Rejestracja EEG u noworodków szczurów poruszających się w swobodnym ruchu przy użyciu nowej metody
29 maja 2017
Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę przeznaczoną do rejestrowania elektroencefalografii (EEG) u swobodnie poruszających się noworodków z padaczką i opisujemy jej procedury, cechy i zastosowania. Ta metoda pozwala na rejestrację EEG przez więcej niż 1 tydzień.
Ogólnym celem tej metody jest rejestracja EEG u swobodnie poruszających się noworodkowych szczurów, z wykorzystaniem nowatorskiego zestawu elektrod, który pozostaje stabilny przez tydzień lub dłużej. Metoda ta pozwoli na udzielenie odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki i będzie pomocna w badaniu padaczki noworodkowej. Dzięki zastosowaniu tej techniki możliwe jest rejestrowanie wysokiej jakości i stabilnych sygnałów EEG w dłuższych przedziałach czasowych.
Co pomoże w diagnozowaniu różnych zaburzeń neuropatologicznych. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności, ponieważ noworodki szczurów w dniach p8 do p15 są bardzo trudne w obsłudze i wymagają szczególnej ostrożności. Elektroda wymaga kontaktu w formie widełek, aby pełnić funkcję interfejsu sygnałowego z urządzeniami komunikacyjnymi.
Tę rolę spełnia komputerowy złącze typu pin. Ostrożnie oddziel piny męskie i żeńskie z komputerowego złącza typu pin za pomocą szczypiec. Następnie połącz piny męskie i żeńskie, aby utworzyć elektrodę, i zabezpiecz połączenie cyjanoakrylanem.
Przygotuj kilka takich elektrod. Po utwardzeniu się spoiwa umieść elektrody na dziesięć minut w zlewce z wodą destylowaną. Następnie włóż je do myjki ultradźwiękowej w celu ich oczyszczenia.
Następnie przenieś zlewkę do piekarnika ustawionego na 45 °C i podgrzewaj przez pół godziny. Na koniec wysterylizuj elektrody, poddając je 30-minutowemu naświetlaniu promieniami UV. W komorze z laminarnym przepływem powietrza przygotuj wysterylizowane narzędzia chirurgiczne oraz wysterylizowany aparat stereotaktyczny do przeprowadzenia zabiegu.
Następnie znieczul noworodka szczura, stosując 2,5% izofluranu. Gdy młode zwierzę będzie w głębokiej narkozie, zmniejsz stężenie izofluranu do 1%. Przed przejściem do kolejnych etapów wykonaj test uszczypnięcia palca, aby upewnić się, że mysz jest odpowiednio znieczulona.
Następnie unieruchom głowę pupy w aparacie stereotaktycznym. Umieść pręty uszne w kanałach słuchowych i delikatnie je dokręć. Zachowaj ostrożność: czaszka noworodka jest bardzo miękka.
Następnie wykonaj piętnastomilimetrowe nacięcie w linii środkowej czaszki. Po tym delikatnie rozszerz nacięcie, odsuwając skórę głowy za pomocą pęsety. Aby utrzymać nacięcie w pozycji otwartej, zastosuj kawałek waty nasączonej solą fizjologiczną.
Następnie zlokalizuj bregma i lambda i zaznacz je ołówkiem. Poniższe kroki implantacji elektrod są krytyczne i muszą zostać wykonane precyzyjnie. W pierwszej kolejności, używając igły 26G, wykonaj otwór trepanacyjny w korze przedczołowej, 2 mm przed bregma i w odległości 0,5 mm od linii środkowej.
Następnie wykonaj otwór trepanacyjny w hipokampie w punkcie 1,8 mm za bregmą i 0,5 mm bocznie od linii środkowej. Igła nie powinna wniknąć głębiej niż 2 mm poniżej powierzchni kory, aby zminimalizować uszkodzenia mózgu. Teraz, za pomocą pęsety, wprowadź elektrodę referencyjną do otworu w korze, a elektrody rejestrujące do otworu w hipokampie.
Następnie należy nałożyć maść z erytromycyną wokół elektrod i przymocować je cyjanoakrylanem. Podczas utwardzania kleju przygotowujemy cement stomatologiczny o lepki i gęstej konsystencji. Lepkość cementu stomatologicznego ma kluczowe znaczenie.
Jeśli cement dentystyczny jest zbyt rzadki, może to doprowadzić do powstania niepożądanej warstwy izolacyjnej pod elektrodą. Jeśli cement jest zbyt gęsty, elektrody będą łatwiej odspajać się z powodu nadmiaru masy. Przed nałożeniem cementu należy dokładnie osuszyć czaszkę oraz elektrody.
Następnie przymocuj elektrody do czaszki za pomocą cementu dentystycznego. Po tym kroku nanieś na elektrody kwas pikrykowy, aby zapewnić im dodatkową warstwę ochrony. Teraz wyjmij zwierzę z ramion stereotaktycznych i wstrzyknij podskórnie 300 µL dziesięcioprocentowego roztworu glukozy.
Następnie przenieś zwierzę na podgrzewany koc, aby utrzymać temperaturę 37 °C aż do momentu odzyskania sprawności ruchowej. Po odzyskaniu sprawności ruchowej podaj buprenorfinę w celu uśmierzenia bólu pooperacyjnego i przenieś młode do domowej klatki wraz z matką. Przed użyciem implantu odczekaj co najmniej dwa dni, aby młode mogły dojść do siebie.
Po okresie rekonwalescencji umieść szczenię w pojedynczej klatce i rejestruj sygnały przez około dziesięć minut, aby zwierzę mogło oswoić się z otoczeniem. Podłącz elektrody do wzmacniacza, a wzmacniacz do przetwornika AD podłączonego do komputera. Należy uważać, aby nie poplątać tych połączeń.
Następnie w jednostce akwizycji danych wybierz częstotliwość próbkowania co najmniej 10 000 Hz dla rejestracji i sprawdź poprawność przesyłania danych. Wykonaj pomiar bazowy. Po zarejestrowaniu pomiaru bazowego wstrzyknij szczeniętowi kwas kainowy do jamy otrzewnej, aby wywołać napady padaczkowe.
Piętnast minut po iniekcji zaobserwuj i zarejestruj wyładowania epileptyczne. Zapisz zdigitalizowane dane i przeanalizuj je za pomocą oprogramowania do przetwarzania sygnałów. Wyznacz poziom mocy poszczególnych komponentów częstotliwości w noworodkowych zapisach EEG, wykorzystując analizę widma mocy.
Oblicz moc z jednominutowych ram czasowych, wyznaczając średnią kwadratową amplitudę (RMS) w zakresie od 1 do 100 Hz, który stanowi pasmo EEG. Dziesięć minut po wstrzyknięciu kwasu kainowego zarejestrowano nawracające wzorce wyładowań EEG interiktalnych i iktalnych. Najczęściej rejestrowanymi napadami były napady typu toniczno-klonicznego.
Czas trwania fazy tonicznej napadu wynosił około piętnastu sekund. Zaobserwowano również, że wyładowaniom tonicznym towarzyszyły serie wyładowań klonicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat sposobu implantacji elektrod oraz pozyskiwania wysokiej jakości zapisów EEG od noworodków szczurów w wieku od p8 do p15.
Po przygotowaniu, implantacja szyjna może zostać przeprowadzona w mniej niż dziesięciu minutach, w zależności od stopnia skomplikowania zabiegu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia nowatorską technikę rejestracji elektroencefalografii (EEG) u swobodnie poruszających się noworodków szczurów z epilepsją. Metoda ta umożliwia stabilną rejestrację EEG trwającą ponad tydzień, co ułatwia badanie epilepsji noworodkowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Epilepsja noworodkowa
Wstęp
- Rejestracja EEG u noworodków szczurów jest trudna ze względu na ich delikatną naturę.
- Stabilne ustawienia elektrod są kluczowe dla uzyskania wysokiej jakości danych.
- Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neuronauki.
- Pomaga ona w diagnozowaniu zaburzeń neuropatologicznych.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody rejestracji EEG u noworodków szczurów.
- Pogłębienie zrozumienia epilepsji noworodkowej.
- Zapewnienie narzędzia do długoterminowego monitorowania aktywności mózgu.
Zastosowane metody
- Nowatorska konfiguracja elektrod zapewniająca stabilne zapisy EEG.
- Rejestracja sygnałów z swobodnie poruszających się noworodków szczurów w wieku od p8 do p15.
- Zapewnienie ostrożnego obchodzenia się z badanymi osobnikami podczas procedury.
- Wykorzystanie styków widełkowych jako interfejsu sygnałowego z urządzeniami komunikacyjnymi.
Główne wyniki
- Przez ponad tydzień rejestrowano wysokiej jakości i stabilne sygnały EEG.
- Metoda okazała się skuteczna w badaniu epilepsji noworodków.
- Ułatwiła diagnozowanie różnych zaburzeń neuropatologicznych.
- Wykazano możliwość prowadzenia długoterminowego monitorowania EEG u noworodków.
Wnioski
- Nowa technika stanowi znaczący postęp w rejestracji EEG.
- Otwiera ona nowe możliwości badawcze w zakresie epilepsji noworodkowej.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę metodę do pogłębienia wiedzy na temat aktywności mózgu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Rejestracja EEG u swobodnie poruszających się noworodków szczurów umożliwia podłużne monitorowanie aktywności mózgu w modelach chorobowych, co wspiera walidację celów terapeutycznych oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniach nad epilepsją. Metoda ta zapewnia ilościowe odczyty elektrofizjologiczne, które zwiększają pewność predykcyjną w badaniach przedklinicznych nad zaburzeniami neurologicznymi. Dzięki stabilizacji interfejsów elektrod przez ponad jeden tydzień, rozwiązanie to redukuje zmienność techniczną i poprawia powtarzalność w procesach badawczych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez rejestrację spontanicznych i indukowanych wyładowań epileptycznych in vivo.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych dzięki stabilnym, wysokiej wierności sygnałom EEG w systemach istotnych dla przebiegu choroby.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia analizę zależności dawka-odpowiedź oraz identyfikację biomarkerów w celu podejmowania decyzji go/no-go w procesie odkrywania leków na epilepsję.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do przesiewowego badania związków z mierzalnymi wynikami EEG.
- Powtarzalność: Standaryzacja implantacji elektrod i akwizycji sygnałów w celu zminimalizowania zmienności międzyosobniczej u zwierząt.
- Skalowalność: Możliwość ponownego wykorzystania platformy w modelach noworodkowych i dorosłych gryzoni w badaniach nad epilepsją i zaburzeniami neurologicznymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje epilepsję noworodkową poprzez indukcję kwasem kainowym, umożliwiając badanie wzorców EEG w fazie iktalnej i międziiktalnej.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez zapewnienie spójnych punktów końcowych elektrofizjologicznych.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego dzięki podłużnemu śledzeniu progresji napadów i procesu powrotu do zdrowia.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania leków, od testowania hipotez we wczesnej fazie odkrywania, po optymalizację wiodących związków i walidację przedkliniczną, w szczególności w odniesieniu do celów terapeutycznych w padaczce i zaburzeniach neurologicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez kwantyfikację obciążenia drgawkowego w zapisie elektrograficznym oraz aktywności kory i hipokampa.
- Przesiewanie: Dostarcza systemów gotowych do testów ze stabilnymi, długoterminowymi zapisami EEG, odpowiednimi do oceny wpływu związków chemicznych.
- Analityka: Umożliwia analizę widma mocy oraz obliczenia średniej kwadratowej amplitudy (RMS) w celu porównania specyficznej dla częstotliwości aktywności mózgu w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy fenotypy EEG z klinicznymi biomarkerami epilepsji, wspierając dopasowanie i walidację biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość ponownego wykorzystania kompetencji z zakresu elektrofizjologii w noworodkowych i dorosłych modelach gryzoni w ramach programów odkryć w dziedzinie neuronauki.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w modelach epilepsji dzięki stabilnemu, długotrwałemu monitorowaniu EEG.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność dzięki niskokosztowemu, niezawodnemu układowi elektrod z wykorzystaniem punktów mocowania w postaci pinów komputerowych i fiksacji cyjanoakrylanem.
- Wartość strategiczna: Zwiększa efektywność kapitałową, umożliwiając tygodniowe rejestracje z wolno poruszających się zwierząt, co zmniejsza konieczność przeprowadzania powtarzających się zabiegów chirurgicznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko, dostarczając obiektywnych punktów końcowych elektrofizjologicznych dla decyzji go/no-go w opracowywaniu leków na epilepsję.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z noworodkami gryzoni, chirurgii stereotaksycznej oraz akwizycji sygnałów elektrofizjologicznych.
- Zależne od instrumentacji, w tym od aparatu stereotaksycznego, wzmacniaczy, przetworników analogowo-cyfrowych oraz oprogramowania do przetwarzania sygnałów.
- Wymaga standaryzacji w obrębie zespołu w zakresie przygotowania elektrod, głębokości implantacji oraz lepkości cementu dentystycznego w celu zapewnienia stabilności sygnału.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania procedur do różnych szczepów gryzoni, wieku oraz obszarów mózgu poza hipokampem i korą przedczołową.
- Ograniczone przez umiejętności techniczne niezbędne do utrzymania integralności interfejsu elektroda-tkanka podczas długotrwałych okresów rejestracji.
