Zastosowanie genetycznie kodowanych fluorescencyjnych sond tlenku azotu (NO•), geNOps, do obrazowania w czasie rzeczywistym sygnałów NO• w pojedynczych komórkach
16 marca 2017
Ten manuskrypt przedstawia protokoły zastosowania nowych genetycznie kodowanych sond tlenku azotu (NO•) (geNOps) do monitorowania fluktuacji NO• pojedynczej komórki w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Powstawanie NO• wywołane przez Ca2+ na poziomie pojedynczych komórek śródbłonka uwidoczniono poprzez połączenie geNOps z chemicznym czujnikiem Ca2+.
Ogólnym celem tego podejścia do obrazowania jest monitorowanie sygnałów tlenku azotu w czasie rzeczywistym na poziomie poszczególnych komórek przy użyciu nowej klasy genetycznie kodowanych fluorescencyjnych sond tlenku azotu, geNOps. Biorąc pod uwagę znaczenie tlenku azotu w biologii i fizjologii, od czasu jego odkrycia pożądana była wizualizacja tej cząsteczki na poziomie komórkowym, a nawet subkomórkowym. Wizualizujemy sygnały tlenku azotu za pomocą nowatorskich, raczej prostych w budowie, sond fluorescencyjnych opartych na białkach, geNOps.
GeNOps reagują bezpośrednio i natychmiast na tlenek azotu poprzez wygaszanie fluorescencji. Oznacza to, że możesz monitorować kinetykę wytwarzania, dyfuzji i degradacji tlenku azotu w czasie rzeczywistym w pojedynczych komórkach. Główną zaletą geNOps jest to, że można obserwować sygnały tlenku azotu z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową za pomocą konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego.
Rozpocznij tę procedurę od zastąpienia buforu magazynującego linię komórek śródbłonka lub komórek HEK293 jednym mililitrem na studzienkę roztworu wzmacniającego żelazo(II) w temperaturze pokojowej. Inkubuj komórki dokładnie przez 20 minut w ciemności. Procedura ładowania żelaza jest niezbędna, aby uzyskać pełną responsywność sond i może być dostosowana do różnych typów ogniw i zastosowań.
Następnie przemyć komórki raz buforem do przechowywania i inkubować każdą studzienkę z dwoma mililitrami buforu do przechowywania przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej, aby umożliwić komórkom zrównoważenie. Następnie zastąp bufor pamięci 3,3-mikromolowym Fura-2AM w jednym mililitrze bufora pamięci. Chroń komórki przed światłem i inkubuj je przez 45 minut.
Po 45 minutach przemyć komórki dwukrotnie buforem do przechowywania i ponownie inkubować je przez co najmniej 30 minut, aby umożliwić komórkom wyrównanie. Aby rozpocząć procedurę, najpierw przymocuj 30-milimetrowe szkiełko nakrywkowe pokryte linią komórek śródbłonka lub komórkami HEK293 w metalowej komorze perfuzyjnej. Włącz system obrazowania, a następnie umieść metalową komorę perfuzyjną na mikroskopie.
Podłącz rurkę dopływową do zbiorników buforowych, a następnie włącz system perfuzyjny. Teraz podłącz odpływ do pompy próżniowej, zapewniając stały przepływ i unikając opróżniania szkiełka nakrywkowego. Rozpocznij perfuzję sterowaną grawitacją z fizjologicznym buforem wapnia za pomocą półautomatycznego systemu perfuzji.
Następnie zdefiniuj ustawienia obrazowania za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Wybierz długości fal wzbudzenia: 340 nanometrów i 380 nanometrów do obrazowania Fura-2 oraz 480 nanometrów do wzbudzenia G-geNOp. Następnie wybierz obszar obrazowania, przesuwając stół xyz mikroskopu, aż kilka komórek fluorescencyjnych będzie ostrych.
Następnie zdefiniuj obszary zainteresowania. Narysuj obszary pokrywające kilka całych pojedynczych komórek fluorescencyjnych dla każdego pola obrazowania. Następnie zdefiniuj region tła o podobnym rozmiarze.
Rozpocznij zbieranie danych na odwróconym i zaawansowanym mikroskopie fluorescencyjnym z zmotoryzowanym stolikiem na próbki i monochromatycznym źródłem światła. Alternatywnie, wzbudzić komórki odpowiednio na 340 nanometrach i 380 nanometrach dla Fura-2AM i 480 nanometrach dla G-geNOp. Ustaw odpowiednie czasy ekspozycji, aby wyraźny sygnał fluorescencyjny był wykrywalny w czasie dla wszystkich kanałów.
Zbierz emitowane światło o długości 510 nanometrów dla Fura-2AM, 520 nanometrów dla G-geNOp za pomocą kamery CCD z odpowiednim zestawem filtrów składającym się z 500-nanometrowego wzbudnicy, 495-nanometrowego dichroicznego i 510-520-nanometrowego emitera. Następnie nagrywaj jedną klatkę co trzy sekundy. Zapisz pierwsze trzy minuty w fizjologicznym buforze wapniowym, aby uzyskać linię bazową odpowiednich sygnałów fluorescencyjnych.
Po zaobserwowaniu stabilnej fluorescencji wyjściowej należy przejść na 100-mikromolową histaminę lub ATP zawierającą fizjologiczny bufor wapnia, aby stymulować komórki przez trzy minuty. Następnie przełącz się z powrotem na fizjologiczny bufor wapniowy bez histaminy lub ATP i L-NNA na pięć minut, aby usunąć związki z komórek. Następnie podawać 10-mikromolowy NOC-7 w fizjologicznym buforze wapnia przez dwie minuty za pomocą systemu perfuzyjnego.
Donor tlenku azotu silnie wpływa na fluorescencję G-geNOp i zwykle zmniejsza komórki o ponad 20% w odpowiedzi na 10-mikromolowy NOC-7. W komórkach EA.hy926 efekt NOC-7 jest silniejszy w porównaniu z indukowanym przez agonistę wygaszaniem fluorescencji G-geNOp. Następnie wypłucz związek uwalniający tlenek azotu przez około 10 minut fizjologicznym buforem wapnia i przerwij rejestrację po odzyskaniu podstawowej fluorescencji.
Pokazane tutaj są reprezentatywne szerokokątne obrazy fluorescencyjne komórek EA.hy926 eksprymujących G-geNOp, które są obciążone Fura-2AM. A oto reprezentatywny przebieg czasowy jednoczesnych zapisów sygnałów Fura-2 i G-geNOp w odpowiedzi na 100-mikromolową histaminę. Jak wskazano, histamina została usunięta po trzech minutach za pomocą systemu perfuzyjnego.
Krzywe te reprezentują jednoczesne zapisy sygnałów cytozolowego wapnia i tlenku azotu pojedynczej komórki śródbłonka obciążonej Fura-2AM, przejściowo eksprymującej G-geNOp. Komórki stymulowano 100-mikromolową histaminą przez trzy minuty w buforze zawierającym wapń. Pokazane tutaj są reprezentatywne jednocześnie zarejestrowane sygnały tlenku wapnia i azotu w czasie komórki EA.hy926, która została wstępnie potraktowana 500-mikromolowym L-NNA przed pomiarem.
Komórki traktowano 100-mikromolową histaminą w obecności dwumilimolowego wapnia. Wykresy te pokazują średnie krzywe reprezentujące cytozolowe sygnały tlenku azotu w odpowiedzi na jednomikromolowe ATP, po których następuje stymulacja drugiej komórki 100-mikromolowym ATP. Po opanowaniu technika ta pozwala na wizualizację sygnałów tlenku azotu w czasie rzeczywistym przy minimalnym wysiłku.
Wierzę, że ta technika utoruje naukowcom drogę do zbadania i ponownego zbadania sygnałów tlenku azotu w różnych modelach komórkowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać technologii geNOps do obrazowania tlenku azotu w czasie rzeczywistym w swoim systemie modelowym.
Przegląd
Niniejszy manuskrypt przedstawia protokoły wykorzystania genetycznie kodowanych sond tlenku azotu (geNOps) do monitorowania fluktuacji NO• w pojedynczych komórkach w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Badanie obrazuje tworzenie NO• wyzwalane przez Ca2+ w poszczególnych komórkach śródbłonka.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Mikroskopia fluorescencyjna
Wprowadzenie
- Tlenek azotu odgrywa kluczową rolę w wielu procesach biologicznych.
- Wizualizacja NO• w czasie rzeczywistym na poziomie komórkowym była długoterminowym celem badawczym.
- Genetycznie kodowane sondy stanowią nowatorskie podejście do monitorowania dynamiki NO•.
- Wysoką rozdzielczość przestrzenną i czasową można osiągnąć za pomocą konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej.
Cel badania
- Opracowanie protokołów obrazowania sygnałów tlenku azotu w pojedynczych komórkach w czasie rzeczywistym.
- Wykorzystanie geNOps do monitorowania generowania, dyfuzji i degradacji NO•.
- Pogłębienie zrozumienia roli tlenku azotu w sygnalizacji komórkowej.
Zastosowane metody
- Przygotowanie linii komórek śródbłonkowych lub komórek HEK293 z użyciem roztworu wzmacniającego zawartość żelaza(II).
- Zastosowanie Fura-2AM do obrazowania wapnia równolegle z geNOps.
- Mikroskopia fluorescencyjna w celu rejestracji danych w czasie rzeczywistym dotyczących sygnałów NO• i wapnia.
- Stymulacja komórek histaminą lub ATP w celu obserwacji odpowiedzi NO•.
Główne wyniki
- Pomyślna wizualizacja sygnałów tlenku azotu w czasie rzeczywistym.
- Wykazanie wpływu histaminy i ATP na produkcję NO•.
- Ustalenie poziomu bazowego sygnałów fluorescencji przed i po stymulacji.
- Wykazanie reaktywności geNOps na donory tlenku azotu.
Wnioski
- Technologia geNOps umożliwia efektywne obrazowanie tlenku azotu w czasie rzeczywistym.
- Metoda ta może wspomóc dalsze badania nad sygnalizacją tlenku azotu w różnych modelach komórkowych.
- Przyszłe badania mogą zgłębiać znaczenie NO• w różnych kontekstach fizjologicznych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie dynamiki tlenku azotu (NO•) w czasie rzeczywistym na poziomie pojedynczych komórek pozwala wypełnić istotną lukę w zrozumieniu szybkich zdarzeń sygnałowych związanych z biologią chorób i poszukiwaniem nowych leków. Platforma geNOps umożliwia wysokorozdzielczą kwantyfikację generowania i degradacji NO•, wspierając ograniczanie ryzyka mechanistycznego oraz walidację punktów uchwycenia we wczesnej fazie odkryć. Zdolność ta zwiększa pewność prognostyczną w ramach selekcji projektów w portfolio oraz ciągłość badań translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację kinetyki sygnałowej NO• w żywych komórkach w celu funkcjonalnej analizy celów terapeutycznych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez ilościowe określanie odpowiedzi NO• zależnych od bodźca na poziomie pojedynczych komórek.
- Ułatwia wyjaśnienie szlaków sygnałowych poprzez korelację wahań NO• z wyzwalaczami nadrzędnymi, takimi jak napływ Ca2+.
- Zwiększa pewność prognostyczną w procesie rozwoju celów modulujących NO•.
Przesiewanie i rozwój testów
- Zapewnia zwalidowany system sond genetycznie kodowanych do powtarzalnego wykrywania NO• w różnorodnych modelach komórkowych.
- Umożliwia ilościowe odczyty w czasie rzeczywistym, odpowiednie do standaryzacji testów i dalszych etapów procesów przesiewowych.
- Wspiera obrazowanie dwuparametrowe (np. NO• i Ca2+) w celu opracowania testów multipleksowych.
- Ułatwia wiarygodną ocenę związków będących donorami NO• oraz modulatorów szlaków sygnałowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z systemami istotnymi dla przebiegu choroby, umożliwiając monitorowanie NO• w fizjologicznie relewantnych typach komórek.
- Wspiera rozwój translacyjnych biomarkerów poprzez powiązanie dynamiki NO• z funkcjonalnymi efektami komórkowymi.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną mechanizmów związanych z NO•.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka i ilościowe dane dotyczące sygnalizacji NO•.
Integracja potoków i przepływów pracy
Technologia geNOps integruje się z kontinuum odkryć, od wczesnych badań mechanistycznych, poprzez opracowywanie testów, aż po badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i mapowanie szlaków poprzez umożliwienie ilościowego pomiaru sygnału NO• w czasie rzeczywistym.
- Screening: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki do oceny związków i weryfikacji gotowości testów.
- Analityka: Zapewnia wysokorozdzielcze dane czasowe i przestrzenne do analizy porównawczej odpowiedzi NO•.
- Badania translacyjne: Łączy fazę odkryć z fazą przedkliniczną, umożliwiając monitorowanie NO• w modelach istotnych dla przebiegu chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje modułową platformę kodowaną genetycznie, którą można dostosować do różnych typów komórek i układów doświadczalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w szlakach związanych z NO•.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje detekcję NO• za pomocą skalowalnych i powtarzalnych protokołów dla różnorodnych zespołów badawczo-rozwojowych.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje typu go/no-go i zwiększa efektywność kapitałową poprzez dostarczenie solidnych odczytów funkcjonalnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i związków modulujących NO• z uwzględnieniem ryzyka.
Kwestie dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza z zakresu mikroskopii fluorescencyjnej oraz obrazowania żywych komórek.
- Wymagany jest dostęp do zaawansowanych systemów obrazowania z odpowiednimi zestawami filtrów i oprogramowaniem.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów wprowadzania sond oraz obrazowania pomiędzy zespołami.
- Można potrzebować adaptacji metody dla różnych typów komórek lub warunków doświadczalnych.
- Responsywność sondy zależy od poziomu obciążenia żelazem oraz czynników specyficznych dla danej linii komórkowej.
