Metoda powinowactwa do DNA G-quadruplex do oczyszczania enzymatycznie aktywnej resolwazy G41

Ogólnym celem niniejszej metody jest wyizolowanie białka helikazy G-kwadrupleksu G4 Resolvase1 z bakteryjnego systemu ekspresyjnego przy użyciu unikalnego etapu oczyszczania zależnego od ATP, aby uzyskać niemal czysty i katalitycznie aktywny enzym. Metoda ta może pomóc badaczom w otrzymaniu niemal czystego i katalitycznie aktywnego rekombinowanego białka G4 Resolvase1 do zastosowania w szerokim zakresie biochemicznych testów in vitro. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona wyeliminować z preparatu białkowego enzymy błędnie sfałdowane lub w inny sposób nieaktywne katalitycznie.

Pomysł wykorzystania ATP do elucji helikazy G-kwadrupleksu pojawił się po niepowodzeniu w elucji katalitycznie aktywnego enzymu z kuleczek G4, nawet przy wyjątkowo wysokich stężeniach soli. Przygotować i wyhodować duże kultury bakteryjne ekspresyjne dla G-quadruplex Resolvase1 lub G4R1 zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Odmrozić osad bakteryjny w trzech mililitrach buforu TN w temperaturze pokojowej.

Trzymając butelki w dłoni, należy nimi zakręcić, aby rozmrozić i resuspender osad bakteryjny. Po rozmrożeniu i uzyskaniu względnie jednorodnej zawiesiny, należy uzupełnić objętość do 5 ml za pomocą buforu TN. Następnie należy rozpuścić 20 mg lizozymu w 250 µl wody na każdą kulturę i dodać go do resuspenderowanych bakterii.

Pozostaw lizozym na około 5 do 10 minut w celu strawienia bakterii, delikatnie obracając butelki w dłoni. W miarę postępu procesu trawienia kolor zawiesiny zacznie lekko blednąć, a sama zawiesina stanie się stosunkowo mało lepka. Dodaj 250 µl koktajlu inhibitorów proteaz, w skrócie PIC.

Następnie należy dodać jedną 10 µL aliquotę leupeptyny i dokładnie wymieszać. Zawiesinę umieścić na lodzie, a następnie dodać 10 ml zimnego buforu TN oraz 22 µL beta-merkaptoetanolu lub BME. Zawiesinę przenieść do probówki o pojemności 50 ml.

Poddaj bakterie sonikacji w lodzie, używając cyfrowego sonikatora ustawionego na 30% amplitudy. Stosuj impulsy w cyklu dwóch sekund włączania i dwóch sekund wyłączania przez jedną minutę. Powtórz sonikację trzy razy, pozwalając próbkom schłodzić się w lodzie przez co najmniej dwie minuty pomiędzy poszczególnymi etapami sonikacji.

Następnie dodaj równą objętość zimnego czterokrotnego roztworu cytrynianu sodu i soli (SSC) z dodatkiem BME, PIC oraz leupeptyny i wymieszaj zawiesinę. W wirówce laboratoryjnej schłodzonej do 4 °C odwiruj lizaty z prędkością 2 300 ×g przez 20 minut. Następnie przenieś nadsącz do nowych, schłodzonych probówek o pojemności 50 ml.

Pobrać jeden mililitr zawiesiny magnetycznych kulek streptawidynowych (SPB) na każdą kulturę i przenieść do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Osadzić SPB za pomocą magnesu. Następnie przemyć SPB dwukrotnie roztworem 2X SSC z dodatkiem 5 mM EDTA pH 8.

Następnie zawiesić wypłukane SPB w 200 µL tego samego roztworu. Do zawiesiny SPB dodać jedną porcję G4 DNA o gęstości optycznej 3 OD. Szybko wymieszać, pipetując ciecz kilka razy w górę i w dół.

Następnie umieść probówki na rotatorze i inkubuj w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut. Po tym czasie zablokuj związane z G4 koraliki SPB, dodając jeden mililitr 0,4% laktalbuminy, i przechowuj na lodzie do momentu użycia. Aby związać rekombinowane białko G4R1 z tagiem histydynowym z koralików kobaltowych, dodaj jeden mililitr zawiesiny koralików kobaltowych do każdej probówki o pojemności 50 mililitrów zawierającej oczyszczony lizat bakteryjny.

Mieszaninę inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze. Po inkubacji wirować kuleczki kobaltowe z prędkością 110 ×g przez pięć minut w wirówce stołowej w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessać ciecz, pozostawiając kilka mililitrów, aby nie zakłócić osadu kuleczek kobaltowych.

Następnie należy przemyć kulki 10 do 15 mililitrów zimnego buforu four X SSC z dodatkiem BME, a następnie zcentryfugować kulki w ten sam sposób co poprzednio. Kolejną porcję klarownego lizatu należy wlać na osad kulek kobaltowych. Inkubować przez kolejne 20 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze, a następnie przemyć kulki 10 do 15 mililitrów buforu four X SSC z dodatkiem BME.

Następnie odwiruj kuleczki z prędkością 100 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Po drugim przemyciu odessij ciecz, pozostawiając na dnie probówki około 2 mL kuleczek wraz z cieczą. Przenieś kuleczki kobaltowe z wiązanym białkiem do schłodzonej wcześniej probówki o pojemności 2 mL, używając końcówki do pipety o szerokim otworze o pojemności 1 mL.

Krótko odwiruj kuleczki w probówce o pojemności dwóch mililitrów z dużą prędkością w mikrocentryfużce w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie usuń i odrzuć nadsącz za pomocą pipety, uważając, aby nie zgubić kuleczek kobaltowych z wiązanym białkiem. Nanieś pipetą 0,5 mililitra buforu eluującego histydynowego (HEB) na kuleczki i resuspenduj je poprzez odwracanie probówki.

Następnie inkubować kulki kobaltowe w buforze HEB na rotatorze przez pięć minut w pomieszczeniu chłodniczym. Następnie zawiesinę wirować z prędkością 18 000 ×g w mikrocentryfudze w temperaturze 4 °C przez jedną minutę. Ostrożnie odpipetować nadsącz zawierający białko, pozostawiając niewielką ilość płynu nad kulkami kobaltowymi.

Przenieś nadsącz do schłodzonej wcześniej probówki o pojemności 15 ml. Powtórz te kroki, aby przeprowadzić łącznie trzy elucje buforem HEB. Następnie przeprowadź jedną elucję 0,2 M EDTA o pH 6,0.

Kolor kulek kobaltowych zmieni się z różowego na biały w miarę jak EDTA chelatuje kobalt. Po przeniesieniu tej czwartej i ostatniej frakcji elucji do probówki o pojemności 15 mililitrów, należy odpipetować pozostały bufor elucyjny z kulek kobaltowych, używając końcówki do nakładania żelu osadzonej na końcówce pipety o pojemności jednego mililitra. Poprzez dotarcie końcówką do dna probówki można zebrać pozostały bufor elucyjny zawierający białko.

Za pomocą magnesu przesuń przygotowane G4 SPB na ściankę probówki i odlej nadsącz. Następnie dodaj jeden mililitr 3X buforu res do G4 SPB i wymieszaj za pomocą pipety. Przenieś G4 SPB zawieszone w 3X buforze res do probówki o pojemności 15 mililitrów zawierającej około dwóch mililitrów HEB EDTA z białkiem.

Inkubować przez 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, sporadycznie agitując, aby kuleczki nie osiadały na dnie. Po przemyciu G4 SPB z wiązanym białkiem zgodnie z opisem w protokole tekstowym, osadzić G4 SPB za pomocą magnesu na lodzie i resuspendować kuleczki w 100 µL podgrzanego buforu elucyjnego. Natychmiast przenieść kuleczki do podgrzanej probówki PCR i inkubować przez 30 sekund w temperaturze 37 °C.

Bezzwłocznie dodaj 12 µL pięciomolarnego chlorku sodu i energicznie pipetuj w górę i w dół od 20 do 30 razy. Połączenie wysokiego stężenia soli oraz ATP zawartego w buforze elucyjnym służy do elucji rekombinowanego G4R1 z kulek G4. Natychmiast zredukuj G4 SPB za pomocą magnesu i przenieś eluat zawierający białko do nowej probówki PCR w lodzie.

Po powtórzeniu elucji i przeniesieniu produktu końcowym wynikiem jest około 200 µL buforu elucyjnego zawierającego oczyszczone rekombinowane G4R1. Na koniec należy przeprowadzić enzymatyczny test kontroli jakości, aby sprawdzić, czy oczyszczono wysoce aktywne rekombinowane G4R1, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Test G4 pozwala na pomiar aktywności enzymatycznej rekombinowanego G4R1.

W zakresie od 0,2 do 0,013 mikrolitrów enzymu zazwyczaj obserwuje się, że 50% z 0,2 pikomoli tetramolekularnego G4 DNA znakowanego tetrametylorodaminą zostaje przekształconych w monomery. Barwienie Coomassie oczyszczonego rekombinowanego G4R1 wykazuje pojedynczy prążek o oczekiwanej wielkości 120 kilodaltonów z niewielkim prążkiem zanieczyszczającym przy około 75 kilodaltonach. Prążek ten może reprezentować skróconą formę rekombinowanego G4R1, która zachowała zdolność do wiązania kulek G4 DNA i elucji w sposób zależny od ATP.

Prążek docelowy jest kwantyfikowany względem krzywej wzorcowej białka. Niniejszy protokół pozwala zazwyczaj na uzyskanie 200 µL oczyszczonego enzymu o stężeniu od 20 do 100 nM z jednego litra hodowli bakterii. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak oczyścić białko G4 Resolvase1 z bakteryjnego systemu ekspresyjnego, wykorzystując unikalny etap oczyszczania zależny od ATP w celu wyizolowania niemal czystego i katalitycznie aktywnego enzymu.

Po opanowaniu techniki i uprzednim przygotowaniu zamrożonych peletów bakterii, oczyszczanie rekombinowanego G4R1 można przeprowadzić w ciągu około sześciu godzin. Aby zachować optymalną aktywność katalityczną enzymu, ważne jest utrzymywanie preparatu w lodzie, chyba że zaznaczono inaczej. Zawsze należy stosować inhibitory proteaz.

Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza w probówkach. Oczyszczony enzym należy szybko zamrozić i unikać zbędnych cykli zamrażania i rozmrażania. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom w tej dziedzinie do dokładnego określenia powinowactwa wiązania oraz aktywności helikazowej tego białka w stosunku do szerokiego zakresu substratów DNA i RNA.

Metodę tę można również dostosować do oczyszczania innych enzymów kwasów nukleinowych zależnych od ATP, w których produkt reakcji enzymatycznej przestaje być substratem wiążącym dla enzymu.