek i przeszkód. Bardziej zaawansowane funkcje i podstawy teoretyczne SPHIRE zostaną opisane w innym miejscu.

<table><tbody><tr><td></td><td>Instytut Fizjologii Molekularnej SPHIRE Max Planck - Dortmund&nbsp; oraz Houston Medical School, Houston, Teksas&nbsp;</td><td></td><td>http://sphire.mpg.de</td></tr><tr><td>UCSF Uniwersytet Kalifornijski Chimera</td><td>, San Francisco</td><td></td><td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td></tr> <tr><td>Unblur</td><td>Janelia Farm Research Campus, Ashburn</td><td></td><td>http://grigoriefflab.janelia.org/unblur</td></tr><tr><td>Coot</td><td>MRC Laboratory of Molecular Biology,&nbsp; </td><td></td> Cambridge <td>http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td></tr> <tr><td>EMAN2</td><td>Baylor College of Medicine, Houston</td><td></td><td>http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2</td></tr><tr><td>Klaster obliczeniowy z 1824 rdzeniami</td><td>Max Planck Institute of Molecular Physiology</td><td></td><td>Linux Cluster z 76&nbsp; węzłami, każdy z 2 procesorami Xeon E5-2670v3 12C 2,30 GHz i 128 Gb RAM</td></tr><tr><td>TITAN KRIOS mikroskop elektronowy&nbsp;</td><td>FEI</td><td></td><td>300 kV, poprawka Cs, XFEG</td></tr><tr><td>Falcon II bezpośredni detektor elektronów</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EPU (oprogramowanie do automatycznej akwizycji danych)</td><td>FEI</td><td></td><td>https://www.fei.com/software/epu/</td></tr></tbody></table>

analiza pojedynczych cząstek w wysokiej rozdzielczości na podstawie obrazów kriomikroskopii elektronowej przy użyciu sphire

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) to nowatorski, przyjazny dla użytkownika pakiet oprogramowania o otwartym kodzie źródłowym do półautomatycznego przetwarzania danych z kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM) dla pojedynczych cząstek. Przedstawiony tutaj protokół szczegółowo opisuje, w jaki sposób uzyskać strukturę o rozdzielczości zbliżonej do atomowej, zaczynając od filmów z mikrofotografii cryo-EM, prowadząc użytkowników przez wszystkie etapy procesu określania struktury pojedynczej cząstki. Kroki te są kontrolowane z nowego graficznego interfejsu użytkownika SPHIRE i wymagają minimalnej interwencji użytkownika. Korzystając z tego protokołu, strukturę 3,5 A TcdA1, kompleksu toksyny Tc z Photorhabdus luminescens, uzyskano z zaledwie 9500 pojedynczych cząstek. To uproszczone podejście pomoże początkującym użytkownikom bez dużego doświadczenia w przetwarzaniu i informacji strukturalnych a priori, w uzyskaniu wolnych od szumów i bezstronnych modeli atomowych ich oczyszczonych kompleksów makromolekularnych w ich stanie naturalnym.

Opisany powyżej protokół został wykonany, zaczynając od 112 nagrań z detektora bezpośredniego składnika A Photorhabdus luminescens kompleks Tc (TcdA1) 20,21,22. Zestaw danych został zarejestrowany za pomocą mikroskopu elektronowego do kriomikroskopii z korekcją Cs i źródłem pola emisji o wysokiej jasności (XFEG), pracującego przy napięciu przyspieszającym 300 kV. Obrazy uzyskano automatycznie przy całkowitej dawce 60 e-/Å-2 przy rozmiarze piksela 1,14 Å w skali preparatu. Po wyrównaniu klatek filmu (Krok protokołu 2), uzyskane uśrednione obrazy po korekcji ruchu wykazywały izotropowe pierścienie Thona sięgające wysokiej rozdzielczości (Rycina 2a). Poszczególne cząstki były łatwo widoczne i dobrze oddzielone (Rycina 2b). Cząstki zostały następnie wybrane za pomocą narzędzia swarm w programie e2boxer 18 (Krok protokołu 4.1). W tym przypadku odpowiedni próg ustawiono przy użyciu opcji bardziej selektywnej (Rysunek 2c). 112 cyfrowych mikrofotografii wygenerowało 9 652 cząstek. Większość wyodrębnionych obrazów (Krok protokołu 4.2) zawierały dobrze zdefiniowane cząstki, a ich rozmiar pudełka był około 1,5 razy większy niż rozmiar cząstek, zgodnie z rekomendacjąRycina 2d). Następnie za pomocą ISAC przeprowadzono analizę heterogeniczności w 2D (Krok protokołu 5). Uzyskano 98 klas średnich (Rycina 3a). Używając tych średnich klas 2D, można ab initio model został obliczony przy użyciu VIPER (Krok protokołu 6) przy średniej rozdzielczości (Rycina 3b). Ten model wykazuje doskonałą zgodność ze strukturą krystaliczną TcdA1, uprzednio określoną w rozdzielczości 3,9 Å 22 (Rycina 3c). To ab initio model został użyty jako początkowy szablon do dopasowania 3D (MERIDIEN), co dało rekonstrukcję o rozdzielczości 3,5 Å (kryterium 0,143)Krok protokołu 7) zaledwie z około 40 000 jednostek asymetrycznych (Rycina 4). Mapa o rozdzielczości bliskiej atomowej została uzyskana w ciągu 24 godzin przy wykorzystaniu do 96 procesorów CPU w tych etapach opracowywania danych, które korzystają z wielordzeniowych architektur.
Dla analizy zmienności 3D (krok protokołu 8) użyto tylko 2000 obrazów cząstek na grupę w kroku 8.3.3 (to znaczy proces zaczyna się od 5 początkowych grup 3D oraz 200 obrazów dla najmniejszego rozmiaru grupy w kroku 8.3.4 ze względu na niewielką liczbę cząstek (~10 000). Analiza ujawniła lokalną elastyczność głównie w regionie N-terminalnym kompleksu, który zawiera znacznik His stosowany do oczyszczaniaRysunek 5a). Rzeczywiście, dwanaście reszt N-końcowych oraz znacznik His nie zostały rozstrzygnięte w uprzednio opublikowanej strukturze kryształowej TcdA1 22 a najprawdopodobniej nieuporządkowany obszar pozostał nierozwiązany w obecnej gęstości kriomikroskopii elektronowej, prawdopodobnie z powodu jego giętkości. Dodatkową zmienność wykryto w domenach wiążących receptor oraz w domenie wiążącej BC (Rycina 5a). Ze względu na ogólnie zadowalającą rozdzielczość struktury oraz stosunkowo niewielki rozmiar zestawu danych, uznano tę heterogeniczność za dopuszczalną i dlatego przeprowadzono skoncentrowaną klasyfikację 3D 23 nie zostało wykonane. Ostatecznie obliczono rozdzielczość lokalną końcowej mapy gęstości (Krok protokołu 9.1, Rycina 5b) a wyostrzoną mapę 3D przefiltrowano lokalnie (Krok protokołu 9.2). Objętość o tej jakości może być używana de novo budowanie modelu za pomocą Coot 24 lub dowolne inne narzędzie do doskonalenia (Rycina 6).
<img alt="Diagram przepływu pracy SPHIRE; etapy przetwarzania obrazu: wyrównanie, szacowanie CTF, ekstrakcja cząstek." src="/files/ftp_upload/55448/55448fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
Rycina 1: Przetwarzanie obrazu przy użyciu SPHIRE. (a) Interfejs graficzny pakietu oprogramowania SPHIRE. Konkretny etap przepływu pracy można aktywować, wybierając odpowiedni piktogram po lewej stronie interfejsu ("etap przepływu pracy"). Polecenia i narzędzia powiązane z tym etapem pojawią się w centralnej części interfejsu. Po wybraniu jednego z poleceń odpowiednie parametry zostaną wyświetlone w prawej części interfejsu. Parametry zaawansowane zazwyczaj nie wymagają modyfikacji ustawień domyślnych. (b) Etapy przepływu pracy przetwarzania obrazu pojedynczych cząstek przy użyciu interfejsu graficznego SPHIRE. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces obrazowania metodą kriomikroskopii elektronowej; transformata Fouriera, wybór cząstek, średnie klasy 2D do analizy struktury." src="/files/ftp_upload/55448/55448fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2: Korekcja ruchu i ekstrakcja cząstek. (a, bTypowy wysokiej jakości, niskodawkowy, skorygowany pod względem dryftu mikrofotografii cyfrowej zarejestrowany przy defokusie 1.7 µm. Zwróć uwagę na izotropowe pierścienie Thona sięgające rozdzielczości 2,7 Å w widmie mocy (a) oraz dobrze widoczne cząstki na obrazie 2D (b). (c) Wybór cząstek za pomocą programu e2boxer. Zielone okręgi wskazują wybrane cząstki. (d) Typowe surowe cząstki wyizolowane z mikrofotografii ważonej dawkowo. Skała = 20 nm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza kriomikroskopii elektronowej; rekonstrukcja struktury 3D; wizualizacja kompleksu białkowego; mikroskopia elektronowa." src="/files/ftp_upload/55448/55448fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Klasyfikacja 2D i generowanie modelu początkowego. (a) Zestaw klas średnich 2D, z których większość przedstawia widoki boczne cząstki. Szerokość paska skali = 20 nm. (b) Trójwymiarowa mapa ab initio TcdA1 uzyskana za pomocą RVIPER z klas średnich bez odniesienia. (c) Dopasowanie sztywne struktury kryształowej TcdA1 (wstęgi) (pdb-id 1VW1) do początkowej gęstości kriomikroskopii elektronowej (przezroczysta szara). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza struktury metodą kriomikroskopii, kompleksy białkowe, mapa gęstości 3D, konfiguracja cząsteczkowa, biologia strukturalna" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
Rycina 4: Struktura 3D TcdA1 otrzymana metodą kriomikroskopii elektronowej (kriomikroskopii). (a, b) Ostateczna mapa gęstości o rozdzielczości 3,5 Å dla TcdA1, obliczona na podstawie około 9500 obrazów cząsteczek: (a) widok z boku i (b) widok z góry. (c) Przykładowe obszary gęstości kriomikroskopii odpowiadające α-helisie i arkuszowi β. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza struktury białka, domeny wiążące receptory, diagram strukturalny, wizualizacja molekularna." src="/files/ftp_upload/55448/55448fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Analiza zmienności i rozdzielczość lokalna. (a) Powierzchnia ostrościowej mapy kriomikroskopii elektronowej TcdA1 (szara) oraz mapa zmienności (zielona). Dla lepszej przejrzystości, mapę zmienności poddano filtracji dolnoprzepustowej do 30 Å. (b) Wizualizacja powierzchniowa ostrościowej mapy kriomikroskopii elektronowej TcdA1 pokolorowanej według rozdzielczości lokalnej (Å). Zwróć uwagę na zgodność topologiczną między obszarami wysokiej zmienności a niską rozdzielczością lokalną. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wizualizacja struktury białka; diagram modelu szkieletowego; interfejs oprogramowania do modelowania molekularnego." src="/files/ftp_upload/55448/55448fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Budowa modelu 3D białka TcdA1 za pomocą programu Coot. Przedstawiono reprezentatywne obszary gęstości kriomikroskopii elektronowej oraz model atomowy dla helisy α. Model atomowy został zbudowany de novo przy użyciu programu Coot. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Ten artykuł przedstawia protokół do przetwarzania obrazów cryo-EM za pomocą pakietu oprogramowania SPHIRE. Obecny protokół może być stosowany do prawie wszystkich projektów EM pojedynczych cząstek, które są ukierunkowane na rozdzielczość bliską atomowi.

Analiza pojedynczych cząstek w wysokiej rozdzielczości na podstawie obrazów kriomikroskopii elektronowej przy użyciu SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą analizy pojedynczych cząsteczek danych z kriomikroskopii elektronowej przy użyciu oprogramowania do przetwarzania obrazów SPHIRE. Kriomikroskopia elektronowa pojedynczych cząsteczek staje się główną technologią badania struktur makromolekuł w rozdzielczości zbliżonej do atomowej. SPHIRE to nowy pakiet oprogramowania, który umożliwia półautomatyczne przetwarzanie danych z kriomikroskopii elektronowej w przyjazny dla użytkownika sposób.Główną zaletą SPHIRE jest automatyczny mechanizm walidacji. Większość procedur należy przeprowadzić tylko raz, a wyniki są obiektywne i powtarzalne. Kriomikroskopia elektronowa (cryo-EM) o wysokiej rozdzielczości może być wykorzystana do rozmieszczenia poszczególnych reszt, dostarczając tym samym kluczowych informacji na temat organizacji i funkcji złożonych maszyn mikromolekularnych.Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą powinny pamiętać, że uzyskanie struktury o wysokiej rozdzielczości w dużym stopniu zależy od jakości próbki oraz danych wejściowych. Aby rozpocząć korzystanie z aplikacji SPHIRE, otwórz interfejs graficzny (GUI) z poziomu terminala. Otwórz sekcję UTILITIES, aby wyświetlić obraz z kriomikroskopii za pomocą programu e2display.Użyj wbudowanego narzędzia pomiarowego, aby zmierzyć najdłuższą oś cząsteczki w angstromach na piksel. Otwórz Project Settings. Ustaw rozmiar okna CTF na wartość co najmniej równą rozmiarowi ramki cząsteczki.Ustaw rozmiar pudełka cząsteczki na liczbę parzystą, wynoszącą co najmniej 1 1/2 średnicy cząsteczki. Ustaw promień cząsteczki na co najmniej połowę zmierzonej długości. Wprowadź symetrię grupy punktowej, jeśli jest znana, oraz przybliżoną masę cząsteczkową.Zapisz ustawienia. Następnie w menu MOVIE otwórz funkcję Micrograph movie alignment. Ustaw ścieżki do plików wykonywalnych unblur oraz summovie.Wybierz surowy, niewyrównany film z mikrografii i zastąp zmienną nazwy pliku znakiem wieloznacznym, aby ustawić wzorzec ścieżki wejściowej mikrografii. Nadaj nazwę katalogowi wyjściowemu. Wpisz liczbę klatek filmu, napięcie mikroskopu oraz czas ekspozycji na klatkę.Uruchom proces generowania uśrednionych mikrografii z korekcją ruchu, ważonych oraz nieważonych pod kątem dawki. Następnie otwórz menu CTER i wybierz CTF Estimation. Jako dane wejściowe ustaw mikrografie nieważone pod kątem dawki.Nazwij katalog wyjściowy i uzupełnij parametry zbierania danych. Ustaw najniższą częstotliwość na 0285 inverse angstroms, a najwyższą częstotliwość na 0.285 inverse angstroms. Uruchom proces, aby wygenerować listę parametrów CTF.Następnie otwórz menu WINDOW i wybierz Particle Picking. Jako dane wejściowe ustaw mikrografie z uwzględnieniem dawki (dose-weighted micrographs) i uruchom narzędzie e2boxer. Przeprowadź wybieranie cząsteczek ręcznie lub automatycznie.Wyodrębnij wybrane cząsteczki do stosów obrazów, a następnie połącz stosy w jeden wirtualny stos obrazów w bazie danych BDB. Po wybraniu i ułożeniu cząsteczek w stosy, otwórz menu ISAC i wybierz ISAC 2D Clustering. Jako dane wejściowe ustaw wirtualny stos obrazów w bazie danych BDB.Oszacuj liczbę obrazów na klasę. Uzupełnij pozostałe parametry i wygeneruj średnie klas 2D. Po zakończeniu klasyfikacji 2D użyj narzędzia Display Data, aby wyświetlić zweryfikowane, powtarzalne średnie klas.Należy zweryfikować, czy reprezentowane są liczne orientacje cząsteczek oraz czy średnie klas są satysfakcjonującej jakości. Wygeneruj nowy wirtualny stos obrazów zawierający wyłącznie cząsteczki należące do zwalidowanych średnich klas. Następnie otwórz menu VIPER i użyj narzędzia Display Data, aby wyświetlić średnie klas.Usuń średnie klas o słabej jakości lub wykazujące identyczne widoki cząsteczki. Zapisz pozostałe średnie klas w nowym pliku. Następnie wybierz Initial 3D Model RVIPER i użyj niewielkiego zestawu średnich klas jako danych wejściowych.Uruchom polecenie w celu wygenerowania początkowego, powtarzalnego modelu 3D białka. Przejrzyj model w programie do grafiki molekularnej Chimera. Porównaj model ze znaną strukturą homologicznego białka lub domeny badanego białka.Powróć do menu VIPER w programie SPHIRE i wybierz Create 3D Reference. Wygeneruj wstępny model referencyjny 3D z odpowiednim rozmiarem piksela oraz maską 3D. Otwórz menu MERIDIEN i wybierz 3D Refinement.Wypełnij ścieżki do stosu obrazów wejściowych oraz początkowego pliku referencyjnego 3D. Nazwij katalog wyjściowy i ustaw maskę modelu referencyjnego jako maskę 3D. Zaznacz opcję Apply hard 2D mask.Ustaw rozdzielczość początkową w zakresie od 20 do 25 angstremów i przeprowadź udoskonalenie 3D w celu uzyskania niefiltrowanych połowic objętości (half-volumes). Następnie wyświetl niefiltrowaną połowicę objętości w programie Chimera. Wyznacz próg binaryzacji, przy którym wszystkie gęstości białek są połączone, ale artefakty szumu nie są.Powróć do menu MERIDIEN w programie SPHIRE i otwórz Adaptive 3D Mask. Wprowadź nieprzefiltrowany plik wejściowy połowy objętości (half-volume input) oraz próg binaryzacji. Nadaj nazwę masce wyjściowej i uruchom proces, aby wygenerować trójwymiarową maskę o rozmytych krawędziach.Następnie otwórz funkcję Sharpening i zaznacz obie niefiltrowane połowy wolumenu (half-volumes). Jako maskę dostarczoną przez użytkownika ustaw 3D maskę połowy wolumenu z miękkimi krawędziami (soft-edge half-volume). Uruchom proces, który scala obie połowy wolumenu, a następnie filtruje i wyostrza scalony wolumen.Otwórz plik dziennika, aby wyświetlić końcową szacunkową rozdzielczość. Wygeneruj mapę 3D rozkładu kątowego cząstek dla stosu obrazów wejściowych utworzonego podczas rafinacji 3D. Otwórz wyostrzony i przefiltrowany model 3D w programie Chimera.Przeanalizuj mapę gęstości oraz jej cechy o wysokiej rozdzielczości. Otwórz rozkład kątowy w programie Chimera i zweryfikuj, czy kąty Eulera są rozłożone izotropowo. Otwórz menu SORT3D i wybierz opcję 3D Variability Estimation.Wygeneruj mapę zmienności 3D z wirtualnego stosu obrazów cząsteczek należących do zwalidowanych średnich klas. Na podstawie tej mapy zmienności wygeneruj zbinaryzowaną maskę 3D do późniejszego ukierunkowanego klastrowania 3D. Następnie otwórz program 3D Clustering RSORT3D i jako dane wejściowe wybierz katalog poprzedniego udoskonalenia 3D.Nazwij katalog wyjściowy, a następnie ustaw globalną i ukierunkowaną maskę 3D. W przypadku dużych zestawów danych użyj co najmniej 5 000 do 10 000 obrazów na grupę. Uruchom proces sortowania, aby wygenerować wolumeny dla każdej homogenicznej grupy 3D.Użyj programu Chimera, aby zidentyfikować strukturę o najwyższej pozornej rozdzielczości. Powróć do menu SORT3D w programie SPHIRE i otwórz Local Subset Refinement. Ustaw ścieżkę do pliku tekstowego podzbioru na plik klastrów identyfikatorów cząstek odpowiadający strukturze o najwyższej rozdzielczości.Ustaw katalog udoskonalenia 3D (3D refinement) na katalog zawierający niefiltrowane połowy wolumenów (half-volumes), a iterację restartową na iterację o najwyższej rozdzielczości z poprzedniego udoskonalenia 3D. Uruchom polecenie w celu wygenerowania lokalnych niefiltrowanych połów wolumenów. Następnie stwórz 3D maskę z miękkimi krawędziami (soft-edged 3D mask) z jednej z lokalnych połów wolumenów.Połącz lokalne pół-wolumeny, a następnie wyostrz połączony wolumen bez stosowania filtra dolnoprzepustowego. Następnie otwórz menu LOCALRES i kliknij Local Resolution. Wybierz lokalne pół-wolumeny.Następnie wybierz lokalną maskę o miękkich krawędziach. Ustaw całkowitą rozdzielczość na rozdzielczość absolutną oszacowaną podczas wyostrzania złączonej objętości lokalnej. Oblicz lokalną rozdzielczość objętości.Następnie otwórz funkcję 3D Local Filter. Jako wejście ustaw wyostrzoną, niefiltrowaną objętość lokalną. Wybierz mapę rozdzielczości lokalnej oraz maskę 3D o miękkich krawędziach.Zastosuj filtr rozdzielczości lokalnej do wyostrzonej objętości, aby utworzyć końcowy model 3D. Otwórz otrzymaną objętość oraz mapę rozdzielczości lokalnej w programie Chimera. Uruchom narzędzie Surface Color, wybierz z menu odpowiednią objętość oraz opcję kolorowania powierzchni zgodnie z rozdzielczością lokalną.Kompleks toksyny TcdA1 obrazowano za pomocą krio-mikroskopii elektronowej. Wszystkie obrazy wykazywały wyraźnie widoczne pojedyncze cząsteczki oraz pierścienie Thona sięgające w widmie mocy rozdzielczości lepszej niż cztery angstromy. Cząsteczki wyselekcjonowano przy użyciu programu e2boxer, a następnie wyekstrahowano do stosu obrazów.Dwuwymiarowe średnie klas wygenerowano za pomocą iteracyjnego stabilnego wyrównania i klastrowania, czyli metody ISAC. Średnie klasy te wykorzystano do obliczenia powtarzalnego modelu 3D przy użyciu programu RVIPER. Model ten był zgodny z wcześniej rozwiązaną strukturą krystaliczną TcdA1.Automatyczne udoskonalenie 3D tego modelu przy użyciu programu MERIDIEN pozwoliło na wygenerowanie mapy o rozdzielczości bliskiej atomowej. Analiza zmienności 3D wykazała lokalną elastyczność regionu N-końcowego z tagiem histydynowym, domen wiążących receptor oraz domeny wiążącej TcB. Przeprowadzono obliczenia rozdzielczości lokalnej.Wyszarpany model został przefiltrowany lokalnie i zastosowano skalę kolorów odpowiadającą rozdzielczości lokalnej, co wykazało zgodność topologiczną między obszarami o wysokiej zmienności a obszarami o niskiej rozdzielczości. Końcowa struktura cryo-EM TcdA1 o rozdzielczości 3,5 Å wykazała wyraźne gęstości dla większości łańcuchów bocznych. Mapa gęstości o takim poziomie szczegółowości może być dalej wykorzystana do budowy atomowego modelu de novo.Stosując to podejście, w ciągu kilku godzin lub kilku dni można uzyskać strukturę o rozdzielczości zbliżonej do atomowej, bez a priori informacji strukturalnych. Podczas wykonywania tej procedury należy używać wyłącznie danych wysokiej jakości i sprawdzać wyniki pośrednie. Heterogeniczność składu i struktury próbki do krio-EM może być czynnikiem ograniczającym możliwość osiągnięcia rozdzielczości zbliżonej do atomowej.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć teraz dobrą wiedzę na temat tego, jak używać programu SPHIRE do wyznaczania struktur metodą cryo-EM. Jak Państwo widzieli, procedury klastrowania zawarte w SPHIRE pozwolą nie tylko na rozwiązanie struktury interesującego białka, ale także na badanie dynamiki konformacyjnej i uzyskanie kluczowych informacji mechanistycznych na temat złożonych mechanizmów molekularnych.

high-resolution-single-particle-analysis-from-electron-cryo

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Analiza pojedynczych cząstek w mikroskopii krioelektronowej jest jedną z głównych technik używanych do określania struktury zespołów biologicznych w wysokiej rozdzielczości. Scipion dostarcza narzędzia do stworzenia całego procesu przetwarzania informacji uzyskanych przez mikroskop i uzyskania rekonstrukcji 3D próbki biologicznej.

Cryo-EM i analiza pojedynczych cząstek za pomocą Scipion

Określanie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą cryoEM stało się rutyną dla niektórych klas białek i kompleksów. W tym miejscu podsumowano ten proces (przygotowanie próbki, badanie przesiewowe, pozyskiwanie i przetwarzanie danych), a czytelnicy są kierowani do dalszych szczegółowych zasobów i zmiennych, które mogą ulec zmianie w przypadku trudniejszych próbek.

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek wymaga odpowiedniego pakietu oprogramowania i przyjaznego dla użytkownika potoku do wysokowydajnej automatycznej akwizycji danych. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie w pełni zautomatyzowanego pakietu oprogramowania do akwizycji obrazu, Latitude-S, oraz praktycznego potoku do gromadzenia danych o zeszklonych biomolekułach w warunkach niskich dawek.

Przyjazne dla użytkownika, wysokowydajne i w pełni zautomatyzowane oprogramowanie do akwizycji danych do mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Ten artykuł opisuje, jak efektywnie wykorzystać trzy platformy przetwarzania cryo-EM, tj. cryoSPARC v3, RELION-3 i Scipion 3, aby stworzyć pojedynczy i solidny przepływ pracy mający zastosowanie do różnych zestawów danych o pojedynczych cząstkach do określania struktury w wysokiej rozdzielczości.

Solidny przebieg przetwarzania w mikroskopii krioelektronowej jednocząsteczkowej (cryo-EM) z cryoSPARC, RELION, i Scipion

Zastosowanie warstw nośnych do siatek kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryoEM) może zwiększyć gęstość cząstek, ograniczyć interakcje z interfejsem powietrze-woda, zredukować ruch wywołany wiązką i poprawić rozkład orientacji cząstek. W artykule opisano solidny protokół powlekania siatek krioEM monowarstwą grafenu w celu lepszego przygotowania próbek kriogenicznych.

Zastosowanie jednowarstwowego grafenu w siatkach mikroskopii krioelektronowej do określania struktury w wysokiej rozdzielczości

Zaawansowana metoda selekcji cząstek dla cryo-EM, a mianowicie CryoSieve, poprawia rozdzielczość mapy gęstości, usuwając większość cząstek z końcowych stosów, co zostało zademonstrowane poprzez jej zastosowanie na rzeczywistym zestawie danych.

Ulepszanie map gęstości poprzez usuwanie większości cząstek z końcowych stosów kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek

Biblioteki wyświetlania bakterii w biopanowaniu to sprawdzona technika odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego, solidna alternatywa dla przeciwciał. Półautomatyczna metoda sortowania usprawniła biopanoramowanie w celu zmniejszenia występowania wyników fałszywie dodatnich. Poniżej ilustrujemy proces myślowy i techniki stosowane w ocenie kandydatów i minimalizacji dalszej analizy.

Półautomatyczne biopanowanie bakteryjnych bibliotek wyświetlających w celu odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego i analizy otrzymanych izolatów

Przedstawione tutaj są dwie metody, które mogą być używane indywidualnie lub w połączeniu do analizy wpływu beta-amyloidu na strukturę skrzepu fibryny. W zestawie znajduje się protokół tworzenia skrzepu fibrynowego in vitro, a następnie metody zmętnienia skrzepu i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Analiza nieprawidłowości w strukturze skrzepu fibryny wywołanych przez β-amyloid za pomocą spektroskopii i skaningowej mikroskopii elektronowej

Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Przedstawiono wszechstronny protokół krioskalizacji BN-MS z wykorzystaniem mikrotomu do profilowania kompleksomów w wysokiej rozdzielczości.

Profilowanie kompleksomów w wysokiej rozdzielczości za pomocą analizy BN-MS metodą krioslicingu

Poznaj analizę pojedynczych cząstek w wysokiej rozdzielczości przy użyciu oprogramowania SPHIRE do przetwarzania obrazów kriomikroskopii elektronowej. Ta metoda umożliwia badaczom wyznaczanie struktur kompleksów makromolekularnych z dokładnością zbliżoną do atomowej.

Analiza pojedynczych cząstek w wysokiej rozdzielczości na podstawie obrazów kriomikroskopii elektronowej przy użyciu SPHIRE

Przeglądaj więcej filmów