Name: Badania mikroskopii sił atomowych rozpoznawania zmian DNA w naprawie przez wycinanie nukleotydów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Poznaj mikroskopię sił atomowych do badania rozpoznawania uszkodzeń DNA przez białka naprawcze. Ta metoda pozwala wizualizować kompleksy białkowo-DNA w systemie naprawy przez wycinanie nukleotydów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PUC19N, oligonukleotydy zawierające CPD, oraz p44 zostały uprzejmie dostarczone odpowiednio przez Samuela Wilsona, Korbinian Heila i Thomasa Carella oraz Gudrun Michels i Caroline Kisker. Prace te były wspierane przez dotacje z Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 i TE-671/4 dla IT.

<ol><li>Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+machines+of+DNA+repair%3A+scanning+force+microscopy+analysis+of+their+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture.</a> J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+bending+and+unbending+by+MutS+govern+mismatch+recognition+and+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">DNA bending and unbending by MutS govern mismatch recognition and specificity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14822-14827 (2003).</li>
<li>Tessmer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+MutS+searching+for+DNA+mismatches+and+signaling+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of MutS searching for DNA mismatches and signaling repair.</a> J. Biol. Chem. 283 (52), 36646-36654 (2008).</li>
<li>Wagner, K., Moolenaar, G., van Noort, J., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+reveals+two+separate+DNA-binding+domains+in+the+Escherichia+coli+UvrA+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis reveals two separate DNA-binding domains in the Escherichia coli UvrA dimer.</a> Nucleic Acids Res. 37 (6), 1962-1972 (2009).</li>
<li>Buechner, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+recognition+of+DNA+damages+by+XPD+provides+insights+into+nucleotide+excision+repair+substrate+versatility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Strand-specific recognition of DNA damages by XPD provides insights into nucleotide excision repair substrate versatility.</a> J Biol. Chem. 289 (6), 3613-3624 (2014).</li>
<li>Van der Linden, E., Sanchez, H., Kinoshita, E., Kanaar, R., Wyman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAD50+and+NBS1+form+a+stable+complex+functional+in+DNA+binding+and+tethering%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RAD50 and NBS1 form a stable complex functional in DNA binding and tethering.</a> Nucleic Acids Res. 37 (5), 1580-1588 (2009).</li>
<li>Fuentes-Perez, M. E., Dillingham, M., Moreno-Herrero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM+volumetric+methods+for+the+characterization+of+proteins+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">AFM volumetric methods for the characterization of proteins and nucleic acids.</a> Methods. 60, 113-121 (2013).</li>
<li>Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+binding+of+single-stranded+DNA-binding+protein+to+its+target%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target.</a> Biochemistry. 51, 1500-1509 (2012).</li>
<li>Wirth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+Divergence+in+Nucleotide+Excision+Repair+Lesion+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Conservation and Divergence in Nucleotide Excision Repair Lesion Recognition.</a> J. Biol. Chem. 291 (36), 18932-18946 (2016).</li>
<li>Kuper, J., Kisker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+recognition+in+nucleotide+excision+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Damage recognition in nucleotide excision DNA repair.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 88-93 (2012).</li>
<li>Buechner, C. N., Tessmer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+substrate+preparation+for+atomic+force+microscopy+studies+of+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">DNA substrate preparation for atomic force microscopy studies of protein-DNA interactions.</a> J. Mol. Recognit. 26 (12), 605-617 (2013).</li>
<li>Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+RecG+Helicase+at+the+DNA+Replication+Fork+by+SSB+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein.</a> Sci. Rep. 5, 9625(2015).</li>
<li>Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Crampton, N., Kirkham, J., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+studies+of+DNA+transcription+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule studies of DNA transcription using atomic force microscopy.</a> Phys. Biol. 9 (2), 021001(2012).</li>
<li>Maurer, S., Fritz, J., Muskhelishvili, G., Travers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+and+an+activator+form+discrete+subcomplexes+in+a+transcription+initiation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase and an activator form discrete subcomplexes in a transcription initiation complex.</a> EMBO J. 25 (16), 3784-3790 (2006).</li>
<li>Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. 1, 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).</li>
<li>Theis, K., Chen, P. J., Skorvaga, M., Van Houten, B., Kisker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+UvrB%2C+a+DNA+helicase+adapted+for+nucleotide+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of UvrB, a DNA helicase adapted for nucleotide excision repair.</a> EMBO J. 18 (24), 6899-6907 (1999).</li>
<li>Kuper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+TFIIH%2C+XPD+helicase+is+exclusively+devoted+to+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">In TFIIH, XPD helicase is exclusively devoted to DNA repair.</a> PLoS Biol. 12 (9), e1001954(2014).</li>
<li>Shlyakhtenko, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silatrane-based+surface+chemistry+for+immobilization+of+DNA%2C+protein-DNA+complexes+and+other+biological+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, protein-DNA complexes and other biological materials.</a> Ultramicroscopy. 97, 279-287 (2003).</li>
<li>Roth, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XPB+helicase+regulates+DNA+incision+by+the+Thermoplasma+acidophilum+endonuclease+Bax1%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">XPB helicase regulates DNA incision by the Thermoplasma acidophilum endonuclease Bax1.</a> DNA Repair. 11 (3), 286-293 (2012).</li>
<li>Ratcliff, G. C., Erie, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Single-Molecule+Study+to+Determine+Protein-Protein+Association+Constants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A Novel Single-Molecule Study to Determine Protein-Protein Association Constants.</a> J. Am. Chem. Soc. 123 (24), 5632-5635 (2001).</li>
<li>Yang, Y., Sass, L. E., Du, C., Hsieh, P., Erie, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+protein-DNA+binding+constants+and+specificities+from+statistical+analyses+of+single+molecules%3A+MutS-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions.</a> Nucleic Acids Res. 33 (13), 4322-4334 (2005).</li>
<li>Caron, P. R., Grossman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+a+cryptic+ATPase+activity+of+UvrB+and+its+proteolysis+product%2C+UvrB%2A+in+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of a cryptic ATPase activity of UvrB and its proteolysis product, UvrB* in DNA repair.</a> Nucleic Acids Res. 16 (22), 10891-10902 (1988).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UvrB+domain+4%2C+an+autoinhibitory+gate+for+regulation+of+DNA+binding+and+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">UvrB domain 4, an autoinhibitory gate for regulation of DNA binding and ATPase activity.</a> J. Biol. Chem. 281 (22), 15227-15237 (2006).</li>
<li>Chammas, O., Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+DNA+loops+as+fiducial+markers+for+exploring+DNA-protein+interactions+in+single+molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-stranded DNA loops as fiducial markers for exploring DNA-protein interactions in single molecule imaging.</a> Methods. 60 (2), 122-130 (2013).</li>
<li>Truglio, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+DNA+recognition+and+processing+by+UvrB%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for DNA recognition and processing by UvrB.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (4), 360-364 (2006).</li>
<li>Kuper, J., Wolski, S. C., Michels, G., Kisker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+studies+of+the+nucleotide+excision+repair+helicase+XPD+suggest+a+polarity+for+DNA+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Functional and structural studies of the nucleotide excision repair helicase XPD suggest a polarity for DNA translocation.</a> EMBO J. 31 (2), 494-502 (2012).</li>
<li>Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+two+UvrB+subunits+in+the+UvrAB+complex+ensures+damage+detection+in+both+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The presence of two UvrB subunits in the UvrAB complex ensures damage detection in both DNA strands.</a> EMBO J. 21 (15), 4196-4205 (2002).</li>
<li>Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+nucleotide+excision+repair+complexes%3A+DNA+is+wrapped+by+UvrB+before+and+after+damage+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition.</a> EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).</li>
<li>Moolenaar, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+ATP+Binding+and+Hydrolysis+by+UvrB+during+Nucleotide+Excision+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair.</a> J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Analizy statystyczne AFM pozycji wiązania białek na długich fragmentach DNA, które zawierają określone miejsca docelowe, mogą ujawnić interesujące szczegóły dotyczące konkretnych strategii stosowanych przez białko w celu rozpoznania tych miejsc 2,3,4,5,6. Aby zinterpretować wynikowe rozkłady pozycji, pozycje celów w DNA muszą być dokładnie znane. Osiąga się to...

Mikroskopia sił atomowych (AFM) to potężna technika analizy interakcji białko-DNA1,2,3,4,5,6,7,8,9. Wymaga tylko niewielkich ilości materiału próbki, aby bezpośrednio uwidocznić niejednorodne próbki z rozdzielczością na poziomie pojedynczej cząsteczki. Niejednorodność może wynikać z różnych stanów konformacyjnych lub oligomerycznych białka. W szczególności, w kontekście próbek białko-DNA, kompleksy białkowe mogą wykazywać różne stechiometrie i/lub konformacje indukowane przez wiązanie DNA w ogóle lub wiązanie się z określonym miejscem docelowym w DNA. Próbki heterogeniczne mogą również zawierać dwa (lub więcej) różnych rodzajów białek, a różne formy kompleksów białkowych (np. składające się tylko z jednego rodzaju białka w porównaniu z kompleksami heteromerycznymi) mogą w różny sposób oddziaływać z DNA. Omawiane tutaj badania wykorzystują obrazowanie AFM w powietrzu na statycznych, wysuszonych próbkach białek naprawy DNA związanych z długimi (~900 par zasad, bp) fragmentami DNA, które zawierają zmianę, która stanowi cel tych białek. Wysoka, molekularna rozdzielczość AFM pozwala na rozróżnienie różnych typów kompleksów białkowych i określenie pozycji wiązania białek na fragmentach DNA. Co ważne, zmiany są wprowadzane do substratów DNA w ściśle określonych pozycjach. Ponieważ położenie miejsca zmiany w DNA jest znane, rozkłady białek związanych na DNA zapewniają wgląd w (różne) właściwości rozpoznawania zmian (różnych) kompleksów białkowych, np. jak dobrze rozpoznają one określony typ zmiany (w porównaniu z nieuszkodzonym DNA)2,3,4,5,6. Ich położenie w DNA pozwala również na rozróżnienie między kompleksami białkowymi związanymi specyficznie w zmianach chorobowych a kompleksami związanymi niespecyficznie w innym miejscu DNA. Oddzielna charakterystyka tych różnych typów kompleksów (kompleksy związane specyficznie w zmianie w porównaniu z kompleksami niespecyficznymi) może ujawnić potencjalne zmiany konformacyjne w kompleksach wywołane po identyfikacji miejsca docelowego.
Białka naprawy DNA, na których się tutaj skupiamy, to helikazy, które są odpowiedzialne za rozpoznawanie zmian w szlaku naprawy przez wycinanie nukleotydów (NER). U bakterii NER jest osiągany przez białka UvrA, UvrB i UvrC. UvrA jest odpowiedzialny za początkowe wykrywanie zmian w kompleksie skanowania DNA UvaA2 / UvrB2. Po weryfikacji zmiany przez UvrB kompleks ten przekształca się w monomeryczny UvrB związany w miejscu uszkodzenia, a ten specyficzny kompleks może następnie rekrutować prokariotyczną endonukleazę NER UvrC. UvrC wycina krótki (12-13 nt) odcinek jednoniciowego DNA (ssDNA) zawierającego zmianę. Brakujący odcinek jest następnie uzupełniany przez polimerazę DNA. Na koniec ligaza DNA uszczelnia nowo zsyntetyzowany odcinek za pomocą oryginalnego DNA9,10. U eukariontów większość białek kaskady NER jest częścią dużego, multimerycznego kompleksu czynnika transkrypcyjnego II H (TFIIH). Po wstępnym wykryciu zmiany chorobowej za pomocą trimerycznego kompleksu CEN2-XPC-HR23B, TFIIH jest rekrutowany do miejsca docelowego DNA. Gdy XPD w kompleksie weryfikuje obecność docelowej zmiany NER, eukariotyczne endonukleazy NER XPG i XPF są rekrutowane w celu wycięcia krótkiego (24-32 nt) odcinka ssDNA zawierającego lesion9,10. W szczególności badano helikazy UvrB i XPD odpowiednio z prokariotycznego i eukariotycznego NER. Te helikazy wymagają niesparowanego regionu w DNA (pęcherzyka DNA), aby nawlec się na jedną z dwóch pojedynczych nici DNA, a następnie przemieścić się wzdłuż tej nici napędzanej hydrolizą ATP. Oprócz uszkodzeń DNA, w substratach wprowadzono pęcherzyk DNA, który pełni funkcję miejsca ładowania białek.
Procedura przygotowania specyficznych substratów DNA została opisana wcześniej11. Wymaga kolistego konstruktu DNA (plazmidu) z dwoma blisko rozmieszczonymi miejscami restrykcyjnymi dla nickazy. W kontekście tego badania wykorzystano plazmid pUC19N (2729 pz) (stworzony przez laboratorium S. Wilsona, NIEHS). Ten plazmid zawiera trzy blisko rozmieszczone miejsca restrykcyjne dla nickazy Nt.BstNBI, które otaczają odcinek 48 nukleotydów (nt). Po inkubacji z nickazą, odcinek ssDNA między tymi miejscami może zostać usunięty i zastąpiony oligonukleotydem zawierającym dowolną cechę docelową. Po każdym etapie testuje się pełne trawienie enzymatyczne za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Nacięte koliste DNA można odróżnić ze względu na jego niższą ruchliwość elektroforetyczną w porównaniu z oryginalnym superskręconym plazmidem. Luki w DNA i zastąpienie usuniętego odcinka specyficznym substratem oligonukleotydem można ocenić poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym, który nacina substrat wyłącznie w obszarze między nacięciami. Linearyzacja kolistego plazmidu przez enzym zostanie zatem stłumiona dla DNA z przerwami i przywrócona po wstawieniu określonego oligonukleotydu. Wreszcie, dwa miejsca restrykcyjne endonukleazy (najlepiej pojedyncze frezy) pozwalają na wytworzenie liniowego substratu DNA, o pożądanej długości i z określonym miejscem docelowym w określonej pozycji, a także pęcherzyka DNA w pewnej odległości od zmiany w kierunku 5' lub 3'.
Rozpoznawanie zmian chorobowych przez helikazy NER może być badane za pomocą obrazowania AFM. Zatrzymana translokacja DNA helikaz w miejscu zmiany jest widoczna jako pik w rozkładzie położenia białka w DNA i wskazuje na rozpoznanie zmiany. Ponieważ translokacja DNA tych helikaz jest ponadto kierunkowa, z polaryzacją od 5' do 3', zależność rozpoznania zmiany od położenia miejsca załadunku (pęcherzyk DNA przed lub za zmianą) wskazuje również, czy zmiana jest preferencyjnie rozpoznawana na translokowanej, czy na przeciwnej, nietranslokowanej nici ssDNA5,9. W kolejnych rozdziałach zostaną przedstawione stosowane metody i pokrótce omówione zostaną główne wyniki tych eksperymentów. Co ważne, analogicznie do pokazanej tutaj przykładowej pracy nad naprawą DNA, obrazowanie AFM można zastosować do badania różnych systemów oddziałujących na DNA, takich jak replikacja DNA lub transkrypcja8,12,13,14.

<table><tbody><tr><td>Sonda siły molekularnej (MFP) 3D</td><td>Asylum Research</td><td>N/A mikroskop</td><td>sił atomowych (AFM)</td></tr><tr><td>Precision 390</td><td>DELL</td><td>N/A</td><td>komputerowy</td></tr><tr><td>ThermoMixer i blok 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>blok grzewczy do przygotowania DNA</td></tr><tr><td>Rotilabo Block-Heater H 250 i bloki do probówek 0,5 mL</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>Y264.1 & Blok grzewczy Y267.1</td><td>do inkubacji białek-DNA</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>1704467</td><td>komora do elektroforezy z odlewem żelowym i zasilaczem</td></tr><tr><td>Power Pac Basic</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>Zasilacz do</td><td>elektroforezy</td>1645050</tr><tr><td>Centifuge 5415 D z wirnikiem</td><td>Eppendorf</td><td>2262120-3</td> wirówka <td>stołowa</td></tr><tr><td>Ultra-Lum elektroniczna UV transillumonator MEB-15</td><td>Ultralum</td><td>900-1322-02</td><td>Stół do naświetlania UV</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000</td><td>VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH</td><td>N/A</td><td>Spektrofotometr</td></tr><tr><td>UV TKAX-CAD z 0,2 &mu; m filtr kapsułkowy</td><td>Unity Lab Services</td><td>N/A</td><td>jednostka dejonizacyjno-filtrująca wodę</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP na Igor Pro</td><td>Asylum Research</td><td>N/A</td><td>AFM oprogramowanie</td></tr><tr><td>ImageJ (przetwarzanie obrazów Java o otwartym kodzie źródłowym)</td><td>NIH Image</td><td>N/A</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td></tr><tr><td>Excel (Microsoft Office)</td><td>Microsoft Corporation</td><td>N/A</td><td>oprogramowanie do analizy danych</td></tr><tr><td>Origin9 / Origin2016</td><td>OriginLab Corporation</td><td>N/A</td><td>oprogramowanie do analizy danych statystycznych i wykresów</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Materiał</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OMCL-AC240TS</td><td>Olympus</td><td>OMCL-AC240TS</td><td>Wsporniki AFM</td></tr><tr><td>klasa V-5 moskiewskie</td><td>SPI Supplies</td><td>1805</td><td>arkuszy miki</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0,5 ml 50k Ultracell Millipore</td><td>Ireland Ltd.</td><td>UFC505096</td><td>filtry wirówkowe</td></tr><tr><td>NucleoSpin Extract II&nbsp;</td><td>&nbsp; Macherey-Nagel GmbH</td><td>740 609.250</td><td>Zestaw do ekstrakcji żelu agarozowego</td></tr><tr><td>Papier celulozowy Rotilabo typ 111A</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>AP59.1</td><td>Bibuła do osadzania AFM</td></tr><tr><td>Anatop 25 (0,02 &mu; m)</td> <td>Whatman GmbH</td><td>6809-2102</td><td>filtr strzykawkowy</td></tr><tr><td>SSpI, BspQI</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>R0132, R0712</td><td>enzymy restrykcyjne do przygotowania substratu DNA</td></tr><tr><td>XhoI, BglII</td><td></td><td>R0146, R0144</td><td>enzymy restrykcyjne do przygotowania DNA kontrolują</td></tr><tr><td>enzym ograniczający nacinanie Nt.BstNBI</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>R0607</td><td>ligaza</td></tr> <tr><td></td><td>DNA nickazy T4New England Biolabs (NEB)</td><td>M0202S</td><td>Ligase</td></tr><tr><td>Tris, HEPES</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4855, 9105</td><td>chemikalia buforowe</td></tr><tr><td>NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3957, HN03, HN02, P026</td><td>chemikalia solne</td></tr><tr><td>NaAc</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td><td>32318</td><td>chemikalia solne</td></tr><tr><td>DTT, TCEP, EDTA</td><td></td><td>6908, HN95, 8040</td><td>chemikalia/ </td></tr><tr><td>odczynniki agaroza, kwas octowy, HCl</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>2267, 3738, odczynniki K025</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>K054</td><td>nukleotydy</td></tr><tr><td>oligonukleotyd #1 w tabeli 1</td><td>Biomery</td><td>niestandardowe</td><td>komplementarne oligonukleotydy oligonukleotydowe DNA</td></tr><tr><td>#2, #3 i #6 w tabeli 1</td><td>Zintegrowane technologie DNA (IDT)</td><td>niestandardowe</td><td>fluoresceiny zawierające oligonukleotydy</td></tr><tr><td>oligonukleotydy #4&nbsp; i #5 w Tabeli 1</td><td>prywatne (dostępne np. w TriLink lub GlenResearch)</td><td></td><td>CPD zawierające oligonukleotydy</td></tr><tr><td>Probówka reakcyjna SafeSeal 0,5 ml i 1,5 ml</td><td>Probówki inkubacyjne</td><td>Sarstedt</td><td>72.704 i 72.706</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td>drabinka DNA</td></tr><tr><td>6x koncentrat żel ładowanie barwnik</td><td>fioletowy Nowość England Biolabs (NEB)</td><td>51406</td><td>Barwnik ładujący DNA</td></tr><tr><td>Midori Green&nbsp;</td><td>Nippon Genetics Europe GmbH</td><td>999MG28055</td><td>Barwienie DNA</td></tr></tbody></table>

badania mikroskopii sił atomowych rozpoznawania zmian dna w naprawie przez wycinanie nukleotydów

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

Obrazowanie AFM jest potężną techniką do badania interakcji białko-DNA. Ta metoda jednocząsteczkowa pozwala na jednoczesną rozdzielczość różnych cząsteczek i zespołów molekularnych w niejednorodnej próbce. W szczególnym kontekście systemów białkowych oddziałujących z DNA można zatem rozróżnić różne formy kompleksów białkowych i odpowiadające im pozycje wiązania w miejscach docelowych zawierających fragmenty DNA. W artykule przedstawiono zastosowanie AFM do badania rozpoznawania zmian DNA w systemach naprawy DNA z wycinaniem nukleotydów prokariotycznych i eukariotycznych (NER). Opisano procedury przygotowania próbek DNA i białek oraz podano szczegóły eksperymentalne i analityczne eksperymentów. Dane te pozwalają na wyciągnięcie ważnych wniosków na temat strategii, za pomocą których białka NER mogą przeprowadzić weryfikację miejsca docelowego. Co ciekawe, wskazują one na różne podejścia do rozpoznawania i identyfikacji zmian chorobowych dla eukariotycznego układu NER, w zależności od rodzaju zmiany. Co więcej, odmienne właściwości strukturalne dwóch różnych helikaz zaangażowanych w prokariotyczny i eukariotyczny NER skutkują i wyjaśniają różne strategie obserwowane dla tych dwóch układów. Co ważne, te eksperymentalne i analityczne podejścia można zastosować nie tylko do badania naprawy DNA, ale także do innych systemów białkowych oddziałujących z DNA, takich jak te zaangażowane w procesy replikacji lub transkrypcji.

Rozróżnianie różnych typów kompleksów na podstawie objętości kompleksów białkowych
Aktywność helikazy prokariotycznej helikazy NER UvrB jest stymulowana przez wiązanie DNA22,23. UvrB wymaga niesparowanego regionu w DNA (pęcherzyka DNA) w celu prawidłowego załadowania na jedną z dwóch pojedynczych nici ssDNA. In vivo ta struktura DNA jest zapewniana przez interakcje...

Tutaj pokazano badanie różnych podejść do rozpoznawania zmian DNA za pomocą obrazowania AFM pojedynczej cząsteczki na przykładzie systemu naprawy wycinania nukleotydów. Opisano procedury przygotowania próbek DNA i białek oraz szczegóły doświadczalne i analityczne dla doświadczeń AFM.

Badania mikroskopii sił atomowych rozpoznawania zmian DNA w naprawie przez wycinanie nukleotydów

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

Ogólnym celem tego eksperymentu z mikroskopią sił atomowych jest rozwiązanie interakcji białek naprawy DNA z miejscami uszkodzenia w DNA oraz rozróżnienie między różnymi interakcjami DNA przez różne kompleksy białkowe. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie naprawy DNA, takie jak to, w jaki sposób konkretny system naprawy DNA osiąga rozpoznanie docelowych zmian w DNA. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy bezpośrednio zobaczyć i przeanalizować różne typy kompleksów, które biorą udział w procesie rozpoznawania zmian w DNA.Procedurę zademonstruje Nicolas Wirth, który zastosował to podejście podczas swoich badań licencjackich. Na początek przygotuj odpowiedni substrat DNA, generując jednoniciową lukę DNA w plazmidzie. Uzupełnij lukę zmodyfikowanymi, jednoniciowymi oligonukleotydami DNA, a na koniec zlinearyzuj DNA osocza za pomocą odpowiednich enzymów restrykcyjnych.W tych eksperymentach dwuniciowe substraty DNA mają długość około 1000 par zasad i zawierają uszkodzenie DNA, a także niesparowany region zwany pęcherzykiem DNA do ładowania białka do DNA. Następnie przygotuj próbkę DNA białka do analizy AFM, najpierw pipetując 10-krotny bufor reakcyjny i wodę do probówki mikroreakcyjnej. Następnie dodaj badane DNA i białka.Na przykład w tym przypadku 100 nanomolów próbki DNA i jeden mikromolowiec lub każde z białek naprawczych wycinania nukleotydów eukariotycznych XPD i p44. Następnie inkubuj reakcję przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w bloku grzewczym. Po inkubacji należy na krótko odwirować próbkę.Następnie przygotuj podłoże z miki, na którym umieścisz próbkę. Użyj skalpela, aby wyciąć kawałek miki o wymiarach jeden centymetr na jeden centymetr z większego paska. Następnie użyj kawałka taśmy klejącej, aby usunąć górne warstwy miki, aby odsłonić czystą, płaską, anatomicznie gładką powierzchnię podłoża.Rozszerz próbkę DNA białka od pięćdziesięciu do stu razy w buforze do osadzania AFM i natychmiast umieść 20 mikrolitrów rozcieńczonej próbki na powierzchni miki. Współczynnik rozcieńczenia zależy od stężenia próbki. Natychmiast po osadzeniu próbki na powierzchni miki należy ją przepłukać trzy do czterech razy kilkoma mililitrami przefiltrowanej, zdejonizowanej wody i zetrzeć nadmiar płynu.Użyj delikatnego strumienia azotu, aby wysuszyć próbkę suszarką. Na koniec użyj taśmy klejącej, aby przymocować próbkę na jej krawędziach do szkiełka mikroskopowego. Umieść próbkę na środku stolika AFM i użyj podkładek magnetycznych, aby przymocować szkiełko mikroskopowe do stolika.Następnie włóż końcówkę AFM do uchwytu końcówki. Zamocuj końcówkę w uchwycie pod zaciskiem, dokręcając tak, aby była dokręcona palcami. Po zabezpieczeniu wprowadź uchwyt końcówki do głowicy pomiarowej AFM.Użyj pozycjonujących, aby przesunąć próbkę w pozycji środkowej. Umieść głowicę pomiarową AFM na górze próbki, upewniając się, że głowica stoi stabilnie z nogami wewnątrz wgłębień stopnia. Następnie ustaw laser AFM z tyłu wspornika, aby uzyskać optymalną siłę sygnału.Obserwuj sygnał odbicia w oknie wideo AFM, aby z grubsza ustawić laser. W przypadku tego modelu AFM obróć koła po prawej stronie i z tyłu głowicy pomiarowej AFM, aby wyregulować pozycje X i Y lasera AFM, aby skierować go centralnie na koniec wspornika. Następnie zoptymalizuj sygnał sumy detektora, dostrajając położenie lasera za pomocą dwóch kół.Skieruj odbicie lasera AFM na środek detektora, zerując różny sygnał z górnej i dolnej diody układu detektora. W tym kroku przekręć po lewej stronie głowicy pomiarowej dla tego modelu AFM. Następnie określ częstotliwość przebywania wspornika, przechodząc do okna strojenia panelu głównego w oprogramowaniu.Wybierz amplitudę odpowiadającą wejściu jednowoltowemu dla piezoelektrycznego, który napędza oscylację wspornika, a następnie ustaw częstotliwość oscylacji na minus 5%nieco niższą niż częstotliwość przebywania. Teraz wykonaj automatyczne dostrojenie częstotliwości i wyzeruj fazę oscylacji. Pozostaw system do osiągnięcia równowagi termicznej na około godzinę przed rozpoczęciem obrazowania, aby uniknąć dryftu.Gdy wszystko będzie gotowe do rozpoczęcia obrazowania, w panelu głównym oprogramowania ustaw nastawę ochrony i przygotuj się do zbliżenia końcówki do powierzchni próbki, wybierając opcję włącz. Ręcznie opuść przednie koło głowicy AFM, aż do osiągnięcia ustawienia ochronnego lub wartości zadanej. Następnie ostrożnie opuść przednie koło jeszcze bardziej, aż sygnał czujnika Z zostanie całkowicie rozszerzony w lewo.Aktywuj stół oscylacyjny drgań i zamknij obudowę izolacji akustycznej. Następnie obniż wartość zadaną w oprogramowaniu AFM za pomocą koła chomika, aby dokładnie połączyć końcówkę AFM z próbką. Aby wykonać obrazowanie w trybie podsłuchu w reżimie odpychającym, należy obniżyć wartość zadaną, aż sygnał fazowy stanie się nieco niższy niż faza swobodnego poziomu.Następnie rozpocznij skanowanie próbki. Użyj prędkości skanowania 2,5 mikrometra na sekundę w obszarach powierzchni obrazu o wymiarach cztery mikrometry na cztery mikrometry lub osiem mikrometrów na osiem mikrometrów kwadratowych o rozdzielczości pikseli odpowiednio 2, 048 lub 4 096; i naciśnij przycisk Do Scan (Wykonaj skanowanie). Wstępna selekcja odpowiednich kompleksów białkowych DNA poprzez bezpośrednią kontrolę wzrokową obrazów w oprogramowaniu AFM.W przypadku próbek XPD możliwe kompleksy obejmują DNA XPD p44, a także DNA XPD i DNA p44 o wyraźnie różnych rozmiarach ze względu na różne masy cząsteczkowe XPD i p44. Zmierz objętość poszczególnych pików białkowych w DNA za pomocą narzędzia sekcji w oknie analizy, aby zmierzyć wysokość i średnicę odcinków pików białkowych za pomocą kursorów okna sekcji. Użyj tych wartości, aby określić objętość pików przy użyciu prostych modeli matematycznych w celu zweryfikowania typu złożonego.Na koniec skalibruj swój system AFM z szeregiem białek o znanych masach cząsteczkowych, aby przetłumaczyć te objętości na przybliżone masy cząsteczkowe białek i kompleksów białkowych. W celu określenia dodatkowych cech, takich jak długości fragmentów DNA, położenie kompleksów białkowych na DNA i ich specyficzność w miejscu docelowym lub kąty pasm DNA, należy zapoznać się z dołączonym protokołem tekstowym. Pokazany tutaj jest obraz AFM z trzema różnymi typami kompleksów związanych z DNA, które można rozróżnić na podstawie ich różnych rozmiarów.Kompleksy klasy pierwszej są zgodne tylko z kofaktorem aktywującym helikazę p44, kompleksy klasy drugiej składają się tylko z białka XPD, a kompleksy klasy trzeciej składają się zarówno z XPD, jak i p44, ponieważ rozpoznanie legionu przez XPD wymaga aktywacji jego aktywności helikazy przez p44 i tylko kompleksy klasy trzeciej wykazują rozpoznawanie zmian. W celu zidentyfikowania różnych strategii rozpoznawania zmian chorobowych, położenia białek na substratach DNA zmierzono pod kątem obciążenia białkami w pęcherzyku DNA w pięciu pierwszych lub trzech głównych kierunkach od zmiany DNA pokazanej na czerwono dla prokariotycznych i eukariotycznych helikaz NER. W rozkładach pozycji białek rozpoznawanie zmian w DNA może być postrzegane jako szczyt ze względu na zwiększone wiązanie w pozycji zmiany DNA.Prokariotyczna helikaza NER UVRB i jej eukariotyczny odpowiednik, XPD, wykazują różne strategie rozpoznawania zmian CPD, które wskazują na różne preferencje nici DNA. W szczególności zmiany CPD są rozpoznawane na translokowanej nici przez UVRB, ale preferencyjnie na przeciwnej, nietranslokowanej nici przez XPD. Po opanowaniu tej metody można ją wykonać w ciągu kilku godzin lub dni, łącznie z analizą.Ważne jest, aby pracować z próbkami białek i DNA o wysokiej czystości, aby móc interpretować cechy na obrazach AFM i starannie zaprojektować substrat DNA w zależności od systemu biologicznego i pytania, na które chcesz odpowiedzieć. Ponadto metody zespołowe, takie jak przestrzeń elektroforezy żelowej, przesunięcie elektromobilności lub testy nacięcia DNA, są oczywiście wysoce komplementarne z tymi eksperymentami AFM; Metody te mogą pomóc w rozwiązaniu dodatkowych pytań, takich jak powinowactwo wiązania DNA lub działania związane z wycinaniem zmian w DNA. Technika ta jest stosunkowo szybkim i prostym podejściem do bezpośredniej wizualizacji kompleksów białkowych DNA, a kompleksy te dają nam dobry obraz procesów zachodzących w systemie biologicznym.Oczywiście jest to nie tylko przydatne w zrozumieniu procesów naprawy DNA, ale może być również zastosowane do innych systemów białkowych DNA. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć całkiem niezłe pojęcie o tym, jak przygotować próbkę na swoim ulubionym białkowym systemie DNA, jak zobrazować ją za pomocą AFM i jak wyodrębnić przydatne parametry do interpretacji swoich danych.

atomic-force-microscopy-investigations-dna-lesion-recognition

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W tym filmie opisujemy metodę immunofluorescencji, aby zobrazować lokalizację białek naprawy DNA γH2AX i 53BP1 w miejscach pęknięć dwuniciowego DNA w napromieniowanych jądrach komórkowych.

Oparta na immunofluorescencji wizualizacja interakcji białek naprawy DNA

Obrazowanie spektroskopowe elektronów może obrazować i odróżniać kwas nukleinowy od białka z rozdzielczością nanometrów. Można go połączyć z systemem miniSOG, który jest w stanie specyficznie znakować znakowane białka w próbkach z transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Zastosowanie tych technologii ilustrujemy na przykładzie dwuniciowych ognisk naprawy pęknięć.

Wizualizacja białek naprawczych DNA oznaczonych tagami miniSOG w połączeniu z obrazowaniem spektroskopowym elektronów (ESI)

Lasery są często używane w badaniach nad odpowiedzią komórkową na uszkodzenie DNA. Generują jednak zmiany, których odstępy, częstotliwość i kolizje z widełkami replikacyjnymi są rzadko charakteryzowane. W tym miejscu opisujemy podejście, które umożliwia określenie tych parametrów za pomocą laserowo zlokalizowanych wiązań międzypasmowych.

Analiza pojedynczych cząsteczek zlokalizowanych laserowo adduktów psoralenu

Mikronaświetlanie laserowe jest użytecznym narzędziem do badań nad naprawą DNA w żywych komórkach. Przedstawiono metodologiczne podejście do stosowania laserów UVA do wywoływania różnych zmian w DNA. Zoptymalizowaliśmy metodę miejscowego mikronapromieniowania, która utrzymuje normalny cykl komórkowy; W ten sposób napromieniowane komórki przechodzą przez mitozę.

Zaawansowane techniki mikroskopii konfokalnej do badania interakcji białko-białko i kinetyki zmian w DNA

Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna i mikropromieniowanie laserowe oferują narzędzia do indukowania uszkodzeń DNA i monitorowania odpowiedzi białek naprawy DNA w wybranych obszarach subjądrowych. Technika ta znacznie poszerzyła naszą wiedzę na temat wykrywania uszkodzeń, sygnalizacji i rekrutacji. Niniejszy manuskrypt demonstruje te technologie do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych.

Zastosowanie mikronapromieniania laserowego do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych w komórkach ssaków

Badanie kinetyki naprawy uszkodzeń DNA wymaga systemu do wywoływania uszkodzeń w określonych regionach subjądrowych. Opisujemy metodę tworzenia zlokalizowanych dwuniciowych pęknięć za pomocą laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser 405 nm i zapewniamy zautomatyzowane procedury ilościowego określania dynamiki czynników naprawczych w tych zmianach.

Badanie rekrutacji białek do zmian DNA za pomocą mikropromieniowania laserowego 405 nm

Naprawa pęknięć dwuniciowego DNA jest procesem dynamicznym, wymagającym nie tylko tworzenia kompleksów naprawczych w miejscach pęknięć, ale także ich rozwiązania po usunięciu zmiany. W tym przypadku używamy mikroskopii immunofluorescencyjnej do przejściowych i długotrwałych pęknięć dwuniciowych jako narzędzia do analizy tego mechanizmu utrzymania genomu.

Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

Po uszkodzeniu DNA, ludzkie komórki aktywują niezbędne szlaki naprawcze, aby przywrócić integralność swojego genomu. W tym miejscu opisujemy metodę immunofluorescencji pośredniej jako sposób na wykrycie białek naprawy DNA, analizę ich przestrzennej i czasowej rekrutacji oraz pomoc w badaniu interakcji białko-białko w miejscach uszkodzenia DNA.

Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

Ten protokół opisuje nieinwazyjną metodę efektywnej identyfikacji komórek fazy S do dalszych badań mikroskopowych, takich jak pomiar rekrutacji białka naprawczego DNA za pomocą mikronapromieniowania laserowego.

Mikronaświetlanie laserowe do badania rekrutacji DNA w fazie S

Ta praca przedstawia prostą i wizualną metodę wykrywania polimorfizmów wielonukleotydowych na pneumatycznej platformie do manipulacji kropelkami. Dzięki proponowanej metodzie cały eksperyment, w tym manipulacja kropelkami i wykrywanie polimorfizmów wielonukleotydowych, może być przeprowadzony w temperaturze około 23 °C bez pomocy zaawansowanych urządzeń.

Wizualna detekcja kolorymetryczna polimorfizmów wielonukleotydowych na pneumatycznej platformie do manipulacji kropelkami

Poznaj mikroskopię sił atomowych do badania rozpoznawania uszkodzeń DNA przez białka naprawcze. Ta metoda pozwala wizualizować kompleksy białkowo-DNA w systemie naprawy przez wycinanie nukleotydów.

Badania mikroskopii sił atomowych rozpoznawania zmian DNA w naprawie przez wycinanie nukleotydów

Przeglądaj więcej filmów