Name: Wysokoprzepustowy, kompatybilny test do oceny skuteczności leku przeciwko prątkom gruźlicy pasażowanym przez makrofagi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Poznaj metodę oceny skuteczności leków przeciwko Mycobacterium tuberculosis w makrofagach w formacie 96-well. To szybkie, tanie i kompatybilne z BSL-2 podejście umożliwia badania przesiewowe wysokoprzepustowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Frankowi Wolschendorfowi za dostęp do automatycznego czytnika płytek obrazowych Cytation 3. Prace te zostały częściowo sfinansowane z grantu NIH R01-AI104499 dla OK. Część prac została wykonana w obiektach UAB CFAR oraz przez UAB CFAR Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core, które są finansowane przez NIH/NIAID P30 AI027767 i NIH 5P30 AR048311.

UWAGA: Ponieważ M. tuberculosis mc26206 jest szczepem awirulentowym17,18, wszystkie prace w tym protokole mogą być wykonywane w obiekcie o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2).
1. Warunki hodowli białka zielonej fluorescencji wyrażającego M. tuberculosis mc26206 (Mtb-GFP)
UWAGA: Szczep auksotrofowy M. tuberculosis H37Rv mc26206 (ΔpanCD, ΔleuCD) przekształcony za pomocą plazmidu pMN437 eksprymującego gfp jest używany w całym tym protokole<klasa sup="xref">16. Możliwe jest zastąpienie szczepu Mtb-GFP szczepem typu dzikiego bez ekspresji GFP, aby umożliwić łatwiejszy dostęp do szczepu dla badaczy. Jednak ekspresja gfp jest pożądana, aby umożliwić wizualne potwierdzenie fagocytozy i tworzenie agregatów Mtb/makrofagów. W celu długotrwałego przechowywania, Mtb-GFP zamrożono w temperaturze -80 °C w kompletnych pożywkach 7H9 (opisanych w kroku 1.1) uzupełnionych 20% glicerolem.
<ol>
	<li>Przygotować kompletną pożywkę Mtb-GFP (7H9-C), uzupełniając pożywkę 7H9 10% Middlebrook OADC, 0,02% tyloksapolu, 24 μg/ml kwasu D-pantotenowego, 50 μg/ml L-leucyny i 50 μg/ml higromycyny B.</li>
	<li>Rozmrozić jedną fiolkę Mtb-GFP i dodać do 10 ml 7H9-C w kolbie PETG o pojemności 30 ml z kwadratowym dnem.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C na wytrząsarce obrotowej (50 obr./min). Wykonuj pomiary gęstości optycznej (OD600) co kilka dni, aż OD600 osiągnie 1.0 (około 5-8 dni).</li>
	<li>Rozcieńczyć i pasażować kulturę w razie potrzeby, aby utrzymać OD600 w zakresie 0,2-1,0.</li>
	<li>W przypadku infekcji należy użyć ustalonej hodowli Mtb-GFP w logarytmicznej fazie wzrostu (OD600 0,6-1). Aby uniknąć grudkowatych kultur, należy poddać sonikację kolby hodowlanej Mtb w łaźni wodnej (130 W; impulsy 3 x 5 s) raz lub dwa razy w tygodniu</li>
</ol>
2. Warunki hodowli komórek THP-1
<ol>
	<li>Przygotuj kompletną pożywkę komórkową THP-1 (RPMI-C), uzupełniając pożywkę RPMI 1640 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą, 2 mM L-glutaminy i 10 mM HEPES.</li>
	<li>Inkubować komórki w kolbie T-75 w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 .</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru lub cytometrii przepływowej co drugi dzień i utrzymuj komórki THP-1 w gęstości od 0,1 do 0,6 miliona na ml.</li>
</ol>
3. Protokół infekcji do generowania struktur agregacji Mtb/Macrophage
<ol>
	<li>Przygotowanie komórek THP-1 (na płytkę 96-dołkową)
	<ol>
		<li>Odwirować 7 x 106 komórek THP-1 przy 250 x g przez 5 minut. Zawiesić w 7 ml RPMI-C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie do MTB-GFP
	<ol>
		<li>Wirować 2,8 x 108 Mtb-GFP przy 3 200 x g przez 5 minut w wirówce z odchylanym kubełkiem, stosując konwersję OD600 1,0 = 3 x 108 bakterii/ml.</li>
		<li>Przemyć raz za pomocą RPMI-C i odwirować jak w kroku 3.2.1.</li>
		<li>Zawiesić ponownie w 7 ml RPMI-C i wirować przez 10 s.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakażenie 
	UWAGA: Zobacz rysunek 1, aby zapoznać się z szablonem.
	<ol>
		<li>Przygotować 96-dołkową płytkę, dodając 200 μl sterylnej wody w rzędach A i H oraz kolumnach 1 i 12 jako obwódkę wodną, aby zapobiec parowaniu pożywki.</li>
		<li>Dodaj 200 μl RPMI-C do kolumny 2 (od B2 do G2) dla kontrolki tła (puste).</li>
		<li>W celu zakażenia należy dodać zawiesinę Mtb-GFP (krok 3.2) do zawiesiny komórek THP-1 (krok 3.1) i dobrze wymieszać przez pipetowanie. Ostateczna gęstość komórek THP-1 wynosi 5 x 105 na ml, a odpowiadająca jej wielokrotność infekcji wynosi 40.</li>
		<li>Wlać zawiesinę THP-1/Mtb-GFP do zbiornika o pojemności 25 ml.</li>
		<li>Dodać 200 μl zawiesiny THP-1/Mtb-GFP do wszystkich pozostałych 96 dołków (od B3 do G11) za pomocą pipety wielokanałowej. 
		UWAGA: W przypadku pracy z wieloma płytkami 96-dołkowymi, należy regularnie zawieszać pozostałą zawiesinę THP-1/Mtb w zbiorniku, aby zapewnić równomierne dodanie mieszanki do każdej studzienki.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 7-10 dni.</li>
		<li>Zmieniaj pożywkę co 2 dni, powoli usuwając 100 μl zużytej pożywki z górnej części każdej studzienki i delikatnie dodając 100 μl wstępnie podgrzanego RPMI-C za pomocą wielokanałowej pipety. Nie należy ponownie zawieszać studni i naruszać agregatów Mtb/makrofagów na dnie studni.</li>
		<li>Codziennie badaj wzrokowo studzienki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (obiektyw 4-10X), zwracając uwagę na wielkość agregatów Mtb / makrofagów. W dniach 7-10 agregaty Mtb/makrofagów powinny być wystarczająco duże (patrz rysunek 2 w celu odniesienia), aby można było przystąpić do badania skuteczności leku (sekcja 4).</li>
		<li>W razie potrzeby uchwyć obrazy 96 studzienek za pomocą zautomatyzowanego systemu obrazowania komórek wyposażonego w jasne pole i zestawy filtrów GFP, aby udokumentować tworzenie się agregatów Mtb/makrofagów. 
		UWAGA: Jeśli użytkownicy nie mają dostępu do zautomatyzowanego systemu obrazowania, obrazy reprezentatywnych studzienek można wykonać za pomocą dowolnego odpowiedniego mikroskopu z GFP i funkcją jasnego pola.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Test hamowania wzrostu w celu oceny skuteczności leku przeciwko Mtb pochodzącemu z agregatów Mtb/Makrofagów
<ol>
	<li>Przygotowanie leku (trzy razy dla dwóch leków) 
	UWAGA: Zobacz rysunek 1A, aby zapoznać się z szablonem.
	<ol>
		<li>Na oddzielnej płytce 96-dołkowej dodać 125 μl pożywki 7H9-C do B2 do G10.</li>
		<li>Przygotować dwa leki o podwójnym najwyższym pożądanym stężeniu końcowym w 1 ml 7H9-C, aby uwzględnić rozcieńczenie w kroku 4.2.4.</li>
		<li>Dodać 250 μl każdego leku do studzienek B11-C11-D11 i E11-F11-G11, odpowiednio w celu trzykrotnego leczenia.</li>
		<li>Za pomocą pipety wielokanałowej seryjnie rozcieńczyć badane leki dwukrotnie, przenosząc 125 μl z B11-G11 do B10-G10. Mieszać pipetując 5 razy na każdym etapie.</li>
		<li>Kontynuuj przesuwanie 125 μl od kolumny do kolumny (od prawej do lewej) po płytce i zatrzymaj się za kolumną 4.</li>
		<li>Po wymieszaniu kolumny 4 wyrzucić 125 μl do pojemnika na odpady. Kolumny 2 i 3 nie powinny zawierać żadnych leków, które mogłyby być stosowane jako tło (ślepa próba) i dodatnie kontrole wzrostu. 
		UWAGA: Alternatywnie postępuj zgodnie z szablonem na rysunku 1B, aby przetestować biblioteki leków. Każda 96-dołkowa płytka może pomieścić 58 leków w jednym stężeniu. Przygotuj tę płytkę leku, używając dwukrotnie pożądanego stężenia końcowego, ponieważ zostanie ona rozcieńczona na pół w kroku 4.2.4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie farmakologiczne:
	<ol>
		<li>Pobrać 96-dołkową płytkę zawierającą makrofagi zakażone Mtb (agregaty Mtb/makrofagi).</li>
		<li>Ostrożnie zdekantować wszystkie odpowiednie studzienki (od B2 do G11) za pomocą pipety wielokanałowej. Wykonaj to w dwóch etapach: najpierw usuń 150 μl bez przechylania płytki, a następnie usuń pozostałą pożywkę (~50 μl), przechylając płytkę i wkładając końcówkę pipety do dolnej krawędzi studzienki. Ponieważ agregaty Mtb/makrofagów przylegają do dna studni, nie należy tracić żadnego materiału.</li>
		<li>Delikatnie dodać 100 μl pożywki 7H9-C do wszystkich odpowiednich studzienek (od B2 do G11) płytki zawierającej agregaty Mtb/makrofagów.</li>
		<li>Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 100 μl z płytki zawierającej 96 dołków leku (krok 4.1) do odpowiednich dołków płytki infekcyjnej.</li>
		<li>Umieścić w szczelnie zamkniętej torbie i inkubować przez 3 dni w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Kwantyfikacja skuteczności leku za pomocą testu mikromiareczkowania resazuryny
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy rezazuryny o końcowym stężeniu 0,8 mg/ml wH2O. Przefiltrować przez membranę PVDF o wielkości porów 0,22 μm do sterylizacji.</li>
	<li>Przygotować roztwór roboczy rezazuryny, mieszając podstawowy roztwór rezazuryny,H2Oi Tween-80 (20% roztwór wH2O) w stosunku 2:1:1. Końcowe stężenia wynoszą 0,4 mg/ml rezazuryny i 5% Tween-80.</li>
	<li>Za pomocą czytnika płytek ustawić program do odczytu fluorescencji przy wzbudzeniu 530 nm i emisji 590 nm co 30 minut przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. Czytnik płytek wstępnie podgrzanych do 37 °C.</li>
	<li>Dodać 20 μl roztworu roboczego resazuryny do wszystkich odpowiednich studzienek (od B2 do G11) płytki poddanej działaniu leku (krok 4.11) za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
	<li>Umieść tabliczkę na czytniku płytek i uruchom program skonfigurowany w kroku 5.3. 
	UWAGA: Aby ułatwić przetwarzanie dużych objętości płytek testowych, wystarczy rozwinąć test w inkubatorze o temperaturze 37 °C i wykonywać pojedyncze odczyty fluorescencji co 24 godziny. Dotyczy to również użytkowników, którzy nie mają dostępu do czytnika płytek z możliwością kinetyczną i inkubacyjną</li>.
</ol>

<ol><li>Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+seven+decades+of+antituberculosis+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery.</a> Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).</li>
<li>Bass, J. B. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+tuberculosis+and+tuberculosis+infection+in+adults+and+children.+American+Thoracic+Society+and+The+Centers+for+Disease+Control+and+Prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention.</a> Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).</li>
<li>Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+new+drug+discovery+for+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The challenge of new drug discovery for tuberculosis.</a> Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).</li>
<li>Palomino, J. C., Martin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMC207+becomes+bedaquiline%2C+a+new+anti-TB+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug.</a> Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).</li>
<li>Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+for+early-stage+tuberculosis+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The future for early-stage tuberculosis drug discovery.</a> Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).</li>
<li>Evangelopoulos, D., Fonseca, da, D, J., Waddell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+anti-tuberculosis+drug+efficacy%3A+rethinking+bacterial+populations+and+how+we+model+them%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them.</a> Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).</li>
<li>Ekins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+back+to+the+future%3A+predicting+in+vivo+efficacy+of+small+molecules+versus+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Inf+Model%22%5BJournal%5D)">Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis.</a> J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).</li>
<li>Christophe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening+identifies+decaprenyl-phosphoribose+2%27+epimerase+as+a+target+for+intracellular+antimycobacterial+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors.</a> PLoS Pathog. 5 (10), e1000645(2009).</li>
<li>Hartkoorn, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+drug+susceptibility+of+intracellular+and+extracellular+tuberculosis%2C+and+the+impact+of+P-glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein.</a> Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).</li>
<li>Queval, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microscopic+phenotypic+assay+for+the+quantification+of+intracellular+mycobacteria+adapted+for+high-throughput%2Fhigh-content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening.</a> J Vis Exp. (83), e51114(2014).</li>
<li>Sorrentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+intracellular+screen+for+new+compounds+able+to+inhibit+Mycobacterium+tuberculosis+growth+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).</li>
<li>Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+drug+uptake+in+phenotypically+resistant+nutrient-starved+nonreplicating+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).</li>
<li>Dutta, N. K., Karakousis, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+the+duration+of+tuberculosis+treatment+be+shortened+with+higher+dosages+of+rifampicin%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin?</a> Front Microbiol. 6, 1117(2015).</li>
<li>van Ingen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+Do+We+Use+600+mg+of+Rifampicin+in+Tuberculosis+Treatment%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment?</a> Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).</li>
<li>Donald, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+concentrations+of+antituberculosis+agents+in+adults+and+children%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children.</a> Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).</li>
<li>Schaaf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Macrophage+Infection+Model+to+Predict+Drug+Efficacy+Against+Mycobacterium+Tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis.</a> Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).</li>
<li>Sampson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+elicited+by+a+double+leucine+and+pantothenate+auxotroph+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs.</a> Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).</li>
<li>Jain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+transduction+designed+for+precise+high-throughput+unmarked+deletions+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis.</a> MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).</li>
<li>Davis, J. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+granuloma+in+expansion+and+dissemination+of+early+tuberculous+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection.</a> Cell. 136 (1), 37-49 (2009).</li>
<li>Collins, L., Franzblau, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplate+alamar+blue+assay+versus+BACTEC+460+system+for+high-throughput+screening+of+compounds+against+Mycobacterium+tuberculosis+and+Mycobacterium+avium%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium.</a> Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).</li>
<li>Snewin, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+immunity+to+mycobacterial+infection+with+luciferase+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs.</a> Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu szczegółowo opisaliśmy alternatywny model infekcji Mtb , który nadaje się do testowania skuteczności leków. Model ten uwzględnia dwa kluczowe czynniki, które powinny być bardziej brane pod uwagę podczas wczesnego procesu opracowywania leków na gruźlicę: obecność fizjologicznie istotnych barier dla przenikania leków oraz zmiany metaboliczne Mtb podczas infekcji. Podczas gdy wcześniej pokazaliśmy korzyści płynące z naszego modelu infekcji i zaproponowaliśmy możliwość zwiększenia skali infekc...

Gruźlica (TB) pozostaje poważnym globalnym zagrożeniem dla zdrowia, pomimo dostępności schematów chemioterapii przeciwgruźliczej od ponad 40 lat1. Wynika to częściowo z wymogu stosowania długich okresów leczenia wynoszących ponad 6 miesięcy przy użyciu wielu kombinacji leków, co prowadzi do nieprzestrzegania zaleceń przez pacjenta2. Pojawienie się lekoopornej gruźlicy w ostatnich latach jeszcze bardziej spotęgowało problemy w dziedzinie, w której pomyślny rozwój klinicznie zatwierdzonych leków praktycznie nie istnieje3. Rzeczywiście, pomimo wyczerpującego rozwoju leków przeciwgruźliczych, tylko jeden lek został zatwierdzony przez FDA do użytku klinicznego w ciągu ostatnich 40 lat4. Dlatego pilnie potrzebne są nowe generacje leków przeciwgruźliczych, aby rozwiązać ten problem.
Kluczowym problemem w odkrywaniu leków na gruźlicę jest brak udanego przejścia od związków o aktywności in vitro do skuteczności w warunkach klinicznych5,6,7. Początkowo do badań przesiewowych leków anty-Mtb stosowano podejścia oparte na celach5, które nie były w stanie przekształcić się w całe komórki bakteryjne. Nawet jeśli używane są komórki Mtb, często wykonuje się to przy użyciu kultur wyhodowanych w bulionie, które nie przewidują dokładnie skuteczności leku in vivo8,9. Problemy te zostały rozpoznane, a testy przesiewowe leków przeciwko makrofagom zawierającym Mtb lub utajonemu Mtb zostały pomyślnie ustanowione8,10,11,12. Jednak nawet te bardziej zaawansowane testy nie uwzględniają w wystarczającym stopniu barier penetracji, które leki napotykają w nieunaczynionych zmianach płucnych oraz w ogniskach martwiczych w miejscu zakażenia. Rzeczywiście, nawet w przypadku ryfampicyny, leku pierwszego rzutu na gruźlicę, nieoptymalne dawkowanie zostało zakwestionowane z powodu niewystarczającej penetracji tkanek in vivo i płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF)13,14,15, a także zmniejszoną skuteczność przeciwko wewnątrzkomórkowej Mtb8,9. W związku z tym nowe modele i testy, które uwzględniałyby te parametry we wczesnym procesie opracowywania odprowadzeń, niewątpliwie usprawniłyby wysiłki na rzecz odkrywania leków na gruźlicę.
Aby zaspokoić tę potrzebę, niedawno stworzyliśmy niedrogi, szybki i kompatybilny z BSL-2 alternatywny model infekcji do testowania skuteczności leków Mtb16. Ten model infekcji wytworzył gęsto upakowany Mtb w dużych strukturach agregatów makrofagów, które podsumowały fizjologicznie istotne bariery penetracji komórkowej i wygenerowały Mtb z pasażami makrofagów ze zmienionym stanem fizjologicznym przypominającym utajony Mtb. Mtb uzyskany z tego modelu infekcji połączono z testem mikromiareczkowania rezazuryny (REMA) w celu oceny skuteczności leku, który dał wyniki zgodne z innymi modelami infekcji wewnątrzkomórkowych i dobrze korelował z raportowaną zdolnością powszechnych leków na gruźlicę do osiągania wysokich stężeń płynu mózgowo-rdzeniowego w stosunku do stężeń w surowicy16.
Tutaj szczegółowo opisujemy generowanie struktur agregatów Mtb/makrofagów w celu wytworzenia Mtb z pasażami makrofagów, nadających się do testowania wrażliwości na leki za pomocą REMA. W szczególności pokazujemy, w jaki sposób ten system infekcji można dostosować do formatu 96-dołkowego w celu zapewnienia zgodności z przepływowymi badaniami przesiewowymi potencjalnych leków przeciwgruźliczych.

<table><tbody><tr><td>7H9</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td>Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta</td></tr><tr><td>Middlebrook OADC</td><td>BD Biosciences</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Tyloxapol</td><td>Sigma</td><td>T8761</td><td>Przygotuj 20% roztwór podstawowy w filtrze H2O; sterylizuj</td></tr><tr><td>filtr Kwas D-pantotenowy sól półwapniowa</td><td>Sigma</td><td>P5710</td><td>Przygotować 24 mg/ml roztwór podstawowy w H2</ pod>O; filtr sterylizuj</td></tr><tr><td>L-leucynę</td><td>MP Biomedicals</td><td>194694</td><td>Przygotuj 50 mg/ml roztwór podstawowy w H2O; sterylizuj filtr</td></tr><tr><td>Hygromycyna B</td><td>EMD Millipore</td><td>400051</td><td>Przygotuj roztwór podstawowy 200 mg/ml w H2O</td></tr><tr><td>Nalgene Kwadratowa butelka z pożywką PETG</td><td>Thermo Fisher</td><td>2019-0030</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 media</td><td>Hyclone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450H</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Corning</td><td>MT25005CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Hyclone</td><td>SH30237.01</td><td></td></tr><tr><td>Cytacja 3 czytnik płytek</td><td>Biotek</td><td></td><td>Wymienny z dowolnym czytnikiem płytek fluorescencyjnych i mikroskopem</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td>Gen5 Biotek</td><td></td><td>Nagrywanie i analiza wersja rezasurin</td></tr><tr><td>Ryfampicyna&nbsp;</td><td>Fisher Scientific BP2679250</td><td></td><td>Przygotuj 10 mg/ml roztworu podstawowego w H2O</td></tr><tr><td>Chlorowodorek moksyfloksacyny</td><td>Acros Organics</td><td>457960010</td><td>Przygotuj 10 mg/ml roztworu podstawowego w H2O</td></tr><tr><td>Sól sodowa rezazuryny</td><td>Sigma</td><td>R7017</td><td>Przygotuj 800 &mu; g/ml roztworu podstawowego w H2O; sterylizacja filtra</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Fisher Scientific T164500</td><td></td><td>Przygotuj 20% roztwór podstawowy w sterylizacji filtra H2O;</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowy, kompatybilny test do oceny skuteczności leku przeciwko prątkom gruźlicy pasażowanym przez makrofagi

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

Wczesny proces opracowywania leków przeciwgruźliczych jest utrudniony przez nieefektywne przełożenie związków o aktywności in vitro na skuteczność w warunkach klinicznych. Jest to prawdopodobnie spowodowane brakiem uwzględnienia fizjologicznie istotnych barier penetracji komórkowej, które istnieją w zakażonym gospodarzu. Niedawno opracowaliśmy alternatywny model infekcji, który generuje duże struktury agregacji makrofagów zawierające w swoim rdzeniu gęsto upakowane M. tuberculosis (Mtb), które nadawały się do testowania wrażliwości na leki. Ten model infekcji jest niedrogi, szybki i, co najważniejsze, kompatybilny z BSL-2. W tym miejscu opisujemy procedury eksperymentalne mające na celu generowanie struktur zagregowanych Mtb/makrofagów, które wytwarzałyby Mtb z pasażami makrofagów do badania wrażliwości na leki. W szczególności pokazujemy, w jaki sposób ten system infekcji można bezpośrednio dostosować do formatu płytki 96-dołkowej, wykazując zdolność przepustową do badań przesiewowych bibliotek związków przeciwko Mtb. Ogólnie rzecz biorąc, test ten jest cennym dodatkiem do obecnie dostępnego zestawu narzędzi do odkrywania leków Mtb ze względu na jego prostotę, opłacalność i skalowalność.

Aby potwierdzić stabilność adaptacji tego modelu infekcji do formatu płytki 96-dołkowej, zbadaliśmy tutaj podatność Mtb pochodzących z naszego zaadaptowanego modelu infekcji w płytce 96-dołkowej na ryfampicynę (RIF) oraz moksifłoksacynę (MOXI), zgodnie ze schematem przedstawionym na rysunku 1A. Wykazujemy, że generowanie struktur agregatów Mtb/makrofagów, kluczowych dla tego testu, może być wiarygodnie realizowane w formacie płytki 96-dołkowej (r...

Nowe modele i testy, które poprawiłyby wczesny proces opracowywania leków przeciwgruźliczych nowej generacji, są wysoce pożądane. Tutaj opisujemy szybki, niedrogi i zgodny z BSL-2 test do oceny skuteczności leku przeciwko Mycobacterium tuberculosis, który można łatwo dostosować do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Wysokoprzepustowy, kompatybilny test do oceny skuteczności leku przeciwko prątkom gruźlicy pasażowanym przez makrofagi

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Ogólnym celem tej procedury jest powtarzalne generowanie struktur agregatów makrofagów zainfekowanych Mycobacterium tuberculosis w formacie płytki 96-dołkowej w celu badania wrażliwości na leki przy użyciu barwnika żywotności. Metoda ta może usprawnić proces wczesnego opracowywania leków przeciwgruźliczych, który jest utrudniany przez nieefektywne przenoszenie związków kandydackich do warunków klinicznych. Główną zaletą tego prostego, niedrogiego modelu infekcji, zgodnego z poziomem BSL 2, jest to, że odzwierciedla on fizjologicznie istotne bariery przenikania komórkowego, przypominające ziarniniaki gruźlicze.Dzięki temu uzyskuje się wyniki podatności na leki, które lepiej przewidują skuteczność in vivo. Należy rozpocząć tę procedurę od przygotowania szczepu M.tuberculosis MC squared 6206 wykazującego ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego, zwanego dalej MTBGFP, do zakażenia. Należy pamiętać, że jest to szczep awirulentny, zatem wszystkie czynności opisane w niniejszym protokole mogą być wykonywane w laboratorium o drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego.Dla każdej płytki 96-dołkowej przygotować 2,8 × 10⁸ MTBGFP, wirując je z prędkością 3 200 ×g przez pięć minut w wirówce z ruchomymi koszyczkami. Po wirowaniu odpiessować nadsącz i dodać 5 ml RPMIC w celu przemycia bakterii. Pipetować w górę i w dół, aby resuspenderze komórki.Następnie ponownie odwirować. Po drugim wirowaniu odlać supernatant i zawiesić komórki bakteryjne w siedmiu mililitrach RPMIC, a następnie wymieszać na wortexie przez 10 sekund. Następnie, dla każdej przygotowywanej płytki 96-dołkowej, odwirować 7×10⁶ ludzkich komórek monocytycznych THP1 przy 250 ×g przez pięć minut.Po wirowaniu odlać supernatant i resuspendować komórki THP1 w siedmiu mililitrach RPMIC. Następnie przygotować płytkę 96-dołkową do infekcji, dodając 200 µL sterylnej wody do dołków w rzędach A i H oraz w kolumnach 1 i 12. Ten pierścień wodny zapobiegnie odparowywaniu pożywki hodowlanej.Do kolumny drugiej, od B2 do G2, dodaj 200 µL pożywki RPMIC jako kontrolę tła lub próbę ślepą. Aby zainfekować monocyty THP1, za pomocą pipety przenieś całą przygotowaną zawiesinę bakteryjną MTBGFP do zawiesiny komórek THP1 i wymieszaj dokładnie, pipetując w górę i w dół. Końcowa gęstość komórek THP1 wynosi 5 × 10⁵/ml, a odpowiadająca jej wielokrotność infekcji w dołku wynosi 40.Następnie przelej zawiesinę THP1 MTBGFP do zbiornika o pojemności 25 ml, a następnie, używając pipety wielokanałowej, dodaj 200 µl zawiesiny THP1 MTBGFP do wszystkich pozostałych 96 studni, od E3 do G11. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 przez siedem do 10 dni. Co dwa dni w trakcie inkubacji wymień medium za pomocą pipety wielokanałowej, powoli usuwając 100 µl zużytego medium z góry każdej studni i delikatnie dodając 100 µl uprzednio ogrzanego RPMIC.Podczas wymiany pożywki należy uważać, aby nie naruszyć agregatów makrofagów z MTB na dnie studzienek. Każdego dnia należy poddać studzienki ocenie wizualnej za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w zestaw filtrów do światła przechodzącego oraz GFP, przy użyciu obiektywu o powiększeniu od 4 do 10X. Należy odnotować wielkość agregatów makrofagów z MTB i w razie potrzeby wykonać zdjęcia.Między siódmym a dziesiątym dniem agregaty makrofagów z MTB powinny być wystarczająco duże, aby przystąpić do testowania skuteczności leków, jak opisano później w filmie. W celu przeprowadzenia testów leków, przygotuj dwa leki przeciwprąguźlicze w trzech powtórzeniach na nowej płytce 96-dołkowej w następujący sposób. Najpierw dodaj 125 µL pożywki 7H9C do dołków od B2 do G10.Następnie przygotuj oba leki w podwójnym najwyższym pożądanym stężeniu końcowym w jednym mililitrze 7H9C. Za pomocą pipety dodaj 250 µL każdego leku do dołków B, C i D 11, a następnie do E, F i G 11 odpowiednio dla pomiarów w potrójnych powtórzeniach. Następnie, używając pipety wielokanałowej, wykonaj dwukrotne rozcieńczenia szeregowe testowanych leków, przenosząc 125 µL z dołków B 11 przez G 11 do dołków B 10 przez G 10.Mieszać poprzez pipetowanie pięć razy na każdym etapie. Kontynuować przenoszenie 125 µL z kolumny do kolumny, od prawej do lewej strony płytki, i zatrzymać się po czwartej kolumnie. Po wymieszaniu czwartej kolumny odrzucić 125 µL do pojemnika na odpady.Kolumny druga i trzecia nie powinny zawierać żadnych leków. Pozwoli to na wykorzystanie ich jako tła oraz dodatnich kontroli wzrostu. Następnie należy wyjąć z inkubatora płytkę 96-dołkową zawierającą makrofagi zainfekowane MTB.Bez przechylania płytki, za pomocą pipety wielokanałowej usuń 150 µL medium z dołków od B2 do G11. Następnie przechyl płytkę w sposób pokazany tutaj, wprowadź końcówki pipety do dolnej krawędzi dołków i usuń pozostałe medium, około 50 µL. Ponieważ agregaty makrofagów MTB przylegają do dna dołka, żaden materiał nie powinien zostać utracony.Należy jednak usuwać medium jak najdelikatniej, dbając o to, aby nie doprowadzić do resuspensji podczas tego procesu. Do dołków od B2 do G11 na płytce, w których znajdują się agregaty makrofagów z MTB, należy ostrożnie dodać 100 µL medium 7H9C. Za pomocą pipety wielokanałowej należy przenieść 100 µL z płytki 96-dołkowej zawierającej lek do odpowiadających im dołków na płytce z infekcją.Następnie umieść płytkę w szczelnej torebce i inkubuj przez trzy dni w temperaturze 37 °C. Test rezazurynowy opiera się na wykorzystaniu form utleniających wytwarzanych przez metabolicznie czynne MTB do przekształcenia niebieskiej rezazuryny w fluorescencyjną, różową rezorufinę. Zmiana barwy i fluorescencji może służyć jako marker zastępczy do określenia ilości wzrostu bakterii.Przygotuj roztwór zapasowy rezazuryny o końcowym stężeniu 8 mg/ml w wodzie. Przefiltruj przez membranę PVDF o rozmiarze porów 22 µm w celu sterylizacji. Przygotuj roztwór roboczy rezazuryny, mieszając roztwór zapasowy, wodę i Tween-80 w stosunku dwa do jednego do jednego.Stężenia końcowe wynoszą 4 mg/mL rezurazyny oraz 5% Tween-80. W czytniku płytek należy skonfigurować program do pomiaru fluorescencji przy pobudzeniu 530 nm i emisji 590 nm przez 24 godziny w odstępach co 30 minut w temperaturze 37 °C. Należy wcześniej podgrzać czytnik płytek do 37 °C.Używając pipety wielokanałowej, dodaj 20 µL roztworu roboczego rezazuryny do dołków od B2 do G11 na płytce z lekiem. Umieść płytkę w czytniku i uruchom program. Aby potwierdzić powtarzalność adaptacji tego modelu infekcji do formatu płytki 96-dołkowej, oceniono podatność MTB na ryfampicynę (RIF) oraz moksifloksacynę (moxy) zgodnie z opisem w tym filmie.Jak pokazano tutaj, struktury agregatów makrofagów MTB zostały pomyślnie wytworzone w formacie płytki 96-dołkowej, co umożliwiło kompatybilność z analizami wysokoprzepustowymi. Aby ilościowo zmierzyć konwersję rezauryny jako wskaźnika wzrostu bakterii, fluorescencję poszczególnych dołków monitorowano kinetycznie przez 24 godziny. Obecność żywych komórek MTB określa się na podstawie konwersji niebieskiego barwnika rezauryny w jego różową formę zredukowaną, co znajduje ilościowe odzwierciedlenie w względnych wartościach fluorescencji netto w punkcie nasycenia.Te reprezentatywne minigrafiki przedstawiają wynikowe jednostki fluorescencji na osi Y w funkcji czasu na osi X. W celu wygenerowania krzywych przeżywalności w teście wrażliwości na leki, studzienki traktowane ryfampicyną i moksiflocyną znormalizowano do maksymalnego wzrostu MTB w kontroli bez leku, przyjmując to za 100% przeżywalności. Sygnały tła z pustych studzienek kontrolnych odjęto od każdej studzienki z próbką.Procent przeżywalności wykreślono dla każdego indywidualnego stężenia leku, aby uzyskać krzywą zabijania. Dane te wskazują, że minimalne stężenie hamujące, definiowane jako najniższe stężenie antybiotyku, przy którym obserwuje się 90% zahamowania wzrostu, przekracza 2 µg/mL w przypadku zarówno ryfampicyny, jak i moksyfloksacyny przeciwko MTB pochodzącym z naszego modelu infekcji. W związku z tym minimalne stężenie hamujące tych dwóch leków przeciwko MTB z zastosowaniem naszego modelu infekcji i testu w większym stopniu odzwierciedla aktywność tych leków in vivo.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak w sposób niezawodny i powtarzalny generować agregaty makrofagów zainfekowanych MTB do badania podatności na leki z wykorzystaniem testu rezazurynowego. Po zastosowaniu tej procedury modyfikacja szablonu leków z dwóch pokazanych preparatów na panel biblioteki 58 leków jest łatwo możliwa do wykonania, co umożliwia wysokoprzepustowy screening leków.

a-high-throughput-compatible-assay-to-evaluate-drug-efficacy-against

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film pokazuje test do oceny skuteczności leków przeciwko zakażeniu Mycobacterium tuberculosis (Mtb).  Generowany jest model infekcji in vitro zawierający agregaty Mtb/makrofagów, który naśladuje infekcję in vivo. Po wprowadzeniu odpowiednich antybiotyków ich skuteczność jest testowana za pomocą testu resuzaryny w celu monitorowania przeżywalności bakterii przy rosnących stężeniach leku.

Test do oceny skuteczności leku przeciwko modelowi zakażenia Mycobacterium tuberculosis

Tutaj opisujemy test fenotypowy mający zastosowanie do wysokoprzepustowych/wysokotreściowych ekranów małych interferujących bibliotek syntetycznego RNA (siRNA), związków chemicznych i Mycobacterium tuberculosis. Metoda ta polega na wykrywaniu znakowanych fluorescencyjnie Mycobacterium tuberculosis w znakowanej fluorescencyjnie komórce gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej.

Mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości

Opracowaliśmy modułowy, wysokoprzepustowy system przesiewowy do odkrywania nowych związków przeciwko Mycobacterium tuberculosis, ukierunkowanych na bakterie rosnące wewnątrzkomórkowo i w bulionie, a także cytotoksyczność wobec komórki gospodarza ssaków.

System badań przesiewowych skuteczności i cytotoksyczności inhibitorów ukierunkowanych na wewnątrzkomórkowe prątki gruźlicy

Szybkie i skuteczne oznaczanie wzrostu wewnątrzkomórkowego M. tuberculosis jest kluczowe dla poszukiwania lepszych terapii przeciwko gruźlicy (TB). Protokół ten opisuje test detekcji kolorymetrycznej na bazie bulionu przy użyciu zautomatyzowanego systemu hodowli płynów do ilościowego określenia wzrostu Mtb w makrofagach traktowanych potencjalnymi terapiami kierowanymi przez gospodarza.

Zautomatyzowany system hodowli do stosowania w badaniach przedklinicznych terapii gruźlicy ukierunkowanych na gospodarza

Oznaczanie jednostek tworzących kolonie (CFU) jest złotym standardem w ilościowym oznaczaniu bakterii, w tym Mycobacterium tuberculosis, które mogą potrzebować tygodni na utworzenie widocznych kolonii. W tym miejscu opisujemy mikro-CFU do oznaczania CFU ze zwiększoną wydajnością czasową, zmniejszoną przestrzenią laboratoryjną i kosztami odczynników oraz skalowalnością do eksperymentów o średniej i wysokiej przepustowości.

Test jednostkowy tworzenia mikrokolonii do oceny skuteczności szczepionek przeciwko gruźlicy

To badanie opracowało test do wysokoprzepustowych badań przesiewowych przeciwko Mycobacterium abscessus z niedawno stworzonym podwójnym szczepem reporterowym, wykorzystując fluorescencję i luminescencję do szybkiej oceny żywotności bakterii. Protokół ten będzie istotny dla naukowców dążących do badań przesiewowych nowych leków przeciwko tej lekoopornej bakterii.

Opracowanie testów do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków przeciwko prątkom

Badanie to zawiera protokół oceny interakcji Mycobacterium tuberculosis z czujnikiem mikrobiologicznym SLAMF1. Testy przeprowadzono na ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów przy użyciu cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej. Opisane narzędzia są istotne dla badania interakcji między patogenami a immunoreceptorami.

Testy fluorescencyjne do badania interakcji Mycobacterium tuberculosis z receptorem immunologicznym SLAMF1

Mycobacterium tuberculosis tworzy lekooporne biofilmy podczas hodowli w określonych warunkach. W niniejszej pracy opisujemy metody hodowli biofilmów M. tuberculosis oraz określania częstotliwości występowania lekoopornych form przetrwalnikowych (persisterów). Protokoły te będą przydatne w dalszych badaniach nad mechanizmami tolerancji leków u M. tuberculosis.

Wzrost biofilmu Mycobacterium tuberculosis

Gruźlica i malaria to dwie z najbardziej rozpowszechnionych infekcji u ludzi oraz główne przyczyny zachorowalności i śmiertelności w zubożałych populacjach w tropikach. Stworzyliśmy eksperymentalny system modelowy do badania wyników koinfekcji malarią i gruźlicą u myszy po prowokacji obydwoma patogenami za pośrednictwem ich naturalnej drogi zakażenia.

Model eksperymentalny do badania koinfekcji gruźlicą i malarią po naturalnym przenoszeniu Mycobacterium tuberculosis i Plasmodium berghei

Mikromacierz amplifikacyjna łączy asymetryczną amplifikację PCR i hybrydyzację mikromacierzy w jednej komorze, co znacznie usprawnia pracę z mikromacierzą dla użytkownika końcowego. Uproszczenie przepływu pracy z mikromacierzami jest niezbędnym pierwszym krokiem do stworzenia diagnostyki opartej na mikromacierzach, która może być rutynowo używana w środowiskach o niższych zasobach.

Demonstracja wielolekoopornej mikromacierzy amplifikacyjnej Mycobacterium tuberculosis

Poznaj metodę oceny skuteczności leków przeciwko Mycobacterium tuberculosis w makrofagach w formacie 96-well. To szybkie, tanie i kompatybilne z BSL-2 podejście umożliwia badania przesiewowe wysokoprzepustowe.

Wysokoprzepustowy, kompatybilny test do oceny skuteczności leku przeciwko prątkom gruźlicy pasażowanym przez makrofagi

Przeglądaj więcej filmów