Name: In vivo (in vivo)Obrazowanie ekspresji genów transgenicznych w poszczególnych progenitorach siatkówki w chimerycznych zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania nieautonomicznych wpływów komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Poznaj metodę obrazowania ekspresji genów w progenitorach siatkówki danio pręgowanego. Technika ta pozwala badać nieautonomiczne sygnały komórkowe podczas neurogenezis in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez ARC DECRA dla PRJ (DE120101311) oraz przez grant badawczy Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dla LP (PO 1440/1-1). Australijski Instytut Medycyny Regeneracyjnej jest wspierany przez fundusze rządu stanowego Wiktorii i rządu federalnego Australii. Składamy wyrazy uznania dr Jeremy'emu Ng Chi Kei, który przeprowadził opisane tutaj eksperymenty, opublikowane w Kei et al., 2016. Jesteśmy wdzięczni za dostarczenie ryb transgenicznych od prof. Higashijima i dziękujemy prof. Turner i Rupp za dostarczenie plazmidu pCS2+ oraz dr Wilkinson za generowanie konstruktów H2B-RFP i H2A-GFP. Dziękujemy personelowi placówki FishCore (Monash University) za opiekę nad naszymi zwierzętami.

<ol><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Scholpp, S., Poggi, L., Zigman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+on+the+stage+-+spotlight+on+nervous+system+development+in+zebrafish%3A+EMBO+practical+course%2C+KIT%2C+Sept.+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Brain on the stage - spotlight on nervous system development in zebrafish: EMBO practical course, KIT, Sept. 2013.</a> Neural Dev. 8, 23(2013).</li>
<li>Cayouette, M., Poggi, L., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+in+the+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lineage in the vertebrate retina.</a> Trends Neurosci. 29, 563-570 (2006).</li>
<li>Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influences+on+neural+lineage+and+mode+of+division+in+the+zebrafish+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo.</a> J Cell Biol. 171, 991-999 (2005).</li>
<li>Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+analysis+of+retinal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Time-lapse analysis of retinal differentiation.</a> Curr Opin Cell Biol. 17, 676-681 (2005).</li>
<li>Jusuf, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biasing+amacrine+subtypes+in+the+Atoh7+lineage+through+expression+of+Barhl2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Biasing amacrine subtypes in the Atoh7 lineage through expression of Barhl2.</a> J Neurosci. 32, 13929-13944 (2012).</li>
<li>Jusuf, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+determination+of+inhibitory+cell+lineages+in+the+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origin and determination of inhibitory cell lineages in the vertebrate retina.</a> J Neurosci. 31, 2549-2562 (2011).</li>
<li>Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+retinal+progenitor+lineages+in+developing+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging retinal progenitor lineages in developing zebrafish embryos.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).</li>
<li>Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+transgenic+zebrafish+embryos+for+imaging+the+developing+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of transgenic zebrafish embryos for imaging the developing retina.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).</li>
<li>Vitorino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vsx2+in+the+zebrafish+retina%3A+restricted+lineages+through+derepression%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Vsx2 in the zebrafish retina: restricted lineages through derepression.</a> Neural Dev. 4, 14(2009).</li>
<li>Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+regulation+of+neuronal+production+in+the+larval+frog+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cell-specific regulation of neuronal production in the larval frog retina.</a> J Neurosci. 7, 3317-3324 (1987).</li>
<li>Reh, T. A., Tully, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+tyrosine+hydroxylase-containing+amacrine+cell+number+in+larval+frog+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of tyrosine hydroxylase-containing amacrine cell number in larval frog retina.</a> Dev Biol. 114, 463-469 (1986).</li>
<li>Livesey, F. J., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+neural+cell-fate+determination%3A+lessons+from+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina.</a> Nature reviews. Neuroscience. 2, 109-118 (2001).</li>
<li>Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+and+orientation+of+retinal+ganglion+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo.</a> Neural Dev. 1, 2(2006).</li>
<li>Kimura, Y., Okamura, Y., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alx%2C+a+zebrafish+homolog+of+Chx10%2C+marks+ipsilateral+descending+excitatory+interneurons+that+participate+in+the+regulation+of+spinal+locomotor+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">alx, a zebrafish homolog of Chx10, marks ipsilateral descending excitatory interneurons that participate in the regulation of spinal locomotor circuits.</a> J Neurosci. 26, 5684-5697 (2006).</li>
<li>Kimura, Y., Satou, C., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V2a+and+V2b+neurons+are+generated+by+the+final+divisions+of+pair-producing+progenitors+in+the+zebrafish+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">V2a and V2b neurons are generated by the final divisions of pair-producing progenitors in the zebrafish spinal cord.</a> Development. 135, 3001-3005 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+Rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio)</a>. , University of Oregon Press. (2007).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8589427">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Kei, J. N., Dudczig, S., Currie, P. D., Jusuf, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+from+each+retinal+neuron+population+drives+expression+of+subsequent+fate+determinant+genes+without+influencing+the+cell+cycle+exit+timing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Feedback from each retinal neuron population drives expression of subsequent fate determinant genes without influencing the cell cycle exit timing.</a> J Comp Neurol. 524, 2553-2566 (2016).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Zou, J., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+GFP-expressing+blastomeres+for+live+imaging+of+retinal+and+brain+development+in+chimeric+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of GFP-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Schier, A. F., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+axis+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of axis formation in zebrafish.</a> Annu Rev Genet. 39, 561-613 (2005).</li>
<li>De Luca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/articles/srep04898">ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos.</a> Sci Rep. 4, 4898(2014).</li>
<li>Lin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+requirement+for+ptf1a+in+endocrine+and+exocrine+lineages+of+developing+zebrafish+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential requirement for ptf1a in endocrine and exocrine lineages of developing zebrafish pancreas.</a> Dev Biol. 274, 491-503 (2004).</li>
<li>Hollyfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histogenesis+of+the+retina+in+the+killifish%2C+Fundulus+heteroclitus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Histogenesis of the retina in the killifish, Fundulus heteroclitus.</a> J Comp Neurol. 144 (3), 373-380 (1972).</li>
<li>La Vail, M. M., Rapaport, D. H., Rakic, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1894769">Cytogenesis in the monkey retina.</a> J Comp Neurol. 309 (1), 86-114 (1991).</li>
<li>Rapaport, D. H., Wong, L. L., Wood, E. D., Yasumura, D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+topography+of+cell+genesis+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Timing and topography of cell genesis in the rat retina.</a> J Comp Neurol. 474 (2), 304-324 (2004).</li>
<li>Sharma, S. C., Ungar, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histogenesis+of+the+goldfish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Histogenesis of the goldfish retina.</a> J Comp Neurol. 191 (3), 373-382 (1980).</li>
<li>Stiemke, M. M., Hollyfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+birthdays+in+Xenopus+laevis+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Cell birthdays in Xenopus laevis retina.</a> Differentiation. 58 (3), 189-193 (1995).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zrozumienie, w jakim stopniu sąsiednie komórki wpływają na czas ekspresji kluczowych czynników determinujących los komórki, jest niezbędne, jeśli chodzi o skuteczne instruowanie embrionalnych lub indukowanych multipotencjalnych komórek macierzystych, aby różnicowały się w określony postmitotyczny typ komórek lub nawet wzorzystą tkankę. Co więcej, badanie tych zdarzeń molekularnych w rozwijających się komórkach żywego zwierzęcia dodatkowo dostarcza istotnych dynamicznych (czasowych i przestrzennych) informacji na temat po...

Zdolność do wizualizacji ważnych procesów rozwojowych u kręgowców in vivo przyczyniła się do tego, że danio pręgowany stał się kluczowym modelem do badania warunków normalnych i chorobowych (recenzowane w 1,2). W szczególności siatkówka nerwowa jest dostępną częścią ośrodkowego układu nerwowego. Siatkówka nadaje się do łatwego przeprowadzania badań neurogenezy ze względu na jej wysoce zorganizowaną, ale stosunkowo prostą strukturę i wysoce konserwatywne typy neuronów u różnych gatunków kręgowców 3. Dynamika zachowań komórkowych, takich jak proliferacja, wyjście z cyklu komórkowego, asymetryczny podział komórki, specyfikacja losu, różnicowanie i tworzenie obwodów nerwowych, może być śledzona przez cały proces retinogenezy, który kończy się w centralnej siatkówce danio pręgowanego przez 3-dniowe zapłodnienie (dpf) 4,5,6,7.
Ponadto, wymagania funkcjonalne różnych genów w każdym z wyżej wymienionych etapów mogą być jednocześnie oceniane w siatkówce danio pręgowanego, co daje przewagę nad innymi modelami kręgowców, w których fenotypy wynikające z zastosowania technik nokautowania genów mogą być oceniane tylko na podstawie pośmiertnego badania utrwalonych tkanek. W szczególności zastosowanie linii transgenicznych, w których możemy wizualizować i monitorować ekspresję białek fluorescencyjnych jako transgenów reporterowych w siatkówce, pozwala nam uzyskać czasową rozdzielczość ekspresji genów, która leży u podstaw genezy określonego typu komórki neuronalnej. Ze względu na szybki rozwój danio pręgowanego, zdarzenia te można wizualizować przez cały okres rozwojowy, zapewniając w ten sposób głębszy wgląd w czasowe znaczenie ekspresji genów w odniesieniu do nabywania tożsamości komórek neuronalnych i zachowania komórek.
Wreszcie, te podejścia mogą być efektywnie połączone u danio pręgowanego z generowaniem chimer poprzez przeszczepy, co daje wgląd w dwa kluczowe aspekty funkcji genów. Po pierwsze, badanie komórek przeszczepionych z zarodka dawcy, w którym dany gen został powalony podczas ich rozwoju w nieoznakowanym środowisku typu dzikiego, pozwala nam uzyskać istotne informacje na temat funkcji genu w sposób autonomiczny dla komórki. Prowadzi to do ważnych spostrzeżeń na temat funkcji czynników determinujących los siatkówki w komórkach progenitorowych, w których normalnie ulegają ekspresji. Przykładem tego jest badanie losów rozwojowych przodków, którzy nie mogą już wytwarzać funkcjonalnego białka z tych genów 4,6,8,9. Wykorzystując to podejście, wykazaliśmy, że wiele czynników determinujących los (np. Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) działa autonomicznie komórkowo, kierując określonymi losami neuronów siatkówki; Brak ekspresji genów prowadzi przede wszystkim do zamiany losu, tak że komórki z knockdownem genu zachowują żywotność poprzez przyjęcie alternatywnego losu komórki 4,6,7,10. Po drugie, takie chimeryczne eksperymenty można wykorzystać do oceny, jak zachowują się przodkowie typu dzikiego, gdy rozwijają się w różnych środowiskach genetycznych. Na przykład, porównując rozwój komórek WT, które zwykle wyrażają gen będący przedmiotem zainteresowania (i transgen reporterowy) w WT w porównaniu ze zmanipulowanym środowiskiem gospodarza (np. nokaut / knockdown genu), można ocenić wynikający wpływ na ekspresję genów i los komórki. Wykazano na przykład, że brak pewnych typów neuronów w środowisku gospodarza wpływa na zachowanie progenitorów typu dzikiego w sposób nieautonomiczny komórki, skłaniając je do różnicowania się w niedostatecznie reprezentowane lub brakujące typy neuronów 4,7,11,12. Biorąc pod uwagę, że neurony siatkówki rodzą się w konserwatywnej kolejności histogennej przez sekwencyjną ekspresję określonych genów determinujących los neuronów (ekspresja genu losu) (przejrzane w 13), użyliśmy tych metod, aby pokazać, jak wpływa na czas ekspresji genu losu u progenitorów typu dzikiego, gdy takie progenitory rozwijają się w środowisku gospodarza siatkówki z indukowanym nieprawidłowym składem komórkowym. W tym miejscu przedstawiamy te podejścia jako dowód na to, w jaki sposób połączenie stosunkowo standardowych i szeroko stosowanych technik umożliwia badanie czasu ekspresji genów losu w rozwoju komórek progenitorowych siatkówki 8,9.
Ten protokół opisuje eksperymentalne podejście łączące obrazowanie poklatkowe z łatwością przeprowadzenia przeszczepu w rozwijającym się ex vivo zarodku danio pręgowanego, aby śledzić poszczególne mozaikowo znakowane komórki przez cały okres rozwojowej retinogenezy. Wykonując funkcjonalne manipulacje genami w zarodku gospodarza, zarodku dawcy, obu lub żadnym z nich, można ocenić autonomię funkcji genów w komórkach. Podejście to można w szerokim zakresie zaadaptować do podobnych pytań badawczych w każdym innym systemie, dla którego odpowiednie są poszczególne opisane tutaj komponenty.

<table><tbody><tr><td>Agaroza</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td>Naczynia pokryte agarozą można przygotować kilka dni wcześniej, uszczelnić parafilmem, aby zapobiec wysuszeniu i przechowywać w temperaturze 4 &#176; C</td></tr><tr><td>Agaroza niskotopliwa</td><td>Sigma</td><td>A9414-100G</td><td>Można przygotować w większej objętości, podtrzymać w kuchence mikrofalowej w celu upłynnienia, a następnie przechowywać w stanie stopionym w 40 &#176; C Łaźnia wodna. Można przygotować 1 ml podwielokrotności (po jednej dla każdej grupy zamontowanych zarodków).</td></tr><tr><td>Można zastosować rurkę kapilarną ze szkła borokrzemianowego bez filamentu</td><td>SDR Scientfic</td><td>30-0035</td><td>alternatywy o podobnej średnicy&nbsp;</td></tr><tr><td>Można zastosować rurkę kapilarną ze szkła borokrzemianowego z żarnikiem</td><td>SDR Scientfic</td><td>30-0038</td><td>alternatywy o podobnej średnicy&nbsp;</td></tr><tr><td>Szklane szalki Petriego (średnica 60 mm)</td><td>Science Supply</td><td>1070506</td><td>dowolną szklaną alternatywę o dowolnym rozmiarze</td></tr><tr><td>Rurka iniekcyjna (2 m)</td><td>Eppendorf</td><td>524616004</td><td>Łączy to uchwyt igły ze strzykawką podczas przeszczepu</td></tr><tr><td>Forma do mikroiniekcji (plastikowa forma z wypukłościami w kształcie klina)</td><td>Adaptacyjne narzędzia naukowe</td><td>PT-1</td><td>alternatywy o podobnym kształcie mogą być używane</td></tr><tr><td>mikroigłowe uchwyt</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td>można zastosować dowolną alternatywę, która pasuje do zewnętrznej średnicy igieł iniekcyjnych</td></tr>: <tr><td>mikrowtryskiwacz</td><td>Narishige lub Eppendorf Femtojet</td><td></td><td>Wtryskiwacz pneumatyczny wykorzystujący</td></tr><tr><td>mikromanipulator</td> ciśnienia gazu <td>Coherent Scientific</td><td>M330IR</td><td>można zastosować podobne alternatywy:</td></tr><tr><td>końcówka do mikroładowarek</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma</td><td>M5904-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ściągacz igłowy</td><td>Sutter Instruments</td><td>Model P-2000</td><td>Ustawienia używane dla tego ściągacza to: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Można użyć dowolnego ściągacza igłowego, jeśli skutkuje to odpowiednim wymiarem końcówki</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Interpath</td><td>PM996</td><td>dowolna folia parafinowa</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura plastikowa</td><td>Samco Scientific</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>Szkło do pipet Pasteura</td><td>Hirschmann Laborgeraete</td><td>9260101</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>P5942-25MG</td><td>&nbsp; Proteaza typu XIV</td></tr><tr><td>N-fenylotiomocznik</td><td>Sigma</td><td>P7629-25G</td><td>PTU jest toksyczna i może być przygotowana jako roztwór podstawowy, aby uniknąć częstego narażenia na proszek, przed zakupem/użyciem należy skonsultować się z MSDS.</td></tr><tr><td>Ekstrakcja żelem Qiaquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>można zastosować wszelkie alternatywy do oczyszczania DNA</td></tr><tr><td>Zestaw Rneasy Mini</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>można użyć wszelkich alternatyw do oczyszczania RNA</td></tr><tr><td>Zestaw mMessage SP6</td><td>Qiagen</td><td>AM1340</td><td>wszelkie alternatywy dla transkrypcji DNA za pomocą SP6</td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo)obrazowanie ekspresji genów transgenicznych w poszczególnych progenitorach siatkówki w chimerycznych zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania nieautonomicznych wpływów komórek

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Genetyczne i techniczne atuty sprawiły, że kręgowiec danio pręgowanego stał się kluczowym organizmem modelowym, w którym konsekwencje manipulacji genami można śledzić in vivo przez cały okres szybkiego rozwoju. Można badać wiele procesów, w tym proliferację komórek, ekspresję genów, migrację komórek i morfogenezę. Co ważne, generowanie chimer poprzez przeszczepy może być łatwo wykonane, co pozwala na mozaikowe znakowanie i śledzenie poszczególnych komórek pod wpływem środowiska gospodarza. Na przykład, łącząc funkcjonalne manipulacje genami zarodka gospodarza (np. poprzez mikroiniekcję morfoliny) i obrazowanie na żywo, można ocenić wpływ zewnętrznych, nieautonomicznych sygnałów komórkowych (dostarczanych przez genetycznie zmodyfikowane środowisko) na poszczególne przeszczepione komórki dawcy. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób to podejście jest wykorzystywane do porównywania początku fluorescencyjnej ekspresji transgenu jako wskaźnika zastępczego dla czasu określenia losu komórki w różnych genetycznych środowiskach gospodarza.
W tym artykule przedstawiamy protokół mikroiniekcji zarodków danio pręgowanego w celu oznaczenia komórek dawcy i spowodowania knockdownu genu w embrionach gospodarza, opis techniki transplantacji używanej do generowania chimerycznych zarodków oraz protokół przygotowania i przeprowadzenia in vivo poklatkowego obrazowania konfokalnego wielu zarodków. W szczególności wykonywanie obrazowania wielopozycyjnego ma kluczowe znaczenie przy porównywaniu czasu zdarzeń, takich jak początek ekspresji genów. Wymaga to zbierania danych z wielu zarodków kontrolnych i eksperymentalnych przetwarzanych jednocześnie. Takie podejście można łatwo rozszerzyć na badania wpływów zewnętrznych w dowolnym narządzie lub tkance z wyboru, które można obrazować na żywo, pod warunkiem, że przeszczepy mogą być łatwo ukierunkowane zgodnie z ustalonymi mapami losu zarodka.

Niniejsza praca przedstawia protokół eksperymentalny służący do oceny zmian w czasie ekspresji genów podczas rozwoju retinalnych progenitorów typu dzikiego w embrionie gospodarza będącym morfantem. Eksperymentalne embriony gospodarzy to morfanty Ptf1a, którym brakuje powstających w fazie pośredniej horyzontalnych i amakrynowych neuronów pośrednich siatkówki 7,26. Zostały one porównane z kontrolnymi embrionami gospodarzy, którym ws...

Śledzenie na żywo poszczególnych komórek progenitorowych siatkówki WT w różnych tłach genetycznych pozwala na ocenę udziału nieautonomicznej sygnalizacji komórek podczas neurogenezy. W tym celu wykorzystano kombinację knockdownu genów, generowania chimer poprzez przeszczep zarodka i poklatkowego obrazowania konfokalnego in vivo.

In vivo (in vivo)Obrazowanie ekspresji genów transgenicznych w poszczególnych progenitorach siatkówki w chimerycznych zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania nieautonomicznych wpływów komórek

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Ogólnym celem tych procedur jest zbadanie, w jaki sposób zmiany w ekspresji genów, zachodzące albo wewnątrz rozwijających się komórek, albo w ich otoczeniu, wpływają na procesy czasowe podczas rozwoju. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania, takie jak to, czy czas specyfikacji losu jest kontrolowany przez geny wykazujące ekspresję autonomicznie wewnątrz komórki, czy nieautonomicznie w komórkach sąsiednich. Główna zaleta tej techniki polega na możliwości śledzenia pojedynczych komórek progenitorowych in vivo u kręgowców w miarę ich rozwoju w genetycznie odmiennych środowiskach.Procedurę zademonstruje Stefanie Dudczig, asystentka badawcza z mojego laboratorium. Po przygotowaniu embrionów danio przebraniego oraz igieł do mikroiniekcji z morfolinami lub mRNA zgodnie z protokołem tekstowym, zanurz końcówkę igły w kropli oleju mineralnego w naczyniu. Zmierz objętość iniekcji, naciskając pedał, a następnie dostosuj ciśnienie gazu i/lub czas trwania, aż objętość iniekcji będzie równa 1 nl, co należy zmierzyć za pomocą mikrometru szkiełka lub alternatywnie za pomocą siatki okularowej.Umieść szkiełko przedmiotowe w szalce Petriego i za pomocą pipety transferowej nanieś embriony w stadium jednokomórkowym wzdłuż krawędzi szkiełka. Następnie, używając cienkiej pipety transferowej, usuń jak największą ilość cieczy, aby zapobiec przemieszczaniu się embrionów podczas wstrzykiwań. Następnie, używając końcówki pipety Microloader z odciętą połową cienkiego wierzchołka, ustaw embriony w jednej kolumnie.Następnie opuść igłę w stronę zarodka w stadium jednej komórki i przebij chorion oraz żółtko jednym płynnym ruchem. Gdy końcówka igły znajdzie się w centrum żółtka, naciśnij raz pedał i mikroiniekuj 1 nanoliter mRNA H2AGFP lub H2BRFP do żółtka zarodka w stadium jednej komórki. Wyjmij igłę do iniekcji, przesuń naczynie z zarodkami, aby ustawić kolejny zarodek w odpowiedniej pozycji, i kontynuuj iniekcje, aż zostaną zainfekowane wszystkie zarodki w kolumnie.Po wstrzyknięciu wszystkich embrionów należy przechylić szalkę pod kątem od 30 do 45 stopni i za pomocą delikatnego strumienia medium E3 z butelki z aplikatorem przenieść wstrzyknięte embriony do nowej, czystej szalki Petriego. Trzy godziny po zapłodnieniu, pod mikroskopem fluorescencyjnym przy powiększeniu od 2X do 5X, należy użyć filtra RFP, aby sprawdzić embriony dawców pod kątem sygnału znakowania. Należy wybrać dobrze rozwinięte embriony o silnym sygnale fluorescencyjnym.Po przygotowaniu płytek do iniekcji i szalek Petri zgodnie z protokołem tekstowym, przytnij końcówkę długiej, wąskiej szklanej pipety Pasteura do długości umożliwiającej wygodne manewrowanie, używając noża diamentowego do nacięcia igły i obracając ją, aż końcówka odpadnie. Upewnij się, że cięcie jest proste. Następnie, aby nie uszkodzić zdechorionowanych embrionów, wykonaj polerowanie ogniowe szklanej pipety transferowej, obracając przyciętą powierzchnię w palniku Bunsena w celu uzyskania gładkich krawędzi.Aby przeprowadzić dechorionację embrionów, umieść dobrze rozwinięte embriony gospodarza i dawcy w dwóch osobnych 10 mililitrowych szklanych kolbach Erlenmeyera i odlej jak najwięcej płynu. Do każdej kolby dodaj 5 mililitrów wcześniej przygotowanego roztworu proteazy o stężeniu 0,5 miligrama na mililitr, a następnie delikatnie obracaj embriony, obserwując je pod mikroskopem stereoskopowym. Kontynuując obracanie, gdy tylko pierwszy embrion wydostanie się z chorionu, wykonaj trzy szybkie płukania w medium E3 w celu usunięcia roztworu proteazy, wylewając większość płynu i ponownie napełniając kolbę, delikatnie wlewając E3 po ściance.Przerwij enzymatyczną dechorionację poprzez szybkie, lecz delikatne płukanie, gdy tylko zaobserwowane zostaną pierwsze dechorionowane zarodki. Do transplantacji wybierz wyłącznie dechorionowane zarodki o symetrycznej masie komórkowej, bez wyraźnych deformacji lub uszkodzeń żółtka. Aby przeprowadzić transplantację blastuli, zamocuj igłę w uchwycie i podłącz ją do rurek zestawu do transplantacji.Sprawdzić szczelność, ręcznie operując strzykawką, aby zassać i wypuścić ciecz przez igłę. Następnie, za pomocą pipety szklanej, przenieść embriony dawców do pierwszej kolumny formy agarozowej. Następnie przenieść embriony biorców do kolumn od drugiej do szóstej formy agarozowej.Ostrożnie oprzyj igłę transplantacyjną na komórkach blastomerach zarodka dawcy i powoli wciągnij do igły około 20 do 50 komórek. Należy unikać wciągania żółtka. Za pomocą mikromanipulatora podnieś igłę transplantacyjną z zarodka dawcy.Przesuń naczynie do iniekcji w lewo i wprowadź końcówkę igły do transplantacji przez bok masy komórkowej do bieguna zwierzęcego pierwszego zarodka gospodarza. Zdeponuj od pięciu do 10 komórek w pobliżu powierzchni, zgodnie z mapowaniem losów wskazującym, że obszar ten daje początek polu ocznemu przedmózgowia. Aby zamocować zarodki do obrazowania, pobierz maksymalnie pięć zarodków za pomocą plastikowej pipety transferowej i pozwól im zgromadzić się w końcówce pod wpływem grawitacji.Dotknij pipety transferowej powierzchni wcześniej przygotowanej plastikowej probówki zawierającej 1% niskotopliwą agarozę, pozwalając zarodkom opaść do probówki, ograniczając jednocześnie ilość przenoszonego medium E3. Następnie przenieś pięć zarodków z plastikowej probówki z agarozą do szalki Petriego z 0,5 do 1 ml agarozy i za pomocą tej samej pipety transferowej usuń nadmiar agarozy, tak aby pozostała jedynie mała kropla. Użyj pipety mikroladowej z odłamaną końcówką, aby ustawić zarodki w jednej linii poprzecznie, aż do momentu zastygnięcia agarozy.Następnie kontynuuj montowanie do pięciu zarodków jednocześnie, w poszczególnych kroplach agarozy. W przypadku obrazowania za pomocą mikroskopu pionowego unikaj umieszczania zarodków w odległości mniejszej niż jeden centymetr od obwodu szalki Petriego. Użyj dodatkowej 1% agarozy niskotopliwej, aby połączyć krople agarozy ze sobą przy ściankach szalki, co zapobiegnie ich przemieszczeniu i ruchom bocznym podczas obrazowania.Wybierz zarodki o prawidłowym kącie montażu i silnym biciu serca, z kilkoma przeszczepionymi komórkami dawcy, znajdującymi się głównie w przednio-brzusznej ćwiartce rozwijającej się siatkówki, gdzie rozpoczyna się fala ekspresji genów. Przeprowadź obrazowanie zgodnie z protokołem tekstowym. Jak pokazano na tej rycinie, mikroiniekcja 1 nL mRNA do żółtka zarodków w stadium jednokomórkowym prowadzi do ekspresji fluorescencyjnego białka reporterowego do trzech godzin po zapłodnieniu; na tym etapie wybierane są najsilniej świecące komórki dawcy.W 24. godzinie po zapłodnieniu embriony z przeszczepionymi komórkami dawcy w odpowiednich lokalizacjach siatkówki poddano obrazowaniu poklatkowemu przez okres od 16 do 24 godzin. Ten obraz konfokalny z pojedynczej sekcji optycznej Z przedstawia nałożenie obrazu w jasnym polu w kanałach czerwonych w obrębie rozwijającego się oka, z kilkoma znakowanymi komórkami dawcy w kolorze czerwonym w nieznakowanym środowisku biorcy. Te mikrofotografie pochodzą z obrazowania poklatkowego rozwijających się komórek dawcy typu dzikiego z transgenicznych embrionów atoh7:gapGFP, przeszczepionych do nieznakowanego biorcy typu dzikiego.Początek ekspresji transgenu jest widoczny w kilku komórkach, jak pokazano tutaj. Po opanowaniu techniki, mikroiniekcje można przeprowadzić w ciągu dwóch godzin, a selekcję, przygotowanie i transplantację zarodków można ukończyć w ciągu trzech godzin tego samego dnia. Po tych procedurach lub równolegle do nich, możemy również utrwalić zarodki w określonym wieku w celu przeprowadzenia analizy pośmiertnej.Na przykład możemy określić, jaka proporcja komórek donora wykazuje ekspresję określonego genu lub białka, posiada specyficzną morfologię lub zmigrowała do określonego miejsca. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat tego, jak genetycznie manipulować zarodkami rybek danio-ostrobłotnic (*zebrafish*) oraz jak tworzyć chimery pomiędzy genetycznie odmiennym donorem a gospodarzem. Powinni Państwo również potrafić zamontować zarodki do obrazowania time-lapse in vivo, aby odpowiedzieć na pytania, których nie można rozstrzygnąć w tkankach utrwalonych.

in-vivo-imaging-transgenic-gene-expression-individual-retinal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Transplantacja komórek u rybek zebrafish umożliwia połączenie genetyki i embriologii w celu generowania chimer specyficznych dla danej tkanki. Niniejsze wideo demonstruje transplantacje komórek na etapie gastruli, które pozwoliły naszemu laboratorium zbadać role populacji astroglialnych oraz specyficznych sygnałów prowadzących podczas formowania się spoiw w przedmózgowiu.

Chimery embrionalne z ukierunkowaniem tkankowym: transplantacja komórek gastruli rybki danio-pręgawki

Niniejszy protokół opisuje obrazowanie poszczególnych neuronów lub komórek grzebienia neuronalnego w żywych embrionach danio pruzebrzuchego. Metoda ta jest wykorzystywana do badania zachowań komórkowych oraz lokalizacji aktyny przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse.

Obrazowanie na żywo ruchliwości komórek oraz cytoszkieletu aktynowego pojedynczych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w embrionach danio pręgowanego

Prezentujemy protokół generowania chimerycznych embrionów rybek danio w celu obrazowania na żywo zachowania komórek podczas embriogenezy.

Transplantacja blastomerów wykazujących ekspresję GFP w celu obrazowania na żywo rozwoju siatkówki i mózgu w chimerycznych embrionach danio pręgowanego

W tym filmie przedstawiono techniki wielokolorowego konfokalnego obrazowania time-lapse oraz celowanej ablacji komórek. Obrazowanie time-lapse jest wykorzystywane do monitorowania zachowania wielu wybranych typów komórek in vivo. Celowana ablacja komórek ułatwia badanie funkcji obwodów neuronalnych oraz paradygmatów regeneracji neuronów specyficznych dla danej grupy komórek.

Wielokolorowe obrazowanie poklatkowe transgenicznych rybek zebrafish: wizualizacja komórek macierzystych siatkówki aktywowanych przez ukierunkowaną ablację komórek neuronalnych

Niniejszy film prezentuje metodę wykorzystującą połączenie elektroporacji i mikroskopii konfokalnej do obrazowania na żywo pojedynczych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego. W ten sposób można przeprowadzić analizę in vivo rozwoju komórek progenitorowych neuronów przedmózgowia na poziomie klonalnym.

Obrazowanie live w trybie time-lapse klonalnie powiązanych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego

Opisano metodę warunkowego wyciszania ekspresji białka docelowego w siatkówce dorosłego danio-zebry, która polega na dokonywaniu iniekcji domięśniowych morfolino antysensownych oraz ich elektroporacji do siatkówki. W wyniku tego procesu ekspresja białka jest wyciszona przez kilka dni, co umożliwia zbadanie roli tego białka w regenerującej się lub nienaruszonej siatkówce.

In vivo elektroporacja morfolin do siatkówki dorosłego danio pręgowanego

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Łącząc transplantację komórek, znakowanie cytoszkieletu i podejście do utraty/wzmocnienia funkcji, ten protokół opisuje, w jaki sposób migrująca prospektywna płytka przedstrunowa danio pręgowanego może być wykorzystana do analizy funkcji genu kandydującego w migracji komórek in vivo.

Analiza migracji komórek in vivo przy użyciu przeszczepów komórek i obrazowania poklatkowego w zarodkach danio pręgowanego

Regeneracja siatkówki danio pręgowanego była głównie badana przy użyciu stałych siatek oka. Jednak dynamiczne procesy, takie jak interkinetyczna migracja jądrowa, zachodzą podczas odpowiedzi regeneracyjnej i wymagają obrazowania żywych komórek w celu zbadania mechanizmów leżących u ich podstaw. W tym miejscu opisujemy warunki hodowli i obrazowania w celu monitorowania międzykinetycznej migracji jądrowej (INM) w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Hodowla dorosłych transgenicznych eksplantatów siatkówki danio pręgowanego do obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopii wielofotonowej

Obrazowanie tkanki siatkówki może dostarczyć informacji o pojedynczej komórce, której nie można uzyskać tradycyjnymi metodami biochemicznymi. Protokół ten opisuje przygotowanie wycinków siatkówki od danio pręgowanego do obrazowania konfokalnego. Fluorescencyjne czujniki kodowane genetycznie lub barwniki wskaźnikowe umożliwiają wizualizację wielu procesów biologicznych w różnych typach komórek siatkówki.

Przygotowanie świeżych plastrów siatkówki od dorosłego danio pręgowanego do eksperymentów obrazowania ex vivo

Poznaj metodę obrazowania ekspresji genów w progenitorach siatkówki danio pręgowanego. Technika ta pozwala badać nieautonomiczne sygnały komórkowe podczas neurogenezis in vivo.

In vivo (in vivo)Obrazowanie ekspresji genów transgenicznych w poszczególnych progenitorach siatkówki w chimerycznych zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania nieautonomicznych wpływów komórek (Wideo) | JoVE Journal

In vivo (in vivo)Obrazowanie ekspresji genów transgenicznych w poszczególnych progenitorach siatkówki w chimerycznych zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania nieautonomicznych wpływów komórek

Przeglądaj więcej filmów