Name: Metoda powinowactwa do DNA G-quadruplex do oczyszczania enzymatycznie aktywnej resolwazy G41 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania aktywnej resolwazy G4 z bakterii przy użyciu ATP. Technika wyklucza nieaktywne enzymy i zapewnia czyste białko do badań biochemicznych in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować naszym źródłom finansowania, w tym hojnemu darowi od Fundacji Ware (dla J.P.V.), The National Institutes of HealthGrant T32-CA079448 (dla P.J.S.) oraz funduszom startowym Ball State University (dla P.J.S.). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

<ol><li>Qin, Y., Hurley, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures%2C+folding+patterns%2C+and+functions+of+intramolecular+DNA+G-quadruplexes+found+in+eukaryotic+promoter+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Structures, folding patterns, and functions of intramolecular DNA G-quadruplexes found in eukaryotic promoter regions.</a> Biochimie. 90 (8), 1149-1171 (2008).</li>
<li>Stegle, O., Payet, L., Mergny, J. L., MacKay, D. J., Leon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+and+understanding+the+stability+of+G-quadruplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Predicting and understanding the stability of G-quadruplexes.</a> Bioinformatics. 25 (12), i374-i382 (2009).</li>
<li>Todd, A. K., Johnston, M., Neidle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+prevalent+putative+quadruplex+sequence+motifs+in+human+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Highly prevalent putative quadruplex sequence motifs in human DNA.</a> Nucleic Acids Res. 33 (9), 2901-2907 (2005).</li>
<li>Huppert, J. L., Balasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+quadruplexes+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Prevalence of quadruplexes in the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 33 (9), 2908-2916 (2005).</li>
<li>Bedrat, A., Lacroix, L., Mergny, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluation+of+G-quadruplex+propensity+with+G4Hunter%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Re-evaluation of G-quadruplex propensity with G4Hunter.</a> Nucleic Acids Res. 44 (4), 1746-1759 (2016).</li>
<li>Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M. Jr, Mergny, J. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26883636">G-quadruplexes and helicases.</a> Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).</li>
<li>Huppert, J. L., Balasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-quadruplexes+in+promoters+throughout+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G-quadruplexes in promoters throughout the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 35 (2), 406-413 (2007).</li>
<li>Eddy, J., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+function+correlates+with+potential+for+G4+DNA+formation+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gene function correlates with potential for G4 DNA formation in the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 34 (14), 3887-3896 (2006).</li>
<li>Eddy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+motifs+correlate+with+promoter-proximal+transcriptional+pausing+in+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G4 motifs correlate with promoter-proximal transcriptional pausing in human genes.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 4975-4983 (2011).</li>
<li>Vaughn, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEXH+protein+product+of+the+DHX36+gene+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).</li>
<li>Booy, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+RHAU+%28DHX36%29+unwinds+a+G4-quadruplex+in+human+telomerase+RNA+and+promotes+the+formation+of+the+P1+helix+template+boundary%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase RHAU (DHX36) unwinds a G4-quadruplex in human telomerase RNA and promotes the formation of the P1 helix template boundary.</a> Nucleic Acids Res. 40 (9), 4110-4124 (2012).</li>
<li>Creacy, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+resolvase+1+binds+both+DNA+and+RNA+tetramolecular+quadruplex+with+high+affinity+and+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+and+G4-RNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">G4 resolvase 1 binds both DNA and RNA tetramolecular quadruplex with high affinity and is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA and G4-RNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 283 (50), 34626-34634 (2008).</li>
<li>Giri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+resolvase+1+tightly+binds+and+unwinds+unimolecular+G4-DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA.</a> Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).</li>
<li>Lattmann, S., Stadler, M. B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEAH-box+RNA+helicase+RHAU+binds+an+intramolecular+RNA+G-quadruplex+in+TERC+and+associates+with+telomerase+holoenzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The DEAH-box RNA helicase RHAU binds an intramolecular RNA G-quadruplex in TERC and associates with telomerase holoenzyme.</a> Nucleic Acids Res. 39 (21), 9390-9404 (2011).</li>
<li>Sexton, A. N., Collins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5%27+guanosine+tracts+of+human+telomerase+RNA+are+recognized+by+the+G-quadruplex+binding+domain+of+the+RNA+helicase+DHX36+and+function+to+increase+RNA+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The 5' guanosine tracts of human telomerase RNA are recognized by the G-quadruplex binding domain of the RNA helicase DHX36 and function to increase RNA accumulation.</a> Mol Cell Biol. 31 (4), 736-743 (2011).</li>
<li>Smaldino, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+Dissection+of+Telomeric+DNA+Binding+Requirements+of+G4+Resolvase+1+Shows+that+G4-Structure+and+Certain+3%27-Tail+Sequences+Are+Sufficient+for+Tight+and+Complete+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mutational Dissection of Telomeric DNA Binding Requirements of G4 Resolvase 1 Shows that G4-Structure and Certain 3'-Tail Sequences Are Sufficient for Tight and Complete Binding.</a> PLoS One. 10 (7), e0132668(2015).</li>
<li>Booy, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+RHAU+%28DHX36%29+suppresses+expression+of+the+transcription+factor+PITX1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase RHAU (DHX36) suppresses expression of the transcription factor PITX1.</a> Nucleic Acids Res. 42 (5), 3346-3361 (2014).</li>
<li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yin+Yang+1+contains+G-quadruplex+structures+in+its+promoter+and+5%27-UTR+and+its+expression+is+modulated+by+G4+resolvase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Yin Yang 1 contains G-quadruplex structures in its promoter and 5'-UTR and its expression is modulated by G4 resolvase 1.</a> Nucleic Acids Res. 40 (3), 1033-1049 (2012).</li>
<li>Tran, H., Schilling, M., Wirbelauer, C., Hess, D., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+mRNA+deadenylation+and+decay+by+the+exosome-bound%2C+DExH+protein+RHAU%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Facilitation of mRNA deadenylation and decay by the exosome-bound, DExH protein RHAU.</a> Mol Cell. 13 (1), 101-111 (2004).</li>
<li>Yoo, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHX36+enhances+RIG-I+signaling+by+facilitating+PKR-mediated+antiviral+stress+granule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">DHX36 enhances RIG-I signaling by facilitating PKR-mediated antiviral stress granule formation.</a> PLoS Pathog. 10 (3), e1004012(2014).</li>
<li>Lai, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEAH-box+helicase+RHAU+is+an+essential+gene+and+critical+for+mouse+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The DEAH-box helicase RHAU is an essential gene and critical for mouse hematopoiesis.</a> Blood. 119 (18), 4291-4300 (2012).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DDX1%2C+DDX21%2C+and+DHX36+helicases+form+a+complex+with+the+adaptor+molecule+TRIF+to+sense+dsRNA+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">DDX1, DDX21, and DHX36 helicases form a complex with the adaptor molecule TRIF to sense dsRNA in dendritic cells.</a> Immunity. 34 (6), 866-878 (2011).</li>
<li>Kim, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartate-glutamate-alanine-histidine+box+motif+%28DEAH%29%2FRNA+helicase+A+helicases+sense+microbial+DNA+in+human+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Aspartate-glutamate-alanine-histidine box motif (DEAH)/RNA helicase A helicases sense microbial DNA in human plasmacytoid dendritic cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (34), 15181-15186 (2010).</li>
<li>BD Biosciences. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bd.com/ds/technicalCenter/misc/difcobblmanual_2nded_lowres.pdf">http://www.bd.com/ds/technicalCenter/misc/difcobblmanual_2nded_lowres.pdf</a> (2016).</li>
<li>Booy, E. P., McRae, E. K., McKenna, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+G4+quadruplex+telomerase+RNA+unwinding+by+the+RNA+helicase+RHAU%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of G4 quadruplex telomerase RNA unwinding by the RNA helicase RHAU.</a> Methods Mol Biol. 1259, 125-135 (2015).</li>
<li>Lattmann, S., Giri, B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+amino+terminal+RHAU-specific+motif+in+the+recognition+and+resolution+of+guanine+quadruplex-RNA+by+the+DEAH-box+RNA+helicase+RHAU%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Role of the amino terminal RHAU-specific motif in the recognition and resolution of guanine quadruplex-RNA by the DEAH-box RNA helicase RHAU.</a> Nucleic Acids Res. 38 (18), 6219-6233 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten reprezentuje wysoce wydajny schemat ekspresji, oczyszczania i kwantyfikacji do izolacji produktu genu DHX36, G4-Resolvase1 (G4R1, zwanego również RHAU i DHX36) (Figura 1). Protokół ten wykorzystuje dwa etapy oczyszczania: oczyszczanie powinowactwa do znacznika Hisa na kulkach powinowactwa kobaltu i oczyszczanie enzymatyczne na kulkach sprzężonych z G4-DNA. Ten ostatni etap jest wyjątkowy, ponieważ wykorzystuje ścisłe powinowactwo, wysoką specyficzność i katalityczną aktywność odwijania, jaką...

G4 struktury są wysoce stabilnymi drugorzędowymi strukturami kwasu nukleinowego, które tworzą się w bogatych w guaninę regionach DNA i RNA. Struktury G4 są stabilizowane poprzez oddziaływania wiążące Hoogsteena i koordynują wiązanie w centralnej jamie z kationami jednowartościowymi (tj.K+ i Na+), które znacząco przyczyniają się do niezwykłej stabilności termicznej struktur G41,2. Wczesne badania bioinformatyczne sugerowały, że ludzki genom zawiera > 375 000 "potencjalnych motywów tworzących G4"3,4. Nowsze szacunki badań sugerują, że liczba motywów G4 jest wyższa o czynnik 2-55, podczas gdy inne badanie przewiduje 716 310 różnych potencjalnych sekwencji tworzących G4 w ludzkim genomie6. Sekwencje tworzące G4 są ewolucyjnie konserwatywne i nie są losowo rozproszone w genomie. Motywy G4 są wzbogacone w regiony kodujące geny, a ponad 40% wszystkich promotorów genów zawiera motywy G47. Co ciekawe, wykazano, że stopień wzbogacenia motywów G4 w genie sugeruje funkcję genu. Na przykład protoonkogeny i geny biorące udział w rozwoju mają znacznie większe wzbogacenie struktur G4 niż geny supresorowe nowotworów8,9.

Dzięki wysokiej stabilności termicznej, niemal wszechobecnej obecności w całym genomie i możliwości znaczącego wpływu na główne procesy komórkowe, nie jest zaskakujące, że komórka wyewoluowała enzymy do zarządzania tymi strukturami. Jednym z takich enzymów jest resolwaza G4 (G4R1; zwana również RHAU i DHX36), którą scharakteryzowaliśmy jako źródło większości tetramolekularnej aktywności rozdzielczej G4-DNA w komórkach ludzkich (HeLa)10. Od tego czasu wykazano, że G4R1 ściśle wiąże i katalitycznie rozwija tetramolekularne i jednocząsteczkowe G4-DNA i G4-RNA z najściślej zgłoszonymi KD dla białka wiążącego G4<klasa sup="xref">11,12,13. Dodatkowo, aktywność G4R1 w zakresie rozpoznawania G4 jest zaangażowana w szeroki zakres procesów biochemicznych i komórkowych, w tym biologię telomerów/telomerazy11,14,15,16, transkrypcja i splicing17,18,19,20, development21, hematopoiesis21, oraz regulacja immunologiczna22,23. Z przewagą sekwencji G4 specyficznie rozmieszczonych w całym genomie i różnorodnymi procesami komórkowymi, w które ostatnio zaangażowano G4R1, zdolność do ekspresji i skutecznego oczyszczania wysoce aktywnego rG4R1 będzie miała ogromne znaczenie dla wyjaśnienia mechanizmów biochemicznych i zachowań tego białka.

Tutaj demonstrujemy nowatorski schemat ekspresji i oczyszczania (Rysunek 1), który wykorzystuje zależną od ATP, rozdzielczą aktywność G4R1 RG4R1 do efektywnej izolacji aktywnego enzymu. Schemat ten można dostosować do oczyszczania innych enzymów kwasów nukleinowych zależnych od ATP, dla których produkt reakcji enzymatycznej nie jest już substratem do wiązania, jak ma to miejsce w przypadku G4R1.

<table><tbody><tr><td>TriEx4-DHX36 plazmid</td><td>Addgene</td><td>68368</td><td></td></tr><tr><td>Rosetta2(DE3)plysS kompetentne komórki</td><td>Novagen</td><td>71403-4</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544034&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Difco Terrific Bulion</td><td>Becton Dickinson</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td>35 &micro; g/ml w płytkach bakteryjnych/dużych kulturach</td></tr><tr><td>Karbenicylina (testowana na kulturach komórek roślinnych)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3416</td><td>50 &micro; g/ml w płytkach bakteryjnych/dużych kulturach</td></tr><tr><td>Izopropyl &beta;-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Lizozym (z białka jaja kurzego)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 8</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1963-B</td><td>lub ze standardowego źródła</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1966</td><td>lub ze standardowego źródła</td></tr><tr><td>1,5 M Tris-HCl, pH 8,8</td><td></td><td></td><td>Do odlewania żelu rozdzielczego (do żelu do oznaczania ilości białek); Ze standardowego źródła</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 6,8</td><td></td><td></td><td>Do odlewania żelu do układania w stosy (do żelu do oznaczania ilości białka); Ze standardowego źródła</td></tr><tr><td>1 M Tris-Acetate, pH 7,8</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1981</td><td>lub ze standardowego źródła</td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td></td><td></td><td>Ze standardowego źródła</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (1&nbsp; M solution)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1665</td><td>lub ze standardowego źródła</td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol (2-BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8849</td><td></td></tr><tr><td>Hemisulfian leupeptyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna Koraliki paramagnetyczne</td><td>Promega</td><td>Z5482</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8&nbsp;</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>0718</td><td>lub ze standardowego źródła</td></tr><tr><td>0,2 M EDTA, pH 6</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td></td><td>Ze standardowego źródła; najpierw dostosuj pH za pomocą NaOH, a następnie dostosuj pH z powrotem za pomocą HCl.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>A-laktoalbumina (typ 1 z mleka krowiego)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5385</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki powinowactwa do metalu</td><td>kobaltowego Clonetech</td><td>635502</td><td></td></tr><tr><td>L-histydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy, lodowaty</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Adenozyno-5'-trifosforan (ze źródła bakteryjnego)</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>40% roztwór akryloamidu/Bis (37,5:1)</td><td>Biorad</td><td>161-0148</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td>do produkcji żelu białkowego bufor do biegania (192 mM glicyna, 25 mM Tris Base, 0,1% SDS)</td></tr><tr><td>10% Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1667</td><td>do produkcji buforu do biegania w żelu białkowym (192 mM glicyny, 25 mM Tris Base, 0,1% SDS); lub ze standardowego źródła</td></tr><tr><td>10x TBE&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11666703001</td><td>lub ze standardowego źródła</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>do produkcji żelu białkowego bufor do biegania (192 mM glicyny, 25 mM Tris Base, 0,1% SDS); Ze standardowego źródła</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>411019</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Szeroki zakres markerów białkowych MW</td><td>Promega</td><td>V8491</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowany oligo Z33 ("Z33-Bio")</td><td>Oligos Etc</td><td></td><td>5' AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA GGA TTC GGA CCT-biotyna 3'</td></tr><tr><td>TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM")</td><td>Oligos Etc 5</td><td></td><td>' TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'</td></tr><tr><td>Powlekana fluorem płyta TLC</td><td>Life Technologies</td><td>AM10110</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2637</td><td>30% w H2O</td></tr><tr><td>Coomassie R-250</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27816</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>Wielopasmowa lampa</td><td></td><td></td> UV <td>Zdolna do emitowania światła UV o długości fali 365 nm</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa (z wahliwym wirnikiem kubełkowym)</td><td></td><td></td> <td>Możliwość chłodzenia do 4 stopni C</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td></td><td></td><td>Możliwość chłodzenia do 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Digital Sonfier</td><td>Branson</td><td></td><td>Lub równoważny zdolny do dostarczania impulsów dźwiękowych (30% amplitudy, 2 s WŁ./2 s WYŁ.)</td></tr><tr><td>50 &deg; C łaźnia</td><td></td><td></td> wodna <td>Do formowania Z33 w kwadrupleks</td></tr><tr><td>37 & deg; Inkubator C dla bakterii</td><td></td><td></td><td>Do przemian bakteryjnych i początkowego wzrostu w ciągu nocy dużych kultur Rosetta2 E. coli transformowanych za pomocą TriEx4-DHX36</td></tr><tr><td>37 &deg; Nr kat. C/14&nbsp; &deg; Inkubator z wytrząsaniem C dla bakterii</td><td></td><td></td><td>Do wzrostu i indukcji białek dużych kultur Rosetta2 E. coli transformowanych za pomocą TriEx4-DHX36</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td></td><td></td><td>zdolny do odczytu OD600; zdolny do odczytu stężeń oligomerów na podstawie sekwencji zasad (np. Biorad SmartSpec 3000)</td></tr><tr><td>Termometr</td><td></td><td></td><td>Ze standardowego źródła</td></tr><tr><td>Probówki</td><td></td> paskowe do PCR<td></td><td>Z standardowego źródła</td></tr><tr><td>15 i 50 ml probówek wirówkowych (polipropylen)</td><td></td><td></td><td>Ze standardowego źródła</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek (2,0 ml)</td><td></td><td></td><td>Z standardowego źródła</td></tr><tr><td>500 ml butelek wirówkowych (polipropylen)</td><td>Thermo Scientific</td><td>3141-0500</td><td></td></tr><tr><td>Standardowy zestaw końcówek do pipet i pipet</td><td></td><td></td> serologicznych <td>Ze standardowego źródła</td></tr><tr>Końcówki <td></td><td></td><td>do ładowania żelu</td><td>Ze standardowego źródła</td></tr><tr><td>Automatyczna pipeta</td><td></td><td></td> powtarzalna <td>Do szybkiego porcjowania rG4R1; Ze standardowego źródła</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td></td><td></td><td>Ze standardowego źródła</td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td></td><td></td><td>Ze standardowego źródła</td></tr><tr><td>Suchy lód</td><td></td><td></td><td>Ze standardowego źródła</td></tr><tr><td>Bufor do próbek Laemlli&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Aparatura do uruchamiania żeli do dużych płyt</td><td>Biorad</td><td></td><td>Użyliśmy aparatu komórkowego Protean II xi firmy Biorad</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12301D</td><td>Używamy magnesu firmy One Lambda (obecnie marka Thermo Fisher Scientific); a Life jest również spółką zależną Thermo, a zatem wymieniony tutaj magnes powinien być odpowiednim zamiennikiem</td></tr><tr><td>Żyletki</td><td></td><td></td><td>Ze standardowego źródła</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna i lejek</td><td></td><td></td><td>Ze standardowego źródła</td></tr><tr><td>Szklane naczynie</td><td></td><td></td> żaroodporne <td>Ze standardowego źródła</td></tr><tr><td>Wytrząsarka</td><td></td><td></td> orbitalna <td>Ze standardowego źródła</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td>Ze standardowego źródła</td></tr><tr><td>Przezroczyste ochraniacze arkuszy</td><td></td><td></td><td>Ze standardowego źródła</td></tr><tr><td>Skaner i powiązane Oprogramowanie</td><td></td><td></td> TWAIN <td>Ze standardowego źródła</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td> do analizy obrazu<td>, takie jak Fuji Multiguage lub równoważny</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td><td>Lub równoważny&nbsp;</td></tr></tbody></table>

metoda powinowactwa do dna g-quadruplex do oczyszczania enzymatycznie aktywnej resolwazy g41

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Struktury kwasów nukleinowych wyższego rzędu zwane G-kwadrupleksami (struktury G4, G4) mogą tworzyć się w bogatych w guaninę regionach zarówno DNA, jak i RNA i są wysoce stabilne termicznie. W ludzkim genomie znajduje się > 375 000 przypuszczalnych sekwencji tworzących G4, które są wzbogacone w regiony promotorowe, regiony nieulegające translacji (UTR) oraz w powtórzeniach telomerowych. Ze względu na potencjał tych struktur do wpływania na procesy komórkowe, takie jak replikacja i transkrypcja, komórka wyewoluowała enzymy, aby nimi zarządzać. Jednym z takich enzymów jest resolwaza G4 1 (G4R1), która została biochemicznie scharakteryzowana przez nasze laboratorium i Nagamine et al. i stwierdzono, że bardzo ściśle wiąże się zarówno z G4-DNA, jak i G4-RNA (Kd w zakresie niskiego pM). G4R1 jest źródłem większości aktywności rozdzielczej G4 w lizatach komórek HeLa i od tego czasu uważa się, że odgrywa rolę w metabolizmie telomerów, rozwoju limfy, transkrypcji genów, hematopoezie i nadzorze immunologicznym. Zdolność do efektywnej ekspresji i oczyszczania aktywnego katalitycznie G4R1 ma znaczenie dla laboratoriów zainteresowanych uzyskaniem dalszego wglądu w oddziaływanie kinetyczne struktur G4 i enzymów rozdzielczych G4. Tutaj opisujemy szczegółową metodę oczyszczania rekombinowanego G4R1 (rG4R1). Opisana procedura obejmuje tradycyjne, oparte na powinowactwie oczyszczanie C-końcowego enzymu znakowanego histydyną, ulegającego ekspresji w ludzkich bakteriach zoptymalizowanych pod kątem kodonów, z wykorzystaniem zdolności rG4R1 do wiązania i rozwijania G4-DNA w celu oczyszczenia wysoce aktywnego enzymu w etapie elucji zależnym od ATP. Protokół obejmuje również etap kontroli jakości, w którym mierzy się aktywność enzymatyczną rG4R1 poprzez badanie zdolności oczyszczonego enzymu do rozwijania G4-DNA. Opisano również metodę, która pozwala na ilościowe oznaczenie oczyszczonego rG4R1. Omówiono alternatywne adaptacje tego protokołu.

Niniejszy protokół (Rysunek 1) pozwala na rutynowe uzyskiwanie niemal czystego, katalitycznie aktywnego białka rG4R1. Jako miara aktywności enzymatycznej zazwyczaj obserwuje się, że 50% 0,2 pmol tetramolekularnego G4-DNA znakowanego TAMRA zostaje przekształconych w monomery w zakresie 0,2 - 0,013 µL rG4R1, co potwierdzono w teście aktywności G4 opisanym powyżej (Rysunek 2). Barwienie Coomassie oczyszczonego rG4R1 wykazuje pojedynczy prążek o oczekiwanej masie 120 kDa oraz niewielki prąże...

G4 Resolvase1 wiąże się ze strukturami G-quadruplex (G4) o najściślejszym zgłoszonym powinowactwie do białka wiążącego G4 i reprezentuje większość aktywności odwijania G4-DNA w komórkach HeLa. Opisujemy nowatorski protokół, który wykorzystuje powinowactwo i zależną od ATP aktywność odwijania G4-Resolvazy1 do specyficznego oczyszczania katalitycznie aktywnego rekombinowanego G4R1.

Metoda powinowactwa do DNA G-quadruplex do oczyszczania enzymatycznie aktywnej resolwazy G41

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Ogólnym celem niniejszej metody jest wyizolowanie białka helikazy G-kwadrupleksu G4 Resolvase1 z bakteryjnego systemu ekspresyjnego przy użyciu unikalnego etapu oczyszczania zależnego od ATP, aby uzyskać niemal czysty i katalitycznie aktywny enzym. Metoda ta może pomóc badaczom w otrzymaniu niemal czystego i katalitycznie aktywnego rekombinowanego białka G4 Resolvase1 do zastosowania w szerokim zakresie biochemicznych testów in vitro. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona wyeliminować z preparatu białkowego enzymy błędnie sfałdowane lub w inny sposób nieaktywne katalitycznie.Pomysł wykorzystania ATP do elucji helikazy G-kwadrupleksu pojawił się po niepowodzeniu w elucji katalitycznie aktywnego enzymu z kuleczek G4, nawet przy wyjątkowo wysokich stężeniach soli. Przygotować i wyhodować duże kultury bakteryjne ekspresyjne dla G-quadruplex Resolvase1 lub G4R1 zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Odmrozić osad bakteryjny w trzech mililitrach buforu TN w temperaturze pokojowej.Trzymając butelki w dłoni, należy nimi zakręcić, aby rozmrozić i resuspender osad bakteryjny. Po rozmrożeniu i uzyskaniu względnie jednorodnej zawiesiny, należy uzupełnić objętość do 5 ml za pomocą

a-g-quadruplex-dna-affinity-approach-for-purification-enzymatically

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Struktura krystaliczna kompleksów białko–DNA może dostarczyć informacji na temat funkcji i mechanizmu działania białka, a także charakteru specyficznej interakcji. W niniejszym materiale opisujemy sposób optymalizacji długości, sekwencji i końców dwuniciowego DNA w celu kokrystalizacji z białkiem SeqA z Escherichia coli, które jest negatywnym regulatorem inicjacji replikacji.

Iteracyjna optymalizacja dupleksów DNA w celu krystalizacji kompleksów SeqA-DNA

Opisujemy czułe, żelowe testy nieciągłe, aby zbadać kinetykę inicjacji opóźnionej nici przy użyciu białek replikacyjnych bakteriofaga T7.

Kinetyka syntezy opóźnionej nici DNA in vitro przez białka replikacji bakteriofagów T7

Metody generowania dużych bibliotek gRNA powinny być proste, wydajne i opłacalne. Opisujemy protokół produkcji bibliotek gRNA oparty na enzymatycznym trawieniu docelowego DNA. Metoda CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity) stanowi alternatywę dla kosztownej, niestandardowej syntezy oligonukleotydów.

Uniwersalny protokół do produkcji bibliotek gRNA na dużą skalę z dowolnego źródła DNA

Zgłoszono platformę jednocząsteczkowych pęsety magnetycznej do manipulowania G-quadruplexami, która pozwala na badanie stabilności i regulacji G4 przez różne białka.

Manipulacja pojedynczymi cząsteczkami G-kwadrupleksów za pomocą pęsety magnetycznej

Obecny protokół demonstruje użycie szybkiego, 3-stopniowego, opartego na aptamie testu wykładniczego amplifikacji do wykrywania celów. Przygotowanie próbki, wzmocnienie sygnału i rozwój koloru są omówione w celu wdrożenia tego systemu do rozpoznawania obecności teofiliny w porównaniu z kofeiną.

Wykrywanie celów oparte na aptamierach ułatwione przez 3-stopniową izotermiczną reakcję amplifikacji wykładniczej G-Quadruplex

Bis-3-chloropiperydyny (B-CePs) są użytecznymi sondami chemicznymi do identyfikacji i charakteryzowania struktur G-kwadrupleksu w matrycach DNA in vitro. Protokół ten szczegółowo opisuje procedurę przeprowadzania reakcji sondowania z B-i rozpuszczania produktów reakcji za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym o wysokiej rozdzielczości.

In vitro Mapowanie chemiczne struktur DNA G-Quadruplex za pomocą bis-3-chloropiperydyn

Istotną przeszkodą dla technologii takich jak CRISPR są zdarzenia niezgodne z celem, które mogą zakłócić działanie ważnych genów. "Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing" (CIRCLE-seq) jest techniką opracowaną w celu identyfikacji niezamierzonych miejsc rozszczepienia. Metoda ta mapuje aktywność CRISPR-Cas9 w całym genomie z wysoką czułością i bez uprzedzeń.

CIRCLE-Seq do badania edycji genów poza celem

Protokół ten demonstruje wykonanie testu pojedyncząłego w celu wizualizacji na żywo rozwijania DNA za pomocą helikazy CMG. Opisuje (1) przygotowanie substratu DNA, (2) oczyszczanie fluorescencyjnie znakowanej helikazy Drosophila melanogaster CMG, (3) przygotowanie komórki przepływowej mikrofluidycznej do mikroskopii całkowitej fluorescencji odbicia wewnętrznego (TIRF) oraz (4) test odwijania DNA pojedyncząłą.

Wizualizacja rozwijania DNA w czasie rzeczywistym pojedyncząłą cząsteczką przez helikazę CMG

Ten protokół opisuje test replikacji pojedynczej cząsteczki DNA oparty na mikroskopii fluorescencyjnej, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym interakcji między polimerazami DNA a przeszkodami, takimi jak struktury G-quadruplex.

Wizualizacja fluorescencji pojedynczej cząsteczki dynamiki polimerazy DNA w G-kwadrupleksach

Przedstawiono protokół produkcji, oczyszczania i stosowania pęcherzyków z zewnętrzną błoną upakowaną enzymem (OMV), zapewniający zwiększoną stabilność enzymów do zastosowania w różnych zastosowaniach.

Ukierunkowane pakowanie białka w pęcherzykach błony zewnętrznej z Escherichia coli: projektowanie, produkcja i oczyszczanie

Poznaj metodę oczyszczania aktywnej resolwazy G4 z bakterii przy użyciu ATP. Technika wyklucza nieaktywne enzymy i zapewnia czyste białko do badań biochemicznych in vitro.

Metoda powinowactwa do DNA G-quadruplex do oczyszczania enzymatycznie aktywnej resolwazy G41

Przeglądaj więcej filmów