Name: Fluorescencyjne znakowanie barwnikami erytrocytów i leukocytów w celu badania dynamiki przepływu w krążeniu siatkówkowym myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Poznaj metodę fluorescencyjnego znakowania erytrocytów i leukocytów w celu badania dynamiki przepływu krwi w siatkówce myszy. Technika ta umożliwia wizualizację komórek krwi w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projekt badawczy został sfinansowany w ramach grantu dla nowych badaczy od Narodowej Rady Badań Medycznych (NMRC), Singapur. Zespół pragnie podziękować za szkolenie badawcze prowadzone przez dr Agrawala w Instytucie Okulistyki (IoO), University College London (UCL) w ramach stypendium National Medical Research Council (NMRC) Overseas Research Training Fellowship od listopada 2012 r. do października 2014 r. pod kierunkiem prof. Davida Shimy. Dr Agrawal nabył koncepcję i umiejętności znakowania komórek i obrazowania na żywo w laboratorium dr Shimy. W związku z tym zespół będzie wdzięczny za nadzór i wskazówki podczas stypendium szkoleniowego ze strony prof. Davida Shimy, pro.f Kenitha Meissnera, dr Petera Lundha i dr Daiju Iwata.

Protokoły na zwierzętach użyte w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt SingHealth w Singapurze i są zgodne z wytycznymi Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) Oświadczenie dotyczące wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych.
1. Znakowanie erytrocytów i leukocytów barwnikami fluorescencyjnymi
<ol>
	<li>Przygotowanie odczynników
	<ol>
		<li>Przygotować ICG (1,5 mg/ml) rozpuszczając 3 mg ICG w 1800 μl sterylizowanej wody destylowanej. Dodać 200 μl 10x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
		<li>Przygotuj 40% 1x PBS, dodając 4 ml 1x PBS do 6 ml wysterylizowanej wody destylowanej. Przygotować 1% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w PBS, dodając 100 mg BSA do 10 ml 1x PBS. Dobrze wymieszaj, aż BSA się rozpuści.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja erytrocytów i leukocytów za pomocą wirowania w gradientacji gęstości
	<ol>
		<li>Znieczulić myszy (typ dziki C57BL/6) za pomocą kombinacji chlorowodorku ketaminy (50 mg/kg) i chlorowodorku ksylazyny (0,5 mg/kg) (zgodnie z harmonogramem 1, zgodnie z wytycznymi ARVO). Potwierdź znieczulenie odruchem wycofania pedału (tj. uszczypnięciem palca u nogi).</li>
		<li>Powoli wprowadzić igłę o rozmiarze 29 (dołączoną do strzykawki o pojemności 1 ml) pod kątem żebrowym skierowanym w stronę serca. Aby upewnić się, że igła znajduje się wewnątrz serca, należy lekko odsunąć tłok i sprawdzić, czy krew została pobrana do strzykawki. Eksangwinian 0,8 - 1 ml krwi bezpośrednio z serca.</li>
		<li>Natychmiast przenieść krew do probówki z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) (1,8 mg/ml krwi) zawierającej krew i delikatnie wymieszać, aby zapobiec krzepnięciu krwi.</li>
		<li>Poddaj myszy eutanazji, podając pentobarbital (80 mg / kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym.</li>
		<li>Ułóż krew pełną na wierzchu roztworu polisacharozy i diatrizoinianu sodu (stosunek 1:1; gęstość 1,077 g/ml) w probówce do mikrowirówki o pojemności 2 ml i odwiruj (450 x g, 30 min), aby umożliwić oddzielenie leukocytów i erytrocytów od osocza.</li>
		<li>Usunąć i wyrzucić supernatant (osocze) za pomocą pipety. Ostrożnie przenieś kożuszek (leukocyty) i erytrocyty (warstwę czerwonych krwinek) do nowych i oddzielnych probówek za pomocą pipet.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znakowanie ICG (1,5%) erytrocytów
	<ol>
		<li>Umyj erytrocyty 1x PBS, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia. Ponownie zawieś erytrocyty w 1x PBS (1:1), aby uzyskać 50% hematokrytu. Podwielokrotność 0,5 ml 50% hematokrytu (~ 250 μL upakowanych erytrocytów) do probówek do mikrowirówek. Odwirować erytrocyty (750 x g, 5 min) i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Dodać 200 μL 40% 1x PBS do granulowanych erytrocytów, dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min. Dodać 100 μL ICG (1,5 mg/ml) do zawiesiny erytrocytów, delikatnie wymieszać odwracając probówkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min. Dodać 300 μL 1x PBS i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsarką przez 60 min.</li>
		<li>Odwirować erytrocyty nośnika (750 x g, 3 min) i ponownie zawiesić w 1 ml 1x PBS.</li>
		<li>Przemyć komórki ~ 3 - 5 razy 1x PBS, aż supernatant będzie klarowny (krok 1.3.3). Po ostatnim przemyciu zdekantować supernatant i dodać 1% BSA PBS (1:1) do znakowanych, wstępnie spęczniałych erytrocytów, aby uzyskać 50% hematokrytu (1,25 x 108 komórek/ml) erytrocytów znakowanych ICG.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znakowanie leukocytów fluoresceiną sodu (1%)
	<ol>
		<li>Po oddzieleniu kożucha od krwi za pomocą wirowania w gradionym gradieniu gęstości (od kroku 1.2.6), przemyć komórki raz 10 ml 1x PBS, wirując przy 450 x g przez 10 minut, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia. Zawiesić osad w 900 μL 1x PBS.</li>
		<li>Dodać 100 μl 10% fluoresceiny sodu do 900 μl zawiesiny leukocytów i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 min. Umyć znakowane komórki trzykrotnie 10 ml 1X PBS przez odwirowanie (450 x g, 10 min). Ponownie zawiesić komórki w 100 μl 1x PBS.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Obrazowanie na żywo komórek znakowanych fluorescencyjnie
<ol>
	<li>Obrazowanie żywych komórek erytrocytów znakowanych ICG
	<ol>
		<li>Aby przygotować komórki do wstrzyknięcia przez żyłę ogonową lub drogę zaoczodołową, rozcieńczyć 50% hematokrytu erytrocytów znakowanych ICG 10-krotnie i 50-krotnie 1x PBS, aby uzyskać odpowiednio 5% i 1% komórek hematokrytu.</li>
		<li>Umieść mysz pod światłem podczerwonym (intensywność 250 W) na 5 minut, aby żyła ogonowa mogła się rozszerzyć. Znieczulić mysz chlorowodorkiem ketaminy (50 mg/kg) i chlorowodorkiem ksylazyny (0,5 mg/kg) poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe (tutaj, zgodnie z harmonogramem 1, zgodnie z wytycznymi ARVO).</li>
		<li>Rozszerz każdą źrenicę oczu kroplą 0,5% tropikamidu i 2,5% chlorowodorku fenylefryny.</li>
		<li>Umieść soczewkę kontaktową na jednym oku w celu wykonania obrazowania. Żel okulistyczny należy stosować jako podłoże do obrazowania i zapobiegania wysuszeniu rogówki. Zamocuj konfokalną laserową kamerę oftalmoskopową do skaningu laserowego (SLO) z soczewką +25 dioptrii, aby skompensować załamanie oka myszy.</li>
		<li>Umieść mysz na platformie obrazowania SLO. Upewnij się, że rogówka myszy jest skierowana prosto w stronę głowicy optycznej urządzenia SLO.</li>
		<li>Włącz moduł obrazowania. Korzystając z powiązanego oprogramowania modułu obrazowania, kliknij przycisk "Nowy pacjent" i dodaj dane identyfikacyjne zwierzęcia, takie jak numer kolczyka myszy, data urodzenia, procentowa zawartość barwnika fluorescencyjnego i oznaczony typ komórki.
		<ol>
			<li>Umieść nerw wzrokowy zwierzęcia na środku ekranu obrazowania, manewrując modułem obrazowania. Korzystając z odpowiedniego oprogramowania modułu obrazowania, kliknij przycisk "Pobierz", aby wykonać zdjęcia dna oka w podczerwieni (IR) z ustawieniem kąta widzenia 30° lub 15°. Upewnij się, że środek siatkówki, źrenica i ścieżka optyczna lasera są wyrównane, aby uzyskać obraz o najlepszej jakości. 
			UWAGA: Ścieżka optyczna jest wyrównywana poprzez manewrowanie joystickiem w celu uzyskania najostrzejszego obrazu i najlepszej ekspozycji oświetlenia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Obejrzyj film na temat badania dna oka ICG.
		<ol>
			<li>Włącz filtr ICG (790 nm), ustaw kamerę w trybie wysokiej prędkości z widokiem pod kątem 30° lub 15° i ustaw intensywność ICG na 85 dla wszystkich odczytów w celu standaryzacji. Na panelu sterowania kliknij przycisk "Pobierz", aby nagrywać wideo (kontrola podstawowa) z prędkością 8,8/15 klatek/s przez 1 minutę.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Załaduj 100 μl erytrocytów znakowanych ICG do strzykawki insulinowej przymocowanej do igły o rozmiarze 30.
		<ol>
			<li>W przypadku wstrzyknięcia przez żyłę ogonową, należy wprowadzić igłę pod kątem do żyły ogonowej. Potwierdź dostęp dożylny, sprawdzając przepływ wsteczny krwi do strzykawki i wstrzyknij znakowane komórki do krążenia.</li>
			<li>W przypadku wstrzyknięcia drogą zaoczodołową należy wprowadzić igłę przylegającą do oka do przestrzeni zaoczodołowej. Potwierdź dostęp zadoczodołowy, sprawdzając przepływ wsteczny krwi do strzykawki i wstrzyknij znakowane komórki do krążenia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po wstrzyknięciu zmień położenie myszy i wykonaj zdjęcia dna oka w podczerwieni (patrz krok 2.1.6.1) oraz wideo za pomocą filtra ICG (patrz krok 2.1.7.1). Znakowane komórki w krążeniu siatkówkowym można uwidocznić natychmiast po wstrzyknięciu komórek.</li>
		<li>Po pobraniu klatek wideo wyodrębnij .tiff obrazy sekwencji wideo, wybierając format .tiff podczas eksportowania wideo za pomocą oprogramowania modułu wyświetlania SLO. Zapisz pliki w żądanym folderze.</li>
		<li>Zdejmij soczewkę kontaktową, umieść ją na drugim oku i dokończ obrazowanie zgodnie z opisem w krokach 2.1.4 - 2.1.7.</li>
		<li>Po zobrazowaniu umieść znieczulone zwierzę pod światłem podczerwonym (250 W), aby utrzymać temperaturę ciała do czasu powrotu do zdrowia po znieczuleniu. Gdy zwierzę w pełni wyzdrowieje, umieść mysz z powrotem w klatce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie żywych komórek leukocytów znakowanych 1% fluoresceiną sodu
	<ol>
		<li>Przygotuj mysz i ustaw instrument zgodnie z opisem w rozdziale 2.1.</li>
		<li>Ustaw mysz i wykonaj zdjęcia dna oka w podczerwieni zgodnie z opisem w krokach 2.1.4 - 2.1.6.
		<ol>
			<li>Uzyskaj angiogram fluoresceinowy myszy za pomocą filtra fluoresceinowego (488 nm) w trybie szybkiej kamery z kątem widzenia 30° lub 15° i intensywnością fluoresceiny przy 85 dla wszystkich odczytów w celu standaryzacji. Nagraj wideo (kontrola linii bazowej) z prędkością 8,8/15 klatek/s (patrz krok 2.1.7.1). 
			UWAGA: W tym przypadku wiele ścieżek filmów (1-minutowe filmy) zostało zarejestrowanych w różnych odstępach czasu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wstrzyknąć 100 μl znakowanych leukocytów myszy przez żyłę ogonową lub wstrzyknięcie zaoczodołowe, jak opisano w sekcji 2.1.8.</li>
		<li>Natychmiast po wstrzyknięciu należy ustawić mysz w odpowiedniej pozycji i wykonać zdjęcia dna oka w podczerwieni (patrz kroki 2.1.5 i 2.1.6) oraz angiogram fluoresceinowy myszy (patrz punkt 2.2.2).</li>
		<li>Obserwuj znakowane komórki w siatkówkach lub naczyniach krwionośnych, regulując ogniskową lasera skanującego, obracając pokrętło ostrości na module obrazowania.</li>
		<li>Zdobądź klatki wideo i obrazy za pomocą oprogramowania modułu wyświetlania SLO (patrz krok 2.1.10) i zapisz je w wybranym folderze.</li>
		<li>Po zabiegu postępuj zgodnie z krokiem 2.1.12 dotyczącym opieki nad zwierzętami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza obrazu za pomocą oprogramowania MtrackJ
	<ol>
		<li>Otwórz sekwencję obrazów w ImageJ, klikając "Plik". Wybierz "Importuj" i wybierz "Sekwencja obrazów", wybierz żądany folder obrazów i kliknij "Otwórz". Na ekranie pojawi się wyskakujące okienko o nazwie "Opcje sekwencji". Kliknij "OK"; Otworzy się sekwencja obrazów.</li>
		<li>Ustaw interwał klatek obrazu wideo, klikając "Obraz" i wybierz "Właściwości" do pomiarów prędkości. Tutaj jest to 8,8 klatki/s.</li>
		<li>Otwórz wtyczkę MTrackJ, wybierając "Wtyczki". Wybierz "Śledzenie", a następnie wybierz "MtrackJ". Powinno pojawić się menu.</li>
		<li>Aby dostosować ustawienia śledzenia, wybierz "Śledzenie" (pod menu) i zaznacz pole "Przenieś do następnego indeksu przedziału czasowego po dodaniu punktu".</li>
		<li>Śledź pierwszą komórkę.
		<ol>
			<li>Zlokalizuj jedną komórkę i śledź tę samą komórkę w kolejnych klatkach. W menu kliknij "Dodaj", aby dodać nowy utwór.</li>
			<li>Najedź kursorem na obraz (znak +) i kliknij odpowiednią komórkę. 
			UWAGA: MTrackJ automatycznie przeskoczy do następnego przedziału czasowego i doda małe kółko, oznaczające pozycję pierwszego punktu na trajektorii.</li>
			<li>Kontynuuj klikanie bieżącej pozycji komórki podczas przechodzenia przez klatki sekwencji obrazów. 
			UWAGA: Czasami okręgi oznaczające poprzednie punkty trajektorii zakłócają możliwość wyświetlenia bieżącej lokalizacji. W takim przypadku przejdź do kroku 2.3.5.3.1.
			<ol>
				<li>Zmień opcję wyświetlania trajektorii, klikając "Wyświetlanie" w menu i wybierając opcję "wyświetlaj tylko punkty trasy w bieżącym czasie". Aby wyświetlić wszystkie trajektorie, usuń zaznaczenie tej opcji.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Kontynuuj klikanie, aż zobaczysz trajektorię pierwszej komórki. Następnie zapisz utwór, klikając "Zapisz".</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Śledź drugą komórkę.
		<ol>
			<li>W menu kliknij "Dodaj", aby rozpocząć nowy utwór. Powtórz kroki od 2.3.5.1 do 2.3.5.4, aby śledzić nową komórkę. Kliknij "Zapisz", aby zapisać drugi utwór.</li>
			<li>Kontynuuj te kroki dla wszystkich obserwowanych komórek, które można śledzić. Po śledzeniu komórek kliknij "Zmierz" i "OK" w zakładce menu, aby uzyskać wyniki. 
			UWAGA: Automatycznie otworzy się okno wyników, które można zapisać i otworzyć w arkuszu kalkulacyjnym w celu dalszej analizy.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia. Brak konfliktu finansowego lub konfliktu interesów.

Badanie hemodynamiki w krążeniu siatkówkowym i naczyniówkowym jest niezbędne do zrozumienia patofizjologii wielu chorób oczu. Dynamikę przepływu krwi w krążeniu siatkówkowym można badać za pomocą optycznej koherentnej tomografii w domenie Fouriera (FD-OCT), laserowej przepływomierza plamkowego (LSFG) i oksymetrii siatkówki. Chociaż metody te wykorzystują różne podejścia do badania całkowitego przepływu krwi w krążeniu siatkówkowym 40,41,42,43,44,45, łączy je ograniczenie polegające na niemożności zbadania dynamiki przepł...

Badanie dynamiki przepływu komórek krwi w krążeniu siatkówkowym i naczyniówkowym jest niezbędne do zrozumienia patogenezy potencjalnie zagrażających widzeniu chorób oczu i innych stanów zapalnych oczu. Jednak konwencjonalne techniki angiografii, które polegają na wiązaniu barwników fluorescencyjnych z białkami osocza, nie dostarczają żadnych informacji dotyczących dynamiki erytrocytów lub leukocytów1. Dynamika przepływu siatkówki erytrocytów jest ważna dla badania metabolicznie wydajnego krążenia w siatkówce oraz dynamiki przepływu leukocytów, dla zrozumienia migracji, rozpoznawania, adhezji i niszczenia komórek w różnych stanach zapalnych2. Istnieje kilka cząsteczek fluorescencyjnych używanych do identyfikacji i charakterystyki różnych typów komórek3. Hemodynamikę komórek krwi można zmierzyć, barwiąc je odpowiednimi barwnikami fluorescencyjnymi i stosując odpowiednie techniki obrazowania4.
Obecność reakcji zapalnych w chorobach wewnątrzgałkowych, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD) i retinopatia cukrzycowa (DR), wiąże się z akumulacją limfocytów w obszarze chorym5,6. Śledzenie komórek odpornościowych w tkankach może pomóc w zrozumieniu złożonych zdarzeń związanych z mechanizmem patogenezy choroby. Izotopy promieniotwórcze, takie jak 51Cr i 125I, były używane jako znaczniki komórek we wczesnych badaniach. Barwniki te są toksyczne i wpływają na żywotność komórek. Chociaż markery radioaktywne 3H i 14C są mniej toksyczne dla komórek, ze względu na ich niższe energie emisji, trudno jest wykryć ich sygnały w systemie7,8. Wprowadzono szereg barwników fluorochromowych, aby przezwyciężyć potencjalne problemy związane z markerami radioaktywnymi i śledzić migrację limfocytów in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej9,10. Hoechst 33342 i oranż tiazolowy to barwniki fluorescencyjne wiążące DNA, które są używane do śledzenia limfocytów in vivo. Hoechst 33342 wiąże się z regionami DNA bogatymi w AT, jest przepuszczalny dla błony, zachowuje sygnały fluorescencyjne przez 2 - 4 dni i jest odporny na wygaszanie9,10. Wadami Hoechst 33342 i oranżu tiazolowego są hamowanie proliferacji limfocytów11 i krótki okres półtrwania, odpowiednio9.
Calcein-AM, dioctan fluoresceiny (FDA), 2′,7′-bis-(2-karboksetylo)-5-(i-6)-karboksyfluoresceina, ester acetoksymetylowy (BCECF-AM), dioctan 5-(i-6)-karboksyfluoresceiny (CFDA) i 5-(i-6)-dioctan karboksyfluoresceiny ester acetoksymetylowy (CFDA-AM) to cytoplazmatyczne barwniki fluorescencyjne używane do badań migracji limfocytów. Jednak FDA, CFDA i CFDA-AM mają niższą retencję w komórkach9. BCECF-AM zmniejsza odpowiedź proliferacyjną i wpływa na chemotaksję i produkcję ponadtlenków9,12. Calcein-AM jest barwnikiem fluorescencyjnym i jest przydatny w krótkoterminowych badaniach migracji limfocytów in vivo. Emituje silne sygnały fluorescencyjne, nie zakłóca większości funkcji komórkowych i zachowuje sygnały fluorescencyjne przez okres do 3 dni12,13. Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) i ester sukcynimidylowy dioctanu karboksyfluoresceiny (CFDA-SE) są kowalencyjnymi barwnikami fluorescencyjnymi sprzęgającymi, które są stosowane do badań migracji limfocytów. FITC nie wykazuje wpływu na żywotność komórek i ma silniejsze powinowactwo do limfocytów B niż limfocytów T14,15. Limfocyty znakowane CFDA-SE mogą być śledzone in vivo przez ponad 8 tygodni i do 8 podziałów komórkowych9,16. C18 DiI (nadchloran 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny), DiO (nadchloran 3,3'-dioctadecyloxacarbocyjaniny), Paul Karl Horan (PKH)2, PKH3 i PKH26 to fluorescencyjne barwniki karbocyjaninowe wprowadzające błonę, używane do znakowania leukocytów i erytrocytów. C18 Dil i DiO wykazują wyższe sygnały po włączeniu do błony komórkowej i są stosunkowo nietoksyczne12,17. Komórki znakowane PKH2, PKH3 i PKH26 wykazują dobrą retencję sygnałów fluorescencyjnych przy mniejszej toksyczności18,19,20,21,22. Jednak PKH2 w dół reguluje ekspresję CD62L i zmniejsza żywotność limfocytów23.
Większość wyżej wymienionych badań została przeprowadzona w celu śledzenia migracji i proliferacji limfocytów w układzie limfatycznym oraz badania oznaczonych erytrocytów w krążeniu nieocznym. Istnieje bardzo niewiele badań, w których stosuje się techniki znakowania do badania komórek krwi w krążeniu ocznym. Zastosowanie skaningowej oftalmoskopii laserowej (SLO) ma ogromną zaletę w badaniu znakowanych komórek w krążeniu siatkówkowym i naczyniówkowym in vivo za pomocą angiografii dna oka24. Istnieje kilka barwników fluorescencyjnych, takich jak ICG, oranż akrydynowy, FITC, fluoresceina sodu i CFDA, które są używane do badania leukocytów w krążeniu siatkówkowym za pomocą SLO25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. Fototoksyczność i rakotwórczość oranżu akrydynowego 26,27, interferencja FITC z aktywnością komórkową oraz wymóg stosowania wewnątrznaczyniowego środka kontrastowego w celu rozwiązania naczyń krwionośnych siatkówki i naczyniówki ogranicza ich zastosowanie w eksperymentach na zwierzętach in vivo29. Fluoresceina sodu i ICG są nietoksyczne, zatwierdzone przez Agencję ds. Żywności i Leków oraz bezpieczne do testowania na ludziach32,35. Większość badań dynamiki przepływu jest związana z znakowaniem leukocytów lub erytrocytów i ich wizualizacją w naczyniach krwionośnych siatkówki i naczyniówki36,37,38,39. W tym miejscu opisujemy znormalizowany protokół znakowania erytrocytów ICG, znakowania leukocytów fluoresceiną sodową i śledzenia wizualizowanych znakowanych komórek w krążeniu siatkówki myszy za pomocą SLO.

<table><tbody><tr><td>Barwnik polimetynowy Cardiogreen (zieleń indocyjaninowa)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12633-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceina 100 mg/ml</td><td>Novartis</td><td>U1705A/H-1330292</td><td></td></tr><tr><td>10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) Ultra Pure Grade</td><td>1st BASE</td><td>BUF-2040-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>Probówki mikrotainerowe z K2E (K2EDTA) - stężenie EDTA - 1,8 mg/ml krwi</td><td>BD, USA</td><td>REF</td><td></td></tr> 365974 <tr><td>Roztwór histofaque 1077</td><td>Wirówka Sigma Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>05-413-401</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek 2 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>Insta BioAnalytik pte. ltd</td><td>FINE VORTEX</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsarką</td><td>Lab Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ceva Ketamina do wstrzykiwań (Chlorowodorek ketaminy 100 mg/ml)</td><td>Ceva</td><td>KETALAB03</td><td></td></tr><tr><td>ILIUM XYLAZIL-20 (chlorowodorek ksylazyny 20 mg/ml)</td><td>Troy Laboratories PTY. Limited</td><td>LI0605</td><td></td></tr><tr><td>1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamid 1%)</td><td>Alcon&nbsp; Laboratories, Inc. Stany Zjednoczone</td><td>NDC&nbsp; 0998-0355-15</td><td></td></tr><tr><td>2,5% Mydfrin 5 ml (chlorowodorek fenylefryny 2,5%)</td><td>Alcon&nbsp; Laboratories, Inc. Stany Zjednoczone</td><td>NDC&nbsp; 0998-0342-05</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Terumo z igłą 1 cc/ml Tuberculin</td><td>Terumo (Philippenes) Corporation, Filipiny</td><td>SS-01T2613</td><td></td></tr><tr><td>Żel Vidisic 10 g</td><td>Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waciki nasączone alkoholem</td><td>Assure medyczne materiały jednorazowego użytku</td><td>7M-004-L-01</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy skaningowy system angiografii (Heidelberg Retina Angiograph 2)</td><td>Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Hiedelberg Spectralis Viewing Module, v4.0</td><td>Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>ZEISS</td><td>Model: axio imager z1</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescencyjne znakowanie barwnikami erytrocytów i leukocytów w celu badania dynamiki przepływu w krążeniu siatkówkowym myszy

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

Dynamika przepływu krwi w siatkówkach i naczyniówkach może dostarczyć wglądu w patofizjologię i następstwa różnych chorób oczu, takich jak jaskra, retinopatia cukrzycowa, zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD) i inne stany zapalne oka. Może również pomóc w monitorowaniu odpowiedzi terapeutycznych w oku. Prawidłowe znakowanie komórek krwi, w połączeniu z obrazowaniem żywych komórek znakowanych, pozwala na badanie dynamiki przepływu w krążeniu siatkówkowym i naczyniówkowym. Tutaj opisujemy znormalizowane protokoły znakowania 1,5% zielenią indocyjaninową (ICG) i 1% fluoresceiną sodową odpowiednio erytrocytów i leukocytów myszy. Skaningowa oftalmoskopia laserowa (SLO) została zastosowana do wizualizacji znakowanych komórek w krążeniu siatkówkowym myszy C57BL / 6J (typ dziki). Obie metody wykazały wyraźne fluorescencyjnie znakowane komórki w krążeniu siatkówkowym myszy. Te metody znakowania mogą mieć szersze zastosowanie w różnych modelach chorób oczu.

Erytrocyty znakowane 1,5% ICG wizualizowano w krążeniu siatkówkowym myszy C57BL/6J (typ dziki). W krążeniu siatkówkowym możliwe było rozróżnienie zarówno 1%, jak i 5% hematokrytu erytrocytów znakowanych 1,5% ICG. Jednakże pojedyncze znakowane komórki były wyraźniej widoczne przy 1% hematokrycie erytrocytów znakowanych 1,5% ICG (Rysunek 1). Przy 5% hematokrycie, ze względu na dużą liczbę znakowanych komórek w naczyniach siatkówki, nie było możliwe oznaczenie p...

Obrazowanie żywych komórek krwi oznaczonych krwinek w krążeniu ocznym może dostarczyć informacji o stanie zapalnym i niedokrwieniu w retinopatii cukrzycowej oraz zwyrodnieniu plamki żółtej związanym z wiekiem. Opisano protokół oznaczania komórek krwi i obrazowania znakowanych komórek w krążeniu siatkówkowym.

Fluorescencyjne znakowanie barwnikami erytrocytów i leukocytów w celu badania dynamiki przepływu w krążeniu siatkówkowym myszy

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja krążenia komórek krwi w siatkówce myszy przy użyciu skanującego oftalmoskopu laserowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące chorób siatkówki, takie jak dynamika przepływu WBC i RBC w warstwie dna siatkówki oraz w jaki sposób dynamika ich przepływu może przyczyniać się do patogenezy choroby. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona odzwierciedlać różne fenotypy chorób, a ponadto jest ona bardzo łatwa do wykonania.Procedurę tę zaprezentują członkowie naszego zespołu: Praveen, Bo Bo i Neha. Aby wyizolować warstwę komórek krwi mysiej, nanieś świeżo pobraną krew pełną na roztwór polisukrozy i diatrizoanu sodu w stosunku 1:1 w probówce o pojemności 2 ml. Następnie wiruj probówkę przez 30 minut.Następnie odessaj i odrzuć nadsącz plazmy. Potem ostrożnie zbierz warstwę tzw. buffy coat, składającą się z leukocytów, oraz znajdującą się pod nią warstwę erytrocytów do oddzielnych probówek. Następnie przemyj erytrocyty roztworem 1XPBS, aby usunąć zanieczyszczenia, i resuspenduj je w jednej objętości PBS.Następnie przenieś aliquoty zawiesiny o objętości 0,5 ml do probówek do mikrocentryfugi. Odwiruj aliquoty, odlej nadsącz i dodaj około 200 µl 40% 1XPBS do osadu erytrocytów. Dokładnie wymieszaj.Następnie inkubuj je w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po pięciu minutach dodaj 100 µL ICG do każdej zawiesiny. Wymieszaj zawartość probówek poprzez odwracanie, a następnie inkubuj je w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Następnie dodaj 300 µL 1XPBS i inkubuj przez godzinę przy łagodnym mieszaniu w temperaturze 37 °C. Następnie odwiruj zawiesiny, zachowaj osad komórkowy i resuspenduj komórki w 1 mL 1XPBS. Kontynuuj przemywanie komórek w 1XPBS do momentu, aż nadsącz stanie się klarowny.Po odlaniu supernatantu należy dodać objętość 1% BSA oraz PBS równą objętości osadu, aby uzyskać 50% hematokryt erytrocytów znakowanych ICG. Następnie należy przeprowadzić proces zbierania warstwy białej (buffy coat). W pierwszej kolejności komórki należy przemyć raz 10 mililitrami 1XPBS w celu usunięcia zanieczyszczeń.Ponownie odwirować próbki, a następnie resuspendować osad w 900 µL 1XPBS. Następnie dodać 100 µL 10% fluoresceiny sodowej i inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Na koniec trzykrotnie przemyć znakowane limfocyty 10 mL 1XPBS.Odwirować i zawiesić je ponownie w 100 µl 1XPBS. Aby przygotować erytrocyty znakowane ICG do wstrzyknięcia, należy najpierw rozcieńczyć alikwot do poziomu hematokrytu 5% lub 1%. Zanestetyzować mysz i rozszerzyć jej źrenice.Następnie nanieś maść oftalmiczną do obu oczu. Na jedno z oczu załóż soczewkę kontaktową. Teraz wykonaj obrazowanie myszy przy użyciu kamery konfokalnego SLO z dodatnią soczewką 25 dioptrii, aby skompensować refrakcję oka.Należy precyzyjnie skierować rogówkę do głowicy optycznej urządzenia SLO. Następnie należy włączyć moduł obrazowania i manewrować nim do momentu, aż nerw wzrokowy znajdzie się w centrum ekranu obrazowania. Następnie, pod kątem 30 stopni, należy wykonać obrazy dna oka w podczerwieni.Następnie należy wykonać film z dna oka w podczerwieni. Włącz filtr ICG 790 nanometrów, ustaw tryb kamery na wysoką prędkość, a kąt widzenia utrzymuj w zakresie od 15 do 30 stopni. Następnie ustaw intensywność ICG na 85 dla wszystkich odczytów.Na panelu sterowania kliknij przycisk acquire, aby zarejestrować film bazowy z częstotliwością od 8,8 do 15 klatek na sekundę przez jedną minutę. Następnie pobierz 100 µL erytrocytów znakowanych ICG do strzykawki insulinowej z igłą o rozmiarze 30 G i wstrzyknij komórki do żyły ogonowej lub podaj je drogą retroorbitalną. Bezpośrednio po wstrzyknięciu wykonaj nowe zdjęcie dna oka w podczerwieni oraz nowy film z zastosowaniem filtra ICG.Po zarejestrowaniu filmów wyeksportuj je do formatu TIFF w celu przeprowadzenia analizy obrazu. Przetwórz obrazy przy użyciu bezpłatnego pakietu oprogramowania do analizy obrazowania MHJ. Po otwarciu pliku ustaw interwał klatek filmu w celu pomiaru prędkości.Następnie otwórz wtyczkę MtrackJ. Z menu wybierz opcję tracking i zaznacz pole przeskakiwania do następnego indeksu ramki czasu po dodaniu punktu. Teraz zlokalizuj interesującą komórkę i śledź ją w każdej ramce.Z menu wybierz opcję dodawania, aby dodać nowy ślad, a następnie kliknij w wybraną komórkę. Następnie kontynuuj klikanie w aktualną pozycję komórki w miarę przesuwania się obrazów z klatki na klatkę. Po zakończeniu śledzenia zmień opcję wyświetlania trajektorii z dostępnych wyborów i wybierz opcję wyświetlania tylko punktów śladu w aktualnym czasie.Kontynuuj klikanie, aż zostanie wyświetlona trajektoria komórki, a następnie zapisz ścieżkę. Teraz przejdź do śledzenia kolejnej komórki, zaczynając od polecenia add i postępując tak jak w przypadku pierwszej komórki. Po prześledzeniu wszystkich interesujących komórek otwórz wyświetlanie wszystkich pomiarów ścieżek za pomocą opcji measure.Następnie należy zapisać wynik do dalszej analizy. Erytrocyty znakowane 1,5% ICG wizualizowano w krążeniu siatkówki myszy C57 black 6J przy użyciu 1% lub 5% hematokrytu; komórki były rozróżnialne, lecz przy 1% hematokrycie komórki znakowane były łatwiejsze do wizualizacji. Przy obu wstrzykniętych stężeniach w obszarze parapapilarnym obserwowano pewną erytrostazę, która była bardziej widoczna przy 5% hematokrycie.Leukocyty oznakowano 1% fluoresceiną sodową i zwizualizowano jako komórki znakowane na zielono przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Zaobserwowano pewne skupianie się komórek. Po opanowaniu techniki, jej przeprowadzenie zajmuje sześć godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest rozszerzenie źrenic w celu uzyskania wysokiej jakości obrazów i nagrań siatkówki.

fluorescent-dye-labeling-erythrocytes-leukocytes-for-studying-flow

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Mikroskopia wewnątrzżyciowa do śledzenia czasowych i przestrzennych zdarzeń hemodynamicznych i zapalnych w mikrokrążeniu opony miękkiej.

Mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okna czaszkowego

Niedawno opracowane techniki obrazowania z wykorzystaniem fluorescencji w bliskiej podczerwieni (NIRF) mogą pomóc w wyjaśnieniu roli, jaką układ limfatyczny odgrywa w przerzutowaniu nowotworów, odpowiedzi immunologicznej, gojeniu ran oraz innych chorobach związanych z układem limfatycznym.

Nieinwazyjne obrazowanie optyczne naczyń limfatycznych myszy

Ten film demonstruje cytometrię przepływową do pomiaru wychwytu mikrogleju przez fluorescencyjne biocząstki po dostrzodowisku do ciała szklistego w oku myszy. Cytometria przepływowa wykrywa żywe komórki wykazujące ekspresję CD11b i odróżnia fagocytarne komórki mikrogleju wykazujące zieloną fluorescencję od innych komórek szpikowych, w tym monocytów eksprymujących Ly6C i neutrofili wykazujących ekspresję Ly6G.

Pomiar wychwytu mikrogleju przez cząstki fluorescencyjne dostarczane do ciała szklistkowego za pomocą cytometrii przepływowej

Mikroskopia przyżyciowe może być używana u zwierząt do wizualizacji i pomiaru średnic naczyń krwionośnych siatkówki, prędkości przepływu krwi i całkowitego przepływu krwi w siatkówce.

Przyżyciowe pomiary wideomikroskopii przepływu krwi w siatkówce u myszy

Fagocytoza mikrogleju jest kluczowa dla utrzymania homeostazy tkanek, a nieodpowiednia funkcja fagocytarna została zamieszana w patologię. Jednak ocena funkcji mikrogleju in vivo jest technicznie trudna. Opracowaliśmy prostą, ale solidną technikę precyzyjnego monitorowania i ilościowego określania potencjału fagocytarnego mikrogleju w warunkach fizjologicznych.

Ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Ten protokół opisuje szczegółową metodę przygotowania i immunofluorescencji barwienia płaskich mocowań siatkówki myszy oraz analizy. Szczegółowo opisano również zastosowanie angiografii dna oka fluoresceiny (FFA) u młodych myszy i przetwarzanie obrazu.

Monitorowanie dynamicznego wzrostu naczyń siatkówki w mysim modelu retinopatii indukowanej tlenem

Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej może być wykorzystana do badania interakcji leukocytów-śródbłonka i perfuzji naczyń włosowatych w czasie rzeczywistym. Protokół ten opisuje metody obrazowania i ilościowego oznaczania tych parametrów w mikrokrążeniu płucnym za pomocą stabilizowanego próżniowo systemu obrazowania płuc.

Przyżyciowa mikroskopia fluorescencyjna szerokokątnego mikrokrążenia płucnego w eksperymentalnym ostrym uszkodzeniu płuc z wykorzystaniem systemu obrazowania stabilizowanego próżniowo

Unaczynienie siatkówki myszy jest szczególnie interesujące w zrozumieniu mechanizmów powstawania wzorców naczyniowych. Protokół ten automatycznie mierzy średnicę naczyń siatkówki myszy na podstawie obrazów dna oka angiografii fluorescencyjnej w stałej odległości od tarczy nerwu wzrokowego.

Pomiar średnicy naczynia siatkówki na podstawie obrazów angiografii fluorescencyjnej myszy

Demonstrujemy metodę oznaczania ścian układu krwionośnego siatkówki i przylegających leukocytów. Te przylegające leukocyty można następnie policzyć pod mikroskopem fluorescencyjnym jako parametr stanu zapalnego lub odpowiedź tego zapalenia na terapie.

Kwantyfikacja adherentnych leukocytów wywołanych cukrzycą w unaczynieniu siatkówki

Poznaj metodę fluorescencyjnego znakowania erytrocytów i leukocytów w celu badania dynamiki przepływu krwi w siatkówce myszy. Technika ta umożliwia wizualizację komórek krwi w czasie rzeczywistym.

Fluorescencyjne znakowanie barwnikami erytrocytów i leukocytów w celu badania dynamiki przepływu w krążeniu siatkówkowym myszy

Przeglądaj więcej filmów