Zautomatyzowana analiza skurczów ludzkiej zmodyfikowanej tkanki serca do badań przesiewowych bezpieczeństwa leków sercowych

Ogólnym celem tej techniki jest wygenerowanie trójwymiarowej zmodyfikowanej tkanki serca, która może być wykorzystana jako platforma analizy skurczów in vitro do badań przesiewowych leków i modelowania chorób. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie serca dotyczące modelowania chorób, farmakologii bezpieczeństwa i wpływu wariantów genów lub leków na siłę skurczu. Główną zaletą tej techniki jest to, że siła skurczu może być mierzona w zmodyfikowanych tkankach serca różnych gatunków w sterylnych warunkach, przez dłuższy czas.

Naukowcy, którzy dopiero zaczynają przygodę z tą metodą, mogą zmagać się z brakiem jakości komórek. Albo brak w medium. Ważne jest, aby zoptymalizować samoprzygotowanie i unikać cykli Demonstrując tę procedurę będą Anika Benzin i Umber Saleem.

Przed rozpoczęciem procedury dodaj 1,6 mililitra ciepłej dwuprocentowej agarozy do dołków pierwszej pomocy na 24-dołkowej płytce. I natychmiast umieść politetrafluoroetylen w przekładkach w agarozie. Po około 10 minutach w temperaturze pokojowej agaroza stanie się nieprzezroczysta, co oznacza jej zestalenie.

Usuń przekładki i umieść stojaki PDMS w odlewach tak, aby pary słupków stojaka sięgały do każdej formy agarozowej. Po umieszczeniu wszystkich stojaków zawieszamy kardiomiocyty w pożywce o minimalnym stężeniu 1,5 razy 10 do siedmiu komórek na mililitr i świeżo przygotowane rozpuszczenie mieszamy z fibrynogenem 10 do 15 razy za pomocą pipety serologicznej, aż skrzep fibrynogenu zostanie rozpuszczony. Sprawdzić, czy mieszanina do rozpuszczenia w pipecie jest jednorodna.

Następnie dla każdej zmodyfikowanej tkanki serca lub EHT wymieszaj 100 mikrolitrów mieszanki do rozpuszczenia z trzema mikrolitrami trombiny w probówce o pojemności 200 mikrolitrów. I natychmiast podajcie 100 mikrolitrów tej mieszaniny trombiny EHT do szczelin agarozy. Użyj nowej końcówki filtra dla każdego EHT.

Gdy wszystkie szczeliny zostaną wypełnione mieszanką do rekonstytucji, zamknij pokrywę naczynia do hodowli komórkowych i inkubuj preparaty przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i siedmioprocentowej zawartości dwutlenku węgla. Pod koniec inkubacji umieścić płytkę w sterylnym kapturze i przykryć każdą studzienkę 200 do 500 mikrolitrami pożywki. Delikatnie wstrząsnąć płytką i umieścić EHT z powrotem w inkubatorze.

Po 10 minutach ostrożnie przenieść stojaki na nową 24-dołkową płytkę zawierającą 1,5 mililitra pożywki EHT na studzienkę i umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w odpowiednich warunkach hodowli. Podawanie EHT w każdy poniedziałek, środę i piątek, poprzez przeniesienie stojaków PDMS na drugą płytę ze świeżą pożywką. Siedem do 10 dni po odlaniu EHT powinny wykazywać spontaniczne skurcze odchylające słupki stojaków PDMS.

Aby przeanalizować skurcze EHT, w dniu eksperymentu należy włączyć urządzenie grzewcze w przyrządzie do analizy EHT na dwie godziny przed pomiarem. Bezpośrednio przed analizą należy włączyć zasilanie gazem i elektroniką układu osi. W celu rejestracji linii bazowej należy umieścić płytkę EHT w przyrządzie do analizy EHT i uruchomić oprogramowanie do analizy skurczu zgodnie z instrukcjami producenta.

Korzystając z instrukcji zawartych w instrukcji obsługi oprogramowania, aby rozpocząć nowy przebieg, kliknij kartę protokołu, aby wprowadzić odpowiednie informacje o badaniu. Otwórz zakładkę konfiguracji i wybierz studnie do analizy. Ze względu na ograniczenia czasowe jest to pokazane tylko dla dwóch EHT w tym filmie.

Następnie kliknij kartę widoku kamery i uruchom tryb kamery na żywo z trybem automatycznego wykrywania postaci. Dostosuj pozycję kamery za pomocą współrzędnych xyz dla każdego wybranego dołka w czaszy 24-dołkowej, uważając, aby każdy EHT znajdował się w środku okna i był ostry. Upewnij się, że niebieskie krzyżyki znajdują się na górnym i dolnym końcu EHT i przesuwają się, aby dopasować się do skurczów EHT.

I naciśnij przycisk pozycji w porządku, aby zapisać ustawione pozycje każdej studni. Teraz kliknij kartę parametrów, aby zdefiniować kryteria, na podstawie których oprogramowanie identyfikuje pik skurczu, oznaczając piki zielonymi kwadratami. Zapisz wszystkie wprowadzone ustawienia, naciskając przycisk Użyj parametrów we wszystkich studniach.

Następnie kliknij zakładkę automatyczną i przycisk Start, aby zarejestrować wyjściowe skurcze EHT i obliczyć spontaniczną kurczliwość wyjściową dla każdego EHT. Analiza skurczów na żywo zostanie wyświetlona w zakładce czasu rzeczywistego. Upewnij się, że niebieskie krzyżyki poruszają się tylko pionowo, aby dopasować się do skurczów EHT.

Aby przeanalizować wpływ określonego leku na skurcze, najpierw przenieś 24-dołkową płytkę wypełnioną bezbiałkowym roztworem tarczycy pod sterylny kaptur i umieść elektrody węglowe w studzienkach. Przenieś EHT w stojakach PDMS na elektrody i włóż EHT z powrotem do inkubatora. Po około pół godzinie umieść EHT w blokadzie przyrządu do analizy EHT i rejestruj spontaniczną kurczliwość wyjściową przez 20 sekund na EHT.

Następnie podłącz elektrody węglowe do stymulacyjnego i rozpocznij elektryczną stymulację EHT. Zapisuj tempo wyjściowe przez 10 sekund na EHT, upewniając się, że wszystkie EHT są w odpowiednim tempie. Sygnał stymulacji jest teraz oznaczony niebieskimi pionowymi liniami, zawartymi w przeszczepie skurczu przed każdym szczytem.

Po zapisie linii podstawowej przenieść elektrody i stojaki PDMS na nową 24-dołkową płytkę zawierającą pierwsze stężenie leku i natychmiast zwrócić EHT do blokady przyrządu do analizy EHT na 20-minutową inkubację. Podłącz ponownie stymulacyjne, dostosuj rozpoznawanie figur i zarejestruj skurcze EHT w odpowiedzi na pierwsze stężenie leku. Po przetestowaniu wszystkich stężeń leku, zapisz wszystkie wynikowe nagrania PDF i sprawdź każde nagranie pod kątem rozpoznania figury i prawidłowego położenia kwadratów pików skurczu i artefaktów.

W przypadku analizy w trybie offline kliknij opcję wybierz uruchom dla odpowiedniego przebiegu z bazy danych przebiegów i w zakładce parametrów zmień parametr analizy skurczu. Następnie na karcie offline wybierz analizę offline, aby ponownie przeanalizować filmy. Aby dostosować rozpoznawanie figur i nagrać nowy plik wideo.

Dostosuj rozpoznawanie figur w zakładce czasu rzeczywistego i wybierz przykładowy przegląd. EHT będzie teraz analizowany zgodnie z nowymi pozycjami. Analiza każdego EHT opiera się na rozpoznawaniu figur na górnym i dolnym końcu tkanki.

Sfilmowane skurcze EHT są następnie automatycznie analizowane przez algorytm oprogramowania przyrządu do analizy EHT, a piki są określane zgodnie z odpowiednimi, predefiniowanymi kryteriami. Długoterminowy pomiar analizy skurczu EHT pokazuje, że nie ma widocznych zależnych od czasu zmian siły skurczu, częstotliwości uderzeń, skurczu T1 lub czasów relaksacji T2 przez okres do 20 godzin. Wskazuje to na wysoki poziom stabilności konstrukcji.

Rzeczywiście, wyniki dla każdego sygnału EHT są możliwe do odtworzenia z niewielką zmiennością. Ekspozycja na bloker kanału hERG powoduje jednak znaczne wydłużenie czasu relaksacji T2, począwszy od stężenia. I nieregularny wzór dudnienia przy wyższych stężeniach.

Po opanowaniu, 24 EHT mogą zostać wygenerowane w ciągu 30 minut, jeśli preparat zostanie wykonany prawidłowo. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się modelowaniem chorób do zbadania wpływu wariantów genów in vitro. Wszechstronność tego modelu pozwala na połączenie go z ludzkimi komórkami macierzystymi lub technologią edycji genomu.

Po tej procedurze można zastosować dodatkowe metody, takie jak histologia lub analiza RNA i białek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące transkrypcji i ekspresji genów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobry pomysł, jak rzucać i analizować EHT. Jeśli masz jakiekolwiek pytania dotyczące tej procedury, nie wahaj się i skontaktuj się z nami bezpośrednio.