Name: Zastosowanie genetycznie kodowanych fluorescencyjnych sond tlenku azotu (NO•), geNOps, do obrazowania w czasie rzeczywistym sygnałów NO• w pojedynczych komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Poznaj metodę obrazowania tlenku azotu w czasie rzeczywistym w pojedynczych komórkach przy użyciu genetycznie kodowanych sond fluorescencyjnych geNOps. Technika ta umożliwia badanie dynamiki sygnałów NO• z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują C.J. Edgell, Pathology Department, University of North Carolina at Chapel Hill, NC, USA za dostarczenie komórek EA.hy926. Autor E.E. jest wspierany przez firmę Nikon Austria w ramach Centrum Doskonałości Nikon w Grazu i jest stypendystą programu doktoranckiego z medycyny molekularnej na Uniwersytecie Medycznym w Grazu. Naukowcy są również wspierani przez program doktorancki Choroby metaboliczne i sercowo-naczyniowe (DK-W1226) Uniwersytetu Medycznego w Grazu. Prace te zostały również sfinansowane przez projekt FWF P 28529-B27. Mikroskopijny sprzęt jest częścią Centrum Doskonałości firmy Nikon w Grazu, które jest wspierane przez austriacki program infrastrukturalny 2013/2014, Nikon Austria Inc. i BioTechMed w Grazu.

1. Przygotowanie i roztworów chemicznych
<ol>
	<li>Przygotować bufor magazynujący zawierający 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 2,6 mM NaHCO3, 0,44 mM KH2PO4, 0,34 mM Na2HPO4, 10 mM D-glukozy, 2 mM L-glutaminy, 1x witaminy MEM, 1x aminokwasy MEM, 1% paciorkowiec i 1% amfoterycyna B. Rozpuść wszystkie składniki w wodzie destylowanej i mieszaj bufor przez 20 minut za pomocą mieszadła magnetycznego w temperaturze pokojowej. Dostosować pH do 7,44 za pomocą 1 M NaOH. Po kroplowym dodaniu NaOH zmierz pH za pomocą pH-metru, ciągle mieszając.</li>
	<li>Przygotować fizjologiczny bufor zawierający Ca2+, który składa się ze 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM D-glukozy i 10 mM HEPES. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH, jak opisano w kroku 1.1.</li>
	<li>Przygotuj bufor wolny od Ca2+, który składa się z tych samych składników, które wymieniono w kroku 1.2. Użyj 1 mM EGTA zamiast 2 mM.</li>
	<li>Rozpuścić Fura-2AM w DMSO, aby otrzymać roztwór podstawowy o stężeniu 1 mM. Podwielokrotność roztworu podstawowego umieścić w szczelnie zamkniętych fiolkach i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do jednego miesiąca. W przypadku zamrożenia pozostawić roztwór podstawowy do zrównoważenia w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę, chroniąc go przed światłem. Rozcieńczyć roztwór podstawowy Fura-2AM w 1 ml buforu do przechowywania (krok 1.1) do uzyskania końcowego stężenia 3,3 μM.</li>
	<li>Przygotować 1 ml 100 mM roztworu podstawowego histaminy w wodzie destylowanej (pH 7,0). Rozcieńczyć 100 mM roztworu podstawowego histaminy w 100 ml buforu fizjologicznego zawierającego Ca2+ do końcowego stężenia 100 μM histaminy.</li>
	<li>Rozpuścić Nω-nitro-L-argininę (L-NNA) w 100 ml buforu fizjologicznego zawierającego wapń, aby uzyskać końcowe stężenie 300 μM. Roztwory przechowywać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę, aż do całkowitego rozpuszczenia L-NNA.</li>
	<li>Rozpuścić 10 mg NOC-7 w wodzie destylowanej (pH 7,0) w celu uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 10 mM. Podwielokrotność roztworu podstawowego w małych porcjach umieścić w szczelnie zamkniętych fiolkach i natychmiast przechowywać w temperaturze -70 °C. Rozcieńczyć roztwór podstawowy NOC-7 w buforze fizjologicznym do uzyskania końcowego stężenia 10 μM NOC-7, 
	UWAGA: NOC-7 to mały związek chemiczny, który spontanicznie uwalnia NO z krótkim okresem półtrwania. robocze składające się z NOC-7 należy zawsze przygotowywać tuż przed każdym eksperymentem.</li>
	<li>Sporządzić 1 mM roztwór nitroprusydku sodu (SNP) w fizjologicznym buforze wapnia i przygotować rozcieńczenie 10 μM. 
	UWAGA: Zawsze przygotuj małe ilości (~10 ml) roztworów NO-donor ze względu na szybkie tempo degradacji.</li>
	<li>Przygotować buforowany roztwór fosforanowy (PBS) składający się ze 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 9,2 mM Na2HPO4 i 1,5 mM KH2PO4. Dostosuj wartość pH do 7,44 za pomocą NaOH/HCl.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek
UWAGA: Aby osiągnąć jednolitość w wydajności pomiaru tlenku azotu (NO•) w pojedynczych komórkach za pomocą geNOps, komórki muszą być wstępnie inkubowane z buforem zawierającym żelazo(II)/witaminę C przed eksperymentami obrazowania, aby przywrócić Fe2+ w domenie wiążącej NO•sond NO•. W przypadku komórek EA.hy926 i HEK293 inkubacja przez 20 minut z roztworem wzmacniającym żelazo(II) prowadzi do pełnej aktywacji czujników NO•.
<ol>
	<li>Nasiona 5,5 x 105 komórek EA.hy926 lub HEK293 na następny dzień lub 3,5 x 105 komórek na następny dzień, na 30-milimetrowych mikroskopowych szkłach nakrywkowych do studzienki na 6-dołkowej płytce. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku z 5% CO2, 
	UWAGA: Szczegółowe informacje dotyczące adenowirusowego zakażenia komórek ssaków i budowy wirusa zostały opisane przez Zhang i wsp.25. Ten krok nie dotyczy komórek HEK 293 stabilnie wykazujących ekspresję G-geNOp.</li>
	<li>Weź płodową surowicę cielęcą (FCS) i wolną od antybiotyków pożywkę zmodyfikowaną orłem Dulbecco (DMEM) i dodaj wektor wirusa związanego z adenowirusem typu 5 (AAV5) przenoszący gen kodujący G-geNOp (MOI: 500 dla komórek EA.hy926 daje prawie 100% komórek dodatnich; MOI: 1 jest wydajny dla komórek HEK293). 
	UWAGA: Stosowanie wektorów wirusowych związanych z adenowirusem jest przypisane do grupy ryzyka 2. Do pracy z tym wektorem zazwyczaj wymagany jest poziom bezpieczeństwa biologicznego 2. W razie potrzeby infekcja wirusowa może być również przeprowadzona w pożywce zawierającej FCS. Alternatywnie, komórki mogą być przejściowo transfekowane za pomocą nośników na bazie lipidów1.</li>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną i przemyć komórki wstępnie ogrzanym (37 °C) PBS. Dodaj 1 ml pożywki DMEM/AAV5 do każdego dołka przez 1 godzinę. Ten krok nie ma zastosowania do komórek HEK 293 stabilnie eksprymujących G-geNOp.</li>
	<li>Dodać 1 ml 20% DMEM zawierającego FCS do każdej studzienki do końcowego stężenia 10% FCS. Nie usuwaj pożywki zawierającej AAV5 z komórek. Delikatnie rozhuśtać płytkę, aby homogenizować podłoże w studzienkach. Inkubować komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku z 5% CO2 . Ten krok nie dotyczy komórek HEK 293 stabilnie eksprymujących G-geNOp.</li>
	<li>Po 48 godzinach umyj komórki wstępnie podgrzanym PBS. Następnie dodać 2 ml wstępnie ogrzanego buforu do przechowywania (sekcja 1.1) do każdej studzienki i inkubować komórki w pomieszczeniu RT przez co najmniej 1 godzinę, chroniąc je przed promieniowaniem świetlnym.</li>
	<li>Zastąp bufor do przechowywania 1 ml/studzienkę roztworu wspomagającego żelazo(II) o temperaturze pokojowej (RT). Inkubuj komórki dokładnie przez 20 minut w ciemności. 
	UWAGA: Nie przekraczaj ani nie skracaj optymalnego czasu inkubacji, ponieważ może to wpłynąć na reakcję sond NO•</li>.
	<li>Raz przemyć komórki buforem do przechowywania i inkubować każdą studzienkę z 2 ml buforu do przechowywania przez co najmniej 2 godziny w suchej temperaturze w celu umożliwienia zrównoważenia komórek.</li>
	<li>Wymień bufor pamięci na 3,3 μM Fura-2AM w 1 ml buforze do przechowywania przez 45 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie buforem do przechowywania i inkubować, ponownie przez co najmniej 30 minut, aby umożliwić komórkom zrównoważenie.</li>
</ol>
3. Obrazowanie na żywo sygnałów NO• i Ca2+ w poszczególnych komórkach
<ol>
	<li>Zamocuj 30 mm szkiełko nakrywkowe pokryte komórkami EAhy.926 lub HEK293 (od kroku 2.1) w metalowej komorze perfuzyjnej i umieść je na mikroskopie. Podłączyć rurkę dopływową do zbiorników buforowych, a wypływ do pompy próżniowej. Zapewnić stały przepływ i unikać opróżniania szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Rozpocznij perfuzję sterowaną grawitacyjnie fizjologicznym buforem wapnia (od kroku 1.2) za pomocą półautomatycznego systemu perfuzyjnego. 
	UWAGA: Taki system składa się ze zbiorników buforowych, odpowiednich przewodów, zaworów magnetycznych, które są sterowane elektronicznie oraz pompy próżniowej (patrz rysunek 1B). Natężenie przepływu może wynosić od 1 do 3 ml/min, w zależności od wysokości zbiorników perfuzyjnych. W celu spójnego miejscowego stosowania leków, natężenie przepływu we wszystkich używanych zbiornikach powinno być w przybliżeniu równe. Należy to przetestować przed eksperymentami obrazowymi. Weź pod uwagę, że komórki śródbłonka reagują na zwiększone naprężenie ścinające, które może być wywołane przez rygorystyczną perfuzję.</li>
	<li>Włącz system obrazowania i pozwól na rozgrzanie wszystkich urządzeń przez 30 minut.</li>
	<li>Zdefiniuj ustawienia obrazowania za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Wybierz długość fali wzbudzenia 340 nm i 380 nm dla obrazowania fura-2 oraz 480 nm dla wzbudzającego G-geNOp. Aby zminimalizować wybielanie fluorescencyjne, zwiększ binning kamery do 4 i zmniejsz intensywność wzbudzenia oraz czasy ekspozycji. Patrz także kroki 3.6-3.8. 
	UWAGA: Ustawienia i parametry obrazowania zależą od zastosowanych urządzeń, wydajności ładowania fury-2 i poziomów ekspresji G-geNOp.</li>
	<li>Wybierz obszar obrazowania, przesuwając tabelę xyz mikroskopu, aż kilka komórek fluorescencyjnych znajdzie się w ognisku. Następnie zdefiniuj obszary zainteresowania (ROI) za pomocą odpowiedniego narzędzia programowego. Ręcznie narysuj regiony obejmujące kilka całych pojedynczych komórek fluorescencyjnych na pole obrazowania. Ponadto zdefiniuj region tła o podobnym rozmiarze. 
	UWAGA: Po uzyskaniu i zapisaniu obrazów, po zakończeniu procesu obrazowania można również zdefiniować zwrot z inwestycji w celu dalszej analizy za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazowania (patrz Lista materiałów).</li>
	<li>Rozpocznij zbieranie danych na odwróconym i zaawansowanym mikroskopie fluorescencyjnym z zmotoryzowanym stolikiem na próbki i monochromatycznym źródłem światła. Na przemian wzbudzić przy 340 nm i 380 nm odpowiednio dla Fura-2AM i 480 nm dla G-geNOp. Ustaw odpowiednie czasy ekspozycji, aby dla wszystkich kanałów wyraźny sygnał fluorescencyjny był wykrywalny w czasie. Patrz także krok 3.4. 
	UWAGA: Zależy to od intensywności światła wzbudzenia i łączenia kamery. Na przykład użyj 15% intensywności światła wzbudzenia, binningu kamery 4 i 150 ms dla 340 nm, 50 ms dla 380 nm i 300 ms dla 480 nm. Patrz także krok 3.4.</li>
	<li>Zebrać wyemitowane światło o długości fali 510 nm dla fura-2/am, 520 nm dla G-geNOp za pomocą kamery z urządzeniem sprzężonym z ładunkiem (CCD) z odpowiednim zestawem filtrów składającym się z wzbudnicy 500 nm, dichroicznej 495 nm i emitera 510-520 nm. Nagrywaj jedną klatkę co 3 sekundy.</li>
	<li>Zapisać pierwsze minuty (w razie potrzeby do 3 minut) w fizjologicznym buforzeCa2+ (1.2) w celu uzyskania linii podstawowej odpowiednich sygnałów fluorescencyjnych w czasie.</li>
	<li>Po zaobserwowaniu stabilnej fluorescencji wyjściowej należy przejść na 100 μM histaminy lub ATP (1 μM lub 100 μM) zawierającej fizjologiczny bufor Ca2+, aby stymulować komórki przez 3 min. 
	UWAGA: Komórki EA.hy926, które reagują na agonistów, wykazują gwałtowny wzrost stosunku fura-2 (fluorescencja wzbudzona przy 340 nm podzielona przez fluorescencję wzbudzoną przy 380 nm) i wyraźny spadek sygnału fluorescencji G-geNOp.</li>
	<li>Przełącz się z powrotem na fizjologiczny bufor Ca2+ bez histaminy lub ATP i L-NNA na 5 minut, aby usunąć związki z komórek. Ten etap może być przedłużony do czasu całkowitego odzyskania zmian fluorescencji.</li>
	<li>Podawać 10 μM NOC-7 w fizjologicznym buforze Ca2+ przez 2 minuty za pomocą systemu perfuzyjnego. Donor NO silnie wpływa na fluorescencję G-geNOp, która zwykle zmniejsza się o >20% w odpowiedzi na 10 μM NOC-7. W komórkach EA.hy926 efekt NOC-7 jest około 3 razy silniejszy w porównaniu z wygaszaniem fluorescencji G-geNOp indukowanym przez agonistę.</li>
	<li>Wypłucz związek uwalniający NO• przez około 10 minut fizjologicznym buforem Ca2+ i przestań rejestrować po odzyskaniu podstawowej fluorescencji.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Eksport uzyskanych danych o średniej intensywności fluorescencji pojedynczych komórek w czasie do oprogramowania do analizy danych.</li>
	<li>Odejmij odpowiednie wartości tła i oblicz stosunek 340 nm do 380 nm odpowiednich sygnałów fura-2 każdej pojedynczej komórki w czasie.</li>
	<li>Odejmij wartości tła kanału G-geNOp, aby uzyskać rzeczywistą intensywność fluorescencji sondy NO (F) w czasie za pomocą dowolnego oprogramowania obliczeniowego.</li>
	<li>Przyjmij wyjściowe wartości fluorescencji jako F0 (F0 to fluorescencja sondy NO w czasie bez stymulacji). Patrz także krok 4.5 i rysunek 1C.</li>
	<li>Oblicz funkcję w czasie dla efektów wybielania fluorescencyjnego, korzystając z następującego równania: F0 = Fpoczątkowy•exp(-K•Czas) +F plateau. F początkowy: maksymalny sygnał fluorescencji po rozpoczęciu obrazowania; K: stała szybkości wybielania fluorescencyjnego w czasie; Plateau F: minimum fluorescencji osiągane przez wybielanie w czasie; Patrz również kroki 4.3-4.4 i rysunek 1C. 
	UWAGA: W przybliżeniu można użyć wszystkich wartości fluorescencji w czasie przed i po stymulacji komórek. Dalsze szczegóły zostały określone przez Bentley i wsp.27.</li>
	<li>Aby znormalizować sygnał G-geNOp w czasie, oblicz 1-F/F0 (kroki 4.3-4.5). Zobacz rysunki 1C i 1D.</li>
</ol>

<ol><li>Eroglu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+novel+FP-based+probes+for+live-cell+imaging+of+nitric+oxide+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Development of novel FP-based probes for live-cell imaging of nitric oxide dynamics.</a> Nat Commun. 7, 10623(2016).</li>
<li>Bush, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+for+enhancer-dependent+assembly+and+activation+of+the+AAA+transcriptional+activator+NorR%5BTitle%5D)+AND+%22Mo.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The structural basis for enhancer-dependent assembly and activation of the AAA transcriptional activator NorR.</a> Mo. Microbiol. 95 (1), 17-30 (2015).</li>
<li>Cranfill, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 13 (7), 557-562 (2016).</li>
<li>D'Autréaux, B., Tucker, N., Spiro, S., Dixon, R. Characterization of the Nitric Oxide-Reactive Transcriptional Activator NorR. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Characterization+of+the+Nitric+Oxide-Reactive+Transcriptional+Activator+NorR">Globins and Other Nitric Oxide-Reactive Proteins, Part B</a>. Poole, ed.P. oole,R. .K. .,(ed)., 437, 1st edition, Elsevier textbooks, s.l. 235-251 (2008).</li>
<li>Strack, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sensors+and+probes%3A+Yes+to+genetically+encoded+NO%E2%80%A2+sensors">Sensors and probes: Yes to genetically encoded NO• sensors.</a> Nat Methods. 13 (4), 288(2016).</li>
<li>Auten, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+to+%27The+use+of+diaminofluorescein+for+nitric+oxide+detection%3A+Conceptual+and+methodological+distinction+between+NO+and+nitrosation%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Response to 'The use of diaminofluorescein for nitric oxide detection: Conceptual and methodological distinction between NO and nitrosation.</a> Free Radic. Biol. Med. 50 (12), 1812(2011).</li>
<li>Sivaraman, G., Anand, T., Chellappa, D. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cplu.201402217/abstract">A Fluorescence Switch for the Detection of Nitric Oxide and Histidine and Its Application in Live Cell Imaging.</a> ChemPlusChem. 79 (12), 1761-1766 (2014).</li>
<li>Ye, X., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+nitric+oxide+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Detection of nitric oxide in single cells.</a> Analyst. 133 (4), 423-433 (2008).</li>
<li>Thyagarajan, B., Malli, R., Schmidt, K., Graier, W. F., Groschner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+inhibits+capacitative+Ca2%2B+entry+by+suppression+of+mitochondrial+Ca2%2B+handling%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide inhibits capacitative Ca2+ entry by suppression of mitochondrial Ca2+ handling.</a> Br J Pharmacol. 137 (6), 821-830 (2002).</li>
<li>Germond, A., Fujita, H., Ichimura, T., Watanabe, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+development+of+genetically+encoded+fluorescent+sensors+to+monitor+intracellular+chemical+and+physical+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Biophy.+Rev%22%5BJournal%5D)">Design and development of genetically encoded fluorescent sensors to monitor intracellular chemical and physical parameters.</a> Biophy. Rev. 8, 121-138 (2016).</li>
<li>Malli, R., Eroglu, E., Waldeck-Weiermair, M., Graier, W. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Filling+a+GAP-An+Optimized+Probe+for+ER+Ca2%2B+Imaging+In+Vivo">Filling a GAP-An Optimized Probe for ER Ca2+ Imaging In Vivo.</a> Cell Chem Biol. 23 (6), 641-643 (2016).</li>
<li>Sato, M., Hida, N., Umezawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+nanomolar+range+of+nitric+oxide+with+an+amplifier-coupled+fluorescent+indicator+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging the nanomolar range of nitric oxide with an amplifier-coupled fluorescent indicator in living cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102 (41), 14515-14520 (2005).</li>
<li>Weidinger, A., Kozlov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Activities+of+Reactive+Oxygen+and+Nitrogen+Species%3A+Oxidative+Stress+versus+Signal+Transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Biological Activities of Reactive Oxygen and Nitrogen Species: Oxidative Stress versus Signal Transduction.</a> Biomolecules. 5 (2), 472-484 (2015).</li>
<li>Paolo, S. Nitric Oxide in Human Health and Disease. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/9780470015902.a0003390.pub2/abstract">Encyclopedia of life sciences</a>. , Wiley. Chichester. (2005).</li>
<li>Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+and+peroxynitrite+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease.</a> Physiol Rev. 87 (1), 315-424 (2007).</li>
<li>Bonafe, F., Guarnieri, C., Muscari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+regulates+multiple+functions+and+fate+of+adult+progenitor+and+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide regulates multiple functions and fate of adult progenitor and stem cells.</a> J Physiol Biochem. 71 (1), 141-153 (2015).</li>
<li>Forstermann, U., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+synthases%3A+regulation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide synthases: regulation and function.</a> Eur. Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).</li>
<li>Dudzinski, D. M., Igarashi, J., Greif, D., Michel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+and+pharmacology+of+endothelial+nitric+oxide+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The regulation and pharmacology of endothelial nitric oxide synthase.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 46, 235-276 (2006).</li>
<li>Zhou, L., Zhu, D. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+nitric+oxide+synthase%3A+structure%2C+subcellular+localization%2C+regulation%2C+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Neuronal nitric oxide synthase: structure, subcellular localization, regulation, and clinical implications.</a> Nitric Oxide. 20 (4), 223-230 (2009).</li>
<li>Aktan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iNOS-mediated+nitric+oxide+production+and+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">iNOS-mediated nitric oxide production and its regulation.</a> Life Sci. 75 (6), 639-653 (2004).</li>
<li>Ghafourifar, P., Cadenas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+nitric+oxide+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial nitric oxide synthase.</a> Trends Pharmacol Sci. 26 (4), 190-195 (2005).</li>
<li>Crane, B. R., Sudhamsu, J., Patel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+nitric+oxide+synthases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Bacterial nitric oxide synthases.</a> Annu Rev Biochem. 79, 445-470 (2010).</li>
<li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).</li>
<li>Kelm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+metabolism+and+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide metabolism and breakdown.</a> Biochim Biophys Acta. 1411 (2-3), 273-289 (1999).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen-related+receptors+stimulate+pyruvate+dehydrogenase+kinase+isoform+4+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Estrogen-related receptors stimulate pyruvate dehydrogenase kinase isoform 4 gene expression.</a> J Biol Chem. 281 (52), 39897-39906 (2006).</li>
<li>Holzmann, S., Kukovetz, W. R., Windischhofer, W., Paschke, E., Graier, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+differentiation+between+endothelium-dependent+relaxations+sensitive+and+resistant+to+nitro-L-arginine+in+coronary+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic differentiation between endothelium-dependent relaxations sensitive and resistant to nitro-L-arginine in coronary arteries.</a> J Cardiovasc Pharmacol. 23 (5), 747-756 (1994).</li>
<li>Bentley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+calcium+regulates+coat+retention%2C+fusogenicity%2C+and+size+of+pre-Golgi+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Vesicular calcium regulates coat retention, fusogenicity, and size of pre-Golgi intermediates.</a> Mol Biol Cell. 21 (6), 1033-1046 (2010).</li>
<li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide%3A+a+unique+endogenous+signaling+molecule+in+vascular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide: a unique endogenous signaling molecule in vascular biology.</a> Biosci Rep. 19 (2), 51-71 (1999).</li>
<li>Upreti, M., Kumar, S., Rath, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replacement+of+198MQMDII203+of+mouse+IRF-1+by+197IPVEVV202+of+human+IRF-1+abrogates+induction+of+IFN-%CE%B2%2C+iNOS%2C+and+COX-2+gene+expression+by+IRF-1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Com%22%5BJournal%5D)">Replacement of 198MQMDII203 of mouse IRF-1 by 197IPVEVV202 of human IRF-1 abrogates induction of IFN-β, iNOS, and COX-2 gene expression by IRF-1.</a> Biochem Biophys Res Com. 314 (3), 737-744 (2004).</li>
<li>Lacin, E., Muller, A., Fernando, M., Kleinfeld, D., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Cell-based+Neurotransmitter+Fluorescent+Engineered+Reporters+%28CNiFERs%29+for+Optical+Detection+of+Neurotransmitters+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li>
<li>de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+gene+expression+in+response+to+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Na.+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Controlling gene expression in response to stress.</a> Na. Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).</li>
<li>Latchman, D. S. Transcriptional Gene Regulation in Eukaryotes. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/9780470015902.a0002322.pub2/abstract">Encyclopedia of life sciences</a>. , Wiley. Chichester. (2005).</li>
<li>Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+cycle+transcription+during+G1+and+S+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of cell cycle transcription during G1 and S phases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).</li>
<li>Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+the+mitochondrial+proton+gradient+during+cytosolic+calcium+elevations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations.</a> J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).</li>
<li>Suarez, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+is+reduced+to+HNO+by+proton-coupled+nucleophilic+attack+by+ascorbate%2C+tyrosine%2C+and+other+alcohols.+A+new+route+to+HNO+in+biological+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide is reduced to HNO by proton-coupled nucleophilic attack by ascorbate, tyrosine, and other alcohols. A new route to HNO in biological media.</a> J Am Chem Soc. 137 (14), 4720-4727 (2015).</li>
<li>Kuropteva, Z. V., Kudryavtsev, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferrous-ascorbate+complexes+as+carriers+of+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Physiol+Biophys%22%5BJournal%5D)">Ferrous-ascorbate complexes as carriers of nitric oxide.</a> Gen Physiol Biophys. 16 (1), 91-96 (1997).</li>
<li>Vanin, A. F., Huisman, A., Stroes, E. S., Ruijter-Heijstek, F. C., Rabelink, T. J., van Faassen, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant+capacity+of+mononitrosyl-iron-dithiocarbamate+complexes%3A+implications+for+NO+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Antioxidant capacity of mononitrosyl-iron-dithiocarbamate complexes: implications for NO trapping.</a> Free Radic Biol Med. 30 (8), 813-824 (2001).</li>
<li>Lindberg, R. A., Dewhirst, M. W., Buckley, B. J., Hughes, C. S., Whorton, A. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8760062">Ca2+-dependent nitric oxide release in endothelial but not R3230Ac rat mammary adenocarcinoma cells.</a> Am J Physiol. 271 (1), 332-337 (1996).</li>
<li>Campo, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SOD+mimic+MnTM-2-PyP%285%2B%29+reduces+hyaluronan+degradation-induced+inflammation+in+mouse+articular+chondrocytes+stimulated+with+Fe+%28II%29+plus+ascorbate%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The SOD mimic MnTM-2-PyP(5+) reduces hyaluronan degradation-induced inflammation in mouse articular chondrocytes stimulated with Fe (II) plus ascorbate.</a> Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1610-1619 (2013).</li>
<li>Waldeck-Weiermair, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/labs/articles/23029314/">Spatiotemporal correlations between cytosolic and mitochondrial Ca2+ signals using a novel red-shifted mitochondrial targeted cameleon.</a> PLOS ONE. 7 (9), 45917(2012).</li>
<li>Kuzkaya, N., Weissmann, N., Harrison, D. G., Dikalov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+peroxynitrite+with+uric+acid+in+the+presence+of+ascorbate+and+thiols%3A+implications+for+uncoupling+endothelial+nitric+oxide+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Interactions of peroxynitrite with uric acid in the presence of ascorbate and thiols: implications for uncoupling endothelial nitric oxide synthase.</a> Biochem Pharmacol. 70 (3), 343-354 (2005).</li>
<li>Liu, J., Hughes, T. E., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+35+amino+acids+and+fatty+acylation+sites+determine+the+molecular+targeting+of+endothelial+nitric+oxide+synthase+into+the+Golgi+region+of+cells%3A+a+green+fluorescent+protein+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The first 35 amino acids and fatty acylation sites determine the molecular targeting of endothelial nitric oxide synthase into the Golgi region of cells: a green fluorescent protein study.</a> J Cell Biol. 137 (7), 1525-1535 (1997).</li>
<li>Feron, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Endothelial+Nitric-oxide+Synthase-Caveolin+Regulatory+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Endothelial Nitric-oxide Synthase-Caveolin Regulatory Cycle.</a> J Biol Chem. 273 (6), 3125-3128 (1998).</li>
</ol>

E.E, M.W., R.M. i W.F.G., pracownicy Uniwersytetu Medycznego w Grazu, złożyli wniosek patentowy w Wielkiej Brytanii (zgłoszenie patentowe numer WO2015EP74877 20151027, numer priorytetowy GB20140019073 20141027), który opisuje części badań w tym manuskrypcie. Licencje związane z tym patentem są udzielane firmie Next Generation Fluorescence Imaging (NGFI) GmbH (<a href="http://www.ngfi.eu/" target="_blank">http://www.ngfi.eu/</a>), spółce spin-off Uniwersytetu Medycznego w Grazu.

Od czasu odkrycia NO• jako ważnej cząsteczki sygnałowej w biologii28, dąży się do specyficznego pomiaru rodnika w czasie rzeczywistym w pojedynczych komórkach, tkankach i całych zwierzętach z wysoką rozdzielczością w wykonalny i wiarygodny sposób. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie niedawno opracowanych genetycznie kodowanych sond fluorescencyjnych NO• (geNOps), które umożliwiają dokładne obrazowanie sygnałów NO• na żywych komórkach przy użyciu szerokokątnejmikroskopii fluorescencyjnej1.
Aby obejść skomplikowane i inwazyjne procedury transfekcji, klon komórek HEK, który stabilnie wyraża zieloną fluorescencyjną G-geNOp, został wykorzystany do ilościowego określenia egzogennie generowanych profili NO• pojedynczych komórek. Ponieważ komórki HEK zwykle nie wytwarzają NO• endogennie29, ten typ komórek nadaje się do wytwarzania linii komórek czujnikowych opartych na geNOp, która może być przydatna do wielu innych zastosowań w warunkach kohodowli z komórkami pierwotnymi wytwarzającymi NO• lub nawet u żywych zwierząt30. Jednak w tym badaniu wykazujemy zdolność różnych związków uwalniających NO•, o różnych stężeniach i stabilnościach, do wywoływania wewnątrzkomórkowych sygnałów NO• za pomocą modelu komórkowego HEK eksprymującego G-geNOp. Nasze dane ujawniły, że stężenie NO•-donora, jakość i metoda aplikacji ostatecznie determinują wzorce wewnątrzkomórkowych profili NO•. Takie informacje są niezbędne do charakterystyki farmakokinetycznej in situ różnych dawców NO•, które wskazują na kilka chorób. Warto zauważyć, że wykazano, że geNOpy stabilnie reagują na wielokrotne powtarzające się aplikacje impulsów NO•-donorowych przez bardzo długi czas1. W związku z tym przedstawione tu eksperymenty z użyciem związków uwalniających NO• pozwalają na półilościowe wnioski dotyczące różnych amplitud i kinetyki odpowiednich komórkowych sygnałów NO• (ryc. 1 i 2).
Chociaż klon komórki HEK o stabilnej ekspresji prawdopodobnie pochodzi z pojedynczej komórki, zaobserwowano szeroką niejednorodność poziomów ekspresji G-geNOps (ryc. 1). Jest to wspólna cecha stabilnych klonów komórkowych, ponieważ transkrypcja (zintegrowanego z genomem) genu będącego przedmiotem zainteresowania jest pod kontrolą wielu czynników, takich jak różnorodne stresy środowiskowe31 , które wpływają na tempo wzrostu komórek32 oraz stan cyklu komórkowego33. Pojedyncze geNOpy oparte na FP są sondami nieratiometrycznymi, a zatem utrata intensywności fluorescencji wywołana przez NO• wzrasta wraz z poziomem ekspresji geNOp1. W związku z tym normalizacja sygnałów geNOps jest niezbędna do ilościowego określenia komórkowych sygnałów NO•, szczególnie w przypadku analizy porównawczej. Jak wykazano w naszym ostatnim badaniu, stwierdzono ścisłą liniową korelację między podstawową intensywnością fluorescencji geNOps a siłą tłumienia fluorescencji indukowanej NO• w szerokim zakresie intensywności fluorescencji1. Jest to ważna cecha geNOps do bezwzględnej kwantyfikacji komórkowych sygnałów NO•. Jak pokazano na rysunku 1, normalizacja sygnałów G-geNOps w odpowiedzi na NOC-7 i SNP ujawniła jednorodne sygnały NO• w różnych komórkach HEK z tej samej płytki, co wskazuje, że komórki HEK nie różnią się pod względem zdolności do pobierania i degradacji rodnika NO•, który pochodzi od dawcy NO•. W przeciwieństwie do tego, zastosowanie geNOps w komórkach HeLa wykazało wyraźną heterogeniczność komórkowych sygnałów NO• między różnymi komórkami w odpowiedzi na NOC-7. Różnice te wskazują na specyficzny dla typu komórki metabolizm i tempo rozkładu NO•, które mogą mieć wielorakie implikacje dla fizjologii i patologii komórki i mogą zostać odkryte za pomocą technologii geNOps.
Niemniej jednak należy dokładnie rozważyć dwie ważne cechy geNOps w celu prawidłowego użytkowania czujników i interpretacji danych: i) geNOps wymagają odpowiedniej ilości żelaza(II), aby w pełni reagować na NO•1 oraz ii) w zależności od wariantu FP, geNOps mogą być wrażliwe na pH1. Tutaj opisujemy protokół, który okazał się odpowiedni do nietoksycznej suplementacji żelazem(II) geNOps, które ulegają ekspresji w komórkach HEK, HeLa lub EA.hy926 (patrz Protokół 2.6). Chociaż wykazano, że leczenie komórek żelazem(II)/witaminą C nie wpłynęło na morfologię komórek, żywotność komórek i aktywność metabolicznąkomórek1, może być konieczne zoptymalizowanie tego ważnego kroku dla innych typów komórek i tkanek. Jednak w niektórych warunkach doświadczalnych wymóg obciążenia żelazem(II) może ograniczać możliwość zastosowania geNOps. W szczególności wykazano, że askorbinian może redukować NO•35, a kompleksy askorbinian-żelazo(II) są w stanie wymiatać NO•36,37. Co więcej, nadmiar żelaza(II) i askorbinianu może wywoływać reakcje zapalne39 i rozłączać eNOS41. Takie efekty należy wziąć pod uwagę przy stosowaniu technologii geNOps. Wykazano, że w pewnych warunkach eksperymentalnych wewnątrzkomórkowe pH ulega znacznemu wpływowi34, co może potencjalnie wpływać na fluorescencję geNOps1. Warto zauważyć, że warianty cyjanu i zielonego geNOps są stosunkowo wrażliwe na pH, wykazując spadek fluorescencji po zakwaszeniu1. W związku z tym ostre zmiany pH (sub)komórkowego mogą symulować fałszywe sygnały NO• podczas stosowania geNOps wrażliwych na pH. Jak zasugerowaliśmy w naszej poprzedniej pracy, zaleca się równoległe stosowanie niewrażliwych na NO• geNOps (geNOpsmut) jako kontroli ujemnych w celu przeanalizowania rzeczywistego komórkowego sygnału NO• ze zmian pH1. Ponadto zmiany pH komórek można kontrolować za pomocą sond pH, takich jak SypHer34.
Ponadto zobrazowaliśmy endogenne enzymatyczne tworzenie się NO• w odpowiedzi na fizjologicznego agonistę mobilizującego Ca2 + w substytucie komórek śródbłonka EA.hy926. Linia komórkowa EA.hy926 jest często stosowanym systemem modelowym zapewniającym konsekwentną ekspresję eNOS38. Zastosowanie geNOpów przejściowo eksprymowanych w komórkach EA.hy926 potwierdziło, że sygnały Ca2 + za pośrednictwem IP3 wywołują głębokie tworzenie NO• w tym typie komórek, które było prawie całkowicie zablokowane przez L-NNA. W celu czasowej korelacji Ca2 + z sygnałami NO•, komórki wyrażające G-geNOp zostały obciążone pobudliwym dla promieniowania UV wskaźnikiem Ca2 + fura-2 / am. Separację widmową fluorescencji fura-2 związanej i niezwiązanej Ca2+ od sygnału G-geNOp można łatwo osiągnąć za pomocą dostępnych na rynku zestawów filtrów40. Obrazowanie obu sond ujawniło, że powstawanie enzymatycznego NO• wywołane przez Ca2+ zachodzi znacznie wolniej w porównaniu ze wzrostem cytozolowego Ca2+ w tym typie komórek śródbłonka. Podobną kinetykę sygnałów NO• pojedynczej komórki w komórkach śródbłonka z bydlęcej tętnicy płucnej po leczeniu komórek bradykininą agonistą generującym IP3, a także naprężenia ścinające zostały zgłoszone przy użyciu NOA-1, pośredniego czujnika o wysokiej czułości na NO•12. W związku z tym dane te podkreślają, że tworzenie NO • wywołanego przez Ca2+ eNOS wymaga pewnego czasu rozpoczęcia, aż zostanie osiągnięta pełna aktywność enzymatyczna. Chociaż kinetykę powstawania, dyfuzji i degradacji komórkowego NO• można wyodrębnić z innych danych, np. pomiarów relaksacji naczyń wywołanych NO• opartych na napięciu26, wielką zaletą fluorescencyjnych sond NO• jest to, że bezpośrednio przekształcają one fluktuacje komórkowego NO• w widzialne sygnały w czasie rzeczywistym. W związku z tym obrazowanie komórkowych sygnałów NO• za pomocą geNOps zapewnia wysoką rozdzielczość przestrzenną i czasową oraz oferuje unikalne możliwości w (ponownym) badaniu homeostazy (sub)komórkowego NO•. Na przykład obrazowanie eNOS shuttling42 w połączeniu z technologią geNOps w pojedynczych komórkach śródbłonka może być odpowiednie do skorelowania tworzenia NO• z subkomórkową lokalizacją i translokacją enzymu wytwarzającego NO• lub innych istotnych białek, takich jak kalmodulina i kaweolina43.
Tutaj opisujemy praktyczne zastosowanie komórek HEK i EA.hy926 z ekspresją G-geNOp do wizualizacji egzogennie i endogennie generowanych komórkowych sygnałów NO• na poziomie pojedynczej komórki oraz w czasie rzeczywistym na konwencjonalnym mikroskopie fluorescencyjnym o szerokim polu. Nasze dane sugerują, że geNOpy są odpowiednie do specyficznego śledzenia dynamiki (sub)komórkowego NO• w różnych warunkach eksperymentalnych przy użyciu wszelkiego rodzaju interesujących typów komórek.

Niedawno opracowaliśmy nową klasę genetycznie kodowanych sond fluorescencyjnych NO•, zwanych geNOps1. Czujniki te składają się z prosto zbudowanej, pochodzącej od bakterii, domeny wiążącej NO• 2, która jest sprzężona z odrębnym wariantem białka fluorescencyjnego (FP) 3 (cyjan, zielony lub pomarańczowy FP). NO• wiązanie z centrum żelaza niehemowego(II) class4 w geNOps natychmiast zmniejsza intensywność fluorescencji1. Co ważne, fluorescencja geNOps szybko i w pełni się regeneruje, gdy wewnątrzkomórkowy poziom NO• spada1. W związku z tym geNOps umożliwiają obrazowanie w czasie rzeczywistym (sub)komórkowych fluktuacji NO•. Chociaż mechanizm wykrywania NO• geNOps pozostaje do tej pory niejasny, okazały się one doskonałymi reporterami NO•, a tym samym mają potencjał, aby otworzyć nową erę polichromatycznego, ilościowego bioobrazowania NO• o wysokich rozdzielczościach przestrzennych i czasowych1,5. Inne dostępne sondy fluorescencyjne NO• są oparte na małych związkach chemicznych, które muszą być załadowane do komórek i są nieodwracalnie modyfikowane przez NO•6. Dodatkowymi wadami małych fluoroforów wrażliwych na NO• są ich potencjalna cytotoksyczność i stosunkowo niska swoistość, co utrudnia ich stosowanie w sposób wiarygodny, analityczny i rozstrzygający7,8,9. Chociaż efektywne wykorzystanie genetycznie kodowanych sond fluorescencyjnych wymaga wydajnych technik transferu genów, genetycznie kodowane czujniki oparte na FP okazały się niezbędnymi narzędziami, które zrewolucjonizowały nasze zrozumienie wewnętrznego funkcjonowania komórek10,11. Przed opracowaniem pojedynczych geNOps opartych na FP skonstruowano czujnik NO• oparty na rezonansowym transferze energii Förstera (FRET), określany jako NOA-112. Sato i in. zaprojektowali tę wyrafinowaną sondę, która składa się z dwóch podjednostek wrażliwej na NO• rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej (sGC), obie sprzężone z czujnikami opartymi na FRET, raportującymi poziomy cyklicznego monofosforanu guanozyny (cGMP)12. Ponieważ ta sonda reaguje na cGMP, tylko pośrednio wykrywa wewnątrzkomórkowe fluktuacje NO•12. Chociaż NOA-1 reaguje na podwyższenie NO• w zakresie nanomolowym, narzędzie to nie było do tej pory często używane, prawdopodobnie ze względu na ograniczenia dotyczące dostępności i praktyczności tego nieporęcznego czujnika dwudzielnego.
Wszechstronne funkcje NO•, które wpływają na podstawowe procesy biologiczne, zostały dobrze scharakteryzowane13,14. Wiele badań dowiodło, że stężenie NO• w komórkach i subdomenach determinuje los komórek w zdrowiu i chorobach14,15,16. U ssaków NO• jest głównie wytwarzany enzymatycznie w różnych typach komórek przez dobrze scharakteryzowaną rodzinę syntazy tlenku azotu (NOS)17. Do tej pory opisano trzy izoformy NOS: 18,19,20; są to śródbłonkowe NOS zależne od Ca2+/kalmoduliny (eNOS lub NOS-3)18 i neuronalne NOS (nNOS lub NOS-1)19 oraz Ca2+/calmodulin-independent konstytutywnie aktywny indukowany NOS (iNOS lub NOS-2)20. Co więcej, zasugerowano również istnienie mitochondrialnego NOS (mtNOS)21. Jednak mtNOS jest uważany za wariant splicingu nNOS i dlatego nie jest oddzielnie klasyfikowany jako isoform21. Inną izoformą, oprócz tych w komórkach ssaków, jest tzw. bakteryjny NOS (bNOS), występujący głównie w bakteriach Gram-dodatnich22. Enzymatyczna produkcja NO• jest ściśle kontrolowana i zależy od dostępności kilku kofaktorów, takich jak fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADPH), dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD), tetrahydrobiopteryna (BH4), tlen cząsteczkowy i L-arginina17. Aminokwas kationowy L-arginina jest substratem, który jest przekształcany w L-cytrulinę po NO• production17. Oprócz wysoce regulowanego enzymatycznego wytwarzania NO•, postulowano, że rodnik może być redukowany nieenzymatycznie z puli azotynów przez mitochondria w warunkach niedotlenienia23. Gdy NO• zostanie wytworzony w komórce, może swobodnie dyfundować przez błony biologiczne14,15. Jednak bardzo krótki okres półtrwania tego rodnika zależy głównie od warunków środowiskowych, a różne szlaki i reakcje chemiczne skutecznie degradują poziomy NO•24. Ostatecznie powstawanie, dyfuzja i degradacja NO• zależy od różnych parametrów środowiskowych, które determinują efektywne stężenie wysoce aktywnej biologicznie cząsteczki24.
Technologia geNOps pozwala na bezpośrednie wykrywanie fluktuacji (sub)komórkowego NO•1 i dlatego jest odpowiednia do ponownego zbadania i odkrycia mechanizmów odpowiedzialnych za gromadzenie i dekompozycję komórkowych sygnałów NO•. W tym miejscu przedstawiamy proste protokoły i reprezentatywne wyniki dotyczące wykorzystania geNOps do wizualizacji egzogennie wywołanych i endogennie generowanych profili NO• na poziomie poszczególnych komórek. Co więcej, technologia geNOps może zostać zaadaptowana do zastosowania w innych systemach modeli komórkowych w celu badania złożonych wzorców powstawania, dyfuzji i degradacji NO• w odpowiedzi na różne bodźce komórkowe i stresy.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>3957.20</td><td>chlorek sodu</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>6781.1</td><td>chlorek potasu</td></tr><tr><td>CaCl2&#183; 2H2O</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>T885.1</td><td>dwuwodny chlorek wapnia</td></tr><tr><td>MgCl2&#183; 6H2O</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>2189.2</td><td>sześciowodny chlorek magnezu</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>9105.3</td><td>Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>8551.1</td><td>wodorowęglan sodu</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>104873</td><td>diwodorofosforan potasu</td></tr><tr><td>Na2HPO4&#183; 2H2O</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>4984.1</td><td>wodorofosforan sodu dwuwodny</td></tr><tr><td>D(+)-Glukoza monohydrat</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>6780.1</td><td>>99.5%; do hodowli komórkowych, wolny od endotoksyn</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>3054.2</td><td>glikol etylenowy-bis(2-aminoetyloeter)-N&#8288;,&#8288; N&#8288;,&#8288; N&#8288; &prime; &#8288;,&#8288; N&#8288; &prime; &#8288; -tetraoctowy; czynnik chelatujący wapń</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>6771.1</td><td>wodorotlenek sodu</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>4625.1</td><td>kwas solny, dymiący, 37% (~10 N)</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>4720.1</td><td>dimetylosulfotlenek; &nbsp; wysoce polarny, aprotonowy rozpuszczalnik organiczny</td></tr><tr><td>chlorowodorek kwasu L-glutaminowego&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich, Wiedeń, Austria</td><td>Kwas G2128</td><td>(S)-2-aminoglutarynowy</td></tr><tr><td>DMEM, niska glukoza</td><td>Sigma Aldrich, Wiedeń, Austria</td><td>D5523</td><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średni - niski poziom glukozy; z 1 000 mg/L glukozy i L-glutaminą, bez wodorowęglanu sodu, w proszku, odpowiedni do hodowli komórkowych&nbsp;</td></tr><tr><td>Roztwór witaminowy MEM (100x)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>11120037</td><td>100x więcej witamin znajdujących się w standardowym roztworze Minimum Essential Medium (MEM)</td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów (50x)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>11130036</td><td>50x więcej aminokwasów egzogennych (z wyjątkiem L-glutaminy) znajdujących się w standardowym pożywce Minimum Essential (MEM)</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>15140122.00</td><td>antybiotyki zapobiegające skażeniu bakteryjnemu kultur komórkowych</td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>15290026.00</td><td>Gibco Amfoterycyna B zawiera 250 &mikro; g amfoterycyny B (Fungizone) i 205 &mikro; g deoksycholanu sodu; zapobiega zanieczyszczeniu kultur komórkowych drożdżami i grzybami wielokomórkowymi</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>10270106</td><td>Surowica bydlęca płodu, kwalifikowana, zatwierdzona przez UE, pochodzenie z Ameryki Południowej</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>10010031.00</td><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td></tr><tr><td>Fura-2 (AM)</td><td>Teflabs, Austin, TX, USA</td><td>102</td><td>fluorescencyjne cytozolowe wskaźniki wapnia</td></tr><tr><td>Dihydrochlorek histaminy</td><td>Sigma Aldrich, Wiedeń, Austria</td><td>H7250</td><td>dichlorowodorek 2-(4-Imidazolylo)etyloaminy; Agonista generujący IP3&nbsp;</td></tr><tr><td>N&omega;-Nitro-L-arginina</td><td>Sigma Aldrich, Wiedeń, Austria</td><td>N5501</td><td>Kwas N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminotanowy; L-NNA; &nbsp; inhibitor syntazy tlenku azotu</td></tr><tr><td>NOC-7</td><td>Calbiochem/Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>487952</td><td>3-(2-hydroksy-1-metylo-2-nitrozohydrazyno)-N-metylo-1-propanaminy; donor tlenku azotu (NO) krótki okres półtrwania uwalniania NO</td></tr><tr><td>Dwuwodny nitroprusydek sodu</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Teksas, USA</td><td>sc-203395A</td><td>dwuwodny nitrożelazocyjanek(III) sodu; związek uwalniający tlenek azotu</td></tr><tr><td>30 mm Szkiełka</td> <td>nakrywkoweKarl Hecht, Sondheim v. d. Rh&ouml; n, Niemcy</td><td>41001130</td><td>szkiełka nakrywkowe, HECHT "Assistent", rozmiar 1, okrągłe, 30 mm, (VE: 100 szt.)&nbsp;</td></tr><tr><td>Roztwór wzmacniający żelaza(II)</td><td>Obrazowanie fluorescencyjne nowej generacji (NGFI), Graz, Austria</td><td>n.a.Żelazo</td><td>(II) zawierające fizjologiczny bufor do nietoksycznego obciążenia komórek żelazem(II); &nbsp; http://www.ngfi.eu/product/ironii-booster-solution/</td></tr> <tr><td>Plazmid G-geNOp</td><td>Obrazowanie fluorescencyjne nowej generacji (NGFI), Graz, Austria</td><td>n.a.plasmid</td> <td>DNA kodujący zieloną&nbsp;NO czułą sondę (G-geNOp); &nbsp; http://www.ngfi.eu/product/g-genop/</td></tr> <tr><td>G-geNOp AAV5</td><td>Obrazowanie fluorescencyjne nowej generacji (NGFI), Graz, Austria</td><td>n.a.adenovirus</td> <td>kodujący zieloną sondę czułą na NO (G-geNOp); &nbsp; http://www.ngfi.eu/product-category/genops/viral-genops-vectors/g-genop-aav5/</td></tr> <tr><td>Linia komórkowa czujnika G-geNOp Obrazowanie</td><td>fluorescencyjne nowej generacji (NGFI), Graz, Austria</td><td>n.a.</td> <td>ludzka linia komórek embrionalnych nerki (HEK293) stabilnie eksprymująca zieloną sondę wrażliwą na NO (G-geNOp); &nbsp; http://www.ngfi.eu/product-category/genops/g-genop-sensor-cell-line/</td></tr> <tr><td>HEK293A linia komórkowa</td><td>Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>R70507</td><td>subklon ludzkiej embrionalnej linii komórkowej nerki (HEK293)&nbsp;</td></tr><tr><td>Linia komórkowa EA.hy926</td><td>American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, Niemcy</td><td>CRL-2922</td><td>hybrydowy klon komórek somatycznych ludzkiej linii komórkowej żyły pępowinowej z odpornym na tioguaninę klonem A549</td></tr><tr><td>TILL iMIC</td><td>Till Photonics, Graefling, Niemcy</td><td>n.a.</td> mikroskop <td>cyfrowy</td></tr><tr><td>Monochromator Polychrome V</td><td>Till Photonics, Graefling, Niemcy</td><td>n.a.ultra</td> <td>szybkie przełączanie</td></tr><tr><td>AVT Stingray F145B</td><td>Allied Vision Technologies, Stadtroda, Niemcy</td><td>n.d.Uniwersalna</td> <td>kamera CCD z czujnikiem Sony ICX285 EXview HAD, IEEE 1394b</td></tr><tr><td>alpha Plan Fluar 40</td><td>Zeiss, G&ouml; ttingen, Niemcy</td><td>n.a.40X</td> <td>obiektywowe</td></tr><tr><td>filtry dichroiczne</td><td>Chroma Technology Corp, Rockingham, Vermont, USA</td> <td>Emiter n.a.GFP 514/3 nm (515dcxr)</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler ValveBank8</td><td>AutoMate Scientific, Inc., Berkeley, Kalifornia, USA</td><td>01-08</td><td>programowalna jednostka sterująca systemem perfuzji</td></tr><tr><td>Sterowanie BVC</td><td>Vacuubrand, Wertheim, Niemcy</td><td>727200</td><td>Chemia pompa membranowa ME 1C; pompa próżniowa do systemu perfuzyjnego</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>&nbsp; Obraz NIH&nbsp;</td><td></td><td>Program do przetwarzania obrazów Java inspirowany obrazem NIH. http://imagej.net/Welcome</td></tr></tbody></table>

zastosowanie genetycznie kodowanych fluorescencyjnych sond tlenku azotu (no•), genops, do obrazowania w czasie rzeczywistym sygnałów no• w pojedynczych komórkach

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Tlenek azotu (NO•) to mały rodnik, który pośredniczy w wielu ważnych funkcjach komórkowych u ssaków, bakterii i roślin. Pomimo istnienia dużej liczby metod wykrywania NO• in vivo i in vitro, monitorowanie NO• w czasie rzeczywistym na poziomie pojedynczych komórek jest bardzo trudne. Fizjologiczne lub patologiczne skutki NO• są determinowane przez rzeczywiste stężenie i czas przebywania tego rodnika. W związku z tym metody, które pozwalają na jednokomórkowe wykrywanie NO• są wysoce pożądane. Niedawno rozszerzyliśmy paletę wskaźników NO•, wprowadzając pojedyncze sondy tlenku azotu (NO•) (geNOps) na bazie białek fluorescencyjnych, które bezpośrednio reagują na wahania komórkowego NO•, a tym samym odpowiadają na tę potrzebę. Tutaj pokazujemy zastosowanie geNOps do oceny wewnątrzkomórkowych sygnałów NO• w odpowiedzi na dwie różne chemiczne cząsteczki uwalniające NO•. Nasze wyniki potwierdzają również, że świeżo przygotowana 3-(2-hydroksy-1-metylo-2-nitrozohydrazyno)-N-metylo-1-propanamina (NOC-7) ma znacznie wyższy potencjał wywoływania zmian wewnątrzkomórkowych poziomów NO• w porównaniu z nieorganicznym donorem NO• nitroprusydkiem sodu (SNP). Ponadto przeprowadzono dwukolorowe obrazowanie żywych komórek przy użyciu zielonych geNOps (G-geNOp) i chemicznego wskaźnika Ca2 + fura-2 w celu wizualizacji ścisłej regulacji tworzenia się Ca 2 + zależnego od Ca2 + NO• w pojedynczych komórkach śródbłonka. Te reprezentatywne eksperymenty pokazują, że geNOpy są odpowiednimi narzędziami do badania generowania i degradacji sygnałów NO• w czasie rzeczywistym w pojedynczych komórkach w różnych konfiguracjach eksperymentalnych.

Wizualizacja profilu NO• w pojedynczych komórkach w odpowiedzi na przejściowe podanie donorów NO
Wykorzystano klon komórek HEK stabilnie eksponujący G-geNOp (Ryc. 1A), aby zwizualizować sygnały NO• na poziomie pojedynczych komórek w odpowiedzi na dwa różne uwalniające NO związki chemiczne o małej masie cząsteczkowej: NOC-7 oraz SNP. Donory NO• były kolejno aplikowane do komórek i usuwane podczas obrazowania przy użyciu grawitacyjnego systemu perfuzji, który zapewniał ciągły przepływ (Ryc. 1B). Wszystkie komórki eksponujące G-geNOp z różnym natężeniem wykazały wyraźny spadek fluorescencji w odpowiedzi na NOC-7 i SNP (Ryc. 1C), co wskazuje na szybką akumulację NO• wewnątrz komórek po dodaniu donorów NO•. Znormalizowane sygnały fluorescencji (1-F/F0) wykazały, że oba donory NO• wywołały jednorodne wzrosty poziomu NO• w komórkach, które całkowicie powróciły do stanu pierwotnego po wypłukaniu związków uwalniających NO• (Ryc. 1D). Jednakże 10 µM SNP wywołało jedynie 50% sygnału NO• w komórkach (9,63 ± 1,05%, n = 3/38) w porównaniu do poziomu osiągniętego przez 10 µM NOC-7 (18,10 ± 1,20%, n = 3/38, p &lt; 0,0001). Aby osiągnąć równy poziom wewnątrzkomórkowego NO• przy użyciu obu donorów NO•, wymagane było zastosowanie stężenia 1 mM SNP (Ryc. 1C, 1D).
Następnie przetestowaliśmy zdolność świeżo przygotowanego oraz przeterminowanego NOC-7 do podnoszenia wewnątrzkomórkowych poziomów NO• w komórkach HEK. W tym celu przygotowaliśmy cztery bufory eksperymentalne zawierające 5 µM NOC-7. Donor NO• był dodawany na świeżo bezpośrednio przed pomiarem lub przechowywany w rezerwoarach przez 1 hr, 2 hr i 3 hr w temperaturze pokojowej przed pomiarem. Różne bufory były kolejno aplikowane i usuwane z komórek wykazujących ekspresję G-geNOp przy użyciu systemu perfuzyjnego (Rycina 2B). Podejście to ujawniło stabilność wodnych roztworów NOC-7, które, zgodnie z oczekiwaniami, wykazały z czasem zmniejszoną zdolność do podnoszenia wewnątrzkomórkowych poziomów NO• (Ryciny 2A, 2C). Co ciekawe, sygnały NO• powracały znacznie szybciej po usunięciu przeterminowanych buforów w porównaniu z wewnątrzkomórkową odpowiedzią NO• wywołaną przez świeży NOC-7 (Rycina 2C), co może wskazywać na adhezję nienaruszonych cząsteczek uwalniających NO• do komponentów komórkowych.
Jednoczesna wizualizacja sygnałów Ca2+ i NO• w pojedynczych komórkach śródbłonka
Aby zbadać formowanie NO• indukowane Ca2+ w komórkach śródbłonka, powszechnie stosowaną unieśmiertelnioną linię komórek zastępczych śródbłonka, linię komórkową EA.hy926, przejściowo transfekowano G-geNOp i załadowano Fura-2/am (patrz Protokół 2.8). Transfekcja pozwoliła uzyskać około 10% komórek śródbłonka pozytywnych pod kątem G-geNOp (n = 6, Rysunek 3A), co jest wystarczające do rejestracji produkcji NO• wywołanej Ca2+ na poziomie pojedynczych komórek śródbłonka. Jednakże, stosując wektor wirusa towarzyszącego adenowirusom, osiągnęto niemal 100% komórek EA.hy926 pozytywnych pod kątem G-geNOp (n = 6; patrz Protokół 2.2). Przed pomiarami wielokanałowymi komórki inkubowano przez 20 min w temperaturze pokojowej w buforze do przechowywania zawierającym L-NNA, silny nieodwracalny inhibitor NOS26. Komórki kontrolne utrzymywano w tym samym buforze do przechowywania bez L-NNA (patrz Protokół 1.1) (Rysunek 3B). Traktowanie komórek kontrolnych histaminą, silnym agonistą generującym inozytol 1,4,5-trisfosforan (IP3), natychmiast podniosło poziomy Ca2+ w cytozolu, po czym nastąpił stopniowy wzrost wewnątrzkomórkowego NO• aż do momentu usunięcia agonisty (Rysunki 3C, 3D). Komórki wstępnie potraktowane inhibitorem NOS wykazały podobne sygnały Ca2+ w cytozolu, podczas gdy poziom wewnątrzkomórkowego NO• pozostał niemal niezmieniony w odpowiedzi na histaminę (Rysunek 3E). Komórki EA.hy926 wykazujące ekspresję G-geNOp traktowano również 1 µM oraz 100 µM ATP, agonisty generującego IP3, aby sprawdzić, czy geNOpy nadają się do monitorowania sygnałów NO• w odpowiedzi na niskie stężenia fizjologiczne, jak i stężenia suprafizjologiczne agonisty (Rysunek 3F). W linii komórkowej śródbłonka 1 µM ATP wywołało wyraźny sygnał NO• w cytozolu, który stanowił około połowy sygnału uzyskanego przy 100 µM ATP (Rysunek 3F).
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, system mikroprzepływowy, wykres odpowiedzi komórkowej, SNP, dane z eksperymentów z NOC-7." src="/files/ftp_upload/55486/55486fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Profile wewnątrzkomórkowego NO w odpowiedzi na różne cząsteczki uwalniające NO. (A) Obrazy szerokopolowe komórek HEK stabilnie wykazujących ekspresję cytozolowego G-geNOp. Pasek skali = 20 µm. (B) Schematyczny rysunek grawitacyjnego, półautomatycznego systemu perfuzji do kontrolowanego podawania i usuwania NOC-7 oraz SNP. (C) Reprezentatywne (z 3 niezależnych eksperymentów) nienormowane ślady intensywności fluorescencji pojedynczych komórek w jednostkach arbitralnych w funkcji czasu dla komórek HEK stabilnie wykazujących ekspresję cytozolowego G-geNOp w odpowiedzi na 10 µM NOC-7, 10 µM SNP oraz 1 mM SNP. Pogrubiona czarna krzywa przedstawia średnią z 26 śladów pojedynczych komórek (jasnoszare krzywe). Czarna przerywana krzywa przedstawia F0, która została użyta do normalizacji. (D) Znormalizowane i odwrócone ślady pojedyncze (1-F/F0, jasnoszare krzywe) oraz krzywa średnia (pogrubiona czarna krzywa) w czasie w odpowiedzi na 10 µM NOC-7, 10 µM SNP oraz 1 mM SNP wyekstrahowane z panelu C. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55486/55486fig1large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Badanie wzbudzenia optycznego NOC-7; schemat, wykres intensywności fluorescencji, układ pompy próżniowej." src="/files/ftp_upload/55486/55486fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Test stabilności NOC-7 z wykorzystaniem komórek HEK stabilnie eksponujących G-geNOp. (A) Reprezentatywna krzywa odpowiedzi stężenia NO• w czasie w komórkach HEK stabilnie eksponujących G-GeNOps po zastosowaniu świeżych i starych roztworów buforowych NOC-7. Wszystkie bufory zawierające NOC-7 zostały przygotowane początkowo z końcowym stężeniem 5 µM przy użyciu tego samego roztworu stokowego (50 mM). Czas, jaki upłynął od przygotowania poszczególnych roztworów do obrazowania, wynosi odpowiednio 1 hr, 2 hr i 3 hr, zgodnie z oznaczeniami. (B) Schematyczny rysunek półautomatycznego systemu perfuzji grawitacyjnej do kolejnego dodawania i usuwania roztworów zawierających NOC-7 podczas obrazowania. (C) Korelacje czasowe sygnałów NO• w komórkach w odpowiedzi na świeżo przygotowane i stare bufory NOC-7. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55486/55486fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Pomiar tlenku azotu przy użyciu mikroskopii; wielokanałowe obrazowanie fluorescencyjne i wykresy odpowiedzi na histaminę." src="/files/ftp_upload/55486/55486fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Jednoczesne wielokanałowe obrazowanie sygnałów NO• i Ca2+ w pojedynczych komórkach EA.hy926. (A) Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne w szerokim polu komórek EAhy.926 wykazujących ekspresję G-geNOp (panel lewy), które zostały załadowane fura-2/am (panele środkowy i prawy). Pasek skali = 20 µm. (B) Schematyczne przedstawienie traktowania komórek EAhy.926 500 µM Nω-nitro-L-argininą (L-NNA) przez 20 min w płytce sześciodołkowej przed pomiarem. (C) Reprezentatywny przebieg czasowy jednoczesnego zapisu sygnałów fura-2 (wzbudzenie: 340 nm/380 nm, emisja: 510 nm) oraz G-geNOp (wzbudzenie: 480 nm, emisja: 520 nm) w odpowiedzi na 100 µM histaminy. Jak wskazano, histaminę usunięto po 3 min przy użyciu systemu perfuzyjnego. (D) Krzywe reprezentują jednoczesne zapisy sygnałów cytosolowego Ca2+ (sygnały stosunku fura-2, F340/F380 – szara linia ciągła) i NO• (znormalizowana i odwrócona krzywa, 1-F/F0 – zielona linia ciągła) w czasie dla pojedynczej komórki śródbłonka załadowanej fura-2/am, przejściowo wykazującej ekspresję G-geNOp. Komórki stymulowano 100 µM histaminy przez 3 min w buforze zawierającym Ca2+ (2 mM CaCl2) (n = 8/3). (E) Reprezentatywne jednoczesne zapisy sygnałów Ca2+ (szara linia ciągła) i NO• (zielona linia ciągła) w czasie dla komórki EA.hy926, która została poddana wstępnemu traktowaniu 500 µM Nω-nitro-L-argininą (L-NNA) przed pomiarem (n = 12/3). Komórki traktowano 100 µM histaminy w obecności 2 mM Ca2+. (F) Średnie krzywe reprezentujące sygnały cytosolowego NO• w odpowiedzi na 1 µM ATP, a następnie drugą stymulację komórek 100 µM ATP. Słupki reprezentują wartości średnie ± SD maksymalnych sygnałów G-geNOp w odpowiedzi na 1 µM ATP (biały słupek) i 100 µM ATP (zielony słupek) z 4 niezależnych eksperymentów; p &lt; 0,001 vs. 1 µM ATP. Wartość p obliczono przy użyciu nieparzystego testu t. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55486/55486fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Ten manuskrypt przedstawia protokoły zastosowania nowych genetycznie kodowanych sond tlenku azotu (NO•) (geNOps) do monitorowania fluktuacji NO• pojedynczej komórki w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Powstawanie NO• wywołane przez Ca2+ na poziomie pojedynczych komórek śródbłonka uwidoczniono poprzez połączenie geNOps z chemicznym czujnikiem Ca2+.

Zastosowanie genetycznie kodowanych fluorescencyjnych sond tlenku azotu (NO•), geNOps, do obrazowania w czasie rzeczywistym sygnałów NO• w pojedynczych komórkach

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...

Ogólnym celem tej metody obrazowania jest monitorowanie sygnałów tlenku azotu w czasie rzeczywistym na poziomie pojedynczych komórek przy użyciu nowej klasy genetycznie kodowanych fluorescencyjnych sond tlenku azotu, geNOps. Biorąc pod uwagę znaczenie tlenku azotu w biologii i fizjologii, wizualizacja tej cząsteczki na poziomie komórkowym, a nawet subkomórkowym, była pożądana od momentu jej odkrycia. Wizualizujemy sygnały tlenku azotu za pomocą nowych, o stosunkowo prostej budowie sond opartych na białkach fluorescencyjnych, geNOps.Sondy geNOps reagują bezpośrednio i natychmiastowo na tlenek azotu poprzez wygaszenie fluorescencji. Oznacza to, że można monitorować w czasie rzeczywistym kinetykę generowania, dyfuzji i degradacji tlenku azotu w pojedynczych komórkach. Główną zaletą geNOps jest możliwość obserwacji sygnałów tlenku azotu z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego.Procedurę należy rozpocząć od zastąpienia buforu do przechowywania linii komórek śródbłonka lub komórek HEK293 roztworem wzmacniającym żelazo(II) w ilości jednego mililitra na dołek w temperaturze pokojowej. Komórki należy inkubować przez dokładnie 20 minut w ciemności. Procedura ładowania żelaza jest niezbędna do uzyskania pełnej responsywności sond i może zostać dostosowana do różnych typów komórek oraz zastosowań.Następnie komórki należy raz przemyć buforem do przechowywania, a każdą studzienkę inkubować z dwoma mililitrami buforu do przechowywania przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej, aby umożliwić komórkom równowagowanie. Następnie bufor do przechowywania należy zastąpić 3,3-mikromolarnym Fura-2AM w jednym mililitrze buforu do przechowywania. Komórki należy chronić przed światłem i inkubować przez 45 minut.Po 45 minutach przemyć komórki dwukrotnie buforem do przechowywania, a następnie inkubować je ponownie przez co najmniej 30 minut, aby umożliwić ich equilibration. Aby rozpocząć procedurę, należy najpierw przymocować szkiełko zakrywkowe o średnicy 30 mm pokryte linią komórek śródbłonka lub komórkami HEK293 w metalowej komorze perfuzyjnej. Włączyć system obrazowania, a następnie umieścić metalową komorę perfuzyjną na mikroskopie.Podłącz rurkę doprowadzającą do zbiorników z buforem, a następnie uruchom system perfuzji. Teraz podłącz odpływ do pompy próżniowej, zapewniając stały przepływ i zapobiegając osuszeniu szkiełka podstawowego. Rozpocznij perfuzję grawitacyjną z użyciem fizjologicznego buforu wapniowego, korzystając z półautomatycznego systemu perfuzji.Następnie należy zdefiniować ustawienia obrazowania w odpowiednim oprogramowaniu. Dla obrazowania Fura-2 należy wybrać długości fal wzbudzenia 340 nanometrów oraz 380 nanometrów, a dla wzbudzenia G-geNOp – 480 nanometrów. Następnie należy wyznaczyć obszar obrazowania, przesuwając stół xyz mikroskopu do momentu, aż kilka fluorescencyjnych komórek znajdzie się w ogniskowej.Następnie należy zdefiniować obszary zainteresowania. Należy wyznaczyć obszary obejmujące kilka całych pojedynczych komórek fluorescencyjnych dla każdego pola obrazowania. Po tym kroku należy zdefiniować obszar tła o podobnej wielkości.Rozpocznij gromadzenie danych przy użyciu odwróconego, zaawansowanego mikroskopu fluorescencyjnego z zmotoryzowanym stolikiem przedmiotowym i monochromatycznym źródłem światła. Alternatywnie, pobudź komórki odpowiednio przy 340 nanometrach i 380 nanometrach dla Fura-2AM oraz przy 480 nanometrach dla G-geNOp. Ustaw odpowiednie czasy ekspozycji tak, aby dla wszystkich kanałów w czasie był wykrywalny wyraźny sygnał fluorescencji.Emitowane światło zbieraj przy 510 nanometrach dla Fura-2AM i 520 nanometrach dla G-geNOp, używając kamery CCD z odpowiednim zestawem filtrów, składającym się z wzbudzacza 500 nanometrów, filtru dichroicznego 495 nanometrów i emitera 510-520 nanometrów. Następnie rejestruj jedną pełną klatkę co trzy sekundy. Rejestruj pierwsze trzy minuty w fizjologicznym buforze wapniowym, aby uzyskać linię bazową odpowiednich sygnałów fluorescencji.Po zaobserwowaniu stabilnej fluorescencji bazowej, przełącz na bufor z fizjologicznym stężeniem wapnia zawierający 100 µM histaminy lub ATP, aby stymulować komórki przez trzy minuty. Następnie przełącz z powrotem na bufor z fizjologicznym stężeniem wapnia bez histaminy lub ATP oraz z dodatkiem L-NNA na pięć minut, aby usunąć związki z komórek. Po tym czasie, za pomocą systemu perfuzyjnego, podaj 10 µM NOC-7 w buforze z fizjologicznym stężeniem wapnia przez dwie minuty.Donor tlenku azotu silnie wpływa na fluorescencję G-geNOp, zazwyczaj obniżając ją w komórkach o ponad 20% w odpowiedzi na 10 µM NOC-7. W komórkach EA.hy926 efekt NOC-7 jest silniejszy w porównaniu do wygaszenia fluorescencji G-geNOp indukowanego agonistą. Następnie wypłukać związek uwalniający tlenek azotu przez około 10 minut przy użyciu fizjologicznego buforu wapniowego i zakończyć pomiar po powrocie do podstawowego poziomu fluorescencji.Przedstawiono tutaj reprezentatywne szerokopolowe obrazy fluorescencyjne komórek EA.hy926 wykazujących ekspresję G-geNOp, które zostały załadowane Fura-2AM. A tutaj znajduje się reprezentatywny przebieg czasowy jednoczesnych pomiarów sygnałów Fura-2 i G-geNOp w odpowiedzi na 100 µM histaminy. Jak zaznaczono, histaminę usunięto po trzech minutach za pomocą systemu perfuzyjnego.Krzywe te przedstawiają jednoczesne pomiary sygnałów wapnia cytozolowego i tlenku azotu w pojedynczej komórce śródbłonka obciążonej Fura-2AM, przejściowo eksprimującej G-geNOp. Komórki stymulowano 100 µM histaminą przez trzy minuty w buforze zawierającym wapń. Przedstawiono tutaj reprezentatywne, jednocześnie zarejestrowane sygnały wapnia i tlenku azotu w funkcji czasu dla komórki EA.hy926, która przed pomiarem została poddana wstępnemu traktowaniu 500 µM L-NNA.Komórki poddano działaniu 100 µM histaminy w obecności 2 mM wapnia. Rysunek ten przedstawia średnie krzywe reprezentujące sygnały tlenku azotu w cytozolu w odpowiedzi na 1 µM ATP, a następnie drugą stymulację komórek 100 µM ATP. Po opanowaniu ta technika pozwala na wizualizację sygnałów tlenku azotu w czasie rzeczywistym przy minimalnym wysiłku.Wierzę, że technika ta utoruje drogę badaczom do eksploracji i ponownego zbadania sygnałów tlenku azotu w różnych modelach komórkowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat wykorzystania technologii geNOps do obrazowania tlenku azotu w czasie rzeczywistym w Państwa systemie modelowym.

application-genetically-encoded-fluorescent-nitric-oxide-no-probes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Lacin, E., et al. Budowa komórkowych neuroprzekaźników fluorescencyjnych (CNiFER) do optycznej detekcji neuroprzekaźników in vivo. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia technikę obrazowania uwalniania neuroprzekaźników in vivo przy użyciu komórkowych neuroprzekaźników fluorescencyjnych (CNiFER), wyspecjalizowanych komórek reporterowych wstępnie wstrzykniętych do kory myszy. Umieszczona pod mikroskopem dwufotonowym mysz umożliwia wizualizację sygnalizacji wapniowej indukowanej przez...

Obrazowanie uwalniania neuroprzekaźników za pomocą komórkowych neuroprzekaźników fluorescencyjnych

Ratiometryczne dwumolekularne latarnie (RBMB) mogą być używane do obrazowania pojedynczych transkryptów RNA w żywych komórkach. W tym miejscu opisujemy przygotowanie i oczyszczanie RBMB, dostarczanie RBMB do komórek za pomocą mikroporacji i obrazowanie fluorescencyjne pojedynczych transkryptów RNA w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym pojedynczych zmodyfikowanych transkryptów RNA w żywych komórkach przy użyciu ratiometrycznych latarni bimolekularnych

Ten artykuł pokaże, jak monitorować dynamikę glutaminy w żywych komórkach za pomocą FRET. Genetycznie kodowane czujniki umożliwiają monitorowanie cząsteczek biologicznych w czasie rzeczywistym w rozdzielczości subkomórkowej. Omówiony zostanie projekt eksperymentu, szczegóły techniczne warunków eksperymentalnych oraz rozważania dotyczące analiz poeksperymentalnych dla genetycznie kodowanych czujników glutaminy.

Obrazowanie strumienia glutaminy za pomocą genetycznie kodowanych czujników

Ten manuskrypt opisuje nowatorską technikę, która pozwala na wykrywanie wewnątrzkomórkowej ekspresji genów po endocytozie nanocząstek znakowanych fluorescencyjnie bezpośrednio w żywych komórkach. Metoda nie wymaga manipulacji komórkami i nie jest ograniczona w odniesieniu do docelowego genu lub gatunku.

Wykrywanie wewnątrzkomórkowej ekspresji genów w żywych komórkach pochodzenia mysiego, ludzkiego i świńskiego za pomocą nanocząstek znakowanych fluorescencyjnie

Przedstawiamy protokół do tworzenia komórkowych neuroprzekaźników fluorescencyjnych (CNiFERs) do optycznego wykrywania wolumetrycznego uwalniania neuroprzekaźników.

Budowa komórkowych neuroprzekaźników fluorescencyjnych (CNiFER) do optycznej detekcji neuroprzekaźników in vivo

Zmiany morfologiczne występują w komórkach fibroblastów reagujących immunologicznie po aktywacji i sprzyjają zmianom w rekrutacji komórek. Wykorzystanie obrazowania 2-fotonowego w połączeniu z genetycznie modyfikowanym białkiem 1 specyficznym dla fibroblastów (FSP1)-cre; Linia myszy tdTomato floxed-stop-floxed (TB / TB) i zielony fluorescencyjnie oznaczony lipopolisacharyd-FITC, możemy zilustrować wysoce specyficzny wychwyt lipopolisacharydu w fibroblastach skóry i zmiany morfologiczne in vivo.

Dwukolorowe obrazowanie 2-fotonowe in vivo genetycznie znakowanych komórek reporterowych w skórze

Neuronalne komórki macierzyste/progenitorowe wykazują różną dynamikę ekspresji komponentów sygnalizacyjnych Notch, które prowadzą do różnych wyników zdarzeń komórkowych. Taką dynamiczną ekspresję można ujawnić poprzez monitorowanie w czasie rzeczywistym, a nie przez analizę statyczną, przy użyciu bardzo czułego systemu obrazowania bioluminescencyjnego, który umożliwia wizualizację szybkich zmian w ekspresji genów.

Obrazowanie bioluminescencyjne w czasie rzeczywistym dynamiki sygnalizacji Notch podczas neurogenezy myszy

Multipleksowa hybrydyzacja in situ (ISH) została wykorzystana do jednoczesnej wizualizacji transkryptów dla dwóch receptorów sprzężonych z białkiem G i jednego czynnika transkrypcyjnego w całym kompleksie zwoju błędnego dorosłej myszy. Protokół ten może być wykorzystany do generowania dokładnych map profili transkrypcyjnych neuronów doprowadzających nerwy błędnego.

Wykrywanie ekspresji receptora sprzężonego z białkiem G w mysich neuronach doprowadzających nerwu błędnego za pomocą hybrydyzacji Multiplex In Situ

Protokół ten opisuje, jak efektywnie konfigurować i wykonywać zautomatyzowane analizy danych obrazowania żywych komórek uzyskanych ze śledzenia transportu nukleocytoplazmatycznego za pomocą narzędzi optogenetycznych.

Wykorzystanie narzędzi optogenetycznych LEXY i LINuS oraz zautomatyzowanej analizy obrazu do ilościowego określenia dynamiki transportu nukleocytoplazmatycznego w żywych komórkach

Celem tego protokołu jest umożliwienie ilościowego pomiaru czasu życia fluorescencji sond Riboglow dla powtarzalnych przepływów pracy obrazowania RNA in vitro, w żywych komórkach ssaków i w trójwymiarowym modelu komórkowym. Przedstawiamy przykłady przygotowania próbek, dostarczania sond, pozyskiwania danych oraz przepływów pracy analizy ilościowej w celu pozyskania bezstronnego pomiaru czasu życia fluorescencji.

Charakteryzacja sond Riboglow in vitro jako podstawa dla fluorescencyjnego obrazowania czasu życia w żywych komórkach ssaków i trójwymiarowych modelach komórkowych

Poznaj metodę obrazowania tlenku azotu w czasie rzeczywistym w pojedynczych komórkach przy użyciu genetycznie kodowanych sond fluorescencyjnych geNOps. Technika ta umożliwia badanie dynamiki sygnałów NO• z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Zastosowanie genetycznie kodowanych fluorescencyjnych sond tlenku azotu (NO•), geNOps, do obrazowania w czasie rzeczywistym sygnałów NO• w pojedynczych komórkach (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowanie genetycznie kodowanych fluorescencyjnych sond tlenku azotu (NO•), geNOps, do obrazowania w czasie rzeczywistym sygnałów NO• w pojedynczych komórkach

Przeglądaj więcej filmów