Zastosowanie całościowej metody immunohistochemicznej do badania unerwienia dróg żółciowych u Suncus murinus

Ogólnym celem tej procedury jest zastosowanie barwienia immunohistochemicznego w całości do wizualizacji rozmieszczenia nerwów w drogach żółciowych Suncus murinus. Metoda ta może być stosowana do analizy rozmieszczenia nerwów w narządach trzewnych wielu gatunków, w szczególności nieregularnych lub małych narządów, które są trudne do oceny standardowymi metodami. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że operacja jest prosta.

Nie wymaga skomplikowanych zabiegów i ma wysoki wskaźnik sukcesu. Procedurę zademonstrują mi Yidan Dai, doktorant, i Shuang-Qin Yi, pracownik naukowy, obaj z mojego laboratorium. Zacznij od przepłukania zwierzęcia indywidualnymi PBS i 4% perfuzjami paraformaldehydu w dygestorium.

Następnie wstrzyknij od dwóch do trzech mililitrów białego lateksu neoprenowego przez cewnik perfuzyjny do aorty brzusznej, aby oznaczyć naczynia krwionośne. A kiedy wszystkie interesujące tkanki zostaną oznaczone, wyekstrahuj narządy jamy brzusznej i związane z nimi nerwy i naczynia. Następnie wstrzyknij około 0,1 mililitra niebieskiego lateksu neoprenowego do pęcherzyka żółciowego, aby oznaczyć układ żółciowy i po utrwaleniu tkanek w 4% paraformaldehydzie przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu barwienia immunologicznego w całości.

Następnego ranka przenieś próbkę do szklanej fiolki na cztery jednogodzinne płukanie w temperaturze pokojowej w wodzie destylowanej na nutatorze. Po ostatnim myciu inkubuj tkanki w świeżo przygotowanym 1% kwasie ortoperiodycznym przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby zapobiec wszelkim wewnętrznym reakcjom peroksydazy. Następnie umyj próbkę w wodzie destylowanej przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie inkubuj w świeżo przygotowanym 0,004% papillonie przez dwie godziny w łaźni wodnej o stałej temperaturze 37 stopni Celsjusza z delikatnym kołysaniem.

Pod koniec inkubacji przemywać próbkę wodą destylowaną przez 50 do 60 minut. Następnie przechowuj tkanki w 4% paraformaldehydzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka umyj próbkę w wodzie destylowanej, jak właśnie pokazano, a następnie wykonaj kolejną dwugodzinną inkubację w świeżo przygotowanym papillonie.

Myć próbkę przez kolejne 50 do 60 minut w wodzie destylowanej, a następnie utrwalić przez noc w 4% paraformaldehydzie. Trzeciego ranka umyj tkanki cztery razy w wodzie destylowanej, a następnie zanurz w trzech sekwencyjnych, wznoszących się 30-minutowych inkubacjach sacharozy. Następnie zamrozić próbkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na 30 do 60 minut, a następnie całkowicie rozmrozić w temperaturze pokojowej.

Po trzecim cyklu zamrażania i rozmrażania przenieść próbkę do 2% Triton X-100 w celu inkubacji przez noc w czterech stopniach Celsjusza. Następnego ranka przenieś próbkę do pojemnika z pierwotnym przeciwciałem będącym przedmiotem zainteresowania w celu delikatnego kołysania na nutatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy do sześciu dni, w zależności od wielkości próbki. Po odpowiednim okresie znakowania usunąć niezwiązane przeciwciało pierwszorzędowe za pomocą czterech jednogodzinnych płukań w PBS w temperaturze pokojowej i znakować próbkę odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym przez trzy dni z delikatnym kołysaniem w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Pod koniec okresu znakowania przeciwciałami wtórnymi przemyć próbkę cztery razy w PBS. Następnie inkubuj tkanki w 10 mikrolitrach 30% nadtlenku wodoru w 100 mililitrach świeżo przygotowanego 0,002% roztworu barwiącego DAB w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 16 do 72 godzin z delikatnym kołysaniem. Po osiągnięciu optymalnej intensywności barwienia przenieś próbkę do 0,04% azydku sodu w PBS, aby zatrzymać reakcję barwienia.

Następnie ostrożnie zanurz próbkę na 10-centymetrowej szalce Petriego zawierającej świeży PBS i uchwyć obrazy tkanek w całości za pomocą kamery zamontowanej na mikroskopie stereoskopowym. Oprócz wizualizacji unerwienia pozawątrobowych dróg żółciowych, znakowanie przeciwciałem przeciwko neurofilamentowo-dodatnim włóknom nerwowym pozwala również na jednoznaczną identyfikację gęstości biegu i dystrybucji nerwu błędnego wzdłuż przełyku i do żołądka. Znakowanie naczyń krwionośnych pęcherzyka żółciowego białym lateksem neoprenowym ujawnia cienkie zwłóknienie nerwowe w dużym kontraście do otaczających tkanek z większą gęstością unerwienia obserwowaną w szyi pęcherzyka żółciowego niż w dnie.

W górnym przewodzie żółciowym oznaczone są dwa rodzaje wiązek nerwowych, drobne wiązki nerwowe, które tworzą nieregularną i gęstą sieć nerwów i biegną adhezjalnie znajdujące się na drogach żółciowych i w nich oraz grubsze wiązki nerwowe, które są rozmieszczone równolegle do powierzchni dróg żółciowych. Oznakowanie przewodu żółciowego wspólnego niebieskim lateksem neoprenowym oraz naczyń białym lateksem neoprenowym umożliwia uwidocznienie cienkich włókien nerwowych na końcu przewodu żółciowego wspólnego i okolicy brodawki dwunastnicy. Przed przystąpieniem do tej procedury należy upewnić się, że rozegrałeś harmonogram dla każdego z eksperymentów, ponieważ cały proces trwa od dwóch do trzech tygodni.

Aby uniknąć uszkodzenia próbki podczas wymiany roztworów, zawsze wylewaj roztwory zamiast usuwać próbkę kleszczami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie zastosować tę technikę do oznaczania szeregu nerwów w różnych narządach trzewnych.