Precyzyjnie wycięte plastry płuc myszy do wizualizacji żywych komórek dendrytycznych płuc

Ogólnym celem tej metody jest wykorzystanie precyzyjnie wycinanych plastrów płuc (PCLS) do wizualizacji lokalizacji i transportu różnych typów komórek odpornościowych w płucach. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny immunologii, takie jak wzorce lokalizacji i migracji komórek odpornościowych w płucach. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wizualizacji wielu oddziaływań w żywej tkance ex vivo, która zachowuje trójwymiarową architekturę płuc.

Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat lokalizacji i transportu komórek odpornościowych podczas stanu zapalnego, może być ona również wykorzystana do wizualizacji skurczu tkanek dróg oddechowych oraz mięśni gładkich. Aby pobrać tkankę płucną, należy najpierw za pomocą nożyczek rozciąć skórę i otrzewną od środka brzucha aż do żuchwy myszy w wieku od 6 do 12 tygodni, a następnie przesunąć jelita na bok jamy brzusznej. Przeciąć żyłę główną dolną, aby odprowadzić krew z płuc, i użyć ostrej końcówki nożyczek do przebicia przepony, co umożliwi rozszerzenie klatki piersiowej.

Następnie za pomocą pincety należy ręcznie odsunąć gruczoły ślinowe i inne tkanki od tchawicy, a następnie użyć precyzyjnej pincety, aby wykonać nacięcie w tchawicy po stronie przedniej w miejscu najgrubszego pierścienia chrzęstnego, na tyle duże, aby umożliwić penetrację igły 20 G. Teraz należy nasunąć igłę 20 G o długości 1,5 cala na odcinek rurki polietylenowej i odciąć rurkę pod kątem około 45 stopni. Igłę należy przymocować do strzykawki o pojemności 1 ml i nabrać do niej 0,8 ml 2% agarozy niskotopliwej o temperaturze 40 °C.

Po napełnieniu całej rurki agarozą, wprowadź ścięty koniec rurki do nacięcia i powoli wstrzyknij agarozę do płuc. Nie przesuwając igły ani strzykawki, przymocuj strzykawkę taśmą do polistyrenowej podstawy, aby unieruchomić igłę w tchawicy, a następnie umieść zwierzę w temperaturze 4 degrees Celsius na co najmniej 10 minut. Po zestaleniu się agarozy, ostrożnie wyciśnij płuca za pomocą nożyczek i umieść je w naczyniu o średnicy trzech centymetrów zawierającym lodowaty PBS.

Następnie obróć płat przeznaczony do krojenia tkanek tak, aby wewnętrzna część płuca łącząca się z tchawicą była skierowana w dół. Aby pokroić tkankę płucną, najpierw nanieś małą kroplę kleju błyskawicznego All Purpose No Run gel na metalny tłok strzykawki, rozprowadzając go kolistym ruchem. Po nałożeniu całego kleju, za pomocą pęsety natychmiast, lecz delikatnie, chwyć wycięty płat stroną tchawicy do dołu i osusz go chusteczką, aby usunąć nadmiar cieczy.

Ostrożnie umieść wysuszony płat na górnej części tłoka i odetnij nadmiar tkanki wystającej poza krawędź tłoka. Przesuń tłok w dół tak, aby ścianki metalowej strzykawki przesunęły się w górę i objęły tkankę, tworząc w trzonie strzykawki zagłębienie z płucem na dnie, którego głębokość nie przekracza kilku centymetrów. Oklej taśmą dół strzykawki, aby ustabilizować tłok w tej pozycji.

Następnie ostrożnie wlej 2% niskotopiącą agarozę o temperaturze 40 °C do strzykawki tak, aby wprost przykryła górną część płata, a następnie otocz metalową strzykawkę blokiem chłodzącym z lodem. Po jednej lub dwóch minutach umieść strzykawkę z preparatem w automatycznym slicerze i ustaw nowe ostrze. Następnie napełnij zbiornik z buforem lodowatym PBS.

Wyrównaj napęd silnika krokowego z strzykawką z preparatem i usuń taśmę. Przełącz przełącznik w pozycję szybkiego przesuwania do przodu, aż napęd silnika krokowego lekko dotknie tylnej części tłoka. Ustaw grubość tkanki, tryb ciągłego cięcia pojedynczych plastrów, oscylację oraz prędkość na krojonce.

Następnie naciśnij start i za pomocą cienkiej szpatułki zbieraj każdy fragment PCLS w momencie wpadania do zbiornika z buforem, umieszczając plastry w oddzielnych studzienkach płytki 24-dołkowej zawierającej lodowaty PBS. W przypadku statycznego obrazowania PCLS, przenieś próbki płuc zawierające interesujący obszar anatomiczny do oddzielnych naczyń o średnicy trzech centymetrów zawierających jeden mililitr odpowiedniego koktajlu przeciwciał. Po 30 do 60 minutach w lodzie, przy kołysaniu i ochronie przed światłem, wypłucz plastry dwukrotnie jednym mililitrem lodowatego PBS.

Następnie do każdego nowego, okrągłego naczynia z szklanym dnem o średnicy trzech centymetrów należy dodać 50 µL PBS na każdą próbkę, a następnie szybko przenieść plastry do każdej kropli, delikatnie manipulując fragmentami tkanki tak, aby były rozłożone płasko. Następnie za pomocą pipety należy odessać PBS, nanieść na szkiełko kroplę medium montażowego o temperaturze pokojowej, a następnie przykryć je szkiełkiem nakrywką. Aby obrazować tkankę, należy umieścić naczynie na stole mikroskopu konfokalnego pod obiektywem 20x i użyć narzędzia do skanowania obszarowego (tile tool) w celu zlokalizowania i zaznaczenia krawędzi tkanki w ustawieniu otoczki wypukłej (convex hull), aby skrócić czas skanowania.

Następnie ustaw zakres stosu z (z-stack), dbając o to, aby wyznaczone zakresy były odpowiednie dla wielu obszarów skrawka, w szczególności wzdłuż jego krawędzi. W przypadku obrazowania żywych komórek, po 30 minutach inkubacji w odpowiednim koktajlu przeciwciał, przepłucz skrawki dwukrotnie jedną mililitrem zimnego medium Leibovitz 10. Następnie dodaj 50 µL świeżego medium Leibovitz 10 do jednego otworu szkiełka nakrywkowego z komorami dla każdej próbki, a następnie niezwłocznie przenieś każdy PCLS do medium, delikatnie manipulując tkankami, aż zostaną one płasko rozłożone.

Następnie za pomocą pipety odessaj pożywkę z każdej komory i przymocuj każdy PCLS za pomocą platynowego obciążnika. Ostrożnie nanieś świeżo przygotowaną, lodowatą macierz zewnątrzkomórkową na każdy PCLS, dbając o to, aby żel został umieszczony na wierzchu skrawków płuca i aby skrawki nie unosiły się na powierzchni żelu. Po pięciu minutach w temperaturze 37 °C przenieś preparat do uprzednio podgrzanej komory mikroskopu konfokalnego ustawionej na 37 °C pod obiektywem 20x.

Następnie należy ustawić zakresy stosu z oraz kafelkowania w oparciu o pożądany interwał między klatkami, używając narzędzia do kafelkowania w celu oznaczenia obszaru zainteresowania w tkance oraz ustawienia siatki centralnej, aby wycentrować próbkę w polu widzenia. Konwencjonalne komórki dendrytyczne z wysoką ekspresją CD11b lokalizują się w miąższu płuc, podczas gdy konwencjonalne komórki dendrytyczne CD103 pozytywne znajdują się głównie wokół dróg oddechowych i w obszarze podpleuralnym. Podwójne barwienie na CD88 i CD172a pozwala na odróżnienie makrofagów pęcherzykowych CD172a negatywnych i CD88 pozytywnych od makrofagów śródmiąższowych CD172a pozytywnych i CD88 pozytywnych, z których ci drudzy lokalizują się preferencyjnie w miąższu, a nie w obszarze podnabłonkowym.

Podwójne znakowanie CD90.2, znanego markeru limfocytów T, oraz białka fluorescencyjnego TdTomato, transgenu pod kontrolą transkrypcyjną głównego czynnika transkrypcyjnego niezbędnego do limfangiogenezy, ułatwia identyfikację struktur limfatycznych w płucach. Konwencjonalne komórki dendrytyczne wykazujące ekspresję CD103 występują w kilku obszarach anatomicznych, w tym w nabłonku dróg oddechowych wykazującym ekspresję CD324, w naczyniach limfatycznych oraz w obszarze podpleuralnym. Ruch komórek oraz oddziaływania międzykomórkowe mogą być rejestrowane za pomocą obrazowania żywych komórek, tak jak właśnie zaprezentowano.

Na przykład w reprezentatywnym eksperymencie, 16 godzin po doustnym podaniu ova-LPS, można wyraźnie zaobserwować interakcję komórek dendrytycznych wykazujących ekspresję CD103 z adoptywnie przeniesionymi limfocytami T specyficznymi dla ova w okresie czterech godzin. Po opanowaniu techniki, przygotowanie tkanki oraz krojenie mogą zostać wykonane w dwie i pół godziny, pod warunkiem właściwego przeprowadzenia procedury. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zapewnienie prawidłowego napowietrzenia płuc agarozą oraz dbanie o to, aby delikatne skrawki płuc pozostały jak najbardziej płaskie podczas obrazowania.

Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak traktowanie PCLS acetylocholiną lub metacoliną, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące sygnalizacji wapniowej i kurczliwości dróg oddechowych w różnych stanach chorobowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować precyzyjnie cięte plastry płuc w celu wizualizacji lokalizacji, transportu i interakcji komórek odpornościowych w płucach.