Ocena podtypów kardiomiocytów po przeprogramowaniu fibroblastów embrionalnych myszy za pośrednictwem czynnika transkrypcyjnego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wygenerowanie i ilościowe określenie zróżnicowanego zestawu indukowanych podtypów kardiomiocytów. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe, fundamentalne pytania dotyczące specyficznej dla podtypu konwersji linii podczas przeprogramowania serca, takie jak niezbędne sygnały regulujące montaż sarkomerów i specyfikację podtypu. Główną zaletą tej techniki jest dostarczenie metody do ilościowego określania efektów specyfikacji podtypów kardiomiocytów, co jest wymagane do przeprowadzenia badań nad mechanizmami.

W pierwszej kolejności należy wyizolować zarodkowe fibroblasty mysie z embrionów w stadium E 12.5. Należy je przechowywać w ciekłym azocie zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Następnie należy zebrać komórki plat-E i wysiać je w liczbie jednego miliona komórek na dołek na płytce sześciodołkowej, tak aby w ciągu 24 godzin osiągnęły one 70 do 80% konfluencji.

Przykryj komórki pożywką do transfekcji i inkubuj je w standardowych warunkach hodowli. Na dzień przed planowanym eksperymentem weź stożkową probówkę polistyrenową o pojemności 15 ml i wymieszaj 60 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy z sześcioma µL odczynnika do transfekcji na jedną reakcję. Inkubuj mieszaninę przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Ponieważ stosowany jest odczyn do transfekcji, należy dodać go bezpośrednio do pożywki z obniżoną zawartością surowicy, aby uniknąć spadku wydajności transfekcji. Następnie do każdej reakcji należy dodać łącznie 2 µg koktajlu GHMT i delikatnie opukać probówkę, aby wymieszać zawartość. Reakcję inkubuje się przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie mieszaninę dodaje się kroplami do komórek plat-E.

Zanotuj datę i godzinę transfekcji. Inkubuj transfektowane komórki plat-E przez noc. Na godzinę przed wysianiem embrionalnych fibroblastów mysich przygotuj płytkę 24-dołkową do immunocytochemii, umieszczając w każdym dołku szkiełka podstawowe o średnicy 12 mm pokryte fibronektyną.

Następnie do każdej dołki należy dodać 300 µL roztworu kolagenu bydlęcego i inkubować płytkę przez jedną godzinę. Pod koniec inkubacji należy rozmrozić zamrożoną fiolkę z mysimi fibroblastami embrionalnymi HCN4GFP. Komórki należy szybko rozmrozić, jednokrotnie przemyć uprzednio ogrzaną pożywką do fibroblastów i oznaczyć stężenie żywych komórek.

Następnie odessaj roztwór powlekający z płytki 24-dołkowej i niezwłocznie wysiej 30 000 komórek na dołek na szkiełka podstawowe powleczone kolagenem i fibronektyną. 24 godziny po transfekcji przefiltruj medium retrowirusowe przez filtr z octanu celulozy bez surfaktantów o rozmiarze porów 0,45 micron i przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 milliliter. Następnie dodaj polybrene do stężenia końcowego 8 µg/mL.

Ostrożnie uzupełnij komórki plat-E dwiema mililitrami świeżej pożywki do transfekcji. Zbyt szybka wymiana pożywki może spowodować odklejenie się komórek. Prawidłowo utrzymywane komórki plat-E produkują średnio dziesięć milionów jednostek zakaźnych na mililitr.

Wysoka ekspresja i intensywność GFP w ponad 95% komórek zazwyczaj koreluje z pomyślnym wygenerowaniem indukowanych miocytów przypominających kardiomiocyty za pośrednictwem GHNT. Następnie należy odessać medium z hodowli fibroblastów zarodkowych i dodać świeżo zebrane medium retrowirusowe. Następnie należy umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze i inkubować przez noc.

Następnego dnia ponownie przenieś medium z komórek plat-E do fibroblastów embrionalnych. Po drugim zbiorze wirusa zutylizuj komórki plat-E. 48 godzin po indukcji odessaj medium kondycjonujące i raz przemyj komórki PBS.

Następnie do każdego dołka płytki 24-dołkowej należy dodać 500 µL podgrzanej pożywki do indukcji kardiomiocytopodobnych. Pożywkę należy wymieniać co dwa do trzech dni przez kolejne 12 dni. 14 dni po indukcji należy ostrożnie odessać pożywkę i wypłukać każdy dołek 300 µL lodowatego PBS.

Następnie usunąć PBS i dodać 250 µL 4% roztworu paraformaldehydu do każdej studzienki, a następnie inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej. W następnym kroku przeprowadzić permeabilizację komórek, przemywając studzienki trzykrotnie przez pięć minut 300 µL 0,1% Triton X-100 w PBS. Po ostatnim przemyciu odessać nadmiar roztworu do permeabilizacji, a następnie dodać uniwersalny bufor blokujący w ilości 300 µL na studzienkę.

Inkubować w celu blokowania przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Jedną parę szkiełek barwić przez noc z zastosowaniem przeciwciał mysich przeciwko alfa-akteninie, kurzych przeciwko GFP oraz króliczych przeciwko NPPA, aby zidentyfikować indukowane miocyty o charakterze rozrusznikowym w indukowanych miocytach o charakterze przedsionkowym. Następnego dnia wypłukać dołki i dodać odpowiednie przeciwciało wtórne zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym.

Po dodatkowych etapach płukania, nanieś 2,4 µL medium montażowego na szklany preparat mikroskopowy. Wyjmij szkiełko nakrywkowe z płytki 24-dołkowej i usuń nadmiar roztworu. Następnie przenieś je na szkiełko z medium montażowym.

W przypadku każdego preparatu należy rozpocząć od jednej krawędzi i skanować obszar w górę i w dół w kanale fluorescencji czerwonej, aby zidentyfikować komórki dodatnie pod kątem alfa-aktyniny i sarkomerów. Prążkowanie sarkomerów jest najłatwiejsze do zidentyfikowania przy długości fali 555 nanometrów. Po ich zidentyfikowaniu należy przełączyć na kanał zielony i odnotować, czy komórki są dodatnie.

Następnie przejdź do komputera, aby ocenić długość fali dalekiej czerwieni 647 nanometr w celu poszukiwania barwienia NPPA lub MYL2. Komórki wykazujące pozytywny wynik dla alfa-aktyniny, pozytywny dla sarkomerów, negatywny dla Hnc4-GFP i pozytywny dla Nppa są indukowanymi miocytami przypominającymi komórki przedsionka. Barwienie Nppa będzie miało charakter paranuklearny i punktowy.

Najpierw, 24 godziny po wysianiu, należy policzyć komórki zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Następnie należy poddać wizualnej inspekcji każdą komórkę na szkiełku nakrywce pod kątem prawidłowego barwienia alfa-aktyniny i sarkomerów, a następnie zapisać liczbę komórek wykazujących pozytywne barwienie dla obu markerów. Na koniec wartość tę należy podzielić przez rzeczywistą całkowitą liczbę wysianych komórek.

Średni eksperyment z przeprogramowaniem daje około jednego procenta komórek wykazujących pozytywny wynik zarówno dla alfa-aktyniny, jak i sarkomerów. W 14. dniu eksperyment można przerwać i ocenić organizację sarkomerów. Jest ona identyfikowana poprzez pozytywne barwienie na alfa-aktyninę, pokazane tutaj na czerwono.

Tylko komórki wykazujące organizację sarkomerów są zdolne do spontanicznego skurczu, dlatego jest to dobra pierwsza metoda weryfikacji. Przedstawione tutaj są indukowane kardiomiocyty typu rozrusznikowe pochodzące od myszy reporterowych Hcn4-GFP. Trzy komórki w tym widoku wykazują organizację sarkomerów.

W centrum obrazu widoczne są trzy skupiska komórek wykazujące pozytywny wynik dla Hcn4-GFP, które można zidentyfikować jako typ komórek rozrusznikowych. W lewym dolnym rogu można zaobserwować jedną komórkę z barwieniem na alfa-aktyninę, jednak bez organizacji sarkomerów lub możliwego do zidentyfikowania markera podtypu. W tej populacji indukowanych kardiomiocytów o fenotypie komór komorowych, centralna komórka wykazuje organizację sarkomerów; komórka ta barwi się również pozytywnie na marker lekkich łańcuchów miozyny MYL-2, który jest markerem kardiomiocytów komorowych.

Po opanowaniu techniki, wysiew oraz transfekcja komórek plat-E mogą zostać przeprowadzone w ciągu jednej godziny. Indukcja embrionalnych fibroblastów mysich zajmuje od jednej do dwóch godzin, a kwantyfikacja myto całej płytki 24-dołkowej trwa około ośmiu godzin. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że zdrowe embrionalne fibroblasty mysie oraz wirusy o wysokim mianie są kluczowe dla sukcesu eksperymentu z reprogramowaniem.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak generować i kwantyfikować poszczególne podtypy indukowanych kardiomiocytów.