Zautomatyzowana analiza skurczów ludzkiej zmodyfikowanej tkanki serca do badań przesiewowych bezpieczeństwa leków sercowych

Ogólnym celem tej techniki jest wytworzenie trójwymiarowej inżynieryjnej tkanki serca, która może służyć jako platforma do analizy skurczów in vitro w badaniach przesiewowych leków oraz modelowaniu chorób. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie kardiologii dotyczące modelowania chorób, farmakologii bezpieczeństwa oraz wpływu wariantów genetycznych lub leków na siłę skurczu. Główną zaletą tej techniki jest możliwość pomiaru siły skurczu w inżynieryjnych tkankach serca różnych gatunków w warunkach sterylnych przez dłuższy czas.

Naukowcy rozpoczynający pracę z tą metodą mogą napotkać trudności związane z niską jakością komórek lub brakiem składnika w pożywce. Ważne jest, aby zoptymalizować przygotowanie próbki i unikać cykli. Procedurę tę zaprezentują Anika Benzin oraz Umber Saleem.

Przed rozpoczęciem procedury należy wlać 1,6 ml ciepłego, dwupocentnego agarozy do pierwszych studni płytki 24-dołkowej. Następnie należy niezwłocznie umieścić w agarozie dystansory z politetrafluoroetylenu. Po około 10 minutach w temperaturze pokojowej agaroza stanie się mętna, co będzie oznaczało jej zestalenie.

Usuń przekładki i umieść statywy PDMS w odlewach w taki sposób, aby pary słupków statywu wchodziły do każdej formy agarozowej. Po umieszczeniu wszystkich statywów zawieszamy kardiomiocyty w pożywce o minimalnym stężeniu 1,5 × 10⁷ komórek/ml oraz świeżo przygotowanej mieszaninie do rekonstytucji z fibrynogenem, mieszając 10–15 razy pipetą serologiczną, aż skrzep fibrynogenu zostanie rozpuszczony. Sprawdź homogeniczność mieszaniny do rekonstytucji w pipecie.

Następnie dla każdej sztucznie wyhodowanej tkanki serca (engineered heart tissue, EHT) zmieszaj 100 µl mieszaniny do rekonstytucji z 3 µl trombiny w probówce o pojemności 200 µl. Bezzwłocznie nanieś 100 µl tej mieszaniny EHT z trombiną do otworów w agarozie. Do każdej tkanki EHT użyj nowej końcówki z filtrem.

Po wypełnieniu wszystkich otworów mieszaniną do rekonstytucji, zamknij pokrywę naczynia do hodowli komórkowej i inkubuj preparaty przez dwie godziny w temperaturze 37 °C i siedmioprocentowym stężeniu dwutlenku węgla. Po zakończeniu inkubacji umieść płytkę w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza i pokryj każdą studzienkę od 200 do 500 µL pożywki. Delikatnie potrząśnij płytką i przenieś EHT z powrotem do inkubatora.

Po 10 minutach ostrożnie przenieś stelaże do nowej płytki 24-dołkowej zawierającej 1,5 milliliters medium EHT na dołek i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórek w odpowiednich warunkach hodowlanych. Dokarmiaj EHT w każdy poniedziałek, środę i piątek, przenosząc stelaże PDMS do drugiej płytki ze świeżym medium. Od siedmiu do dziesięciu dni po odlewie EHT powinny wykazywać spontaniczne skurcze powodujące ugięcie słupków stelaży PDMS.

Aby przeanalizować skurcze EHT, w dniu eksperymentu należy włączyć urządzenie grzewcze w aparacie do analizy EHT na dwie godziny przed pomiarem. Bezpośrednio przed analizą należy włączyć zasilanie gazowe i elektroniczne systemu osi. W celu rejestracji linii bazowej należy umieścić płytkę EHT w aparacie do analizy EHT i uruchomić oprogramowanie do analizy skurczów zgodnie z instrukcjami producenta.

Kierując się instrukcjami z podręcznika oprogramowania w celu rozpoczęcia nowego pomiaru, kliknij kartę protokołu, aby wprowadzić odpowiednie informacje dotyczące badania. Otwórz kartę konfiguracji i wybierz studzienki do analizy. Ze względu na ograniczenia czasowe, w tym filmie zademonstrowano to jedynie dla dwóch EHT.

Następnie kliknij zakładkę podglądu kamery i uruchom tryb transmisji na żywo z automatycznym trybem wykrywania obiektów. Dostosuj położenie kamery za pomocą współrzędnych xyz dla każdej wybranej studni w płytce 24-dołkowej, dbając o to, aby każda EHT znajdowała się w centrum okna i była w ostrości. Upewnij się, że niebieskie krzyżyki znajdują się na górnym i dolnym końcu EHT i poruszają się zgodnie ze skurczami EHT.

Następnie należy nacisnąć przycisk „Position OK”, aby zapisać ustawione pozycje dla każdej studni. Teraz kliknij zakładkę „Parameters”, aby zdefiniować kryteria, według których oprogramowanie identyfikuje szczyt skurczu, zaznaczając szczyty zielonymi kwadratami. Zapisz wszystkie wprowadzone ustawienia, naciskając przycisk „Use parameters on all wells”.

Następnie kliknij kartę automatyczną i przycisk start, aby zarejestrować skurcze bazowe EHT oraz obliczyć spontaniczną kurczliwość bazową dla każdego EHT. Analiza skurczów na żywo zostanie wyświetlona w karcie czasu rzeczywistego. Upewnij się, że niebieskie krzyżyki poruszają się wyłącznie w pionie, odpowiadając skurczom EHT.

Aby przeanalizować wpływ konkretnego badanego leku na skurcze, należy najpierw przenieść pod sterylną dygestorię płytkę 24-dołkową wypełnioną roztworem tarczycy wolnym od białek i umieścić elektrody węglowe w dołkach. Następnie przenieść EHT w ich stojakach PDMS na elektrody i zwrócić EHT do inkubatora. Po około pół godzinie umieścić EHT w zamku instrumentu do analizy EHT i zarejestrować spontaniczną kurczliwość bazową przez 20 sekund dla każdego EHT.

Następnie podłącz elektrody węglowe do kabla stymulującego i rozpocznij elektryczną stymulację EHT. Zarejestruj linię bazową w rytmie stymulowanym przez 10 sekund dla każdego EHT, upewniając się, że wszystkie EHT są odpowiednio stymulowane. Sygnał stymulacji jest teraz oznaczony niebieskimi pionowymi liniami, włączonymi do wykresu skurczów przed każdym pikiem.

Po zarejestrowaniu pomiarów bazowych przenieś elektrody i statiwy z PDMS do nowej płytki 24-dołkowej zawierającej pierwsze stężenie leku i natychmiast umieść EHT z powrotem w komorze urządzenia do analizy EHT w celu inkubacji przez 20 minut. Podłącz ponownie kable stymulujące, dostosuj rozpoznawanie kształtów i zarejestruj skurcze EHT w odpowiedzi na pierwsze stężenie leku. Po przetestowaniu wszystkich stężeń leku zapisz wszystkie wynikowe nagrania w formacie PDF i sprawdź każde z nich pod kątem rozpoznawania kształtów oraz prawidłowego rozmieszczenia kwadratów szczytów skurczów i artefaktów.

W celu przeprowadzenia analizy offline, należy wybrać odpowiedni pomiar z bazy danych pomiarów, a następnie w karcie parametrów zmienić parametr dla analizy skurczu. Następnie w karcie offline należy wybrać analizę offline, aby ponownie przeanalizować filmy. Służy to również do dostosowania rozpoznawania postaci oraz nagrania nowego pliku wideo.

Dostosuj rozpoznawanie obrazów w karcie czasu rzeczywistego i wybierz przegląd próbki. EHT zostanie teraz przeanalizowany zgodnie z nowymi pozycjami. Analiza każdego EHT opiera się na rozpoznawaniu obrazów w górnej i dolnej części tkanki.

Nagrane skurcze EHT są następnie analizowane automatycznie przez algorytm oprogramowania instrumentu do analizy EHT, a piki są wyznaczane zgodnie z odpowiednimi, zdefiniowanymi wcześniej kryteriami. Długoterminowy pomiar analizy skurczów EHT wykazuje brak wyraźnych zmian zależnych od czasu w sile skurczu, częstotliwości bicia, czasie skurczu T1 lub czasie relaksacji T2 przez okres do 20 godzin. Wskazuje to na wysoki poziom stabilności konstruktów.

W rzeczywistości wyniki dla każdego sygnału EHT są powtarzalne przy niskiej zmienności. Narażenie na bloker kanału hERG skutkuje jednak znacznym wydłużeniem czasu relaksacji T2, zaczynając od tej koncentracji, a przy wyższych stężeniach występuje nieregularny rytm skurczów.

Po opanowaniu metody, w ciągu 30 minut można wygenerować 24 EHT, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia przygotowania. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie modelowania chorób do badania wpływu wariantów genetycznych in vitro. Wszechstronność tego modelu pozwala na jego łączenie z ludzkimi indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi lub technologią edycji genomu.

Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać dodatkowe metody, takie jak histologia lub analiza RNA i białek, aby odpowiedzieć na kolejne pytania dotyczące transkrypcji i ekspresji genów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć jasne pojęcie o tym, jak odlewać i analizować EHT. W przypadku jakichkolwiek pytań dotyczących tej procedury prosimy o bezpośredni kontakt z nami.