Name: Zastosowanie całościowej metody immunohistochemicznej do badania unerwienia dróg żółciowych u Suncus murinus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Poznaj metodę immunohistochemii całościowej do wizualizacji unerwienia dróg żółciowych u Suncus murinus. Technika ta umożliwia analizę nerwów w małych i nieregularnych narządach wewnętrznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Metropolitalnego w Tokio (IACUC). Zwierzęta były trzymane i traktowane zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz Przewodnikiem opieki i wykorzystania zwierząt doświadczalnych Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami. Wykorzystaliśmy zwierzęta wyhodowane i utrzymywane w Laboratorium Morfologii Funkcjonalnej, Wydział Nauk o Zdrowiu w Tokio, Japonia.
1. Opieka nad zwierzętami i ich trzymanie
<ol>
	<li>Pozyskać 7 S. murinus (3 samice i 4 samce o wadze 70-90 g) z zamkniętej kolonii hodowlanej.</li>
	<li>Po odsadzeniu (20 dni po urodzeniu) należy umieścić S. murinus w klatkach z tworzywa sztucznego wyposażonych w drewnianą budkę lęgową zawierającą paski papieru. Trzymaj je w konwencjonalnie klimatyzowanym pomieszczeniu dla zwierząt: 23-27 °C, bez kontroli wilgotności i cykl 12:12 godzin światło: ciemność. Dostarczaj komercyjne pelety z pstrąga i wodę ad libitum.</li>
</ol>
2. Przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Aby przygotować 4% (w/v) paraformaldehydu (PFA), rozpuść 40 g PFA w 1,000 ml 0,01 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,4). W dygestorium mieszaj za pomocą wiru, aż roztwór będzie klarowny. Przechowywać 4% PFA O/N w temperaturze 4 °C. 
	Ostrzeżenie: Podczas obchodzenia się z PFA należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE).</li>
	<li>Aby wykonać perfuzję i utrwalić zwierzę, znieczulij je eterem, a następnie wstrzyknij dootrzewnowo somnoopentyl (pentobarbital sodu, 0,6 ml/kg masy ciała).</li>
	<li>Po całkowitym narkotyzowaniu zwierzęcia otwórz jamę brzuszną skalpelem, tworząc nacięcie brzucha w linii środkowej o długości 3 cm. Podczas nacinania żyły głównej dolnej w celu wykrwawienia, wprowadzić cewnik wstecznie do aorty brzusznej na poziomie bezpośrednio powyżej rozwidlenia tej tętnicy do tętnic biodrowych wspólnych.</li>
	<li>Wstrzyknąć somnopentyl (pentobarbital sodu, 1,0 ml/kg masy ciała). Po całkowitej eutanazji perfaktor z 0,01 M PBS (pH 7,4), a następnie z 4% PFA w dygestorium.</li>
	<li>Po perfuzji wstrzyknij 2-3 ml białego lateksu neoprenowego (rozcieńczyć biały lateks neoprenowy 3:2 wodą destylowaną (DW)) w celu oznaczenia naczyń krwionośnych.</li>
	<li>Wyodrębnij narządy jamy brzusznej, w tym wątrobę, woreczek żółciowy, wspólny przewód żółciowy, dwunastnicę i trzustkę en bloc, wraz z powiązanymi nerwami i naczyniami.</li>
	<li>Wstrzyknąć około 0,1 ml niebieskiego lateksu neoprenowego (dodać kroplę niebieskiego atramentu do 10 ml rozcieńczonego białego lateksu neoprenowego) do pęcherzyka żółciowego, aby oznaczyć układ żółciowy.</li>
	<li>Po utrwaleniu przez noc z 4% PFA w temperaturze 4 °C w celu barwienia immunologicznego całego wierzchodu. 
	Uwaga: PFA jest toksyczny. Unikaj bezpośredniego obchodzenia się z PFA. PFA powinien być stosowany w dygestorium.</li>
</ol>
3. Immunohistochemia w całości
Uwaga: Przez cały czas trwania protokołu, w tym podczas mycia, inkubacji przeciwciał i barwienia, próbka musi pozostać na nutatorze, delikatnie kołysząc się w temperaturze RT lub 4°C.
<ol>
	<li>Dzień 1: Leczenie enzymatyczne i inaktywacja potencjalnej endogennej peroksydazy
	<ol>
		<li>Przygotowany preparat należy przemyć za pomocą DW 4x przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w szklanej fiolce o odpowiedniej wielkości. Delikatnie kołysz próbką na nutatorze, aby usunąć PFA. Unikaj uszkodzenia próbki podczas wymiany roztworów.</li>
		<li>Aby przygotować 1% (w/v) kwasu ortoperiodycznego, rozpuść 1 g kwasu ortoperiodycznego w 100 ml DW.</li>
		<li>Inkubować próbkę w 1% kwasie ortoperiodycznym przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby zapobiec jakiejkolwiek wewnętrznej reakcji peroksydazy.</li>
		<li>Przygotować 0,004% (w/v) papainy, rozpuszczając 0,004 g papainy w 100 ml buforu Tris-HCl o stężeniu 0,025 mol/l (pH 7,6).</li>
		<li>Myć próbkę DW przez 10 minut w temperaturze suchej temperatury.</li>
		<li>Inkubować próbkę w świeżo przygotowanym 0,004% papainie przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w kąpieli o stałej temperaturze z delikatnym kołysaniem.</li>
		<li>Myć próbkę DW przez 50-60 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przechowywać próbkę w 4% PFA w temperaturze 4 °C O/N.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2: Leczenie enzymatyczne
	<ol>
		<li>Przechowywaną próbkę przemyć DW 4 razy po 1 godzinie w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Inkubować próbkę w świeżo przygotowanym 0,004% papainie przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w kąpieli o stałej temperaturze z delikatnym kołysaniem.</li>
		<li>Umyć próbkę DW przez 50-60 minut w temperaturze pokojowej. Przechowywać próbkę w 4% PFA w temperaturze 4 °C O/N.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 3: Zabieg zamrażania
	<ol>
		<li>Przechowywaną próbkę przemyć DW 4x przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, jak wyżej.</li>
		<li>Przygotować 2,5% (w/v), 5% (w/v) i 10% (w/v) sacharozy, rozpuszczając odpowiednio 2,5 g, 5 g i 10 g sacharozy w 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4).</li>
		<li>Zanurz próbkę w 2,5% (w/v), 5% (w/v) i 10% (w/v) sacharozie na 30 minut każdy.</li>
		<li>Zamrażać próbkę w temperaturze -20 °C przez 30-60 minut, a następnie całkowicie rozmrozić ją w temperaturze pokojowej; powtórzyć cykl 3 razy.</li>
		<li>Aby przygotować 2% Triton X-100 (v/v), dodaj 2 ml Triton X-100 do 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4).</li>
		<li>Przechowywać próbkę w 2% Triton X-100 w temperaturze 4 °C O/N.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 4: Inkubacja przeciwciał pierwotnych
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór rozcieńczający przeciwciała pierwszorzędowego, rozpuszczając 0,2 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,3 ml Triton X-100 i 0,1 g azydku sodu w 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4). 
		Uwaga: Azydek sodu jest silnie toksyczny. Należy unikać wdychania i dotykania. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.</li>
		<li>Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe (NFP) w stosunku 1:600 w powyższym buforze do rozcieńczania (krok 3.4.1). Inkubować próbkę z przeciwciałem NFP w temperaturze 4 °C przez 3-6 dni, delikatnie kołysząc próbkę na nutatorze. Większe okazy będą wymagały wydłużenia czasu inkubacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja przeciwciał wtórnych
	<ol>
		<li>Przemyć próbkę w PBS 4x przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała pierwszorzędowego.</li>
		<li>Przygotować roztwór rozcieńczający dla przeciwciała drugorzędowego, rozpuszczając 0,2 g BSA i 0,3 ml Triton X-100 w 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4).</li>
		<li>Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe (sprzężone z peroksydazą, oczyszczone z powinowactwa owcze przeciwciało anty-mysie IgG-HRP) w stosunku 1:600 w buforze rozcieńczającym (etap 3.5.2). Inkubować próbkę z przeciwciałem drugorzędowym w temperaturze 4 °C przez 3 dni i delikatnie kołysać próbkę na nutatorze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zabarwienie
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór barwiący DAB, dodając 0,002 g czterochlorowodorku 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) do 100 ml buforu Tris-HCl o stężeniu 0,05 mol/l (pH 7,6) pod dygestoriami, utrzymując roztwór w ciemności.</li>
		<li>Umyć próbki w RT w PBS 4x przez 1 godzinę każda.</li>
		<li>Dodać 10 μl 30%H2O2do świeżo przygotowanego roztworu barwiącego DAB i inkubować z roztworem w temperaturze 4 °C O/N lub przez 3 dni, delikatnie kołysząc nutatorem.</li>
		<li>Zatrzymaj reakcję, umieszczając próbkę w PBS z 0,04% azydkiem sodu po osiągnięciu optymalnej intensywności barwienia. 
		UWAGA: Do tego etapu należy unikać stosowania azydku sodu, ponieważ hamuje on peroksydazę chrzanową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie zabarwionej tkanki
	<ol>
		<li>Ostrożnie przenieść próbkę do naczynia ze szkła Petriego (5 cm wysokości, 10 cm średnicy) zawierającego PBS. Rejestruj obrazy z pełnym zamontowaniem za pomocą kamery zamontowanej na mikroskopie stereoskopowym. 
		UWAGA: Cała zabarwiona tkanka powinna być obrazowana, gdy jest całkowicie zanurzona w PBS na przezroczystym szklanym naczyniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kuratani, S., Tanaka, S., Ishikawa, Y., Zukeran, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+of+the+hypoglossal+nerve+in+the+chick+embryo+as+observed+by+the+whole-mount+nerve+staining+method%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Early development of the hypoglossal nerve in the chick embryo as observed by the whole-mount nerve staining method.</a> Am. J. Anat. 182 (2), 155-168 (1988).</li>
<li>Kuratani, S., Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+development+of+the+avian+vagus+nerve+with+special+reference+to+the+morphological+innervation+of+heart+and+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Embryol.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Peripheral development of the avian vagus nerve with special reference to the morphological innervation of heart and lung.</a> Anat. Embryol. (Berl). 182 (5), 435-445 (1990).</li>
<li>Kuratani, S., Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+development+of+avian+trigeminal+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Peripheral development of avian trigeminal nerves.</a> Am. J. Anat. 187 (1), 65-80 (1990).</li>
<li>Yi, S. Q., et al. House musk shrew, Suncus murinus: a novel and natural obesity-resistant animal model. Obes. Metab. 6, 22-28 (2010).</li>
<li>Yi, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+anatomy+of+innervation+of+the+gallbladder+in+humans+and+Suncus+murinus+with+special+reference+to+morphological+understanding+of+gallstone+formation+after+gastrectomy%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Surgical anatomy of innervation of the gallbladder in humans and Suncus murinus with special reference to morphological understanding of gallstone formation after gastrectomy.</a> World J. Gastroenterol. 13 (14), 2066-2071 (2007).</li>
<li>Yi, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+study+of+the+pancreas+in+the+house+musk+shrew%2C+Suncus+murinus%2C+with+special+reference+to+the+blood+supply+and+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec.+A+Discov.+Mol.+Cell+Evol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Anatomical study of the pancreas in the house musk shrew, Suncus murinus, with special reference to the blood supply and innervation.</a> Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 273 (1), 630-635 (2003).</li>
<li>Yi, S. Q., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15782096">Surgical anatomy of the innervation of the major duodenal papilla in humans and Suncus murinus, from the perspective of preserving innervation in organ-saving procedures.</a> Pancreas. 30 (3), 211-217 (2005).</li>
<li>Yi, S. Q., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4087648/">Surgical anatomy of the innervation of the pylorus in humans and Suncus murinus, in relation to the surgical technique for pylorus-preserving pancreatoduodenectomy.</a> World J. Gastroenterol. 12 (14), 2209-2216 (2006).</li>
<li>Yi, S. Q., Ren, K., Kinoshita, M., Takano, N., Itoh, M., Ozaki, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26179953">Innervation of Extrahepatic Biliary Tract, With Special Reference to the Direct Bidirectional Neural Connections of the Gall Bladder, Sphincter of Oddi and Duodenum in Suncus murinus, in Whole-Mount Immunohistochemical Study.</a> Anat. Histol. Embryol. 45 (3), 184-188 (2016).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofilament+proteins+in+axonal+regeneration+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen.+Res%22%5BJournal%5D)">Neurofilament proteins in axonal regeneration and neurodegenerative diseases.</a> Neural Regen. Res. 7 (8), 620-626 (2012).</li>
<li>Wyatt, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+of+the+sphincter+of+Oddi+to+the+stomach%2C+duodenum+and+gall-bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The relationship of the sphincter of Oddi to the stomach, duodenum and gall-bladder.</a> J. Physiol. 193 (2), 225-243 (1967).</li>
<li>Mawe, G. M., Kennedy, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duodenal+neurons+provide+nicotinic+fast+synaptic+input+to+sphincter+of+Oddi+neurons+in+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Duodenal neurons provide nicotinic fast synaptic input to sphincter of Oddi neurons in guinea pig.</a> Am. J. Physiol. 277, G226-G234 (1999).</li>
<li>Seo, J. H., Cho, S. S., Lee, I. S., Lee, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+neuropeptidergic+properties+of+the+duodenal+neurons+projecting+to+the+gallbladder+in+the+golden+hamster%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Histol.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Anatomical and neuropeptidergic properties of the duodenal neurons projecting to the gallbladder in the golden hamster.</a> Arch. Histol. Cytol. 65 (4), 317-321 (2002).</li>
<li>Padbury, R. T., Furness, J. B., Baker, R. A., Toouli, J., Messenger, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+nerve+cells+from+the+duodenum+to+the+sphincter+of+Oddi+and+gallbladder+of+the+Australian+possum%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Projections of nerve cells from the duodenum to the sphincter of Oddi and gallbladder of the Australian possum.</a> Gastroenterology. 104 (1), 130-136 (1993).</li>
<li>White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wholemount+immunohistochemistry+for+revealing+complex+brain+topography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography.</a> J. Vis. Exp. (62), e4042(2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W pracy opisano eksperymentalną procedurę wizualizacji unerwienia pozawątrobowych dróg żółciowych za pomocą przeciwciała przeciwko białku neurofilamentu. Protokół ten został zaadaptowany z protokołu opisanego przez Kuratani i Tanaka 1,2,3.
W tym eksperymencie zaplanuj harmonogram każdego z eksperymentów, ponieważ barwienie całego mocowania trwa przez 2-3 tygodnie. Naczynie zawierające tkankę musi być ...

Ryjówka zwyczajna, Suncus murinus, należy do rzędu Insectivora i rodziny Soricidae. Ten maleńki ssak występuje w całej Azji Południowo-Wschodniej i zamieszkuje domy oraz obszary trawiaste, które znajdują się w pobliżu ludzkich siedzib lub zagród dla bydła4. Gatunek ten wykazuje ogólne cechy morfologiczne bardziej podobne do ludzi niż inne zwierzęta laboratoryjne, takie jak mysz, szczur i królik5. Wcześniej, barwienie immunologiczne w całości za pomocą markera neuronów obwodowych dla białka neurofilamentu S. murinus (NFP) było używane do oznaczania nerwów obwodowych w trzustce6, major duodenal papilla7, pylorus8, woreczek żółciowy5 i extrahepatic żółciowe drogi żółciowe9.
NFP to kompleks makromolekularny, który jest częścią dojrzałego cytoszkieletu neuronalnego. Białka związane z neurofilamentami pośredniczą w interakcjach między NFP a zygosomem. Zarówno funkcja enzymu, jak i struktura białek łącznikowych są regulowane przez NFP10. Kompleks NFP zbudowany jest z trzech polipeptydów: NF-L (70 kDa), NF-M (150-160 kDa) i NF-H (200 kDa). NFP można znaleźć w aksonach neuronalnych zarówno w ośrodkowym, jak i obwodowym układzie nerwowym. Wykazano, że przeciwciało anty-ludzkie NFP znakuje aksony ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego. Badania anatomiczne i elektrofizjologiczne wykazały, że zwieracz, pęcherzyk żółciowy i proksymalny przewód pokarmowy są ze sobą połączone11,12,13,14. Jednak cechy morfologiczne ich połączeń neuronalnych nie zostały jeszcze określone.
Ta praca demonstruje użycie metody barwienia immunohistochemicznego całej góry do oznaczania unerwienia dróg żółciowych S. murinus przeciwciałem NFP.

<table><tbody><tr><td>kwas ortoperiodyczny</td><td>Wako</td><td>162-00732</td><td></td></tr><tr><td>papaina</td><td>Wako</td><td>164-00172</td><td></td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Wako</td><td>010-15131</td><td></td></tr><tr><td>azydek sodu</td><td>Nacalai Tesque</td><td>312-33</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało przeciwko białku neurofilamentu (NFP)</td><td>Dako</td><td>M0762, partia 089, klon: 2F11</td><td></td></tr><tr><td>sprzężona z peroksydazą Oczyszczone powinowactwem owce anty-mysie IgG-HRP</td><td>MBL</td><td>Code 330</td><td></td></tr><tr><td>Tetrachlorowodorek 3,3'-diaminobenzydyny (DAB)</td><td>Wako</td><td>349-00903</td><td></td></tr><tr><td>imidazol</td><td>Sigma</td><td>I-0125</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie całościowej metody immunohistochemicznej do badania unerwienia dróg żółciowych u suncus murinus

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Ta praca szczegółowo opisuje metodę barwienia immunohistochemicznego całej góry, wykorzystując przeciwciało białka neurofilamentu do oznaczania unerwienia dróg żółciowych u Suncus murinus (S. murinus ). Najpierw próbkę wypreparowano z S. murinus i utrwalono w 4% paraformaldehydzie (PFA). Po drugie, przeprowadzono obróbkę enzymatyczną i potencjalną endogenną inaktywację peroksydazy. Próbka była następnie wystawiona na działanie pierwszorzędowego przeciwciała, przeciwciała przeciwko białku neurofilamentowemu, przez 3-6 dni. Następnie inkubowano go z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą chrzanową. Reakcja barwna została ujawniona przez reakcję próbki z substratem 3,3'-diaminobenzydyny (DAB). Metodę tę można zastosować do analizy unerwienia wszystkich narządów trzewnych. Co więcej, protokół ten można również dostosować do testowania innych przeciwciał neuronalnych, ale najpierw należy przeprowadzić optymalizację przeciwciał. Ta metoda została pierwotnie wprowadzona przez Kuratani i Tanaka1,2,3.

Rysunki 1-4 przedstawiają typowe wyniki dla włókien nerwowych NFP-dodatnich w drogach żółciowych pozawątrobowych u S. murinus. Przeciwciało przeciwko NFP w sposób powtarzalny znakowało unerwienie w całym obrazie dróg żółciowych pozawątrobowych (Rysunek 1), pęcherzyka żółciowego (Rysunek 2), górnego odcinka przewodu żółciowego (Rysunek 3) oraz obszaru brodawk...

Całościowe podejście immunohistochemiczne, do wizualizacji ekspresji białka neurofilamentu w pozawątrobowym przewodzie żółciowym u Suncus murinus. jest prezentowane tutaj. Protokół ten może być wykorzystany do analizy unerwienia wszystkich narządów trzewnych u S. murinus lub innych gatunków.

Zastosowanie całościowej metody immunohistochemicznej do badania unerwienia dróg żółciowych u Suncus murinus

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zastosowanie immunohistochemicznego barwienia całych preparatów w celu wizualizacji rozmieszczenia nerwów w drogach żółciowych Suncus murinus. Metodę tę można wykorzystać do analizy rozmieszczenia nerwów w narządach trzewnych wielu gatunków, w szczególności w przypadku narządów o nieregularnym kształcie lub niewielkich rozmiarach, których ocena standardowymi metodami jest utrudniona. Główną zaletą tej techniki jest prostota przeprowadzenia operacji.Metoda ta nie wymaga skomplikowanych procedur i charakteryzuje się wysokim wskaźnikiem sukcesu. Procedurę zaprezentują Yidan Dai, doktorantka, oraz Shuang-Qin Yi, pracownik naukowy, oboje z mojego laboratorium. Rozpocznij od przepłukania zwierzęcia za pomocą PBS oraz 4% paraformaldehydu w dygestorium.Następnie wstrzyknij od dwóch do trzech mililitrów białego lateksu neoprenowego przez cewnik perfuzyjny do aorty brzusznej w celu oznakowania naczyń krwionośnych. Po oznakowaniu wszystkich interesujących tkanek wyekstrahuj narządy jamy brzusznej oraz powiązane z nimi nerwy i naczynia. Następnie wstrzyknij około 0,1 mililitra niebieskiego lateksu neoprenowego do pęcherzyka żółciowego w celu oznakowania układu żółciowego, a następnie poddaj tkanki utrwalaniu po-fiksacyjnemu w 4% paraformaldehydzie przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed przeprowadzeniem immunobarwienia całych preparatów.Następnego dnia rano przenieś próbkę do szklanej fiolki i przeprowadź cztery jednogodzinne przemycia w wodzie destylowanej w temperaturze pokojowej na mieszałce typu nutator. Po ostatnim przemyciu inkubuj tkanki w świeżo przygotowanym 1% kwasie ortonadjodowym przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby zapobiec reakcjom endogennej peroksydazy. Następnie przemyj próbkę wodą destylowaną przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie inkubuj w świeżo przygotowanym 0,004% papillonie przez dwie godziny w kąpieli wodnej o stałej temperaturze 37 °C przy delikatnym kołysaniu.Po zakończeniu inkubacji przemyć preparat wodą destylowaną przez 50 do 60 minut. Następnie przechowywać tkanki w 4% paraformaldehydzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka przemyć próbkę wodą destylowaną, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, a następnie przeprowadzić kolejną dwugodzinną inkubację w świeżo przygotowanym papillonie.Przemywaj próbkę przez kolejne 50 do 60 minut w wodzie destylowanej, a następnie utrwalaj przez noc w 4% paraformaldehydzie. Trzeciego dnia rano przemyj tkanki cztery razy w wodzie destylowanej, a następnie poddaj je trzem następującym po sobie 30-minutowym inkubacjom w roztworach sacharozy o rosnącym stężeniu. Następnie zamroź próbkę w temperaturze -20 °C przez 30 do 60 minut, po czym całkowicie rozmroź ją w temperaturze pokojowej.Po trzecim cyklu zamrażania i rozmrażania przenieś próbkę do 2% Triton X-100 i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia przenieś próbkę do pojemnika z odpowiednim przeciwciałem pierwotnym i inkubuj na nutatorze przy delikatnym wstrząsywaniu w temperaturze 4 °C przez trzy do sześciu dni, zależnie od wielkości preparatu. Po odpowiednim czasie znakowania usuń niezwiązane przeciwciała pierwotne, wykonując cztery jednogodzinne płukania w PBS w temperaturze pokojowej, a następnie znakuj preparat odpowiednim przeciwciałem wtórnym przez trzy dni przy delikatnym wstrząsywaniu w temperaturze 4 °C.Po zakończeniu okresu znakowania przeciwciałem wtórnym, wypłucz preparat czterokrotnie w PBS. Następnie inkubuj tkanki w 10 µL 30% nadtlenku wodoru w 100 mL świeżo przygotowanego 0,002% roztworu barwiącego DAB w temperaturze 4 °C przez 16 do 72 godzin przy łagodnym kołysaniu. Po osiągnięciu optymalnego natężenia barwienia, przenieś preparat do 0,04% azotku sodu w PBS, aby zatrzymać reakcję barwienia.Następnie ostrożnie zanurz próbkę w 10 centymetrowej szalce Petriego zawierającej świeży PBS i wykonaj obrazy całych preparatów tkanek, używając kamery zamontowanej na stereomikroskopie. Oprócz wizualizacji unerwienia pozawatropowych dróg żółciowych, znakowanie przeciwciałem przeciwko neurofilamentom w celu wykazania dodatnich włókien nerwowych pozwala również na jednoznaczne określenie przebiegu i gęstości rozmieszczenia nerwu błędnego wzdłuż przełyku i w obrębie żołądka. Znakowanie naczyń krwionośnych pęcherzyka żółciowego białym lateksem neoprenowym ujawnia cienkie włókna nerwowe w wysokim kontraście do otaczających tkanek, przy czym w szyjce pęcherzyka żółciowego obserwuje się wyższą gęstość unerwienia niż w jego dnie.W górnym odcinku przewodu żółciowego znakowano dwa rodzaje pęczków nerwowych: cienkie pęczki nerwowe, które tworzą nieregularną i gęstą sieć nerwów i przebiegają przylegaćco na powierzchni oraz w obrębie dróg żółciowych, oraz grubsze pęczki nerwowe, które są rozmieszczone równolegle do powierzchni dróg żółciowych. Znakowanie wspólnego przewodu żółciowego niebieskim lateksem neoprenowym oraz naczyń białym lateksem neoprenowym umożliwia wizualizację cienkich włókien nerwowych w końcowym odcinku wspólnego przewodu żółciowego oraz w obszarze brodawki dwunastniczej. Przed przystąpieniem do tej procedury należy starannie zaplanować harmonogram każdego z eksperymentów, ponieważ cały proces wymaga od dwóch do trzech tygodni na jego ukończenie.Aby uniknąć uszkodzenia preparatu podczas wymiany roztworów, należy zawsze wylewać roztwory zamiast wyjmować preparat pęsetą. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie zastosować tę technikę do znakowania różnych nerwów w różnych narządach trzewnych.

using-whole-mount-immunohistochemical-method-to-study-innervation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Międzytkankowe komórki Cajala (ICC) są komórkami rozrusznikowymi przewodu pokarmowego. Tworzą one złożone sieci pomiędzy komórkami mięśni gładkich a powypierścienicowymi włóknami neuronalnymi, aby regulować kurczliwość przewodu pokarmowego. W niniejszej pracy przedstawiamy metody immunofluorescencji do wizualizacji sieci ICC u myszy w przekrojach poprzecznych oraz w preparatach całych (whole-mount).

Wizualizacja sieci komórek Cajala (ICC) u myszy

Normalna unaczyniona tkanka ssaka dorosłego, w której nie zachodzi fizjologiczna angiogeneza i która nie była poddana interwencji chirurgicznej, jest wykorzystywana do badania: (i) inicjacji i rozwoju angiogenezy po podaniu środków testowych do jamy otrzewnej; oraz (ii) modyfikacji angiogenezy po systemowym podaniu wybranych środków testowych.

Test angiogenezy w krezoni szczura

Ten film demonstruje technikę lokalizacji immunofluorescencji in vivo (IVIL) do badania biodystrybucji przeciwciał skierowanych przeciwko nowotworowi w mysim modelu raka piersi. Po dożylnym wstrzyknięciu przeciwciała specyficznego dla nowotworu myszy, guz jest izolowany chirurgicznie, a lokalizacja przeciwciała w tkance nowotworowej jest potwierdzana za pomocą barwienia immunologicznego ex vivo.

Metoda lokalizacji immunofluorescencji in vivo do badania biodystrybucji przeciwciał

Ten film demonstruje barwienie immunologiczne embrionalnego mysiego przewodu pokarmowego w celu wizualizacji i analizy rozmieszczenia populacji neuronów za pomocą immunofluorescencji i mikroskopii konfokalnej.

Barwienie immunofluorescencyjne populacji neuronów w embrionalnym mysim przewodzie pokarmowym

Mysia siatkówka noworodka dostarcza dobrze scharakteryzowanego fizjologicznego modelu angiogenezy, który pozwala na badanie ról różnych genów lub leków modulujących angiogenezę w kontekście in vivo. Barwienie immunofluorescencyjne w celu dokładnej wizualizacji splotu naczyniowego ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego typu badań.

Barwienie immunofluorescencyjne siatkówki noworodka myszy w celu zbadania angiogenezy in vivo

Jelitowy układ nerwowy (ENS) to sieć neuronów i komórek glejowych znajdujących się w ścianie jelita, która kontroluje odruchy jelitowe. Protokół ten opisuje metody rejestrowania aktywności neuronów jelitowych i gleju w żywych preparatach ENS przy użyciu obrazowania Ca2+.

In Situ Ca2+ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego

Jelitowy układ nerwowy tworzą komórki grzebienia nerwowego, które namnażają się, migrują i kolonizują jelita. Komórki grzebienia nerwowego różnicują się w neurony z markerami specyficznymi dla ich fenotypu neuroprzekaźnika. Protokół ten opisuje technikę preparowania, utrwalania i barwienia immunologicznego mysiego embrionalnego przewodu pokarmowego w celu wizualizacji ekspresji neuroprzekaźników jelitowego układu nerwowego.

Barwienie immunologiczne w celu wizualizacji rozwoju mysiego jelitowego układu nerwowego

Badanie echokardiograficzne jest często stosowane u myszy. W tym celu opracowano drogie urządzenia ultrasonograficzne o wysokiej rozdzielczości. Protokół ten opisuje niedrogą procedurę echokardiograficzną połączoną z histologicznymi analizami morfometrycznymi w celu określenia morfologii serca.

Echokardiograficzne i histologiczne badanie morfologii serca u myszy

Prezentujemy dość prostą i czułą metodę dokładnego oznaczania gęstości dróg żółciowych w wątrobie myszy. Metoda ta może pomóc w określeniu wpływu modyfikatorów genetycznych i środowiskowych oraz skuteczności potencjalnych terapii w mysich modelach chorób dróg żółciowych.

Określanie gęstości dróg żółciowych w wątrobie myszy

Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

Poznaj metodę immunohistochemii całościowej do wizualizacji unerwienia dróg żółciowych u Suncus murinus. Technika ta umożliwia analizę nerwów w małych i nieregularnych narządach wewnętrznych.

Zastosowanie całościowej metody immunohistochemicznej do badania unerwienia dróg żółciowych u Suncus murinus

Przeglądaj więcej filmów