Fluorescencyjne znakowanie barwnikami erytrocytów i leukocytów w celu badania dynamiki przepływu w krążeniu siatkówkowym myszy

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja krążenia komórek krwi w siatkówce myszy przy użyciu skanującego oftalmoskopu laserowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące chorób siatkówki, takie jak dynamika przepływu WBC i RBC w warstwie dna siatkówki oraz w jaki sposób dynamika ich przepływu może przyczyniać się do patogenezy choroby. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona odzwierciedlać różne fenotypy chorób, a ponadto jest ona bardzo łatwa do wykonania.

Procedurę tę zaprezentują członkowie naszego zespołu: Praveen, Bo Bo i Neha. Aby wyizolować warstwę komórek krwi mysiej, nanieś świeżo pobraną krew pełną na roztwór polisukrozy i diatrizoanu sodu w stosunku 1:1 w probówce o pojemności 2 ml. Następnie wiruj probówkę przez 30 minut.

Następnie odessaj i odrzuć nadsącz plazmy. Potem ostrożnie zbierz warstwę tzw. buffy coat, składającą się z leukocytów, oraz znajdującą się pod nią warstwę erytrocytów do oddzielnych probówek. Następnie przemyj erytrocyty roztworem 1XPBS, aby usunąć zanieczyszczenia, i resuspenduj je w jednej objętości PBS.

Następnie przenieś aliquoty zawiesiny o objętości 0,5 ml do probówek do mikrocentryfugi. Odwiruj aliquoty, odlej nadsącz i dodaj około 200 µl 40% 1XPBS do osadu erytrocytów. Dokładnie wymieszaj.

Następnie inkubuj je w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po pięciu minutach dodaj 100 µL ICG do każdej zawiesiny. Wymieszaj zawartość probówek poprzez odwracanie, a następnie inkubuj je w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Następnie dodaj 300 µL 1XPBS i inkubuj przez godzinę przy łagodnym mieszaniu w temperaturze 37 °C. Następnie odwiruj zawiesiny, zachowaj osad komórkowy i resuspenduj komórki w 1 mL 1XPBS. Kontynuuj przemywanie komórek w 1XPBS do momentu, aż nadsącz stanie się klarowny.

Po odlaniu supernatantu należy dodać objętość 1% BSA oraz PBS równą objętości osadu, aby uzyskać 50% hematokryt erytrocytów znakowanych ICG. Następnie należy przeprowadzić proces zbierania warstwy białej (buffy coat). W pierwszej kolejności komórki należy przemyć raz 10 mililitrami 1XPBS w celu usunięcia zanieczyszczeń.

Ponownie odwirować próbki, a następnie resuspendować osad w 900 µL 1XPBS. Następnie dodać 100 µL 10% fluoresceiny sodowej i inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Na koniec trzykrotnie przemyć znakowane limfocyty 10 mL 1XPBS.

Odwirować i zawiesić je ponownie w 100 µl 1XPBS. Aby przygotować erytrocyty znakowane ICG do wstrzyknięcia, należy najpierw rozcieńczyć alikwot do poziomu hematokrytu 5% lub 1%. Zanestetyzować mysz i rozszerzyć jej źrenice.

Następnie nanieś maść oftalmiczną do obu oczu. Na jedno z oczu załóż soczewkę kontaktową. Teraz wykonaj obrazowanie myszy przy użyciu kamery konfokalnego SLO z dodatnią soczewką 25 dioptrii, aby skompensować refrakcję oka.

Należy precyzyjnie skierować rogówkę do głowicy optycznej urządzenia SLO. Następnie należy włączyć moduł obrazowania i manewrować nim do momentu, aż nerw wzrokowy znajdzie się w centrum ekranu obrazowania. Następnie, pod kątem 30 stopni, należy wykonać obrazy dna oka w podczerwieni.

Następnie należy wykonać film z dna oka w podczerwieni. Włącz filtr ICG 790 nanometrów, ustaw tryb kamery na wysoką prędkość, a kąt widzenia utrzymuj w zakresie od 15 do 30 stopni. Następnie ustaw intensywność ICG na 85 dla wszystkich odczytów.

Na panelu sterowania kliknij przycisk acquire, aby zarejestrować film bazowy z częstotliwością od 8,8 do 15 klatek na sekundę przez jedną minutę. Następnie pobierz 100 µL erytrocytów znakowanych ICG do strzykawki insulinowej z igłą o rozmiarze 30 G i wstrzyknij komórki do żyły ogonowej lub podaj je drogą retroorbitalną. Bezpośrednio po wstrzyknięciu wykonaj nowe zdjęcie dna oka w podczerwieni oraz nowy film z zastosowaniem filtra ICG.

Po zarejestrowaniu filmów wyeksportuj je do formatu TIFF w celu przeprowadzenia analizy obrazu. Przetwórz obrazy przy użyciu bezpłatnego pakietu oprogramowania do analizy obrazowania MHJ. Po otwarciu pliku ustaw interwał klatek filmu w celu pomiaru prędkości.

Następnie otwórz wtyczkę MtrackJ. Z menu wybierz opcję tracking i zaznacz pole przeskakiwania do następnego indeksu ramki czasu po dodaniu punktu. Teraz zlokalizuj interesującą komórkę i śledź ją w każdej ramce.

Z menu wybierz opcję dodawania, aby dodać nowy ślad, a następnie kliknij w wybraną komórkę. Następnie kontynuuj klikanie w aktualną pozycję komórki w miarę przesuwania się obrazów z klatki na klatkę. Po zakończeniu śledzenia zmień opcję wyświetlania trajektorii z dostępnych wyborów i wybierz opcję wyświetlania tylko punktów śladu w aktualnym czasie.

Kontynuuj klikanie, aż zostanie wyświetlona trajektoria komórki, a następnie zapisz ścieżkę. Teraz przejdź do śledzenia kolejnej komórki, zaczynając od polecenia add i postępując tak jak w przypadku pierwszej komórki. Po prześledzeniu wszystkich interesujących komórek otwórz wyświetlanie wszystkich pomiarów ścieżek za pomocą opcji measure.

Następnie należy zapisać wynik do dalszej analizy. Erytrocyty znakowane 1,5% ICG wizualizowano w krążeniu siatkówki myszy C57 black 6J przy użyciu 1% lub 5% hematokrytu; komórki były rozróżnialne, lecz przy 1% hematokrycie komórki znakowane były łatwiejsze do wizualizacji. Przy obu wstrzykniętych stężeniach w obszarze parapapilarnym obserwowano pewną erytrostazę, która była bardziej widoczna przy 5% hematokrycie.

Leukocyty oznakowano 1% fluoresceiną sodową i zwizualizowano jako komórki znakowane na zielono przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Zaobserwowano pewne skupianie się komórek. Po opanowaniu techniki, jej przeprowadzenie zajmuje sześć godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest rozszerzenie źrenic w celu uzyskania wysokiej jakości obrazów i nagrań siatkówki.