Wysokoprzepustowy, kompatybilny test do oceny skuteczności leku przeciwko prątkom gruźlicy pasażowanym przez makrofagi

Nowe modele i testy, które poprawiłyby wczesny proces opracowywania leków przeciwgruźliczych nowej generacji, są wysoce pożądane. Tutaj opisujemy szybki, niedrogi i zgodny z BSL-2 test do oceny skuteczności leku przeciwko Mycobacterium tuberculosis, który można łatwo dostosować do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Ogólnym celem tej procedury jest powtarzalne wygenerowanie struktur agregacji makrofagów zakażonych Mycobacterium tuberculosis w formacie płytki 96-dołkowej do badania wrażliwości na leki przy użyciu barwnika żywotności. Metoda ta może usprawnić wczesny proces opracowywania leków przeciwgruźliczych, który jest utrudniony przez bezproduktywną translację związków kandydujących do warunków klinicznych. Główną zaletą tego prostego, niedrogiego, kompatybilnego z BSL dwóch modeli infekcji jest to, że podsumowuje on fizjologicznie istotne bariery penetracji komórkowej, przypominające ziarniniaki gruźlicy.

W ten sposób uzyskuje się wyniki wrażliwości leków, które są bardziej predykcyjne dla skuteczności in vivo. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania białka zielonej fluorescencji wyrażającego M.tuberculosis MC kwadrat 6206, zwanego dalej MTBGFP, do zakażenia. Należy pamiętać, że jest to szczep awirulentny, więc wszystkie prace w opisanym tutaj protokole mogą być wykonywane w obiekcie o drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego.

Dla każdej 96-dołkowej płytki, która ma być ustawiona, odwirować 2,8 razy 10 do ósmego MTBGFP przy 3, 200 razy G przez pięć minut w wirówce z odchylanym wiadrem. Po wirowaniu odessać supernatant i dodać pięć mililitrów RPMIC, aby umyć bakterie. Pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić ogniwo.

Następnie ponownie odwirować. Po drugim wirowaniu odlej supernatant i ponownie zawieś komórki bakteryjne w siedmiu mililitrach RPMIC, a następnie wiruj przez 10 sekund. Następnie, dla każdej płytki 96-dołkowej, która ma zostać ustawiona, odwirować siedem razy 10 do szóstych ludzkich komórek monocytarnych THP1 w temperaturze 250 razy G przez pięć minut.

Po odwirowaniu odlać supernatant i ponownie zawiesić komórki THP1 w siedmiu mililitrach RPMIC. Następnie przygotuj 96-dołkową płytkę do infekcji, dodając 200 mikrolitrów sterylnej wody do studzienek w rzędach A i H oraz kolumnach pierwszej i 12. Ta krawędź wodna zapobiegnie parowaniu pożywki hodowlanej.

Dodaj 200 mikrolitrów RPMIC do kolumny drugiej, B dwa do G dwóch, dla kontroli tła lub ślepej próby. Aby zainfekować monocyt THP1, użyj pipety, aby przenieść całą przygotowaną zawiesinę bakteryjną MTBGFP do zawiesiny komórek THP1 i wymieszaj wolę, pipetując w górę iw dół. Ostateczna gęstość komórek THP1 wynosi pięć razy od 10 do jednej piątej na mililitr, a odpowiadająca jej dwulicowość infekcji wynosi 40.

Następnie wlej zawiesinę THP1 MTBGFP do zbiornika o pojemności 25 mililitrów, a następnie za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 200 mikrolitrów zawiesiny THP1 MTBGFP do wszystkich pozostałych 96 studzienek, od E trzy do G 11. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 przez siedem do 10 dni. Co dwa dni przez cały okres inkubacji należy używać pipety wielokanałowej do zmiany pożywki, powoli usuwając 100 mikrolitrów zużytego podłoża z górnej części każdej studzienki i delikatnie dodając 100 mikrolitrów wstępnie podgrzanego RPMIC.

Podczas zmiany podłoża należy uważać, aby nie zakłócić agregatów makrofagów MTB na dnie studni. Każdego dnia badaj wzrokowo studnie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, wyposażonego w jasne pole i zestawy filtrów GFP z obiektywem od czterech do 10 X. Zwróć uwagę na rozmiar agregatów makrofagów MTB i w razie potrzeby zrób obrazy.

Do dnia 7 do 10 agregaty makrofagów MTB powinny być wystarczająco duże, aby można było przystąpić do testowania skuteczności leków, jak opisano w dalszej części filmu. Do testów narkotykowych przygotuj dwa leki przeciwgruźlicze w trzech egzemplarzach na nowej płytce 96-dołkowej w następujący sposób. Najpierw dodaj 125 mikrolitrów pożywki 7H9C do studzienek od B od 2 do G 10.

Następnie przygotuj oba leki w podwójnym pożądanym stężeniu końcowym w jednym mililitrze 7H9C. Za pomocą pipety dodaj 250 mikrolitrów każdego leku do studzienek B, C i D 11, a następnie odpowiednio E, F i G 11 w celu trzykrotnego leczenia. Następnie, za pomocą pipety wielokanałowej, seryjnie rozcieńczyć badane leki dwukrotnie, przesuwając 125 mikrolitrów z B 11 przez G 11 do B 10 przez G 10.

Mieszać pipetując pięć razy na każdym etapie. Kontynuuj przesuwanie 125 mikrolitrów od kolumny do kolumny, od prawej do lewej po płycie i zatrzymaj się po kolumnie czwartej. Po wymieszaniu kolumny czwartej wyrzucić 125 mikrolitrów do pojemnika na odpady.

Kolumny druga i trzecia nie powinny zawierać żadnych leków. Pozwoli to na wykorzystanie ich jako tła i do pozytywnej kontroli wzrostu. Następnie pobrać z inkubatora 96-dołkową płytkę zawierającą makrofagi zakażone MTB.

Nie przechylając płytki, za pomocą pipety wielokanałowej usunąć 150 mikrolitrów pożywki z dołków od B do G 11. Następnie przechyl płytkę, jak pokazano tutaj, i włóż końcówki pipet do dolnej krawędzi studzienek i usuń pozostałe podłoże, około 50 mikrolitrów. Ponieważ agregaty makrofagów MTB przylegają do dna studni, nie należy tracić żadnego materiału.

Jednak usuwanie pożywki powinno być tak delikatne, jak to możliwe i należy zachować ostrożność, aby uniknąć ponownego zawieszenia podczas tego procesu. Delikatnie dodaj 100 mikrolitrów pożywki 7H9C do studzienek od B od drugiej do G 11 płytki, które zawierają agregaty makrofagów MTB. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 100 mikrolitrów leku zawierającego 96-dołkową płytkę do odpowiednich dołków płytki infekcyjnej.

Następnie umieść płytkę w szczelnie zamkniętej torbie i inkubuj ją przez trzy dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Test resazuryny opiera się na formach utleniających wytwarzanych przez metabolicznie aktywny MTB w celu przekształcenia niebieskiej resazuryny w fluorescencyjną różową rezorufinę. Zmiana koloru i fluorescencji może być wykorzystana jako marker zastępczy do określenia wielkości wzrostu bakterii.

Przygotować w wodzie roztwór podstawowy rezazuryny o końcowym stężeniu 8 miligramów na mililitr. Przefiltruj przez membranę PVDF o wielkości porów 22 mikrometrów w celu sterylizacji. Przygotować roztwór roboczy w rezazurynie, mieszając roztwór podstawowy, wodę i Tween-80 w stosunku dwa do jednego do jednego.

Końcowe stężenia wynoszą 4 miligramy na mililitr rezazuryny i 5% Tween-80. Za pomocą czytnika płytek ustaw program do odczytu fluorescencji przy wzbudzeniu 530 nanometrów i emisji 590 nanometrów przez 24 godziny co 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Rozgrzej czytnik płytek do 37 stopni Celsjusza.

Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 20 mikrolitrów roztworu roboczego resazuryny do studzienek od B od drugiej do G 11 płytki traktowanej lekiem. Umieść tabliczkę na czytniku i uruchom program. Aby potwierdzić solidność dostosowania tego modelu infekcji do formatu płytki 96-dołkowej, oceniono podatność ryfampicyny MTB RIF w moxy moksyfloksacyny zgodnie z opisem w tym filmie.

Jak pokazano tutaj, struktury agregacji makrofagów MTB zostały z powodzeniem wygenerowane w formacie płytki 96-dołkowej, co umożliwiło kompatybilność z put. Aby ilościowo zmierzyć konwersję resazuryny jako wskaźnika wzrostu bakterii, fluorescencję poszczególnych studzienek monitorowano kinetycznie przez 24 godziny. Obecność żywotnych komórek MTB określa się przez konwersję niebieskiego barwnika rezazuryny do jego różowej zredukowanej formy, która jest ilościowo odzwierciedlona przez względne sieci fluorescencji z w momencie nasycenia.

Te reprezentatywne miniwykresy pokazują wynikowe jednostki fluorescencji pokazane na osi Y w funkcji czasu pokazanego na osi X. Aby wygenerować krzywe zabijania podatności na leki, studzienki traktowane ryfampicyną i moksyfloksacyną znormalizowano do maksymalnego wzrostu MTB bez kontroli leku jako 100% przeżycia. Ślepe sygnały kontroli tła zostały odjęte od każdej studzienki próbki.

Procent przeżycia wykreślono dla każdego indywidualnego stężenia leczenia farmakologicznego, aby wygenerować krzywą zabijania. Dane te pokazują, że minimalne stężenie hamujące określa najniższe stężenie antybiotyku, przy którym obserwuje się 90% zahamowanie wzrostu, jest większe niż dwa mikrogramy na mililitr, zarówno dla ryfampicyny, jak i moksyfloksacyny przeciwko MTB pochodzących z naszego modelu infekcji. W związku z tym minimalne stężenie hamujące tych dwóch leków przeciwko MTB przy użyciu naszego modelu infekcji i testu bardziej odzwierciedla aktywność tych leków in vivo.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak niezawodnie i powtarzalnie generować zagregowane struktury makrofagów zakażone MTB do badania wrażliwości na leki za pomocą testu resazuryny. Postępując zgodnie z tą procedurą, można łatwo zmodyfikować szablon leku z dwóch leków, jak pokazano w panelu biblioteki 58 leków, aby umożliwić badanie przesiewowe leków o wysokiej wydajności.