Name: Zautomatyzowana analiza skurczów ludzkiej zmodyfikowanej tkanki serca do badań przesiewowych bezpieczeństwa leków sercowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Poznaj metodę automatycznej analizy skurczów inżynieryjnej tkanki serca z hiPSC do badań przesiewowych bezpieczeństwa leków. Technika umożliwia pomiar siły skurczowej i ocenę wpływu substancji farmakologicznych na funkcję serca in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni Alessandrze Moretti i Dennisowi Schade za ich uprzejmy wkład w materiał. Dziękujemy za ogromne wsparcie grupy roboczej ds. iPS i EHT w Zakładzie Farmakologii Doświadczalnej i Toksykologii UKE. Prace autorów są wspierane przez granty DZHK (Niemieckie Centrum Badań nad Układem Sercowo-Naczyniowym) oraz niemieckiego Ministerstwa Edukacji i Badań Naukowych (BMBF), Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG Es 88/12-1, HA 3423/5-1), Brytyjskiego Narodowego Centrum Udoskonalania i Redukcji Zwierząt w Badaniach (NC3Rs CRACK-IT grant 35911-259146), British Heart Foundation RM/13/30157, Europejska Rada ds. Badań Naukowych (Advanced Grant IndivuHeart), Niemiecka Fundacja Kardiologiczna oraz Freie und Hansestadt Hamburg.

<ol><li>Laverty, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+can+we+improve+our+understanding+of+cardiovascular+safety+liabilities+to+develop+safer+medicines%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines?</a> Br J Pharmacol. 163 (4), 675-693 (2011).</li>
<li>Guidance for Industry S7B Nonclinical Evaluation of the Potential for Delayed Ventricular Repolarization (QT Interval Prolongation) by Human Pharmaceuticals. , U.S. Department of Health and Human Services
Food and Drug Administration. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm074963.pdf">http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm074963.pdf</a> (2005).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Burridge, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Kempf, H., Kropp, C., Olmer, R., Martin, U., Zweigerdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+scalable+suspension+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture.</a> Nat Protoc. 10 (9), 1345-1361 (2015).</li>
<li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+adolescence%3A+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).</li>
<li>Mannhardt, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Engineered+Heart+Tissue%3A+Analysis+of+Contractile+Force%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human Engineered Heart Tissue: Analysis of Contractile Force.</a> Stem Cell Reports. 7 (1), 29-42 (2016).</li>
<li>Eder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+proarrhythmic+drugs+on+relaxation+time+and+beating+pattern+in+rat+engineered+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Bas+Res+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Effects of proarrhythmic drugs on relaxation time and beating pattern in rat engineered heart tissue.</a> Bas Res Cardiol. 109 (6), 436(2014).</li>
<li>Stöhr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+abnormalities+and+altered+drug+response+in+engineered+heart+tissue+from+Mybpc3-targeted+knock-in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Contractile abnormalities and altered drug response in engineered heart tissue from Mybpc3-targeted knock-in mice.</a> J Mol Cell Cardiol. 63, 189-198 (2013).</li>
<li>Schaaf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Engineered+Heart+Tissue+as+a+Versatile+Tool+in+Basic+Research+and+Preclinical+Toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human Engineered Heart Tissue as a Versatile Tool in Basic Research and Preclinical Toxicology.</a> PLoS One. 6 (10), e26397(2011).</li>
<li>Hansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+drug+screening+platform+based+on+engineered+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue.</a> Circ Res. 107 (1), 35-44 (2010).</li>
<li>Frank, S., Zhang, M., Schöler, H. R., Greber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule-assisted%2C+line-independent+maintenance+of+human+pluripotent+stem+cells+in+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Small molecule-assisted, line-independent maintenance of human pluripotent stem cells in defined conditions.</a> PloS One. 7 (7), e41958(2012).</li>
<li>Lanier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+inhibition+correlates+with+human+embryonic+stem+cell+cardiomyogenesis%3A+A+structure-activity+relationship+study+based+on+inhibitors+for+the+Wnt+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Wnt inhibition correlates with human embryonic stem cell cardiomyogenesis: A structure-activity relationship study based on inhibitors for the Wnt response.</a> J Med Chem. 55 (2), 697-708 (2012).</li>
<li>Hirt, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+afterload+induces+pathological+cardiac+hypertrophy%3A+a+new+in+vitro+model%5BTitle%5D)+AND+%22Bas+Res+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model.</a> Bas Res Cardiol. 107 (6), 307-323 (2012).</li>
<li>Jacob, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Tyrosine+Kinase+Inhibitor-Mediated+Decline+in+Contractile+Force+in+Rat+Engineered+Heart+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of Tyrosine Kinase Inhibitor-Mediated Decline in Contractile Force in Rat Engineered Heart Tissue.</a> PLoS One. 11 (2), e0145937(2016).</li>
<li>Friedrich, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+FHL1+as+a+novel+disease+gene+for+isolated+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Evidence for FHL1 as a novel disease gene for isolated hypertrophic cardiomyopathy.</a> Hum Mol Genet. 21 (14), 3237-3254 (2012).</li>
<li>Crocini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+ANKRD1+mutations+associated+with+hypertrophic+cardiomyopathy+on+contraction+parameters+of+engineered+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Bas+Res+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Impact of ANKRD1 mutations associated with hypertrophic cardiomyopathy on contraction parameters of engineered heart tissue.</a> Bas Res Cardiol. 108 (3), 349(2013).</li>
<li>Fiedler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Long+Noncoding+RNA-Based+Strategies+to+Modulate+Tissue+Vascularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Development of Long Noncoding RNA-Based Strategies to Modulate Tissue Vascularization.</a> J Am Coll Cardiol. 66 (18), 2005-2015 (2015).</li>
<li>van Meer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+absorption+by+PDMS+in+the+context+of+drug+response+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophysl+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays.</a> Biochem Biophysl Res Commun. , (2016).</li>
<li>Godier-Furnémont, A. F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiologic+force-frequency+response+in+engineered+heart+muscle+by+electromechanical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation.</a> Biomaterials. 60, 82-91 (2015).</li>
<li>Eng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+beating+rate+adaptation+in+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nat Commun. 7, 10312(2016).</li>
<li>Huebsch, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+iPS-Cell-Derived+Cardiac+Muscles+for+Physiologically+Relevant+Drug+Response+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Miniaturized iPS-Cell-Derived Cardiac Muscles for Physiologically Relevant Drug Response Analyses.</a> Sci Rep. 6 (24726), 1-12 (2016).</li>
<li>Masumoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myocardial+regenerative+potential+of+three-dimensional+engineered+cardiac+tissues+composed+of+multiple+human+iPS+cell-derived+cardiovascular+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages.</a> Sci Rep. 6 (29933), 1-10 (2016).</li>
<li>Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Non-myocyte+Cells+Show+Enhanced+Pharmacological+Function+Suggestive+of+Contractile+Maturity+in+Stem+Cell+Derived+Cardiomyocyte+Microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Cardiac Non-myocyte Cells Show Enhanced Pharmacological Function Suggestive of Contractile Maturity in Stem Cell Derived Cardiomyocyte Microtissues.</a> Toxicol Sci. 152 (1), 99-112 (2016).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenbutg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Vandenburgh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durg-screening+platform+based+on+the+contractility+of+tissue-engineered+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Durg-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle.</a> Muscle Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).</li>
<li>EHT Technologies GmbH. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.eht-technologies.com">http://www.eht-technologies.com</a> Forthcoming.</li>
</ol>

I.M., T.E. i A.H. są współzałożycielami EHT Technologies GmbH z siedzibą w Niemczech.

Zmodyfikowana tkanka serca stanowi cenną opcję w zestawie narzędzi do badań sercowo-naczyniowych. EHT w formacie 24-dołkowym okazały się cenne w modelowaniu choroby 8,14, badaniach przesiewowych bezpieczeństwa leków 7,8,10,11,15 lub podstawowych badaniach sercowo-naczyniowych 16,17<sup class...

Skutki uboczne związane z sercem, takie jak zespół wydłużonego odstępu QT wywołany przez leki, doprowadziły do wycofania produktów z rynku w ciągu ostatnich lat. Statystyki wskazują, że około 45% wszystkich wypłat jest spowodowanych niepożądanym wpływem na układ sercowo-naczyniowy1. Niepowodzenie leku po kosztownym procesie rozwoju i zatwierdzenia jest najgorszym scenariuszem dla firm farmaceutycznych. Działy badawczo-rozwojowe koncentrują się zatem na wczesnym wykrywaniu takich niepożądanych skutków sercowo-naczyniowych. Ze względów ekonomicznych i etycznych trwają wysiłki na rzecz ograniczenia doświadczeń na zwierzętach i zastąpienia ich nowymi testami przesiewowymi in vitro.
Zestaw uznanych testów znajduje się w wytycznych Amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (FDA) oraz Europejskiej Agencji Leków (EMA) dotyczących przedklinicznej oceny efektów leków proarytmicznych2. Technologia przeprogramowania komórek somatycznych, a następnie różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) przyczyniła się do rozwoju tej dziedziny badań3. Obecnie oferuje możliwość badań przesiewowych nowych kandydatów na leki na ludzkich kardiomiocytach in vitro i pozwala uniknąć problemów z różnicami międzygatunkowymi. Najnowsze protokoły różnicowania serca4,5 zapewniają nieograniczoną podaż kardiomiocytów bez obaw etycznych. Jednak pomiar siły skurczu, najważniejszego i najlepiej scharakteryzowanego parametru kardiomiocytów in vivo, nie jest dobrze ustalony. Jest to związane ze względną niedojrzałością6 ludzkich indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-CM) w porównaniu z dorosłymi kardiomiocytami. Możliwym postępem jest inżynieria trójwymiarowej tkanki serca z pojedynczych komórek7 (engineered heart tissue, EHT). Protokół EHT opiera się na osadzaniu pojedynczych mysich lub ludzkich kardiomiocytów8,9,10 w hydrożelu fibrynowym między dwoma elastycznymi postami z polidimetylosiloksanu (PDMS)11 w formacie 24-dołkowym. W ciągu kilku dni kardiomiocyty zaczynają samoistnie kurczyć się jako pojedyncze komórki i zaczynają tworzyć sieci komórkowe. Po 7-10 dniach widoczne są makroskopowe skurcze całej tkanki. Podczas tego procesu macierz zewnątrzkomórkowa ulega przebudowie, co prowadzi do zmniejszenia średnicy i długości. Skrócenie EHT powoduje wygięcie słupka PDMS nawet podczas spoczynku, poddając kardiomiocyty w rozwijającym się EHT ciągłemu obciążeniu. EHT kontynuują auksotoniczne skurcze mięśni przez kilka tygodni. Ludzkie EHT wykazują reakcje na stymulację fizjologiczną i farmakologiczną, co wskazuje na ich przydatność do badań przesiewowych leków i modelowania chorób7.
W tym manuskrypcie prezentujemy solidny i łatwy protokół do generowania ludzkiego EHT oraz automatyczną analizę kurczliwości zależnych od stężenia zmian wzorca skurczu w obecności inhibitorów kanału hERG.

<table><tbody><tr><td>Urządzenie do analizy</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>A0001</td><td>Oprogramowanie jest dołączone</td></tr><tr><td>Stojak EHT PDMS</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>C0001</td><td></td></tr><tr><td>Przekładka EHT PTFE</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>C0002</td><td></td></tr><tr><td>Elektroda EHT</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>P0001</td><td></td></tr><tr><td>Adapter/stymulacyjny EHT</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>P0002</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Nunc</td><td>144530</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do hodowli komórek 6-dołkowych</td><td>Nunc</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówka sokoła, z podziałką&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62,554,502</td><td></td></tr><tr><td>Skrobak do komórek</td><td>Sarstedt</td><td>831,830</td><td></td></tr><tr><td>Kolba</td><td>obrotowa Integra</td><td>182 101</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło Variomag/ Cimarec Biosystem Direct&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>70101</td><td>Ustaw prędkość wirnika na 40 obr./min</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych T175&nbsp;</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>831,812,002</td><td></td></tr><tr><td>Stojak sedymentacyjny w kształcie litery V&nbsp;</td><td>Szyte na zamówienie w UKE Hamburg</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>10&times; DMEM</td><td>Gibco</td><td>52100</td><td></td></tr><tr><td>1-tioglicerol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Sól trisodowa kwasu 2-fosfo-L-askorbinowego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49752</td><td></td></tr><tr><td>Activin-A&nbsp;</td><td>R& Systemy D</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15510-019</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad injectabilia</td><td>Baxter GmbH</td><td>1428</td><td></td></tr><tr><td>B27 PLUS insulina&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>R& Systemy D</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza II&nbsp;</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DMEM Biochrom</td><td>F0415</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>DNaza II, typ V (ze śledziony bydlęcej)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D8764</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphina&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab120843</td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-921</td><td></td></tr><tr><td>Fibrynogen (bydlęcy)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A1413302</td><td>Do powlekania: 1:200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>HBSS bez Ca2+/Mg2+&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14175-053</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Roth</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>Surowica końska</td><td>Technologie życia</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy ludzkiej&nbsp;</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>05-720-1B</td><td></td></tr><tr><td>Insulina, ludzka</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Lipidmix&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5146</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Do rekonstrukcji EHT.</td></tr><tr><td>N-Benzyl-p-Toluenesulfonamid</td><td>TCI</td><td>B3082-25G</td><td></td></tr><tr><td>PBS w/o MgCl2/CaCl2</td><td>Biochrom</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol poliwinylowy&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>Selenin sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>TGF&szlig; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>Trombin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7513</td><td></td></tr><tr><td>Transferyna&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Biorbyt</td><td>orb6014</td><td></td></tr><tr><td>hiPSC</td><td>Wykonane na zamówienie w UKE hamburg</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>zestaw kardiomiocytów iCell</td><td>Cellular Dynamics International</td><td>CMC-100-010-001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw kardiomiocytów Pluricyte</td><td>Pluriomics</td><td>PCK-1.5</td><td></td></tr><tr><td>Cor.4U - zestaw kardiomiocytów HiPSC</td><td>Axiogenesis AG</td><td>Ax-C-HC02-FR3</td><td></td></tr><tr><td>Kardiomiocyty Cellartis</td><td>Takara Bio USA, Inc.</td><td>Y10075</td><td></td></tr></tbody></table> powiedział:

zautomatyzowana analiza skurczów ludzkiej zmodyfikowanej tkanki serca do badań przesiewowych bezpieczeństwa leków sercowych

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Inżynieria tkanek serca opisuje techniki tworzenia trójwymiarowych tkanek generujących siłę. Dla wdrożenia tych procedur w badaniach podstawowych i przedklinicznym opracowywaniu leków ważne jest opracowanie protokołów automatycznego generowania i analizy w znormalizowanych warunkach. W tym miejscu przedstawiamy technikę generowania zmodyfikowanej tkanki serca (EHT) z kardiomiocytów różnych gatunków (szczur, mysz, człowiek). Technika ta polega na złożeniu fibryny-żelu zawierającego zdysocjowane kardiomiocyty między elastycznymi słupkami polidimetylosiloksanu (PDMS) w formacie 24-dołkowym. Trójwymiarowe, generujące siłę EHT powstają w ciągu dwóch tygodni po odlewaniu. Procedura ta pozwala na wytwarzanie kilkuset EHT tygodniowo i jest technicznie ograniczona jedynie dostępnością kardiomiocytów (0,4-1,0 x 106/EHT). Ocena skurczów mięśni auksotonicznych odbywa się w zmodyfikowanej komorze inkubacyjnej z blokadą mechaniczną dla płytek 24-dołkowych i kamerą umieszczoną na górze tej komory. Oprogramowanie steruje kamerą przemieszczoną w układzie osi XYZ do każdego EHT. Skurcze EHT są wykrywane przez algorytm automatycznego rozpoznawania figur, a siła jest obliczana na podstawie skrócenia EHT oraz skłonności do sprężystości i geometrii słupków PDMS. Procedura ta pozwala na automatyczną analizę dużej liczby EHT w znormalizowanych i sterylnych warunkach. Wiarygodne wykrywanie wpływu leku na skurcz kardiomiocytów ma kluczowe znaczenie dla opracowywania leków sercowych i farmakologii bezpieczeństwa. Pokazujemy, na przykładzie inhibitora kanału hERG E-4031, że ludzki układ EHT replikuje odpowiedzi leków na kinetykę skurczu ludzkiego serca, co wskazuje, że jest to obiecujące narzędzie do badań przesiewowych bezpieczeństwa leków sercowych.

Różnicowanie kardiologiczne i przygotowanie EHT
Komórki HiPSC namnażano na macierzy błony podstawnej z obniżoną zawartością czynników wzrostu, dysocjowano za pomocą EDTA, a następnie w kolbach z mieszadłem (spinner flasks) formowano ciała embrionalne (EB) przez noc. Po trzydniowej indukcji mezodermalnej rozpoczęto różnicowanie w kierunku kardiomiocytów przy użyciu inhibitora Wnt. Po około 17 dniach protokołu różnicowania bijące cia...

Tutaj pokazujemy generowanie ludzkiej tkanki serca z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) pochodzących z kardiomiocytów. Przedstawiono metodę analizy siły skurczu oraz przykładową zmianę wzorca skurczu przez inhibitor kanału hERG E-4031. Metoda ta wykazuje wysoki poziom odporności i przydatności do badań przesiewowych leków sercowych.

Zautomatyzowana analiza skurczów ludzkiej zmodyfikowanej tkanki serca do badań przesiewowych bezpieczeństwa leków sercowych

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Ogólnym celem tej techniki jest wytworzenie trójwymiarowej inżynieryjnej tkanki serca, która może służyć jako platforma do analizy skurczów in vitro w badaniach przesiewowych leków oraz modelowaniu chorób. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie kardiologii dotyczące modelowania chorób, farmakologii bezpieczeństwa oraz wpływu wariantów genetycznych lub leków na siłę skurczu. Główną zaletą tej techniki jest możliwość pomiaru siły skurczu w inżynieryjnych tkankach serca różnych gatunków w warunkach sterylnych przez dłuższy czas.Naukowcy rozpoczynający pracę z tą metodą mogą napotkać trudności związane z niską jakością komórek lub brakiem składnika w pożywce. Ważne jest, aby zoptymalizować przygotowanie próbki i unikać cykli. Procedurę tę zaprezentują Anika Benzin oraz Umber Saleem.Przed rozpoczęciem procedury należy wlać 1,6 ml ciepłego, dwupocentnego agarozy do pierwszych studni płytki 24-dołkowej. Następnie należy niezwłocznie umieścić w agarozie dystansory z politetrafluoroetylenu. Po około 10 minutach w temperaturze pokojowej agaroza stanie się mętna, co będzie oznaczało jej zestalenie.Usuń przekładki i umieść statywy PDMS w odlewach w taki sposób, aby pary słupków statywu wchodziły do każdej formy agarozowej. Po umieszczeniu wszystkich statywów zawieszamy kardiomiocyty w pożywce o minimalnym stężeniu 1,5 × 10⁷ komórek/ml oraz świeżo przygotowanej mieszaninie do rekonstytucji z fibrynogenem, mieszając 10–15 razy pipetą serologiczną, aż skrzep fibrynogenu zostanie rozpuszczony. Sprawdź homogeniczność mieszaniny do rekonstytucji w pipecie.Następnie dla każdej sztucznie wyhodowanej tkanki serca (engineered heart tissue, EHT) zmieszaj 100 µl mieszaniny do rekonstytucji z 3 µl trombiny w probówce o pojemności 200 µl. Bezzwłocznie nanieś 100 µl tej mieszaniny EHT z trombiną do otworów w agarozie. Do każdej tkanki EHT użyj nowej końcówki z filtrem.Po wypełnieniu wszystkich otworów mieszaniną do rekonstytucji, zamknij pokrywę naczynia do hodowli komórkowej i inkubuj preparaty przez dwie godziny w temperaturze 37 °C i siedmioprocentowym stężeniu dwutlenku węgla. Po zakończeniu inkubacji umieść płytkę w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza i pokryj każdą studzienkę od 200 do 500 µL pożywki. Delikatnie potrząśnij płytką i przenieś EHT z powrotem do inkubatora.Po 10 minutach ostrożnie przenieś stelaże do nowej płytki 24-dołkowej zawierającej 1,5 milliliters medium EHT na dołek i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórek w odpowiednich warunkach hodowlanych. Dokarmiaj EHT w każdy poniedziałek, środę i piątek, przenosząc stelaże PDMS do drugiej płytki ze świeżym medium. Od siedmiu do dziesięciu dni po odlewie EHT powinny wykazywać spontaniczne skurcze powodujące ugięcie słupków stelaży PDMS.Aby przeanalizować skurcze EHT, w dniu eksperymentu należy włączyć urządzenie grzewcze w aparacie do analizy EHT na dwie godziny przed pomiarem. Bezpośrednio przed analizą należy włączyć zasilanie gazowe i elektroniczne systemu osi. W celu rejestracji linii bazowej należy umieścić płytkę EHT w aparacie do analizy EHT i uruchomić oprogramowanie do analizy skurczów zgodnie z instrukcjami producenta.Kierując się instrukcjami z podręcznika oprogramowania w celu rozpoczęcia nowego pomiaru, kliknij kartę protokołu, aby wprowadzić odpowiednie informacje dotyczące badania. Otwórz kartę konfiguracji i wybierz studzienki do analizy. Ze względu na ograniczenia czasowe, w tym filmie zademonstrowano to jedynie dla dwóch EHT.Następnie kliknij zakładkę podglądu kamery i uruchom tryb transmisji na żywo z automatycznym trybem wykrywania obiektów. Dostosuj położenie kamery za pomocą współrzędnych xyz dla każdej wybranej studni w płytce 24-dołkowej, dbając o to, aby każda EHT znajdowała się w centrum okna i była w ostrości. Upewnij się, że niebieskie krzyżyki znajdują się na górnym i dolnym końcu EHT i poruszają się zgodnie ze skurczami EHT.Następnie należy nacisnąć przycisk „Position OK”, aby zapisać ustawione pozycje dla każdej studni. Teraz kliknij zakładkę „Parameters”, aby zdefiniować kryteria, według których oprogramowanie identyfikuje szczyt skurczu, zaznaczając szczyty zielonymi kwadratami. Zapisz wszystkie wprowadzone ustawienia, naciskając przycisk „Use parameters on all wells”.Następnie kliknij kartę automatyczną i przycisk start, aby zarejestrować skurcze bazowe EHT oraz obliczyć spontaniczną kurczliwość bazową dla każdego EHT. Analiza skurczów na żywo zostanie wyświetlona w karcie czasu rzeczywistego. Upewnij się, że niebieskie krzyżyki poruszają się wyłącznie w pionie, odpowiadając skurczom EHT.Aby przeanalizować wpływ konkretnego badanego leku na skurcze, należy najpierw przenieść pod sterylną dygestorię płytkę 24-dołkową wypełnioną roztworem tarczycy wolnym od białek i umieścić elektrody węglowe w dołkach. Następnie przenieść EHT w ich stojakach PDMS na elektrody i zwrócić EHT do inkubatora. Po około pół godzinie umieścić EHT w zamku instrumentu do analizy EHT i zarejestrować spontaniczną kurczliwość bazową przez 20 sekund dla każdego EHT.Następnie podłącz elektrody węglowe do kabla stymulującego i rozpocznij elektryczną stymulację EHT. Zarejestruj linię bazową w rytmie stymulowanym przez 10 sekund dla każdego EHT, upewniając się, że wszystkie EHT są odpowiednio stymulowane. Sygnał stymulacji jest teraz oznaczony niebieskimi pionowymi liniami, włączonymi do wykresu skurczów przed każdym pikiem.Po zarejestrowaniu pomiarów bazowych przenieś elektrody i statiwy z PDMS do nowej płytki 24-dołkowej zawierającej pierwsze stężenie leku i natychmiast umieść EHT z powrotem w komorze urządzenia do analizy EHT w celu inkubacji przez 20 minut. Podłącz ponownie kable stymulujące, dostosuj rozpoznawanie kształtów i zarejestruj skurcze EHT w odpowiedzi na pierwsze stężenie leku. Po przetestowaniu wszystkich stężeń leku zapisz wszystkie wynikowe nagrania w formacie PDF i sprawdź każde z nich pod kątem rozpoznawania kształtów oraz prawidłowego rozmieszczenia kwadratów szczytów skurczów i artefaktów.W celu przeprowadzenia analizy offline, należy wybrać odpowiedni pomiar z bazy danych pomiarów, a następnie w karcie parametrów zmienić parametr dla analizy skurczu. Następnie w karcie offline należy wybrać analizę offline, aby ponownie przeanalizować filmy. Służy to również do dostosowania rozpoznawania postaci oraz nagrania nowego pliku wideo.Dostosuj rozpoznawanie obrazów w karcie czasu rzeczywistego i wybierz przegląd próbki. EHT zostanie teraz przeanalizowany zgodnie z nowymi pozycjami. Analiza każdego EHT opiera się na rozpoznawaniu obrazów w górnej i dolnej części tkanki.Nagrane skurcze EHT są następnie analizowane automatycznie przez algorytm oprogramowania instrumentu do analizy EHT, a piki są wyznaczane zgodnie z odpowiednimi, zdefiniowanymi wcześniej kryteriami. Długoterminowy pomiar analizy skurczów EHT wykazuje brak wyraźnych zmian zależnych od czasu w sile skurczu, częstotliwości bicia, czasie skurczu T1 lub czasie relaksacji T2 przez okres do 20 godzin. Wskazuje to na wysoki poziom stabilności konstruktów.W rzeczywistości wyniki dla każdego sygnału EHT są powtarzalne przy niskiej zmienności. Narażenie na bloker kanału hERG skutkuje jednak znacznym wydłużeniem czasu relaksacji T2, zaczynając od tej koncentracji, a przy wyższych stężeniach występuje nieregularny rytm skurczów.Po opanowaniu metody, w ciągu 30 minut można wygenerować 24 EHT, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia przygotowania. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie modelowania chorób do badania wpływu wariantów genetycznych in vitro. Wszechstronność tego modelu pozwala na jego łączenie z ludzkimi indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi lub technologią edycji genomu.Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać dodatkowe metody, takie jak histologia lub analiza RNA i białek, aby odpowiedzieć na kolejne pytania dotyczące transkrypcji i ekspresji genów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć jasne pojęcie o tym, jak odlewać i analizować EHT. W przypadku jakichkolwiek pytań dotyczących tej procedury prosimy o bezpośredni kontakt z nami.

automated-contraction-analysis-human-engineered-heart-tissue-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten manuskrypt opisuje tworzenie zdefiniowanych tkanek serca za pomocą ekspresji markerów powierzchniowych i sortowania komórek. Zdefiniowane tkanki mogą być następnie wykorzystane w bioreaktorze wielotkankowym do zbadania mechanizmów terapii komórkami serca w celu zapewnienia funkcjonalnego, a jednocześnie kontrolowanego systemu modelowego ludzkiego serca.

Budowa zdefiniowanych tkanek serca zaprojektowanych przez człowieka w celu zbadania mechanizmów terapii komórkami serca

Spontanicznie kurczące się syncytia kardiomiocytów pochodzących z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych są użytecznymi modelami ludzkiej fizjologii serca i farmakologii. Poniżej przedstawiamy wysokoprzepustowy system przesiewowy do ilościowego określania wpływu związków egzogennych na częstotliwość dudnienia, przy użyciu barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na Ca i wielodołkowego czytnika płytek do obrazowania z kontrolowaną temperaturą.

Skurcze syncytii kardiomiocytów pochodzących z ludzkiego iPSC mierzone za pomocą barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na Ca na płytkach 384-dołkowych o kontrolowanej temperaturze

Tutaj opisujemy łatwą w użyciu metodologię generowania 3D samodzielnie składających się układów mikrotkanek serca składających się z wcześniej zróżnicowanych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, fibroblastów serca i komórek śródbłonka. Ta przyjazna dla użytkownika i wymagająca niewielkiej liczby komórek technika generowania mikrotkanek serca może zostać wdrożona do modelowania chorób i wczesnych etapów opracowywania leków.

Wytwarzanie matryc mikrotkanek serca 3D przy użyciu ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC, fibroblastów serca i komórek śródbłonka

Celem tego protokołu jest wyjaśnienie i zademonstrowanie rozwoju trójwymiarowego (3D) modelu mikroprzepływowego wysoce wyrównanej tkanki serca ludzkiego, składającej się z kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych hodowanych wspólnie z fibroblastami serca (CF) w biomimetycznym hydrożelu na bazie kolagenu, do zastosowań w inżynierii tkankowej serca, badaniach przesiewowych leków i modelowaniu chorób.

Opracowywanie zorganizowanej w 3D ludzkiej tkanki serca w ramach platformy mikroprzepływowej

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) okazały się obiecującym modelem in vitro do badań przesiewowych kardiotoksyczności indukowanej lekami i modelowania chorób. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół pomiaru kurczliwości i elektrofizjologii hiPSC-CM.

Techniczne zastosowania nagrań matrycy mikroelektrod i patch clamp na indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Analiza zmian w funkcji skurczowej i integralności komórkowej ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC ma ogromne znaczenie dla nieklinicznego rozwoju leków. Hybrydowy system analizy komórek z 96 dołkami analizuje oba parametry w czasie rzeczywistym i w sposób fizjologiczny, zapewniając wiarygodne wyniki istotne dla człowieka, niezbędne do bezpiecznego przejścia do etapów klinicznych.

Hybrydowy system analizy komórek do oceny zmian strukturalnych i kurczliwych ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC do przedklinicznej oceny ryzyka kardiologicznego

Trójwymiarowe tkanki serca bioinżynieryjne wykorzystujące kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych okazały się obiecującymi modelami do badania zdrowego i chorego ludzkiego mięśnia sercowego in vitro, jednocześnie podsumowując kluczowe aspekty rodzimej niszy sercowej. Manuskrypt ten opisuje protokół wytwarzania i analizy zmodyfikowanych tkanek serca o wysokiej zawartości wygenerowanych z ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Projektowanie bioreaktora w celu usprawnienia pozyskiwania danych i modelowania przepustowości zmodyfikowanych tkanek serca

Ten protokół opisuje, jak mierzyć kurczliwość u pierwotnych kardiomiocytów dorosłych ludzi z serc dawców za pomocą systemu MyoBLAZER, niezawodnej platformy do oceny zmian kurczliwości wywołanych lekiem podczas rozwoju przedklinicznego.

Pomiar kurczliwości serca w izolowanych kardiomiocytach pierwotnych u dorosłych ludzi

Ten protokół dostarcza metod generowania tkanek serca i mięśni szkieletowych w inżynierii 3D oraz opisuje ich zastosowanie w przedklinicznych badaniach przesiewowych leków. Opisane metody wykorzystują system detekcji magnetycznej, aby ułatwić jednoczesną ocenę 24 tkanek równolegle.

Przedkliniczne testy leków w skalowalnych tkankach mięśniowych modyfikowanych w 3D

Tutaj demonstrujemy nieinwazyjną metodę oceny kurczliwości kardiologicznych urządzeń medycznych przy użyciu monowarstw 2D indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z kardiomiocytów (hiPSC-CM), platerowanych na elastycznym podłożu, w połączeniu z mikroskopią opartą na wideo. Narzędzie to będzie przydatne do oceny in vitro właściwości skurczowych urządzeń do elektrofizjologii serca.

Ocena terapii modulacji kurczliwości serca w kardiomiocytach 2D pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

Przedstawiono powtarzalną metodę generowania 3D tkanek mięśnia sercowego, łączących rusztowania polikaprolaktonu (PCL) i hydrożele fibrynowe pochodzące z hiPSC. Technika ta zapewnia precyzyjną kontrolę nad architekturą rusztowania i może być stosowana w przedklinicznych testach leków i modelowaniu chorób serca.

Generowanie 3D ludzkiej tkanki mięśnia sercowego przy użyciu elektroprzędzenia stopionego zapisu rusztowań polikaprolaktonowych i komórek serca pochodzących z hiPSC

Poznaj metodę automatycznej analizy skurczów inżynieryjnej tkanki serca z hiPSC do badań przesiewowych bezpieczeństwa leków. Technika umożliwia pomiar siły skurczowej i ocenę wpływu substancji farmakologicznych na funkcję serca in vitro.

Zautomatyzowana analiza skurczów ludzkiej zmodyfikowanej tkanki serca do badań przesiewowych bezpieczeństwa leków sercowych

Przeglądaj więcej filmów