Name: Oczyszczanie genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z mączniaka prawdziwego do sekwencjonowania z długim odczytem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Poznaj metodę izolacji genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z mączniaka prawdziwego do sekwencjonowania z długim odczytem. Technika ta umożliwia badanie złożonych genomów grzybów patogennych roślin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten protokół został opracowany w celu wsparcia Joint Genome Institute-Community Sequencing Project (#1657). Prace były częściowo wspierane przez Fundację Philomathia, Narodową Fundację Nauki (#0929226) i Instytut Nauk Biologicznych Energii dla S. Somerville'a; oraz przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (#310030_163260) do B. Kellera. Chcielibyśmy podziękować naszym kolegom, M. Figureroa i M. Millerowi (University of Minnesota), R. Panstrudze (RWTH Aachen University), C. Pedersenowi (University of Copenhagen), P. Spanu (Imperial College), J. Taneja (University of California Berkeley), M. Wildermuth (University of California Berkeley), R. Wise (Iowa State University) i S. Xiao (University of Maryland) za ich hojne rady i za dobrowolne udostępnienie swoich protokołów, gdy opracowywaliśmy opisany tutaj protokół.

1. Przygotowanie materiału grzybowego
<ol>
	<li>Uprawa mączniaka prawdziwego
	<ol>
		<li>Uprawiaj rośliny w komorach wzrostowych o następujących warunkach: 22 °C temperatura w dzień, 20 °C w nocy, 80% wilgotności względnej, 14-godzinna długość dnia i natężenie światła 125 μE/m2/s (zapewniane przez oświetlenie fluorescencyjne).</li>
		<li>Zainfekuj rośliny ogórka (odmiana Cucumis sativa Bush Champion) szczepem Golovinomyces cichoracearum UCSC1 zgodnie z opisem18,29.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbiór konidiów mączniaka prawdziwego
	<ol>
		<li>Zebrać konidia z zainfekowanych roślin po 7 - 10 dniach od zaszczepienia, używając małego podciśnienia z wbudowanym filtrem (11 μm), na którym gromadzą się konidia. Delikatnie dociskając, przesuń dyszę próżniową wzdłuż powierzchni liścia, aby zebrać konidia. 
		UWAGA: Średni plon G. cichoracearum wynosi 20 mg konidiów z silnie porażonych liści ogórka o powierzchni około 130cm2.</li>
		<li>Wytrzyj około 150 mg konidiów (około 375 μl objętości lub konidiów z 7-8 zainfekowanych liści ogórka) z filtra na arkusz czystego papieru. Stąd przenieś konidia do kriowiali o pojemności 2 ml za pomocą dwóch wstępnie schłodzonych (w ciekłym azocie) stalowych kulach mielących o średnicy 5/32 cala. Natychmiast zwróć probówki do ciekłego azotu. Przechowywać probówki w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozbijanie konidiów przez mielenie kulowe
	<ol>
		<li>Błyskawiczne zamrażanie aluminiowych płyt młyna kulowego w ciekłym azocie. Załaduj kriowiale do stojaka młyna kulowego. Energicznie wstrząsać kriowiami z konidiami i stalowymi kulkami w młynie kulowym przez 30 s przy 30 cyklach/s (w temperaturze pokojowej). Natychmiast ponownie zamrozić kriowiale w ciekłym azocie. 
		UWAGA: Początkowo uzyskaj dostęp do próbki konidiów za pomocą mikroskopii w 100-krotnym powiększeniu, aby uzyskać skuteczność pękania ściany komórkowej podczas mielenia. W razie potrzeby miel przez dodatkowe 1 - 2 rundy po 30 s przez 30 cykli/s, ale ogranicz liczbę rund do minimum. Rutynowa ocena pęknięcia konidiów za pomocą mikroskopii na tym etapie nie jest konieczna, gdy zostaną ustalone optymalne warunki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Oczyszczanie genomowego DNA
<ol>
	<li>Konidia Liza
	<ol>
		<li>Pracując szybko, aby uniknąć rozmrożenia konidiów, usuń stalowe kulki z kriowiali za pomocą magnesu. Dodać 700 μl buforu do lizy o temperaturze 65 °C (Tabela 1) i wirować przez 5 - 10 s, aż powstanie zawiesina.</li>
		<li>Dodać 300 μl wstępnie podgrzanego (65 °C) 5% (v/v) sarkozylu i delikatnie odwrócić, aby wymieszać (1 inwersja na 3 s) pięć razy. Inkubować probówki przez 30 minut w temperaturze 65 °C; Odwróć delikatnie 3 razy po 10, 20 i 30 minutach. Za pomocą końcówki do pipet o szerokim otworze przenieś cały roztwór do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml. Na wszystkich kolejnych etapach należy mieszać przez delikatną, powolną inwersję i przenosić roztwory zawierające DNA za pomocą końcówek do pipet o szerokim otworze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja DNA I
	<ol>
		<li>Dodać 1 objętość chloroformu: alkoholu izoamylowego (24:1 v/v) do roztworu do lizy i delikatnie odwrócić, aby wymieszać pięć razy. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie odwracając, aby wymieszać pięć razy w połowie inkubacji i ponownie pod koniec inkubacji. Wirować w temperaturze pokojowej przez 15 minut przy 14 000 x g. Za pomocą końcówki do pipet o szerokim otworze ostrożnie przenieś warstwę wodną do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml; Unikaj dołączania materiałów z interfejsu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Strącanie DNA I
	<ol>
		<li>Dodaj 1 objętość 100% izopropanolu o temperaturze pokojowej (około 750 μl) i delikatnie odwróć, aby wymieszać sześć razy. Wirować w temperaturze pokojowej przez 15 minut przy 14 000 x g. Ostrożnie usunąć supernatant i wyrzucić.</li>
		<li>Dodać 450 μl wstępnie schłodzonego (-20 °C) 70% etanolu. Wirować przez 5 minut w temperaturze pokojowej przy 14 000 x g. Ostrożnie usunąć supernatant i wyrzucić. Wirować przy 1 000 x g przez 3 s, ostrożnie usunąć supernatant za pomocą drobnej końcówki pipety i wyrzucić. Suszyć granulat na powietrzu przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Nie suszyć dłużej niż 15 minut.</li>
		<li>Zawiesić osad w 300 μl TE (10 mM Tris-Cl, 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego, pH 8,0). Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Delikatnie strzepnąć w celu ponownego zawieszenia pozostałego materiału, który nie został wprowadzony do roztworu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby usunąć zanieczyszczenie RNA, dodaj 10 μl RNazy A (10 mg/ml). Delikatnie odwróć, aby wymieszać trzy razy. Wirować przy 1 000 x g przez 3 s. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.</li>
	<li>Ekstrakcja DNA II
	<ol>
		<li>Dodać 300 μl fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (25:24:1 v/v) i delikatnie odwrócić, aby wymieszać pięć razy. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie odwracając, aby wymieszać pięć razy w połowie inkubacji i ponownie pod koniec inkubacji. Wirować 15 minut w temperaturze pokojowej przy 14 000 x g. Za pomocą końcówki do pipet o szerokim otworze przenieś supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytrącanie DNA II
	<ol>
		<li>Dodać 0,01 objętości 3 M octanu sodu o pH 5,2 (około 3 μL), delikatnie odwrócić do pięciokrotnego mieszania. Dodać 2,5 objętości wstępnie schłodzonego (-20 °C) 100% etanolu (około 750 μL). Delikatnie odwróć, aby wymieszać pięć razy. Inkubować przez noc w temperaturze -20°C.</li>
		<li>Wirować przez 30 minut w temperaturze 4 °C przy 14 000 x g. Ostrożnie usunąć supernatant i wyrzucić.</li>
		<li>Dodać 450 μl wstępnie schłodzonego (-20 °C) 70% etanolu. Wirować przez 5 minut w temperaturze 4 °C przy 14 000 x g. Ostrożnie usunąć supernatant i wyrzucić. Wirować przy 1 000 x g przez 3 s. Ostrożnie usunąć sklarowany osad za pomocą cienkiej końcówki pipety i wyrzucić.</li>
		<li>Suszyć granulat na powietrzu przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić osad w 27,5 μl TE. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Delikatnie strzepnąć w celu ponownego zawieszenia pozostałego materiału, który nie został wprowadzony do roztworu.</li>
		<li>Podaniec 2,5 μL na 22,5 μL TE (końcowa objętość 25 μL) do testów kontroli jakości (patrz poniżej). Próbki DNA należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu przekazania ich do sekwencjonowania. W przypadku długotrwałego przechowywania próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C i zminimalizować cykle zamrażania i rozmrażania, aby zapobiec ścinaniu. 
		UWAGA: Na tym etapie pipetowania należy zachować ostrożność, ponieważ prawidłowe pipetowanie genomowego DNA o dużej masie cząsteczkowej może być trudne, dlatego ważne jest, aby upewnić się, że "QC Aliquot" jest dokładnym odwzorowaniem próbki genomowego DNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Kontrola jakości
<ol>
	<li>Czystość próbki
	<ol>
		<li>Korzystając z próby ślepej TE, ocenić czystość próbki DNA, ładując 1 μl podwielokrotności kontroli jakości do spektrofotometru o małej objętości. Rejestruj odczyty A260/A280 i A260/A230. Czyste DNA będzie miało stosunek A260/A280 wynoszący około 1,8, a stosunek A260/A230 między 1,8 a 2,2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja genomowego DNA
	<ol>
		<li>Przeprowadzić kwantyfikację podwielokrotności QC przy użyciu komercyjnego zestawu do oznaczania ilościowego dwuniciowego DNA zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena jakości DNA I
	<ol>
		<li>Załaduj około 60 ng genomowego DNA i drabinkę DNA na 0,7% żelu agarozowym w 1x TAE (40 mM Tris, 20 mM kwasu octowego i 1 mM EDTA, pH 8,0). Uruchomić aparat żelowy pod napięciem 70 V przez 40 - 45 minut, aż prążki genomowego DNA znajdą się w odległości około 2 cm od studzienki i widoczne będzie oddzielenie pasm w drabince. Warunki te mogą wymagać dostosowania w oparciu o dostępny aparat do elektroforezy żelowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena jakości DNA II
	<ol>
		<li>Załaduj około 60 ng genomowego DNA i drabinkę DNA o wysokiej masie cząsteczkowej (odpowiednią do elektroforezy żelowej w polu pulsacyjnym) na 1% żelu agarozowym w 0,5x TBE (44,5 mM Tris, 44,5 mM kwasu borowego, 1 mM EDTA, pH 8,3) i uruchom w buforze roboczym 0,5x TBE przy użyciu protokołu elektroforezy żelowej w polu pulsacyjnym o kształcie fali 5 - 80 kbp przez 16 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena zanieczyszczeń bakteryjnych, grzybiczych i roślinnych
	<ol>
		<li>Przeprowadzić reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) w celu amplifikacji odpowiednich regionów wewnętrznych transkrybowanych przekładek (ITS) genów rybosomalnych przy użyciu starterów i warunków amplifikacji wymienionych w tabeli 2. Załadować 10 μl wynikowej reakcji na żel. 
		UWAGA: Pasmo reprezentujące region ITS mączniaka prawdziwego powinno być wzmocnione podkładami grzybowymi ITS. DNA z tego amplikonu i każdy amplikon wygenerowany za pomocą starterów bakteryjnych lub roślinnych powinno zostać zsekwencjonowane w celu określenia pochodzenia zanieczyszczenia. W amplikonie grzyba powinny znajdować się tylko sekwencje ITS mączniaka prawdziwego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Agrios, G. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAgrios%2C+GN+%22Plant+Pathology%22">Plant Pathology</a>. , 4th, Academic Press. (1969).</li>
<li>Braun, U., Cook, R. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBraun%2C+U+%22Taxonomic+manual+of+the+Erysiphales+%28Powdery+Mildews%29%22">Taxonomic manual of the Erysiphales (Powdery Mildews)</a>. , CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre Utrecht. The Netherlands. (2012).</li>
<li>Both, M., Csukai, M., Stumpf, M. P. H., Spanu, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+of+Blumeria+graminis+indicate+dynamic+changes+to+primary+metabolism+during+development+of+an+obligate+biotrophic+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles of Blumeria graminis indicate dynamic changes to primary metabolism during development of an obligate biotrophic pathogen.</a> Plant Cell. 17 (7), 2107-2122 (2005).</li>
<li>Glawe, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+powdery+mildews%3A+A+review+of+the+world%27s+most+familiar+%28yet+poorly+known%29+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">The powdery mildews: A review of the world's most familiar (yet poorly known) plant pathogens.</a> Annu Rev Phytopathol. 46, 27-51 (2008).</li>
<li>Fabro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+profiling+Arabidopsis+at+the+stage+of+Golovinomyces+cichoracearum+haustorium+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression profiling Arabidopsis at the stage of Golovinomyces cichoracearum haustorium formation.</a> Plant Physiol. 146 (3), 1421-1439 (2008).</li>
<li>Hückelhoven, R., Panstruga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+the+plant-powdery+mildew+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of the plant-powdery mildew interaction.</a> Curr Opin Plant Biol. 14 (6), 738-746 (2011).</li>
<li>Micali, C. O., Neumann, U., Grunewald, D., Panstruga, R., O'Connell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+a+specialized+plant-fungal+interface+during+host+cell+internalization+of+Golovinomyces+orontii+haustoria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of a specialized plant-fungal interface during host cell internalization of Golovinomyces orontii haustoria.</a> Cell Microbiol. 13 (2), 210-226 (2011).</li>
<li>Chandran, D., Inada, N., Hather, G., Kleindt, C. K., Wildermuth, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microdissection+of+Arabidopsis+cells+at+the+powdery+mildew+infection+site+reveals+site-specific+processes+and+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Laser microdissection of Arabidopsis cells at the powdery mildew infection site reveals site-specific processes and regulators.</a> Proc Natl Acad Sci. 107 (1), 460-465 (2010).</li>
<li>Spanu, P. D., Panstruga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Powdery+mildew+genomes+in+the+crosshairs%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Powdery mildew genomes in the crosshairs.</a> New Phytol. 195 (1), 20-22 (2012).</li>
<li>Vela-Corcía, D., Romero, D., Torés, J. A., De Vicente, A., Pérez-García, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transformation+of+Podosphaera+xanthii+by+electroporation+of+conidia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Transient transformation of Podosphaera xanthii by electroporation of conidia.</a> BMC Microbiol. 15 (20), (2015).</li>
<li>Hacquard, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHacquard%2C+S+%22Advances+in+Botanical+Research%22">Advances in Botanical Research</a>. Francis, M. M. 70, Academic Press. 109-142 (2014).</li>
<li>Spanu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+expansion+and+gene+loss+in+powdery+mildew+fungi+reveal+tradeoffs+in+extreme+parasitism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome expansion and gene loss in powdery mildew fungi reveal tradeoffs in extreme parasitism.</a> Science. 330 (6010), 1543-1546 (2010).</li>
<li>Wicker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wheat+powdery+mildew+genome+shows+the+unique+evolution+of+an+obligate+biotroph%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The wheat powdery mildew genome shows the unique evolution of an obligate biotroph.</a> Nat Genet. 45 (9), 1092(2013).</li>
<li>Jones, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+genomic+structural+variation+in+the+grape+powdery+mildew+pathogen%2C+Erysiphe+necator%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Adaptive genomic structural variation in the grape powdery mildew pathogen, Erysiphe necator.</a> BMC Genomics. 15, 1081(2014).</li>
<li>Thomma, B. P. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mind+the+gap%3B+seven+reasons+to+close+fragmented+genome+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet+Biol%22%5BJournal%5D)">Mind the gap; seven reasons to close fragmented genome assemblies.</a> Fungal Genet Biol. 90, 24-30 (2016).</li>
<li>Parlange, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+invasion+of+transposable+elements+accounts+for+the+large+size+of+the+Blumeria+graminis+f.sp.+tritici+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Funct+Integr+Genomics%22%5BJournal%5D)">A major invasion of transposable elements accounts for the large size of the Blumeria graminis f.sp. tritici genome.</a> Funct Integr Genomics. 11, 671-677 (2011).</li>
<li>Faino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+real-time+sequencing+combined+with+optical+mapping+yields+completely+finished+fungal+genome%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Single-molecule real-time sequencing combined with optical mapping yields completely finished fungal genome.</a> mBio. 6, (2015).</li>
<li>Adam, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Erysiphe+cichoracearum+and+E.+cruciferarum+and+a+survey+of+360+Arabidopsis+thaliana+accessions+for+resistance+to+these+two+powdery+mildew+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+In%22%5BJournal%5D)">Comparison of Erysiphe cichoracearum and E. cruciferarum and a survey of 360 Arabidopsis thaliana accessions for resistance to these two powdery mildew pathogens.</a> Mol Plant Microbe In. 12 (12), 1031-1043 (1999).</li>
<li>Bourras, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+avirulence+loci+and+allele-specific+effector+recognition+control+the+PM3+race-specific+resistance+of+wheat+to+powdery+mildew%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple avirulence loci and allele-specific effector recognition control the PM3 race-specific resistance of wheat to powdery mildew.</a> Plant Cell. 27 (10), 2991-3012 (2015).</li>
<li>Joint Genome Institute DNA sample submission guidelines. , 
 <a target="_blank" href="http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2016/04/DNA-Preparation-Requirements-1.pdf">http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2016/04/DNA-Preparation-Requirements-1.pdf</a> (2016).</li>
<li>Chovatia, M., Sharma, A. Genomic DNA sample QC version 4.0. , 
 <a target="_blank" href="http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2013/11/Genomic-DNA-Sample-QC.pdf">http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2013/11/Genomic-DNA-Sample-QC.pdf</a> (2014).</li>
<li>Daum, C. iTag sample amplification QC version 1.3. , 
 <a target="_blank" href="http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2016/04/iTag-Sample-Amplification-QC-v1.3.pdf">http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2016/04/iTag-Sample-Amplification-QC-v1.3.pdf</a> (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Plant+genotyping+II%3A+SNP+technology%22">Plant genotyping II: SNP technology</a>. Henry, R. J. , CABI. Oxfordshire, UK. (2008).</li>
<li>Healey, A., Furtado, A., Cooper, T., Henry, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+a+simple+method+for+extracting+next-generation+sequencing+quality+genomic+DNA+from+recalcitrant+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: a simple method for extracting next-generation sequencing quality genomic DNA from recalcitrant plant species.</a> Plant Methods. 10 (21), (2014).</li>
<li>Fang, G., Hammar, S., Grumet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quick+and+inexpensive+method+for+removing+polysaccharides+from+plant+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA.</a> Biotechniques. 13 (1), 52-54 (1992).</li>
<li>Jordon-Thaden, I. E., Chanderbali, A. S., Gitzendanner, M. A., Soltis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+CTAB+and+TRIzol+protocols+improve+RNA+extraction+from+chemically+complex+Embryophyta%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Modified CTAB and TRIzol protocols improve RNA extraction from chemically complex Embryophyta.</a> Appl Plant Sci. 3 (5), 1400105(2015).</li>
<li>Murray, M. G., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+high+molecular+weight+plant+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.</a> Nucleic Acids Res. 8 (19), 4321-4325 (1980).</li>
<li>Greco, M., Sáez, C. A., Brown, M. T., Bitonti, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+effective+method+for+high+quality+co-extraction+of+genomic+DNA+and+total+RNA+from+low+biomass+Ectocarpus+siliculosus%2C+the+model+brown+alga%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A simple and effective method for high quality co-extraction of genomic DNA and total RNA from low biomass Ectocarpus siliculosus, the model brown alga.</a> PLoS One. 9 (5), e96470(2014).</li>
<li>Wilson, I. W., Schiff, C. L., Hughes, D. E., Somerville, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+loci+analysis+of+powdery+mildew+disease+resistance+in+the+Arabidopsis+thaliana+accession+Kashmir-1%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait loci analysis of powdery mildew disease resistance in the Arabidopsis thaliana accession Kashmir-1.</a> Genetics. 158 (3), 1301-1309 (2001).</li>
<li>User Manual: Pippin Pulse Electrophoresis Power Supply. , Sage Science. 
 <a target="_blank" href="http://www.sagescience.com/wp-content/uploads/2014/01/Pippin-Pulse-User-Manual-RevH.pdf">http://www.sagescience.com/wp-content/uploads/2014/01/Pippin-Pulse-User-Manual-RevH.pdf</a> (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W celu uzyskania czystego, wysokocząsteczkowego genomowego DNA z obligatoryjnych biotroficznych grzybów mączniaka prawdziwego opracowano zmodyfikowaną wersję wcześniej opisanych metod30. Średnia wydajność przy użyciu tego zoptymalizowanego protokołu wynosi 7 μg DNA na 150 mg konidiów, co stanowi podwojenie wydajności uzyskanej przy użyciu poprzedniego protokołu. Również średni rozmiar wzrósł z około 20 kbp do ponad 48,5 kbp. Protokół ten został zoptymalizowany w systemie cucumber-G. cichoracea...

Mączniak prawdziwy to grupa obowiązkowych biotroficznych patogenów grzybowych roślin, które, razem wzięte, są najczęstszą przyczyną chorób roślin na świecie1. Istnieje ponad 900 opisanych gatunków mączniaka prawdziwego, które zostały taksonomicznie pogrupowane w pięć plemion w rodzinie Erisyphaceae2. Zarówno ze względu na ich znaczenie gospodarcze, jak i bliskie relacje, jakie nawiązują ze swoimi gospodarzami, choroby mączniaka prawdziwego są przedmiotem badań od > 100 lat. Po zakażeniu mączniak prawdziwy wywołuje drastyczne zmiany w strukturze komórkowej, metabolizmie i biologii molekularnej gospodarzy, z korzyścią dla tego patogenu. Jednak badanie mączniaka prawdziwego jest szczególnie trudne ze względu na ich obowiązkowy tryb życia, a wzrost grzyba w czystej kulturze nie został jeszcze opisany3,4,5,6,7,8. Niezawodna, stabilna transformacja genetyczna mączniaka prawdziwego również nie została jeszcze osiągnięta, chociaż u niektórych gatunków odnotowano przejściowe transformacje9,10.
Sekwencjonowanie i składanie genomów mączniaka prawdziwego okazało się trudne ze względu na wiele cech samego genomu. Genomy mączniaka prawdziwego są duże (120 - 180 Mbp) w stosunku do innych genomów grzybów i składają się z 60 - 90% równomiernie rozmieszczonych powtarzających się elementów11. Elementy te obejmują niedługie powtórzenia końcowe, a także nieskategoryzowane powtarzające się elementy. Zsekwencjonowano dwie formy specjalne jednego gatunku mączniaka prawdziwego, Blumeria graminis f. sp. hordei i f. sp. tritici (odpowiednio Bgh i Bgt), a także mączniaka prawdziwego winogron Erysiphe necator, a także zakończono opracowywanie genomów roboczych dla kilku innych12,13,14. Powtarzalna natura genomów utrudniła składanie, a kompletny genom Bgh został złożony w 6 989 superkontigów o L50 wynoszącym 2 Mb12.
Pomimo dużego genomu, mączniak prawdziwy wydaje się mieć niewielką liczbę genów kodujących białka, z 5,845 i 6,540 genami przewidzianymi odpowiednio w Bgh i Bgt. Sekwencjonowane mączniak prawdziwy wydaje się również nie mieć co najmniej 99 podstawowych genów, które są niezbędne dla innych grzybów, co jest zgodne z zależnością grzybów od ich rośliny żywicielskiej dla przetrwania11,12,13,14.
Powtarzające się sekwencje w pobliżu telomerów, centromerów, układów genów rybosomalnego RNA i regionów wzbogaconych w elementy transpozycyjne są słabo złożone ze strategii sekwencjonowania krótkiego odczytu i często są niedostatecznie reprezentowane w składach genomu15. Uważa się, że takie regiony są odpowiedzialne za wiele luk występujących w sekwencjach genomu, a dotyczy to mączniaka prawdziwego z ich rozległą ekspansją powtarzających się elementów16. Wysoce plastyczne regiony genomu są często znajdowane w takich powtarzających się regionach3. Służą one jako miejsce rearanżacji chromosomów i często kodują geny pod silną presją selekcyjną, takie jak geny kodujące białka efektorowe i geny kodujące enzymy metabolizmu wtórnego. Postępy w technologiach sekwencjonowania pojedynczych cząsteczek z długim odczytem stanowią potencjalne rozwiązanie dla sekwencjonowania w powtarzających się regionach genomów15. Na przykład Faino i in. (2015) odkryli, że włączenie technologii odczytu długich sekwencji i mapowania optycznego pozwoliło im wyprodukować sekwencję genomu bez przerw dla dwóch szczepów grzybowego patogenu roślinnego Verticillium dahlia, potrajając proporcję powtarzających się sekwencji DNA w genomie, zwiększając liczbę adnotacji genów (i zmniejszając liczbę częściowych lub brakujących adnotacji genów) i ujawniając rearanżacje genomu17.
Aby zastosować te technologie sekwencjonowania z długim odczytem, potrzebne są wysokie stężenia wysokiej jakości genomowego DNA, o minimalnych rozmiarach > 20 kbp. W tym miejscu opisujemy nasze metody zbierania konidiów, oczyszczania DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z konidiów oraz nasze oceny kontroli jakości przy użyciu gatunku mączniaka prawdziwego >Golovinomyces cichoracearum uprawianego na ogórku18. Protokół ten jest oparty na protokole opracowanym w grupie laboratoryjnej B. Keller (Uniwersytet w Zurychu, Zurych, Szwajcaria)13,19 i zawiera kilka modyfikacji, które doprowadziły do zwiększenia wydajności DNA i większego udziału DNA o rozmiarze >48,5 kbp. Protokół zawiera również kroki kontroli jakości oparte na zaleceniach Joint Genome Institute Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych20,21,22.
Funkcja każdego odczynnika zawartego w buforze do lizy oraz uzasadnienie każdego etapu oczyszczania są opisane w Henry (2008)23. Dostępne opublikowane protokoły izolacji genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z tkanek roślinnych i mikrobiologicznych były również konsultowane podczas projektowania tego protokołu24,25,26,27,28.

<table><tbody><tr><td>MM400 Młyn kulowy</td><td>Retsch</td><td>20.745.0001</td><td>Lub równoważny młyn kulowy</td></tr><tr><td>2 mL probówki do mielenia kulowego</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>72.694.007</td><td></td></tr><tr><td>Kule frezarskie ze stali nierdzewnej 5/32"</td><td>OPS Diagnostics</td><td>GBSS 165-5000-01</td><td></td></tr><tr><td>Sterowana mikroprocesorem łaźnia wodna serii 280 Wstępnie ustawiona na 65 & stopni; C&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2825</td><td>Lub równoważna kąpiel wodna</td></tr><tr><td>Sterowana mikroprocesorem Łaźnia wodna serii 280 Wstępnie ustawiona na 37 & stopni; C</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2825</td><td>Lub równoważna kąpiel wodna</td></tr><tr><td>Eppendorf 5417R mikrowirówka z chłodzeniem</td><td>Krakeler Scientific&nbsp;</td><td>38-022621807</td><td>Lub równoważna mikrowirówka</td></tr><tr><td>Chlorform: IAA (24:1 v/v)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>C0549</td><td>Stwarza zagrożenie w przypadku kontaktu ze skórą lub wdychania. Nosić rękawice nitrylowe, okulary ochronne, fartuch laboratoryjny i pracować w kapturze chemicznym</td></tr><tr><td>Fenol:Chloroform:IAA (25:24:1 v / v)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15593031</td><td>Niebezpieczny w przypadku kontaktu ze skórą lub wdychania. Nosić rękawice nitrylowe, okulary ochronne, fartuch laboratoryjny i pracować w kapturze chemicznym</td></tr><tr><td>100% Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>W292907</tr><tr><td>100% etanol</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>34923</td><td>Schładzanie do -20 stopni; C przed użyciem</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Rnaza, bez dnazy (10 mg/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Pirosiarczyn potasu</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P2522</td><td></td></tr><tr><td>Sacroinate Laurylu Sodu</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L9150</td><td></td></tr><tr><td>Podstawa Tris</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>10708976001</tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Bromek cetyltrimetyloamoniowy (CTAB)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H6269</td><td></td></tr><tr><td>Gogle Uvex by Honeywell Futura S345C, Uvextreme</td><td>Staples</td><td>423263</td><td>Lub równoważne</td></tr><tr><td>okulary Rękawice nitrylowe High Five COBALT, DUŻE</td><td>Neta Scientific</td><td>HFG-N193</td><td>Lub równoważne rękawice</td></tr><tr><td>GelRed Gel Nucleic Acid Gel Stain 10 000x w wodzie</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny 10 mg/ml</td><td>Biotium</td><td>40042</td><td>Niebezpieczny w przypadku kontaktu ze skórą. Nosić rękawice nitrylowe i okulary ochronne</td></tr><tr><td>Agarose Ultrapure Bioreagent</td><td>VWR International LLC</td><td>JT4063</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FERSM1332</td><td></td></tr><tr><td>8 - 48 kb CHEF Wzorce wielkości DNA</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3707</td><td></td></tr><tr><td>Pippin Prep</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>4472172</td><td>Lub równoważny żel do pomiaru pulsacyjnego</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna jakościowa Whatman, klasa 1</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>WHA1001042</td><td>Lub równoważna komora wzrostowa</td></tr><tr><td>Percival Komora wzrostu Percival</td><td></td><td>AR66LXC9</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 8000 Spektrofotometr UV-Vis</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-8000-GL</td><td>Lub równoważny spektrofotometr</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Zestaw do oznaczania</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P11496</td><td></td></tr><tr><td>TAE Bufor (Tris-acetate-EDTA) (50x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B49</td><td>Rozcieńczyć 1/50 wodą przed użyciem (do 1x)</td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12090015&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Boran-EDTA, 10x Roztwór (Elektroforeza)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP13334</td><td>Rozcieńczyć 1/10 wodą przed użyciem (do 1x)</td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td></td><td></td><td>Ciekły azot (-196 &deg; C) stwarza ryzyko zamarznięcia. Po podgrzaniu będzie się również szybko rozszerzał i nie powinien być przechowywany w szczelnie zamkniętym pojemniku</td></tr></tbody></table>

oczyszczanie genomowego dna o wysokiej masie cząsteczkowej z mączniaka prawdziwego do sekwencjonowania z długim odczytem

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

Grzyby mączniaka prawdziwego to grupa ważnych z ekonomicznego punktu widzenia patogenów grzybowych roślin. Stosunkowo niewiele wiadomo na temat biologii molekularnej i genetyki tych patogenów, częściowo z powodu braku dobrze rozwiniętych zasobów genetycznych i genomicznych. Organizmy te mają duże, powtarzalne genomy, co sprawiło, że sekwencjonowanie i składanie genomu jest zbyt trudne. W tym miejscu opisano metody pobierania, ekstrakcji, oczyszczania i oceny jakości genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej jednego gatunku mączniaka prawdziwego, Golovinomyces cichoracearum. Opisany protokół obejmuje mechaniczne rozerwanie zarodników, po którym następuje zoptymalizowana ekstrakcja genomowego DNA fenol/chloroform. Typowa wydajność wynosiła 7 μg DNA na 150 mg konidiów. Genomowe DNA, które jest izolowane przy użyciu tej procedury, nadaje się do sekwencjonowania z długim odczytem (tj. > 48,5 kbp). W tej metodzie opisano również środki kontroli jakości mające na celu zapewnienie rozmiaru, wydajności i czystości genomowego DNA. Sekwencjonowanie genomowego DNA o opisanej tutaj jakości pozwoli na złożenie i porównanie wielu genomów mączniaka prawdziwego, co z kolei doprowadzi do lepszego zrozumienia i lepszej kontroli tego patogenu rolniczego.

Reprezentatywny przykład 60 ng oczyszczonego DNA genomowego z G. cichoracearum przeprowadzone na żelu agarozowym z wykorzystaniem elektroforezy żelowej oraz elektroforezy w polu pulsacyjnym przedstawiono w Rysunki 1 i 2odpowiednio. Przedstawiono preparaty genomowego DNA, które przeszły kontrolę jakości, przeszły ją w stopniu ograniczonym lub nie przeszły jej. Preparaty genomowego DNA, które w pełni przeszły kontrolę jakości, są i...

Opisana tutaj jest metoda ekstrakcji, oczyszczania i kontroli jakości genomowego DNA z obligatoryjnego biotroficznego patogenu grzybowego, mączniaka prawdziwego, do użycia w długotrwałym sekwencjonowaniu genomu.

Oczyszczanie genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z mączniaka prawdziwego do sekwencjonowania z długim odczytem

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest izolacja wysokocząsteczkowego DNA genomowego z haploidalnych konidiów mączniaka prawdziwego do sekwencjonowania genomu metodą długich odczytów. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii grzybów patogennych roślin, takie jak struktura i skład genomów trudnych do badania. Główną zaletą tej techniki jest możliwość ekstrakcji wysokiej jakości DNA genomowego z patogenu, który jest trudny w obróbce laboratoryjnej.Aby rozpocząć eksperyment, należy szybko usunąć kulki stalowe z krioprobek z konidiami za pomocą magnesu. Następnie należy dodać 700 µL buforu lizującego o temperaturze 65 °C i mieszać roztwór w wstrząsarku wierzchowej przez 5 do 10 sekund. Po 5 do 10 sekundach powstanie zawiesina.Dodaj 300 µL sarkosylu 5% v/v uprzednio podgrzanego do 65°C i delikatnie odwróć probówkę pięć razy. Inkubuj probówki przez 30 minut w temperaturze 65°C. Używając końcówki do pipety o szerokim otworze, przenieś cały roztwór do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL.Do roztworu lizującego dodać taką samą objętość chloroformu z alkoholem izoamylowym i delikatnie odwrócić probówkę pięciokrotnie w celu wymieszania. Mieszaninę inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie odwrócić probówkę pięciokrotnie w połowie czasu inkubacji, a następnie ponownie po jej zakończeniu.Następnie wiruj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Używając końcówki do pipety o szerokim otworze, ostrożnie przenieś warstwę wodną do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml, unikając pobierania materiału z interfejsu. Dodaj 750 µL 100% izopropanolu o temperaturze pokojowej i delikatnie odwróć probówkę sześć razy.Następnie odwiruj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Ostrożnie usuń nadsącz i go wylej. Dodaj 450 µL schłodzonego wcześniej 70% etanolu.Odwiruj mieszaninę przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie odlej nadsącz i go zutylizuj. Odwiruj przy 1000 ×g przez trzy sekundy.Ostrożnie usuń nadsącz za pomocą cienkiej końcówki pipety i go wylej. Osusz osad przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Resuspenduj osad w 300 µl buforu TE. Inkubuj DNA przez noc w temperaturze 4 °C.Następnego ranka delikatnie opukaj probówkę, aby resuspendować DNA, które nie rozpuściło się w roztworze. Aby usunąć zanieczyszczenia RNA, dodaj 10 µL RNazy. Delikatnie odwróć probówkę trzy razy i odwiruj DNA przy 1000 ×g przez trzy sekundy.Następnie inkubuj DNA w temperaturze 37°C przez dwie godziny. Dodaj 300 µL fenolo-chloroformu z alkoholem izoamylowym, delikatnie odwróć probówkę pięciokrotnie w celu wymieszania i inkubuj DNA przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie odwróć probówkę, aby wymieszać DNA pięciokrotnie w połowie czasu inkubacji oraz ponownie po jej zakończeniu.Następnie wirowarkę w probówce przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Za pomocą końcówki do pipety o szerokim otworze przenieś nadsącz do nowej probówki do mikrowirowania o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj trzy mikrolitry 3 molarnego octanu sodu pH 5.2, a następnie delikatnie odwróć probówkę pięć razy.Dodaj 750 µL schłodzonego 100% etanolu i delikatnie odwróć probówkę pięć razy. Inkubuj mieszaninę przez noc w temperaturze 20 °C. Następnego dnia rano wiruj probówkę przez 30 minut w temperaturze 4 °C.Ostrożnie odpietuj i usuń nadsącz. Dodaj 450 µL schłodzonego 70% etanolu. Następnie wiruj probówkę przez pięć minut w temperaturze 4 °C.Po zwirowaniu DNA ostrożnie odlej nadsącz. Ponownie wiruj probówkę z prędkością 1000 ×g przez trzy sekundy, aby osadzić pozostałości nadsączu. Usuń resztki nadsączu za pomocą pipety z cienką końcówką.Osad suszyć na powietrzu przez 30 do 60 minut w temperaturze pokojowej. Po wysuszeniu resuspender osad w 27,5 µL buforu TE. Następnego dnia delikatnie odwrócić probówkę, aby resuspender pozostały materiał, który nie rozpuścił się w roztworze. Odnieść alykwot 2,5 µL do 22,5 µL buforu TE w celu przeprowadzenia testów kontroli jakości.Próbki DNA należy przechowywać w temperaturze 4°C do momentu przekazania do sekwencjonowania. W przypadku przechowywania długoterminowego próbki należy przechowywać w temperaturze -80°C, minimalizując liczbę cykli zamrażania i rozmrażania, aby zapobiec fragmentacji DNA. Zgodnie z protokołem, oczyszczone DNA genomiczne wykorzystano do elektroforezy żelowej, w wyniku której uzyskano DNA, które przeszło kontrolę jakości (wyraźny pojedynczy prążek powyżej 20 kbp i minimalne rozmycie), DNA z wynikiem marginalnym (pojedynczy prążek powyżej 20 kbp) oraz wynik negatywny, objawiający się rozmyciem poniżej 20 kbp i obecnością fragmentów o wielkości 100 bp.Elektroforeza w polu pulsującym (PFGE) została przeprowadzona w celu rozróżnienia akceptowalnej próbki DNA, w której większość fragmentów przekraczała 48.5kbp, od próbki DNA o jakości marginalnej, w której większość fragmentów mieściła się w przedziale od 20 do 48.5kbp. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak sekwencjonowanie długich odczytów pojedynczych cząsteczek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące genomu mączniaka prawdziwego.

purification-high-molecular-weight-genomic-dna-from-powdery-mildew

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Opisano metodologię izolacji wysokiej jakości genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z mikrobiologicznej społeczności glebowej.

Ekstrakcja wysokocząsteczkowego genomowego DNA z gleb i osadów

Przedstawiamy ulepszony protokół izolacji wysokocząsteczkowego DNA z hipersalinitycznych mat mikrobjalnych. Przed ekstrakcją i puryfikacją DNA komórki mikrobjalne są oddzielane od macierzy maty. Pozwala to na zwiększenie stężenia, poprawę jakości oraz zwiększenie rozmiaru DNA. Protokół ten może być stosowany również w przypadku innych próbek trudnych do obróbki.

Ekstrakcja wysokocząsteczkowego DNA z mat mikrobowych

Korzystając z przykładu dróg oddechowych mukowiscydozy, manuskrypt przedstawia kompleksowy przepływ pracy obejmujący kombinację podejść metagenomicznych i metatranskryptomicznych w celu scharakteryzowania społeczności mikrobiologicznych i wirusowych w próbkach związanych ze zwierzętami.

Oczyszczanie nieczystości: sekwencjonowanie metagenomów i metatranskryptomów ze złożonych próbek związanych ze zwierzętami

Ten artykuł przedstawia czułą metodę o nazwie Circle-Seq do oczyszczania pozachromosomalnego kolistego DNA (eccDNA). Metoda obejmuje oczyszczanie kolumny, usuwanie pozostałego liniowego chromosomalnego DNA, amplifikację w okręgu toczonym i sekwencjonowanie wysokoprzepustowe. Circle-Seq ma zastosowanie do badań przesiewowych eukariotycznego eccDNA w skali genomu oraz badania niestabilności genomu i zmienności liczby kopii.

Oczyszczanie całego genomu pozachromosomalnego kolistego DNA z komórek eukariotycznych

Przedstawiono porównanie i optymalizację dwóch metod wzbogacania DNA organelek roślinnych: tradycyjne wirowanie różnicowe i frakcjonowanie całkowitego gDNA w oparciu o status metylacji. Oceniamy otrzymaną ilość i jakość DNA, wykazujemy wydajność w sekwencjonowaniu nowej generacji z krótkim odczytem i omawiamy potencjał zastosowania w sekwencjonowaniu pojedynczych cząsteczek z długim odczytem.

Optymalizacja i analiza porównawcza metod wzbogacania organelek DNA roślin odpowiednich do sekwencjonowania nowej generacji

Technologia nanoporowa do sekwencjonowania biomolekuł ma szerokie zastosowanie w naukach przyrodniczych, w tym do identyfikacji patogenów, monitorowania bezpieczeństwa żywności, analizy genomicznej, metagenomicznego monitorowania środowiska i charakterystyki oporności bakterii na antybiotyki. W artykule przedstawiono procedurę metagenomicznego sekwencjonowania DNA gleby w celu identyfikacji gatunków z wykorzystaniem technologii sekwencjonowania nanoporowego.

Sekwencjonowanie DNA w nanoporach do metagenomicznej analizy gleby

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek ujawnia niejednorodność genotypową w systemach biologicznych, ale obecnym technologiom brakuje przepustowości niezbędnej do głębokiego profilowania składu i funkcji społeczności. W tym miejscu opisujemy mikroprzepływowy przepływ pracy do sekwencjonowania &gt;50 000 genomów jednokomórkowych z różnych populacji komórek.

Ultraprzepustowa platforma mikroprzepływowa do sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki

Celem tego protokołu jest wykorzystanie kombinacji badań obliczeniowych i laboratoryjnych do znalezienia nowych sekwencji, które nie mogą być łatwo oddzielone od sekwencji współoczyszczającej, która może być tylko częściowo znana.

Odkrycie nowych sekwencji za pomocą genomiki subtraktywnej

Długie sekwencje znacznie ułatwiają tworzenie złożonych genomów i charakteryzację zmienności strukturalnej. Opisujemy metodę generowania ultradługich sekwencji za pomocą platform sekwencjonowania opartych na nanoporach. Podejście to wykorzystuje zoptymalizowaną ekstrakcję DNA, a następnie zmodyfikowane przygotowania biblioteczne w celu wygenerowania setek odczytów kilobazowych z umiarkowanym pokryciem z komórek ludzkich.

Sekwencjonowanie z bardzo długim odczytem do analizy całego genomu DNA

Tutaj prezentujemy protokół do analizy rozkładu modyfikacji histonów w całym genomie, który może zidentyfikować nowe geny docelowe w patogenezie M. oryzae i innych grzybów strzępkowych.

Analiza całego genomu rozkładu modyfikacji histonów przy użyciu metody sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny w Magnaporthe oryzae

Tutaj prezentujemy prostą technikę oceny środowiskowej oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) poprzez zwiększenie proporcji niskocząsteczkowego DNA zewnątrzkomórkowego. Wcześniejsze leczenie 20%-30% PEG i 1,2 M NaCl pozwala na wykrycie zarówno genomowych, jak i przenoszonych horyzontalnie genów AMR. Protokół nadaje się do procesu bez zestawów z dodatkową optymalizacją.

Ulepszona ekstrakcja DNA o niskiej masie cząsteczkowej ze ścieków w celu kompleksowej oceny oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe

Poznaj metodę izolacji genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z mączniaka prawdziwego do sekwencjonowania z długim odczytem. Technika ta umożliwia badanie złożonych genomów grzybów patogennych roślin.

Oczyszczanie genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z mączniaka prawdziwego do sekwencjonowania z długim odczytem

Przeglądaj więcej filmów