Metoda powinowactwa do DNA G-quadruplex do oczyszczania enzymatycznie aktywnej resolwazy G41

Ogólnym celem tej metody jest wyizolowanie białka resolwazy G4 helikazy G-quadruplex z bakteryjnego systemu ekspresji przy użyciu unikalnego etapu oczyszczania zależnego od ATP w celu wyizolowania prawie czystego i katalitycznie aktywnego enzymu. Metoda ta może pomóc naukowcom w uzyskaniu prawie czystego i katalitycznie aktywnego rekombinowanego białka resolwazy G4 Resolvase1 w wielu testach biochemicznych in vitro. Główną zaletą tej techniki jest to, że wyklucza ona z preparatu białkowego nieprawidłowo sfałdowany lub w inny sposób katalitycznie nieaktywny enzym.

Pomysł wykorzystania ATP do elucji helikazy G-quadruplex zrodził się po tym, jak nie udało się wymyć aktywnego katalitycznie enzymu z kulek G4, nawet przy wyjątkowo wysokich stężeniach soli. Przygotować i wyhodować duże kultury bakterii wykazujące ekspresję G-kwadrupleksu resolwazy1 lub G4R1, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Rozmrozić osad bakteryjny w trzech mililitrach buforu TN w temperaturze pokojowej.

Trzymaj butelki w dłoni i obracaj, aby rozmrozić i ponownie zawiesić granulki bakteryjne. Po rozmrożeniu i względnie równomiernym zawieszeniu zwiększ objętość do pięciu mililitrów za pomocą bufora TN. Następnie rozpuść 20 miligramów lizozymu w 250 mikrolitrach wody na kulturę i dodaj do zawieszonych bakterii.

Pozwól lizozymowi strawić bakterie przez około pięć do 10 minut, obracając butelki w dłoni. Kolor zawiesiny zacznie się nieznacznie rozjaśniać w miarę postępu trawienia, a zawiesina będzie stosunkowo nielepka. Dodaj 250 mikrolitrów koktajlu inhibitorów proteazy w skrócie.

Następnie dodaj jedną 10 mikrolitrową porcję leupeptyny i dokładnie wymieszaj. Umieść zawiesinę na lodzie i dodaj 10 mililitrów zimnego buforu TN i 22 mikrolitry beta merkaptoetanolu lub BME. Przenieś zawiesinę do rurki o pojemności 50 mililitrów.

Sonikuj bakterie na lodzie za pomocą cyfrowego sonikatora ustawionego na amplitudę 30%. Puls po dwóch sekundach włączenia i dwóch sekundach wyłączenia przez jedną minutę. Powtórzyć sonikację trzy razy, pozwalając próbkom ostygnąć na lodzie przez co najmniej dwie minuty pomiędzy etapami sonikacji.

Następnie dodać równą objętość zimnego czterokrotnego roztworu soli fizjologicznej cytrynianu sodu lub SSC oraz BME, i leupeptyny i wymieszać zawiesinę. W wirówce stołowej, wstępnie schłodzonej do czterech stopni Celsjusza, odwiruj lizaty w temperaturze 2 300 razy G przez 20 minut. Następnie przenieś supernatant do świeżych, wstępnie schłodzonych probówek o pojemności 50 mililitrów.

Weź jeden mililitr kulek paramagnetycznych streptawidyny lub zawiesiny SPB na kulturę i przenieś go do 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki. Skumuluj SPB za pomocą magnesu. Następnie umyj SPB dwukrotnie dwoma X SSC i pięcioma milimolowymi EDTA PH8.

Następnie ponownie zawieś umyty SPB w 200 mikrolitrach tego samego roztworu. Dodać jedną podwielokrotność trzech OD DNA G4 do zawiesiny SPB. Mieszaj szybko, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.

Następnie umieść rurki na rotatorze i obracaj w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut. Po tym okresie rotacji zablokuj SPB związany z G4, dodając jeden mililitr 0,4% laktoalbuminy i trzymaj na lodzie, aż będzie potrzebny. Aby związać rekombinowany G4R1 znakowany histydyną z kulkami kobaltu, dodaj jeden mililitr zawiesiny kulek kobaltu do każdej 50-mililitrowej probówki zawierającej oczyszczony lizat bakteryjny.

Inkubować mieszaninę przez 20 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze. Po inkubacji odwiruj kulki kobaltu w temperaturze 110 razy G przez pięć minut w wirówce stołowej o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie zasysaj płyn i pozostaw kilka mililitrów płynu, aby nie naruszyć granulowanych kulek kobaltowych.

Następnie umyj koraliki 10 do 15 mililitrami zimnego czterech X SSC plus BME i granuluj kulki jak poprzednio. Wlej następny klarowany lizat na granulowane kulki kobaltowe. Inkubować przez kolejne 20 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze i umyć kulki 10 do 15 mililitrami czterech X SSC plus BME.

Następnie granuluj kulki w temperaturze 100 razy G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza. Po drugim umyciu odessać płyn i pozostawić około dwóch mililitrów kulek i płynu na dnie tuby. Przenieś związane z białkiem kulki kobaltowe do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności dwóch mililitrów za pomocą końcówki pipety o średnicy jednego mililitra.

Krótko odwiruj kulki w dwumililitrowej probówce z dużą prędkością w mikrowirówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Delikatnie usunąć i wyrzucić supernatant przez pipetowanie, uważając, aby nie stracić kulek kobaltu związanych z białkiem. Odpipetować 0,5 mililitra buforu elucyjnego histydyny lub HEB na kulki i ponownie je zawiesić, odwracając probówkę.

Następnie inkubuj kulki kobaltu w HEB na rotatorze przez pięć minut w chłodnym pomieszczeniu. Następnie odwirować zawiesinę w temperaturze 18 000 razy G w mikrowirówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną minutę. Delikatnie usunąć białko zawierające supernatant przez ostrożne pipetowanie, pozostawiając niewielką ilość płynu na wierzchu kulek kobaltu.

Przenieść supernatant do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 15 mililitrów. Powtórz te kroki, aby uzyskać łącznie trzy elucje HEB. Następnie wymyj raz 0,2 molowym EDTA przy PH 6,0.

Kolor koralików kobaltowych zmieni się z różowego na biały, ponieważ EDTA chelatuje kobalt. Po przeniesieniu tej czwartej i ostatniej elucji do 15-mililitrowej probówki, odpipetować resztkowy bufor elucyjny z kulek kobaltu za pomocą żelowej końcówki ładującej na końcu jednomililitrowej końcówki pipety. Zanurzając końcówkę na dnie probówki, można zebrać resztki białka zawierającego bufor elucyjny.

Pilotować przygotowany G4 SPB do boku rurki z magnesem i wyrzucić supernatant. Następnie dodaj jeden mililitr buforu o trzech rozdzielczościach X do G4 SPB i odpipetuj do wymieszania. Odpipetować G4 SPB zawieszony w buforze o trzech res X do 15-mililitrowej probówki zawierającej około dwóch mililitrów białka zawierającego HEB EDTA.

Inkubować przez 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, od czasu do czasu mieszając, aby kulki nie osiadły. Po umyciu związanego z białkiem G4 SPB, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, osadzać G4 SPB za pomocą magnesu na lodzie i ponownie zawiesić kulki w 100 mikrolitrach wstępnie podgrzanego buforu elucyjnego. Natychmiast przenieś kulki do wstępnie podgrzanej probówki PCR i inkubuj przez 30 sekund w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Natychmiast dodaj 12 mikrolitrów pięciomolowego chlorku sodu i energicznie pipetuj w górę iw dół 20 do 30 razy. Połączenie wysokiej zawartości soli i ATP zawartych w buforze elucyjnym służy do elucji rekombinowanego G4R1 z kulek G4. Natychmiast otocz G4 SPB za pomocą magnesu i przenieś białko zawierające elucję do świeżej probówki PCR na lodzie.

Po powtórzeniu elucji i przeniesieniu produktem końcowym jest około 200 mikrolitrów buforu elucyjnego zawierającego oczyszczony rekombinowany G4R1. Na koniec wykonaj test aktywności enzymatycznej kontroli jakości, aby sprawdzić, czy wysoce aktywny rekombinowany G4R1 został oczyszczony zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Test G4 zapewnia miarę rekombinowanej aktywności enzymatycznej G4R1.

W zakresie od 0,2 do 0,013 mikrolitra w enzymie zwykle obserwuje się, że 50% z 0,2 pikomoli tetracząsteczkowego DNA G4 znakowanego tetrametylorodaminą jest przekształcane w monomery. Pozycja Coomassie oczyszczonego rekombinowanego G4R1 wskazuje na pojedyncze prążki o oczekiwanej wielkości 120 kilodaltonów z niewielkim pasmem zanieczyszczającym o około 75 kilodaltonach. Prążek ten może reprezentować skrócony rekombinowany G4R1, który zachował zdolność do wiązania kulek DNA G4 w elucję w sposób zależny od ATP.

Pasmo zainteresowania określa się ilościowo w stosunku do krzywej wzorcowej białka. W tym protokole zazwyczaj uzyskuje się 200 mikrolitrów od 20 do 100 oczyszczonych enzymów nanomolowych na jeden litr kultury bakterii. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oczyścić białko resolwazy G4 z bakteryjnego systemu ekspresji przy użyciu unikalnego etapu oczyszczania zależnego od ATP, aby wyizolować prawie czysty i katalitycznie aktywny enzym.

Po opanowaniu i uprzednim przygotowaniu zamrożonych granulek bakteryjnych, oczyszczanie rekombinowanego G4R1 można przeprowadzić w ciągu około sześciu godzin. Aby utrzymać optymalną aktywność katalityczną enzymu, ważne jest, aby preparat znajdował się na lodzie, chyba że zaznaczono inaczej. Zawsze stosuj inhibitory proteazy.

Unikaj tworzenia się pęcherzyków w probówkach. Szybko zamrażaj oczyszczony enzym i unikaj niepotrzebnych cykli zamrażania i rozmrażania. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w tej dziedzinie do dokładnego zdefiniowania powinowactwa wiązania i aktywności helikazy tego białka do szerokiego zakresu substratów DNA i RNA.

Metoda ta może być również dostosowana do oczyszczania innych enzymów kwasów nukleinowych zależnych od ATP, dla których produkt reakcji enzymatycznej nie jest już substratem wiążącym enzym.