Name: Precyzyjnie wycięte plastry płuc myszy do wizualizacji żywych komórek dendrytycznych płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Poznaj metodę precyzyjnie wyciętych plastrów płuc myszy do wizualizacji lokalizacji i migracji komórek dendrytycznych w tkance płucnej. Ta technika umożliwia obserwację interakcji immunologicznych w żywym środowisku ex vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jeffowi Tuckerowi, Erice Scappini i Agnes Janoshazi za pomoc w mikroskopii, Ligon Perrow za zarządzanie kolonią myszy, Jun Chen i Michaelowi Sandersonowi za pomoc przy wycinarce tkanek, a także Michaelowi Fesslerowi i Derekowi Cainowi za krytyczne przeczytanie manuskryptu. Praca ta została sfinansowana przez wewnętrzny oddział NIEHS, NIH (ZIA ES102025-09), który z kolei jest sponsorowany przez Departament Zdrowia i Opieki Społecznej.

Procedury eksperymentalne na zwierzętach opisane w tym artykule zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt NIEHS (IACUC).
1. Przygotowanie płuc
<ol>
	<li>Myszy domowe w wieku od 6 do 12 tygodni w określonych warunkach wolnych od patogenów zgodnie z wytycznymi dostarczonymi przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania. 
	UWAGA: Zobrazowane myszy mogą być albo naiwne, albo leczone, w zależności od konkretnych zainteresowań każdego badacza. Tutaj opisujemy lokalizację komórek odpornościowych u myszy nieleczonych wcześniej i myszy leczonych 100 μg albuminy jaja kurzego (OVA) i 0,1 μg lipopolisacharydu (LPS), używając soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) jako nośnika w całkowitej objętości 50 μl. Aby wkroplić OVA/LPS do dróg oddechowych, zwierzęta znieczulono inhalacją izofluranu i pionowo zawieszono za zęby za pomocą gumki. Język delikatnie chwycono kleszczami i przytrzymano z boku, aby zapobiec połknięciu, a 50 μl roztworu OVA/LPS zdeponowano z tyłu jamy ustnej, jak wcześniej opisano17.</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia pentobarbitalu sodu (100 mg/kg) i przypnij zwierzę do podłoża polistyrenowego.</li>
	<li>Otwórz jamę brzuszną nożyczkami, przecinając skórę i otrzewną od środka brzucha do szczęki. Odciągnij jelita na bok kleszczami lub krawędzią nożyczek i odetnij żyłę główną dolną, aby odprowadzić krew z płuc. Nakłuj przeponę ostrą końcówką nożyczek, aby umożliwić rozszerzenie klatki piersiowej, uważając, aby nie przeciąć płuc.</li>
	<li>Usuń gruczoły ślinowe i inne tkanki z tchawicy, chwytając tkankę i ręcznie odciągając ją od leżącej pod nią tchawicy za pomocą kleszczy. Wykonaj małe nacięcie w tchawicy po przedniej stronie najgrubszego pasma chrząstki za pomocą cienkich kleszczy lub nożyczek, uważając, aby nie przeciąć tchawicy do końca. Nacięcie będzie wystarczająco duże, aby umożliwić przejście przez nie igły o wadze 20 G.</li>
	<li>Wsuń igłę o długości 1,5 cala i wadze 20 G na odcinek rurki polietylenowej, pozostawiając około 1 cm rurki poza końcem igły. Przeciąć rurkę pod kątem około 45°, aby ukosować koniec, przymocować igłę do strzykawki o pojemności 1 ml i załadować strzykawkę, pobierając przez igłę 0,8 ml ciepłej (40 °C) 2% agarozy o niskiej temperaturze topnienia.</li>
	<li>Umieść koniec rurki w nacięciu tchawicy i powoli wstrzyknij agarozę do płuc. Nie przesuwając igły ani strzykawki, przyklej strzykawkę do podstawy polistyrenowej, aby upewnić się, że igła pozostaje w tchawicy. 
	UWAGA: Po wstrzyknięciu płuca będą większe i napompowane w klatce piersiowej. Najpierw rozszerza się prawy płat, a następnie lewy płat. Jeśli rozszerza się tylko jeden płat, oznacza to, że igła została włożona zbyt głęboko (poza oskrzela) i konieczne będzie jej lekkie wyciągnięcie przed kontynuowaniem. Ta część procedury musi być wykonana stosunkowo szybko, zanim agaroza zacznie krzepnąć.</li>
	<li>Umieść mysz z podstawą i strzykawką nadal włożoną do tchawicy w chłodni lub lodówce na co najmniej 10 minut. W razie potrzeby zwierzę może być tam trzymane do kilku godzin, nawet jeśli przystąpi do obrazowania migracji komórek za pomocą wideomikroskopii.</li>
	<li>Gdy mysz ostygnie, ostrożnie wytnij napompowane agarozą płuca za pomocą nożyczek i umieść je w 3 cm naczyniu z lodowatym PBS. Trzymaj na lodzie.</li>
	<li>Wybierz żądany płat do krojenia tkanek (np. prawy płat górny). Upewnij się, że wewnętrzna część płuca (w miejscu, w którym łączy się z tchawicą) jest w naczyniu skierowana w dół. 
	UWAGA: Zastosowany płat i jego orientacja na tłoku określą rozmiar naczyń i dróg oddechowych, które będą widoczne. Opisana tutaj orientacja jest idealna do wizualizacji dużych dróg oddechowych i miąższu. Myszy mają jeden duży lewy płat i cztery mniejsze płaty po prawej. W przypadku obrazowania PCLS po wprowadzeniu alergenów do płuc poprzez aspirację ustno-gardłową lub donosową, prawy płat górny jest zwykle cięty, częściowo dlatego, że jest to dogodny rozmiar, ale także dlatego, że wdychane środki rozpraszają się w nim równomiernie. Jednak inne płaty, zwłaszcza lewy płat, mogą być również badane. Porównując szczepy myszy lub metody leczenia, ważne jest, aby porównać ten sam płat.</li>
</ol>
2. Krojenie płuc
UWAGA: Zrób plastry za pomocą automatycznego krajalnicy, metalowego bloku chłodzącego, tłoka i metalowej strzykawki, zgodnie z instrukcjami producenta.
<ol>
	<li>Nałóż małą kroplę uniwersalnego, niebiegnącego żelu superglue na tłok i rozprowadź klej okrężnymi ruchami, uważając, aby klej nie dotykał boków metalowej strzykawki. Jeśli klej dotknie boków strzykawki, sklei strzykawkę i tłok ze sobą.</li>
	<li>Natychmiast po pokryciu tłoka klejem delikatnie chwyć wycięty płatek kleszczami tchawicy do dołu, przetrzyj nim chusteczkę w celu usunięcia nadmiaru płynu i ostrożnie umieść go na tłoku. Odciąć wszelkie dodatkowe tkanki wystające poza krawędź tłoka.</li>
	<li>Przesuń tłok w dół, tak aby boki metalowej strzykawki przesuwały się w górę i nad tkanką, tworząc studzienkę z płucem przyklejonym na dole, o głębokości nie większej niż kilka centymetrów. Przyklej taśmę do dolnej części metalowej strzykawki, aby utrzymać tę pozycję na miejscu.</li>
	<li>Ostrożnie wlej 2% niskotopliwej agarozy w temperaturze 40 °C do studzienki, tak aby pokryła tylko górną część płata.</li>
	<li>Otocz metalową strzykawkę lodowatym blokiem chłodzącym i schładzaj płatek i agarozę przez 1 - 2 minuty 
	UWAGA: Krótszy czas schładzania agarozy otaczającej tkankę może prowadzić do rozpadu agarozy podczas krojenia, co może skutkować nierównomiernym cięciem PCLS.</li>
	<li>Załaduj strzykawkę z próbką do automatycznej krajalnicy i napełnij zbiornik buforowy lodowatym PBS. Dopasuj napęd silnika krokowego do strzykawki z próbką i usuń kawałek taśmy od dołu. Przekręć przełącznik do pozycji szybkiego przewijania do przodu (FF), aż napęd silnika krokowego dotknie tylnej części tłoka.</li>
	<li>Wyrównać świeże ostrze ze strzykawką z próbką. Ustaw grubość tkanki, ciągłą/pojedynczą warstwę, oscylację i prędkość w krajalnicy. Na przykład grubość tkanki: 150 μm, cięcie ciągłe (ciąg dalszy), oscylacja: 9 i prędkość: 3 - 4. Naciśnij start. Powyższe ustawienia należy dostosować do konkretnych specyfikacji automatycznego slicera.</li>
	<li>Za pomocą cienkiej szpatułki lub pędzla zbieraj PCLS pojedynczo, gdy wpadają do zbiornika buforowego i umieść je w 24-dołkowej płytce zawierającej lodowaty PBS. 
	UWAGA: Ważne jest, aby zachować plasterki, aby zachować spójność między eksperymentami. Chociaż każde płuco jest inne w zależności od wieku, płci i wagi, na przykład 10. warstwa na ogół daje drogi oddechowe o podobnej wielkości.</li>
</ol>
3. Barwienie przeciwciał
<ol>
	<li>Zaprojektuj panel fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał w oparciu o typ komórki będącej przedmiotem zainteresowania, biorąc pod uwagę potencjalne nakładanie się widma fluorescencyjnego i możliwości wykrywania mikroskopu. 
	UWAGA: Jako przykład, panel do wykrywania podzbioru DC jest następujący: CD11c/alfa X integryna - BrilliantViolet (BV) 605 (wzbudzenie: 405 nm, emisja szczytowa: 605 nm), CD324/E-kadheryna - Alexa 488 (AF488) (wzbudzenie: 488 nm, emisja szczytowa: 519 nm), CD88/C5Ra1 - fikoerytryna (PE) (wzbudzenie: 561 nm, emisja szczytu: 578 nm), integryna CD103/alfa E - allofikocyjanina (APC) (wzbudzenie: 633 nm, emisja szczytowa: 660 nm). Narzędzia do przeglądania widma fluorescencji (patrz Lista materiałów) są przydatne do projektowania paneli.</li>
	<li>Przygotuj koktajl przeciwciał zawierający pożądane przeciwciała.
	<ol>
		<li>W przypadku statycznego obrazowania PCLS dodaj 800 μl buforu barwiącego, 100 μl blokera Fc, 50 μl normalnej surowicy myszy i 50 μl normalnej surowicy szczura do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, aby uzyskać całkowitą objętość 1 ml. Do obrazowania żywych komórek zamiast buforu barwiącego należy użyć 800 μl pożywki Leibovitz (1x) zawierającej 10% FBS (Leibovitz-10).</li>
		<li>Dodaj przeciwciała, aby dostosować pożądane końcowe stężenie każdego przeciwciała. Przenieść roztwór przeciwciał do 3 cm naczynia i przechowywać w ciemności do momentu użycia do momentu, gdy będzie gotowy do użycia. 
		UWAGA: Końcowe stężenia muszą być zoptymalizowane dla każdego pojedynczego przeciwciała (zwykle 1 - 5 μg/ml).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybrać PCLS z anatomicznym obszarem zainteresowania, takim jak duże drogi oddechowe lub obrzeża płuc, i umieścić w 3-centymetrowym naczyniu zawierającym 1 ml roztworu przeciwciał</li>.
	<li>Plamić PCLS w ciemności, na lodzie, kołysząc powoli przez 30 lub 60 minut.</li>
	<li>W przypadku statycznego obrazowania PCLS należy przejść do sekcji 4. W przypadku obrazowania żywych komórek przejdź do sekcji 5.</li>
</ol>
4. Obrazowanie statyczne PCLS
<ol>
	<li>Po 60 minutach inkubacji PCLS z przeciwciałami wyjmij roztwór przeciwciała z naczynia i dwukrotnie przepłucz plastry 1 ml lodowatego PBS.</li>
	<li>Odpipetować 50 μl PBS na okrągłym naczyniu ze szklanym dnem o średnicy 3 cm. Za pomocą szpatułki lub pędzla przenieś poplamione PCLS na kroplę, delikatnie manipulując plasterkiem, aż będzie płaski i rozprowadzony. Wyjmij PBS za pomocą pipety. Plasterek powinien leżeć tak płasko, jak to możliwe. Powyższe procedury należy wykonać szybko, aby uniknąć fotowybielania.</li>
	<li>Umieść 1 kroplę podłoża montażowego o temperaturze pokojowej na plasterku i delikatnie wrzuć szklane szkiełko nakrywkowe do zagłębienia talerza. Przechowywać PCLS w ciemności w temperaturze 4 °C przez maksymalnie godzinę przed obrazowaniem.</li>
	<li>Podczas oglądania pod mikroskopem konfokalnym należy użyć obiektywu 20X (patrz Lista materiałów). Użyj narzędzia "kafelki", aby zlokalizować i zaznaczyć krawędzie tkanki w ustawieniu "wypukła powłoka". Pomoże to skrócić czas skanowania kafelków.</li>
	<li>Ustawiając zakres stosu z, sprawdź w wielu obszarach wycinka, zwłaszcza wzdłuż krawędzi, czy ustawione zakresy są odpowiednie. 
	UWAGA: Zakres z prawdopodobnie będzie musiał być większy niż grubość samej tkanki, ponieważ bardzo trudno jest sprawić, aby tkanka leżała całkowicie płasko. Na przykład w przypadku PCLS o grubości 150 μm zakres stosów z będzie prawdopodobnie musiał być ustawiony na 200–250 μm, aby uwzględnić nierówności i krzywe w warstwie. W zależności od zakresu z-stack i wielkości tkanki, każdy pełny skan płuc zajmie od 7 do 12 godzin przy obiektywie 20X. Każde płuco jest wyjątkowe, a ustawienia muszą być dostosowane do każdego eksperymentu.</li>
</ol>
5. Obrazowanie PCLS na żywo
<ol>
	<li>Po 30 minutach inkubacji PCLS z przeciwciałami wyjmij roztwór przeciwciała z naczynia i dwukrotnie opłucz plastry 1 ml zimnego Leibovitz-10.</li>
	<li>Odpipetować świeże 50 μl Leibovitz-10 do jednej szczeliny w komorze nakrywkowej (8 szczelin). Za pomocą szpatułki przenieś PCLS na podłoże, delikatnie manipulując nim, aż plasterek będzie płaski i rozłożony. Powyższe procedury należy wykonać szybko, aby uniknąć fotowybielania.</li>
	<li>Usunąć 50 μl podłoża za pomocą pipety. Plasterek ma leżeć tak płasko, jak to możliwe. 
	UWAGA: Dopuszczalne jest, jeśli krawędzie plastra są odchylone pionowo do ściany komory. Ponadto, jeśli jest dostępny, metalowy platynowy ciężarek może być użyty do zakotwiczenia plastra przed przejściem do następnego kroku. Zapoznaj się z załączoną listą materiałów, aby zapoznać się z przykładem drutu platynowego, który można ciąć i zginać na małe ciężary.</li>
	<li>W chłodni o temperaturze 4 °C zmieszać 100 μl macierzy zewnątrzkomórkowej o obniżonym czynniku wzrostu, wolnej od czerwieni fenolowej, ze 100 μl Leibovitz-10. Użyj do tego wstępnie schłodzonych końcówek pipet, w przeciwnym razie macierz zewnątrzkomórkowa zestali się w końcówce. 
	UWAGA: Ten stosunek matrycy i pożywki (1:1) tworzy żel wystarczająco gęsty, aby utrzymać PCLS w warunkach hodowli tkankowej.</li>
	<li>Delikatnie odpipetować matrycę, aby wymieszać, i ostrożnie pipetować na wierzchu PCLS, upewniając się, że żel znajduje się na wierzchu wycinka płuca i że plasterek nie unosi się na wierzchu żelu. Żel powinien działać jak obciążnik, zakotwiczając PCLS na dnie płytki.</li>
	<li>Ostrożnie przenieść szkło nakrywkowe z komorą do inkubatora o temperaturze 37 °C i pozostawić matrycę do zestalenia się na ~5 minut.</li>
	<li>Przenieś całe komorowe szkło nakrywkowe na wstępnie ogrzany stolik mikroskopu konfokalnego. Utrzymywać temperaturę 37 °C w komorze przez cały czas trwania obrazowania. Dostarczanie CO2 nie jest wymagane podczas inkubacji komórek przy użyciu pożywki Leibovitz.</li>
	<li>Ustaw zakres stosu z i zakres kafelków na podstawie żądanego interwału między klatkami. Podczas oglądania pod mikroskopem konfokalnym należy użyć obiektywu 20X (patrz Lista materiałów). Użyj narzędzia "kafelek", aby oznaczyć obszar zainteresowania w tkance, używając ustawienia "wyśrodkowana siatka" (np. siatka wyśrodkowana 2x2).</li>
	<li>Ustawiając zakres stosu z, sprawdź w wielu obszarach wycinka, czy ustawione zakresy są odpowiednie. 
	UWAGA: Zakres z będzie prawdopodobnie równy grubości tkanki. Każde płuco jest wyjątkowe, a ustawienia muszą być dostosowane do każdego eksperymentu. Kafelki 2x2 i 10 stosów z zazwyczaj dają ~1 klatkę/2 minuty. Upewnij się, że funkcja automatycznego ustawiania ostrości jest aktywna przed rozpoczęciem eksperymentu, aby zminimalizować dryf x-y i z-drift w okresie obrazowania.</li>
</ol>

<ol><li>Schneider, T., van Velzen, D., Moqbel, R., Issekutz, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+quantitation+of+eosinophil+and+neutrophil+recruitment+to+allergic+lung+inflammation+in+a+brown+Norway+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetics and quantitation of eosinophil and neutrophil recruitment to allergic lung inflammation in a brown Norway rat model.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 17 (6), 702-712 (1997).</li>
<li>Vermaelen, K. Y., Carro-Muino, I., Lambrecht, B. N., Pauwels, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+migratory+dendritic+cells+rapidly+transport+antigen+from+the+airways+to+the+thoracic+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Specific migratory dendritic cells rapidly transport antigen from the airways to the thoracic lymph nodes.</a> J Exp Med. 193 (1), 51-60 (2001).</li>
<li>Sung, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+lung+CD103+%28alphaE%29-beta7+integrin-positive+epithelial+dendritic+cell+population+expressing+Langerin+and+tight+junction+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins.</a> J Immunol. 176 (4), 2161-2172 (2006).</li>
<li>Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lasker+Basic+Medical+Research+Award.+Dendritic+cells%3A+versatile+controllers+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system.</a> Nat Med. 13 (10), 1155-1159 (2007).</li>
<li>Jakubzick, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph-migrating%2C+tissue-derived+dendritic+cells+are+minor+constituents+within+steady-state+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lymph-migrating, tissue-derived dendritic cells are minor constituents within steady-state lymph nodes.</a> J Exp Med. 205 (12), 2839-2850 (2008).</li>
<li>Julia, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+restricted+subset+of+dendritic+cells+captures+airborne+antigens+and+remains+able+to+activate+specific+T+cells+long+after+antigen+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A restricted subset of dendritic cells captures airborne antigens and remains able to activate specific T cells long after antigen exposure.</a> Immunity. 16 (2), 271-283 (2002).</li>
<li>Nakano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory+properties+of+pulmonary+dendritic+cells+are+determined+by+their+developmental+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Migratory properties of pulmonary dendritic cells are determined by their developmental lineage.</a> Mucosal Immunol. 6 (4), 678-691 (2013).</li>
<li>Nakano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+receptor+C5aR1%2FCD88+and+dipeptidyl+peptidase-4%2FCD26+define+distinct+hematopoietic+lineages+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Complement receptor C5aR1/CD88 and dipeptidyl peptidase-4/CD26 define distinct hematopoietic lineages of dendritic cells.</a> J Immunol. 194 (8), 3808-3819 (2015).</li>
<li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Pulm+Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulm Pharmacol Ther. 24 (5), 452-465 (2011).</li>
<li>Liberati, T. A., Randle, M. R., Toth, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+lung+slices%3A+a+powerful+approach+for+assessment+of+lung+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">In vitro lung slices: a powerful approach for assessment of lung pathophysiology.</a> Expert Rev Mol Diagn. 10 (4), 501-508 (2010).</li>
<li>Parrish, A. R., Gandolfi, A. J., Brendel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision-cut+tissue+slices%3A+applications+in+pharmacology+and+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Precision-cut tissue slices: applications in pharmacology and toxicology.</a> Life Sci. 57 (21), 1887-1901 (1995).</li>
<li>Bergner, A., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+stimulates+Ca2%2B+oscillations+and+contraction+in+airway+smooth+muscle+cells+of+mouse+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">ATP stimulates Ca2+ oscillations and contraction in airway smooth muscle cells of mouse lung slices.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (6), L1271-L1279 (2002).</li>
<li>Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Videomicroscopy+of+methacholine-induced+contraction+of+individual+airways+in+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices.</a> Eur Respir J. 9 (12), 2479-2487 (1996).</li>
<li>Henjakovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+testing+of+immune+responses+in+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 231 (1), 68-76 (2008).</li>
<li>Henjakovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+lung+function+measurements+in+precision-cut+lung+slices+%28PCLS%29+from+chemical+allergen-sensitized+mice+represent+a+suitable+alternative+to+in+vivo+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Ex vivo lung function measurements in precision-cut lung slices (PCLS) from chemical allergen-sensitized mice represent a suitable alternative to in vivo studies.</a> Toxicol Sci. 106 (2), 444-453 (2008).</li>
<li>Paddenberg, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxic+vasoconstriction+of+partial+muscular+intra-acinar+pulmonary+arteries+in+murine+precision+cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Res%22%5BJournal%5D)">Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices.</a> Respir Res. 7, 93(2006).</li>
<li>Wilson, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergic+sensitization+through+the+airway+primes+Th17-dependent+neutrophilia+and+airway+hyperresponsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Allergic sensitization through the airway primes Th17-dependent neutrophilia and airway hyperresponsiveness.</a> Am J Respir Crit Care Med. 180 (8), 720-730 (2009).</li>
<li>Schlitzer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cDC1-+and+cDC2-committed+DC+progenitors+reveals+early+lineage+priming+at+the+common+DC+progenitor+stage+in+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification of cDC1- and cDC2-committed DC progenitors reveals early lineage priming at the common DC progenitor stage in the bone marrow.</a> Nat Immunol. 16 (7), 718-728 (2015).</li>
<li>Baluk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+lymphatic+growth+in+bronchus-associated+lymphoid+tissue+in+sustained+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Preferential lymphatic growth in bronchus-associated lymphoid tissue in sustained lung inflammation.</a> Am J Pathol. 184 (5), 1577-1592 (2014).</li>
<li>Jurisic, G., Iolyeva, M., Proulx, S. T., Halin, C., Detmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus+cell+antigen+1+%28Thy1%2C+CD90%29+is+expressed+by+lymphatic+vessels+and+mediates+cell+adhesion+to+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Thymus cell antigen 1 (Thy1, CD90) is expressed by lymphatic vessels and mediates cell adhesion to lymphatic endothelium.</a> Exp Cell Res. 316 (17), 2982-2992 (2010).</li>
<li>Truman, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProxTom+lymphatic+vessel+reporter+mice+reveal+Prox1+expression+in+the+adrenal+medulla%2C+megakaryocytes%2C+and+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">ProxTom lymphatic vessel reporter mice reveal Prox1 expression in the adrenal medulla, megakaryocytes, and platelets.</a> Am J Pathol. 180 (4), 1715-1725 (2012).</li>
<li>Wigle, J. T., Oliver, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prox1+function+is+required+for+the+development+of+the+murine+lymphatic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system.</a> Cell. 98 (6), 769-778 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Opisany tutaj protokół został pierwotnie opracowany w celu wizualizacji lokalizacji dwóch podzbiorów cDC w płucach. Jednak protokół ten można łatwo dostosować do badania wielu różnych typów komórek, przy jednoczesnym zachowaniu żywotności komórek i trójwymiarowej architektury płuc. Ta ostatnia cecha jest istotną zaletą w porównaniu z systemami hodowli komórkowych i ułatwia identyfikację rzadkich typów komórek. Metoda opiera się na wytwarzaniu PCLS z płuc i odpowiedniej kombinacji przeciwciał w celu identyfikacji określon...

Po wdychaniu bodźców prozapalnych, takich jak lipopolisacharyd (LPS), następuje skoordynowany ruch komórek odpornościowych do, wewnątrz i z płuc. Na przykład neutrofile są szybko rekrutowane do miąższu płuc i dróg oddechowych. Ponadto niektóre profesjonalne komórki prezentujące antygen, znane jako konwencjonalne komórki dendrytyczne (cDC), przechodzą stosunkowo złożony wzorzec migracji1,2. cDC można zidentyfikować za pomocą cytometrii przepływowej, częściowo na podstawie wyświetlania znacznika powierzchniowego, CD11c. Odrębne podzbiory DC można rozróżnić na podstawie różnicowego wyrażenia powierzchni CD103 i CD11b3. Po nabyciu wziewnego antygenu niektóre cDC opuszczają płuca i migrują przez naczynia limfatyczne do węzłów chłonnych drenujących płuca (LN), gdzie prezentują peptydy limfocytom T specyficznym dla antygenu4. Jest to krytyczne wczesne zdarzenie w inicjacji adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych. Jednak z nieznanych przyczyn nie wszystkie cDC, które nabywają wdychane antygeny, opuszczają płuca, a wiele z tych komórek pozostaje w tym narządzie przez kilka miesięcy5,6. Obserwację tę można częściowo wyjaśnić pochodzeniem rozwojowym tych komórek, ponieważ komórki CD11c+ pochodzące z monocytów pozbawione receptora chemokiny, CCR7, nie są w stanie migrować do regionalnych LNs7,8. Wydaje się prawdopodobne, że potencjał migracyjny cDC jest również zdeterminowany, przynajmniej częściowo, przez ich anatomiczne położenie w płucach. Jednak dokładna lokalizacja tych różnych populacji cDC w płucach nie jest w pełni scharakteryzowana. Lepsza wiedza na temat lokalizacji komórek odpornościowych w płucach i cząsteczek, które nimi kierują, jest potrzebna do lepszego zrozumienia, w jaki sposób układ odpornościowy płuc zostaje aktywowany.
PCLS są coraz częściej używane jako podejście ex vivo do wizualizacji pozycjonowania komórkowego i interakcji komórka-komórka, przy jednoczesnym zachowaniu integralności strukturalnej architektury płuc9,10. PCLS były używane do badania płuc wielu gatunków, w tym myszy, bydła, małp, owiec, koni i ludzi11. Główną zaletą tej techniki jest to, że z jednego płata płuca myszy można przygotować około 20 plastrów, zmniejszając w ten sposób liczbę zwierząt potrzebnych do indywidualnych eksperymentów. Praktycznie wszystkie typy komórek odpornościowych, w tym DC, makrofagi, neutrofile i limfocyty T, są obecne w PCLS i utrzymują swoje normalne struktury.
PCLS może być również używany do badania sygnalizacji wapniowej i kurczliwości komórek dróg oddechowych i mięśni gładkich po leczeniu acetylocholiną12 lub metacholina13. W tym podejściu tylko niewielka część płuc jest analizowana mikroskopowo, ale jedno z badań wykazało, że pomiary skurczu dróg oddechowych w PCLS różnią się tylko o około 10% w zależności od plasterka, a wariancja ta jest porównywalna z tą obserwowaną przy użyciu testów czynnościowych płuc u nienaruszonych zwierząt14. Inni badacze wykorzystali PCLS jako podejście ex vivo do badania zmian w ekspresji cytokin i markerach powierzchni komórek po inkubacji z LPS15. PCLS stosowano również w modelu ex vivo niedotlenienia naczyń płucnych w małych tętnicach wewnątrzgroniastych. Naczynia te znajdują się w części płuca, do której nie można dotrzeć za pomocą innych procedur, w tym nagrań z wypreparowanych odcinków tętnic lub analizy naczyń podopłucnowych16. Nasze laboratorium wykorzystało przede wszystkim PCLS do wizualizacji lokalizacji komórek odpornościowych w żywej tkance płucnej w stanie stacjonarnym i po bodźcu zapalnym in vivo. Procedury, które opracowaliśmy w tym celu, są następujące.

<table><tbody><tr><td>Myszy C57BL/6J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Transgeniczne myszy Prox1-TdTomato&nbsp;</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>018128</td><td>B6; 129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J</td></tr><tr><td>OT-II TCR X Nur77-GFP transgeniczne myszy specyficzne dla OVA</td>, <td>Jackson Laboratory</td><td>004194, 016617</td><td>B6. Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J&nbsp;</td></tr><tr><td>Myszy z nokautem Rag1</td><td>Jackson Laboratory</td><td>002216</td><td>B6.129S7-Rag1tm1Mom/J</td></tr><tr><td>Albumina jaja kurzego, Low Endo, oczyszczona</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS003059</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacharydy z Escherichia coli</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>L2630-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa (niesterylna) 100 ft</td><td>BD Systemy diagnostyczne</td><td>427421</td><td>Średnica wewnętrzna 0,86 mm, średnica zewnętrzna 1,27 mm</td></tr><tr><td>Sito GeneMate GQA Agaroza niskotopliwa</td><td>BioExpress</td><td>E-3112-125</td><td>2% roztwór rozpuszczony w PBS w temperaturze 70 & stopni; C i utrzymywane w temperaturze 40 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Compresstome VF-300</td><td>Instrumenty precyzyjne, Inc.</td><td>VF-300</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia elektronowa</td> z<td>podwójną krawędzią ze stali nierdzewnej</td> Sciences <td>72000</td><td>Jednorazowe; 250 / pudełko. Ostrze należy wymieniać dla każdego płuca.</td></tr><tr><td>Krazy Glue Uniwersalny żel błyskawiczny</td><td>VWR</td><td>500033-484</td><td>Powszechnie dostępny za 3 USD za tubę w lokalnych drogeriach&nbsp;</td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium, bez czerwieni fenolowej</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica szczura (NRS)</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td><td>012-000-120</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica myszy (NMS)</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td><td>015-000-120</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Hyklon</td><td>SH30071.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Bufor barwiący</td><td>Wyprodukowany w domu</td><td>Nie dotyczy</td><td>PBS z 0,5% albuminą surowicy bydlęcej, 0,1% NaN3, bloker pH 7,4</td></tr><tr><td>Fc (przeciwciała anty-CD16/32)</td><td>Wyprodukowano w domu</td><td>Nie dotyczy</td><td>Supernatant hodowlanej linii komórkowej hybrydoma 2.4G2</td></tr><tr><td>Anty-mysi CD11b eFluor 450 eBioscience</td><td></td><td>48-0112-80</td><td>Przeciw myszom CD11b eFluor 450 (klon: M1/70)&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-mysz CD11c Brilliant Violet 605</td><td>BioLegend</td><td>101237</td><td>Brilliant Violet 605 anty-mysz CD11c (klon: M1/70)</td></tr><tr><td>Anty-mysia CD11c Fikoerytryna</td><td>eBioscience</td><td>12-0114-82</td><td>PE sprzężona z anty-myszą CD11c (klon: N418)</td></tr><tr><td>Anty-mysia CD11c Allofikocyjanina</td><td>BD Phamingen</td><td>550261</td><td>Anty-mysia CD11c znakowana APC 9klon: HL3)</td></tr><tr><td>Anty-mysia fikoerytryna</td> <td>CD88BioLegend</td><td>135806</td><td>PE anty-mysi CD88 (klon: 20/70)</td></tr><tr><td>Anty-mysia CD103 Allofikocyjanina</td><td>eBioscience</td><td>17-1031-82</td><td>Anty-mysia CD103 APC (klon: 2E7)</td></tr><tr><td>Anty-mysz CD90.2/Thy1.2 eF450</td><td>eBioscience</td><td>48-0902-82</td><td>Anty-mysz CD90.2 eFluor 450 (klon: 53-2.1)</td></tr><tr><td>Anty-mysz CD172a/Sirp1a Allofikocyjanina</td><td>eBioscience</td><td>17-1721-82</td><td>Anty-mysz CD172a APC (klon: P84)</td></tr> <tr><td>Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421</td><td>BD Horizon</td><td></td><td>564188 BV421 mysz anty-E Cadherin (klon: 5E8 znany również jako 5E8-G9-B4)</td></tr> <tr><td>Anty-mysz CD324 Alexa Fluor 488</td><td>eBioscience</td><td>53-3249-82</td><td>Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (klon: DECMA-1)</td></tr> <tr><td>Anty-mysz CD324 Alexa Fluor 647</td><td>eBioscience</td><td>51-3249-82</td><td>Anti-CD324 (E-Kadheryna) Alexa Flour 647 (klon: DECMA-1)</td></tr><tr><td>Naczynia Microwell ze szklanym dnem 35 mm szalka Petriego, 14 mm Microwell, nr 1.5 szkło osłonowe</td><td>MatTek Corperation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Komorowa szklana osłona</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>155411PK&nbsp;</td><td>Opakowanie 16 szt</td></tr>.<tr><td>Szkiełko nakrywkowe 15 mm, nr 1,5 Grubość szkła</td><td>MatTek Corperation</td><td>PCS-1.5-15</td><td></td></tr><tr><td>Bare Platinum Wire</td><td>World Precision Instruments</td><td>PTP201</td><td>Średnica 0,020" (0,5 mm) pocięte na kawałki o długości ~1 cm i wygięte w kształt litery "L"</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade</td><td>Mountant ThermoFisher Scientific</td><td>P36934</td><td>Trzymaj w 4 & stopniach; C, przed użyciem rozgrzać do temperatury pokojowej.</td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Podstawna membrana membranowa, bez czerwieni fenolowej, *LDEV-Free</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Wielofotonowy laserowy mikroskop skaningowy Zeiss 880</td> Oprogramowanie <td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Zen Black wersja 8.1, 2012 (Zeiss)</td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 20X/0,8 M27 nadaje obiektyw</td><td>Carl Zeiss</td><td>420650-9901-000</td><td></td></tr></tbody></table>

precyzyjnie wycięte plastry płuc myszy do wizualizacji żywych komórek dendrytycznych płuc

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Wdychanie alergenów i patogenów wywołuje wiele zmian w różnych typach komórek odpornościowych w płucach. Cytometria przepływowa jest potężną techniką analizy ilościowej białek powierzchniowych komórek na komórkach odpornościowych, ale nie dostarcza żadnych informacji na temat lokalizacji i wzorców migracji tych komórek w płucach. Podobnie testy chemotaksji można przeprowadzić w celu zbadania potencjału komórek do reagowania na czynniki chemotaktyczne in vitro, ale testy te nie odtwarzają złożonego środowiska nienaruszonego płuca. W przeciwieństwie do tych wyżej wymienionych technik, lokalizację poszczególnych typów komórek w płucach można łatwo zobrazować, generując precyzyjnie cięte plastry płuc (PCLS), barwiąc je dostępnymi na rynku, fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami i wizualizując skrawki za pomocą mikroskopii konfokalnej. PCLS może być stosowany zarówno do żywej, jak i utrwalonej tkanki płucnej, a plastry mogą obejmować obszary tak duże, jak przekrój poprzeczny całego płata. Wykorzystaliśmy ten protokół, aby z powodzeniem zobrazować lokalizację szerokiej gamy typów komórek w płucach, w tym różnych typów komórek dendrytycznych, makrofagów, neutrofili, limfocytów T i limfocytów B, a także komórek strukturalnych, takich jak komórki limfatyczne, śródbłonka i nabłonka. Zdolność do wizualizacji interakcji komórkowych, takich jak te między komórkami dendrytycznymi a limfocytami T, w żywej, trójwymiarowej tkance płucnej, może ujawnić, w jaki sposób komórki poruszają się w płucach i oddziałują ze sobą w stanie stacjonarnym i podczas stanu zapalnego. Tak więc, w połączeniu z innymi procedurami, takimi jak cytometria przepływowa i ilościowy PCR, PCLS może przyczynić się do kompleksowego zrozumienia zdarzeń komórkowych, które leżą u podstaw chorób alergicznych i zapalnych płuc.

Aby zidentyfikować lokalizację dwóch subpopulacji DC, CD1bhi cDCs oraz CD103+ cDCs, wykonano cięcia PCLS z myszy C57BL/6 i poddano je barwieniu przeciwciałami monoklonalnymi (mAbs) specyficznymi dla CD11c, CD8, CD103 oraz CD324 (E-kadheryna). Przeciwciała przeciwko CD324 barwią komórki nabłonka dróg oddechowych, a CD8 jest prezentowany na makrofagach i neutrofilach, ale nie na cDCs8. Pozwoliło nam to odróżnić cDCs od makrofagów CD1c+</sup...

Opisujemy metodę generowania precyzyjnie wycinanych plastrów płuc (PCLS) i ich barwienia immunologicznego, aby zobrazować lokalizację różnych typów komórek odpornościowych w płucach. Nasz protokół można rozszerzyć w celu wizualizacji lokalizacji i funkcji wielu różnych typów komórek w różnych warunkach.

Precyzyjnie wycięte plastry płuc myszy do wizualizacji żywych komórek dendrytycznych płuc

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

Ogólnym celem tej metody jest wykorzystanie precyzyjnie wycinanych plastrów płuc (PCLS) do wizualizacji lokalizacji i transportu różnych typów komórek odpornościowych w płucach. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny immunologii, takie jak wzorce lokalizacji i migracji komórek odpornościowych w płucach. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wizualizacji wielu oddziaływań w żywej tkance ex vivo, która zachowuje trójwymiarową architekturę płuc.Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat lokalizacji i transportu komórek odpornościowych podczas stanu zapalnego, może być ona również wykorzystana do wizualizacji skurczu tkanek dróg oddechowych oraz mięśni gładkich. Aby pobrać tkankę płucną, należy najpierw za pomocą nożyczek rozciąć skórę i otrzewną od środka brzucha aż do żuchwy myszy w wieku od 6 do 12 tygodni, a następnie przesunąć jelita na bok jamy brzusznej. Przeciąć żyłę główną dolną, aby odprowadzić krew z płuc, i użyć ostrej końcówki nożyczek do przebicia przepony, co umożliwi rozszerzenie klatki piersiowej.Następnie za pomocą pincety należy ręcznie odsunąć gruczoły ślinowe i inne tkanki od tchawicy, a następnie użyć precyzyjnej pincety, aby wykonać nacięcie w tchawicy po stronie przedniej w miejscu najgrubszego pierścienia chrzęstnego, na tyle duże, aby umożliwić penetrację igły 20 G. Teraz należy nasunąć igłę 20 G o długości 1,5 cala na odcinek rurki polietylenowej i odciąć rurkę pod kątem około 45 stopni. Igłę należy przymocować do strzykawki o pojemności 1 ml i nabrać do niej 0,8 ml 2% agarozy niskotopliwej o temperaturze 40 °C.Po napełnieniu całej rurki agarozą, wprowadź ścięty koniec rurki do nacięcia i powoli wstrzyknij agarozę do płuc. Nie przesuwając igły ani strzykawki, przymocuj strzykawkę taśmą do polistyrenowej podstawy, aby unieruchomić igłę w tchawicy, a następnie umieść zwierzę w temperaturze 4 degrees Celsius na co najmniej 10 minut. Po zestaleniu się agarozy, ostrożnie wyciśnij płuca za pomocą nożyczek i umieść je w naczyniu o średnicy trzech centymetrów zawierającym lodowaty PBS.Następnie obróć płat przeznaczony do krojenia tkanek tak, aby wewnętrzna część płuca łącząca się z tchawicą była skierowana w dół. Aby pokroić tkankę płucną, najpierw nanieś małą kroplę kleju błyskawicznego All Purpose No Run gel na metalny tłok strzykawki, rozprowadzając go kolistym ruchem. Po nałożeniu całego kleju, za pomocą pęsety natychmiast, lecz delikatnie, chwyć wycięty płat stroną tchawicy do dołu i osusz go chusteczką, aby usunąć nadmiar cieczy.Ostrożnie umieść wysuszony płat na górnej części tłoka i odetnij nadmiar tkanki wystającej poza krawędź tłoka. Przesuń tłok w dół tak, aby ścianki metalowej strzykawki przesunęły się w górę i objęły tkankę, tworząc w trzonie strzykawki zagłębienie z płucem na dnie, którego głębokość nie przekracza kilku centymetrów. Oklej taśmą dół strzykawki, aby ustabilizować tłok w tej pozycji.Następnie ostrożnie wlej 2% niskotopiącą agarozę o temperaturze 40 °C do strzykawki tak, aby wprost przykryła górną część płata, a następnie otocz metalową strzykawkę blokiem chłodzącym z lodem. Po jednej lub dwóch minutach umieść strzykawkę z preparatem w automatycznym slicerze i ustaw nowe ostrze. Następnie napełnij zbiornik z buforem lodowatym PBS.Wyrównaj napęd silnika krokowego z strzykawką z preparatem i usuń taśmę. Przełącz przełącznik w pozycję szybkiego przesuwania do przodu, aż napęd silnika krokowego lekko dotknie tylnej części tłoka. Ustaw grubość tkanki, tryb ciągłego cięcia pojedynczych plastrów, oscylację oraz prędkość na krojonce.Następnie naciśnij start i za pomocą cienkiej szpatułki zbieraj każdy fragment PCLS w momencie wpadania do zbiornika z buforem, umieszczając plastry w oddzielnych studzienkach płytki 24-dołkowej zawierającej lodowaty PBS. W przypadku statycznego obrazowania PCLS, przenieś próbki płuc zawierające interesujący obszar anatomiczny do oddzielnych naczyń o średnicy trzech centymetrów zawierających jeden mililitr odpowiedniego koktajlu przeciwciał. Po 30 do 60 minutach w lodzie, przy kołysaniu i ochronie przed światłem, wypłucz plastry dwukrotnie jednym mililitrem lodowatego PBS.Następnie do każdego nowego, okrągłego naczynia z szklanym dnem o średnicy trzech centymetrów należy dodać 50 µL PBS na każdą próbkę, a następnie szybko przenieść plastry do każdej kropli, delikatnie manipulując fragmentami tkanki tak, aby były rozłożone płasko. Następnie za pomocą pipety należy odessać PBS, nanieść na szkiełko kroplę medium montażowego o temperaturze pokojowej, a następnie przykryć je szkiełkiem nakrywką. Aby obrazować tkankę, należy umieścić naczynie na stole mikroskopu konfokalnego pod obiektywem 20x i użyć narzędzia do skanowania obszarowego (tile tool) w celu zlokalizowania i zaznaczenia krawędzi tkanki w ustawieniu otoczki wypukłej (convex hull), aby skrócić czas skanowania.Następnie ustaw zakres stosu z (z-stack), dbając o to, aby wyznaczone zakresy były odpowiednie dla wielu obszarów skrawka, w szczególności wzdłuż jego krawędzi. W przypadku obrazowania żywych komórek, po 30 minutach inkubacji w odpowiednim koktajlu przeciwciał, przepłucz skrawki dwukrotnie jedną mililitrem zimnego medium Leibovitz 10. Następnie dodaj 50 µL świeżego medium Leibovitz 10 do jednego otworu szkiełka nakrywkowego z komorami dla każdej próbki, a następnie niezwłocznie przenieś każdy PCLS do medium, delikatnie manipulując tkankami, aż zostaną one płasko rozłożone.Następnie za pomocą pipety odessaj pożywkę z każdej komory i przymocuj każdy PCLS za pomocą platynowego obciążnika. Ostrożnie nanieś świeżo przygotowaną, lodowatą macierz zewnątrzkomórkową na każdy PCLS, dbając o to, aby żel został umieszczony na wierzchu skrawków płuca i aby skrawki nie unosiły się na powierzchni żelu. Po pięciu minutach w temperaturze 37 °C przenieś preparat do uprzednio podgrzanej komory mikroskopu konfokalnego ustawionej na 37 °C pod obiektywem 20x.Następnie należy ustawić zakresy stosu z oraz kafelkowania w oparciu o pożądany interwał między klatkami, używając narzędzia do kafelkowania w celu oznaczenia obszaru zainteresowania w tkance oraz ustawienia siatki centralnej, aby wycentrować próbkę w polu widzenia. Konwencjonalne komórki dendrytyczne z wysoką ekspresją CD11b lokalizują się w miąższu płuc, podczas gdy konwencjonalne komórki dendrytyczne CD103 pozytywne znajdują się głównie wokół dróg oddechowych i w obszarze podpleuralnym. Podwójne barwienie na CD88 i CD172a pozwala na odróżnienie makrofagów pęcherzykowych CD172a negatywnych i CD88 pozytywnych od makrofagów śródmiąższowych CD172a pozytywnych i CD88 pozytywnych, z których ci drudzy lokalizują się preferencyjnie w miąższu, a nie w obszarze podnabłonkowym.Podwójne znakowanie CD90.2, znanego markeru limfocytów T, oraz białka fluorescencyjnego TdTomato, transgenu pod kontrolą transkrypcyjną głównego czynnika transkrypcyjnego niezbędnego do limfangiogenezy, ułatwia identyfikację struktur limfatycznych w płucach. Konwencjonalne komórki dendrytyczne wykazujące ekspresję CD103 występują w kilku obszarach anatomicznych, w tym w nabłonku dróg oddechowych wykazującym ekspresję CD324, w naczyniach limfatycznych oraz w obszarze podpleuralnym. Ruch komórek oraz oddziaływania międzykomórkowe mogą być rejestrowane za pomocą obrazowania żywych komórek, tak jak właśnie zaprezentowano.Na przykład w reprezentatywnym eksperymencie, 16 godzin po doustnym podaniu ova-LPS, można wyraźnie zaobserwować interakcję komórek dendrytycznych wykazujących ekspresję CD103 z adoptywnie przeniesionymi limfocytami T specyficznymi dla ova w okresie czterech godzin. Po opanowaniu techniki, przygotowanie tkanki oraz krojenie mogą zostać wykonane w dwie i pół godziny, pod warunkiem właściwego przeprowadzenia procedury. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zapewnienie prawidłowego napowietrzenia płuc agarozą oraz dbanie o to, aby delikatne skrawki płuc pozostały jak najbardziej płaskie podczas obrazowania.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak traktowanie PCLS acetylocholiną lub metacoliną, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące sygnalizacji wapniowej i kurczliwości dróg oddechowych w różnych stanach chorobowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować precyzyjnie cięte plastry płuc w celu wizualizacji lokalizacji, transportu i interakcji komórek odpornościowych w płucach.

precision-cut-mouse-lung-slices-to-visualize-live-pulmonary-dendritic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Dysocjacja komórek z określonych typów tkanek wymaga zastosowania specyficznych parametrów agitacji tkanki, aby uzyskać dużą liczbę żywotnych komórek zdolnych do hodowli. Dysocjator Miltenyi gentleMACS optymalizuje to zadanie dzięki prostemu i praktycznemu protokołowi. W niniejszej publikacji wyjaśniono sposób wykorzystania tego urządzenia w odniesieniu do tkanki płucnej.

Standaryzowane przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z tkanki płuc myszy przy użyciu dysocjatora gentleMACS

Prezentujemy metodę niechirurgicznego podawania materiałów testowych do płuc znieczulonych myszy poprzez tchawicę. Metoda ta umożliwia ekspozycję płuc na patogeny bakteryjne i wirusowe, cytokiny, przeciwciała, koraliki, związki chemiczne lub barwniki. Ponadto opisujemy proces pobierania i przygotowania płuc oraz drenujących je węzłów chłonnych (LDLNs) do analizy metodą cytometrii przepływowej.

Niesurgicalna instylacja endotrachealna u myszy z analizą płuc oraz drenujących płuca węzłów chłonnych za pomocą cytometrii przepływowej

Opisano metodę otrzymywania wysoce oczyszczonej preparacji komórek dendrytycznych z płuc myszy. Szczególny nacisk położono na izolację podgrupy konwencjonalnych komórek dendrytycznych.

Izolacja komórek dendrytycznych z płuc myszy

Nowy protokół opisany w niniejszym badaniu umożliwia selekcyjne wykrywanie przerzutów do płuc z rozdzielczością pojedynczych komórek u myszy poprzez połączenie perfuzji i fiksacji płuc in-situ oraz barwienia X-Gal komórek nowotworowych znakowanych genem lacZ.

Ulepszona wizualizacja przerzutów do płuc w rozdzielczości pojedynczych komórek u myszy poprzez połączoną perfuzję in-situ tkanki płucnej i barwienie X-Gal komórek nowotworowych znakowanych lacZ

Ten film opisuje przygotowanie zawiesiny komórek płuc myszy do analizy metodą cytometrii przepływowej w celu zbadania ekspresji PD-L1 komórek gruczolakoraka płuc.

Przygotowanie płuc myszy do cytometrii przepływowej: generowanie zawiesiny komórkowej z tkanki płucnej do analizy cytometrii przepływowej

Przedstawiony tutaj jest protokół zachowania kurczliwości naczyniowej mysiej tkanki płucnej PCLS, co daje wyrafinowany trójwymiarowy obraz układu oddechowego i dróg oddechowych, który może być zachowany przez okres do 10 dni, który jest podatny na liczne zabiegi.

Precyzyjnie wycięte plastry płuc jako skuteczne narzędzie do badań ex vivo struktury i kurczliwości naczyń płucnych

W tym badaniu prezentujemy skuteczny i powtarzalny protokół izolowania populacji immunologicznych mysiego układu oddechowego. Zapewniamy również metodę identyfikacji wszystkich wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych, które znajdują się w płucach zdrowych myszy, przy użyciu 9-kolorowego panelu cytometrii przepływowej.

Analiza cytometrii przepływowej w celu identyfikacji wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych płuc myszy

Obecny protokół opisuje przygotowanie i wykorzystanie precyzyjnie wyciętych plastrów płuc myszy do oceny kurczliwości dróg oddechowych i mięśni gładkich tętnic wewnątrzpłucnych w środowisku prawie in vivo.

Wykorzystanie precyzyjnie wyciętego wycinka płuc do badania regulacji skurczowej dróg oddechowych i mięśni gładkich tętnic śródpłucnych

Tutaj opisujemy prosty i ekonomiczny protokół do przeprowadzenia bezstronnej kwantyfikacji gęstości mikrokrążenia płuc dla całej tkanki płucnej myszy za pomocą pojedynczego barwienia izolektyny B4.

Kwantyfikacja gęstości mikronaczyniowej płuc u myszy w poprzek zrazików

Prezentujemy metodę modelu patogenezy grzybów, która zachowuje naturalne położenie zarodników grzybów w drogach oddechowych płuc do analizy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Skuteczna metoda obrazowania płuc myszy, która zachowuje dynamikę przestrzenną zarodników grzybów w drogach oddechowych

Poznaj metodę precyzyjnie wyciętych plastrów płuc myszy do wizualizacji lokalizacji i migracji komórek dendrytycznych w tkance płucnej. Ta technika umożliwia obserwację interakcji immunologicznych w żywym środowisku ex vivo.

Precyzyjnie wycięte plastry płuc myszy do wizualizacji żywych komórek dendrytycznych płuc

Przeglądaj więcej filmów