Badania mikroskopii sił atomowych rozpoznawania zmian DNA w naprawie przez wycinanie nukleotydów
24 maja 2017
Tutaj pokazano badanie różnych podejść do rozpoznawania zmian DNA za pomocą obrazowania AFM pojedynczej cząsteczki na przykładzie systemu naprawy wycinania nukleotydów. Opisano procedury przygotowania próbek DNA i białek oraz szczegóły doświadczalne i analityczne dla doświadczeń AFM.
Ogólnym celem tego eksperymentu z mikroskopią sił atomowych jest rozwiązanie interakcji białek naprawy DNA z miejscami uszkodzenia w DNA oraz rozróżnienie między różnymi interakcjami DNA przez różne kompleksy białkowe. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie naprawy DNA, takie jak to, w jaki sposób konkretny system naprawy DNA osiąga rozpoznanie docelowych zmian w DNA. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy bezpośrednio zobaczyć i przeanalizować różne typy kompleksów, które biorą udział w procesie rozpoznawania zmian w DNA.
Procedurę zademonstruje Nicolas Wirth, który zastosował to podejście podczas swoich badań licencjackich. Na początek przygotuj odpowiedni substrat DNA, generując jednoniciową lukę DNA w plazmidzie. Uzupełnij lukę zmodyfikowanymi, jednoniciowymi oligonukleotydami DNA, a na koniec zlinearyzuj DNA osocza za pomocą odpowiednich enzymów restrykcyjnych.
W tych eksperymentach dwuniciowe substraty DNA mają długość około 1000 par zasad i zawierają uszkodzenie DNA, a także niesparowany region zwany pęcherzykiem DNA do ładowania białka do DNA. Następnie przygotuj próbkę DNA białka do analizy AFM, najpierw pipetując 10-krotny bufor reakcyjny i wodę do probówki mikroreakcyjnej. Następnie dodaj badane DNA i białka.
Na przykład w tym przypadku 100 nanomolów próbki DNA i jeden mikromolowiec lub każde z białek naprawczych wycinania nukleotydów eukariotycznych XPD i p44. Następnie inkubuj reakcję przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w bloku grzewczym. Po inkubacji należy na krótko odwirować próbkę.
Następnie przygotuj podłoże z miki, na którym umieścisz próbkę. Użyj skalpela, aby wyciąć kawałek miki o wymiarach jeden centymetr na jeden centymetr z większego paska. Następnie użyj kawałka taśmy klejącej, aby usunąć górne warstwy miki, aby odsłonić czystą, płaską, anatomicznie gładką powierzchnię podłoża.
Rozszerz próbkę DNA białka od pięćdziesięciu do stu razy w buforze do osadzania AFM i natychmiast umieść 20 mikrolitrów rozcieńczonej próbki na powierzchni miki. Współczynnik rozcieńczenia zależy od stężenia próbki. Natychmiast po osadzeniu próbki na powierzchni miki należy ją przepłukać trzy do czterech razy kilkoma mililitrami przefiltrowanej, zdejonizowanej wody i zetrzeć nadmiar płynu.
Użyj delikatnego strumienia azotu, aby wysuszyć próbkę suszarką. Na koniec użyj taśmy klejącej, aby przymocować próbkę na jej krawędziach do szkiełka mikroskopowego. Umieść próbkę na środku stolika AFM i użyj podkładek magnetycznych, aby przymocować szkiełko mikroskopowe do stolika.
Następnie włóż końcówkę AFM do uchwytu końcówki. Zamocuj końcówkę w uchwycie pod zaciskiem, dokręcając tak, aby była dokręcona palcami. Po zabezpieczeniu wprowadź uchwyt końcówki do głowicy pomiarowej AFM.
Użyj pozycjonujących, aby przesunąć próbkę w pozycji środkowej. Umieść głowicę pomiarową AFM na górze próbki, upewniając się, że głowica stoi stabilnie z nogami wewnątrz wgłębień stopnia. Następnie ustaw laser AFM z tyłu wspornika, aby uzyskać optymalną siłę sygnału.
Obserwuj sygnał odbicia w oknie wideo AFM, aby z grubsza ustawić laser. W przypadku tego modelu AFM obróć koła po prawej stronie i z tyłu głowicy pomiarowej AFM, aby wyregulować pozycje X i Y lasera AFM, aby skierować go centralnie na koniec wspornika. Następnie zoptymalizuj sygnał sumy detektora, dostrajając położenie lasera za pomocą dwóch kół.
Skieruj odbicie lasera AFM na środek detektora, zerując różny sygnał z górnej i dolnej diody układu detektora. W tym kroku przekręć po lewej stronie głowicy pomiarowej dla tego modelu AFM. Następnie określ częstotliwość przebywania wspornika, przechodząc do okna strojenia panelu głównego w oprogramowaniu.
Wybierz amplitudę odpowiadającą wejściu jednowoltowemu dla piezoelektrycznego, który napędza oscylację wspornika, a następnie ustaw częstotliwość oscylacji na minus 5%nieco niższą niż częstotliwość przebywania. Teraz wykonaj automatyczne dostrojenie częstotliwości i wyzeruj fazę oscylacji. Pozostaw system do osiągnięcia równowagi termicznej na około godzinę przed rozpoczęciem obrazowania, aby uniknąć dryftu.
Gdy wszystko będzie gotowe do rozpoczęcia obrazowania, w panelu głównym oprogramowania ustaw nastawę ochrony i przygotuj się do zbliżenia końcówki do powierzchni próbki, wybierając opcję włącz. Ręcznie opuść przednie koło głowicy AFM, aż do osiągnięcia ustawienia ochronnego lub wartości zadanej. Następnie ostrożnie opuść przednie koło jeszcze bardziej, aż sygnał czujnika Z zostanie całkowicie rozszerzony w lewo.
Aktywuj stół oscylacyjny drgań i zamknij obudowę izolacji akustycznej. Następnie obniż wartość zadaną w oprogramowaniu AFM za pomocą koła chomika, aby dokładnie połączyć końcówkę AFM z próbką. Aby wykonać obrazowanie w trybie podsłuchu w reżimie odpychającym, należy obniżyć wartość zadaną, aż sygnał fazowy stanie się nieco niższy niż faza swobodnego poziomu.
Następnie rozpocznij skanowanie próbki. Użyj prędkości skanowania 2,5 mikrometra na sekundę w obszarach powierzchni obrazu o wymiarach cztery mikrometry na cztery mikrometry lub osiem mikrometrów na osiem mikrometrów kwadratowych o rozdzielczości pikseli odpowiednio 2, 048 lub 4 096; i naciśnij przycisk Do Scan (Wykonaj skanowanie). Wstępna selekcja odpowiednich kompleksów białkowych DNA poprzez bezpośrednią kontrolę wzrokową obrazów w oprogramowaniu AFM.
W przypadku próbek XPD możliwe kompleksy obejmują DNA XPD p44, a także DNA XPD i DNA p44 o wyraźnie różnych rozmiarach ze względu na różne masy cząsteczkowe XPD i p44. Zmierz objętość poszczególnych pików białkowych w DNA za pomocą narzędzia sekcji w oknie analizy, aby zmierzyć wysokość i średnicę odcinków pików białkowych za pomocą kursorów okna sekcji. Użyj tych wartości, aby określić objętość pików przy użyciu prostych modeli matematycznych w celu zweryfikowania typu złożonego.
Na koniec skalibruj swój system AFM z szeregiem białek o znanych masach cząsteczkowych, aby przetłumaczyć te objętości na przybliżone masy cząsteczkowe białek i kompleksów białkowych. W celu określenia dodatkowych cech, takich jak długości fragmentów DNA, położenie kompleksów białkowych na DNA i ich specyficzność w miejscu docelowym lub kąty pasm DNA, należy zapoznać się z dołączonym protokołem tekstowym. Pokazany tutaj jest obraz AFM z trzema różnymi typami kompleksów związanych z DNA, które można rozróżnić na podstawie ich różnych rozmiarów.
Kompleksy klasy pierwszej są zgodne tylko z kofaktorem aktywującym helikazę p44, kompleksy klasy drugiej składają się tylko z białka XPD, a kompleksy klasy trzeciej składają się zarówno z XPD, jak i p44, ponieważ rozpoznanie legionu przez XPD wymaga aktywacji jego aktywności helikazy przez p44 i tylko kompleksy klasy trzeciej wykazują rozpoznawanie zmian. W celu zidentyfikowania różnych strategii rozpoznawania zmian chorobowych, położenia białek na substratach DNA zmierzono pod kątem obciążenia białkami w pęcherzyku DNA w pięciu pierwszych lub trzech głównych kierunkach od zmiany DNA pokazanej na czerwono dla prokariotycznych i eukariotycznych helikaz NER. W rozkładach pozycji białek rozpoznawanie zmian w DNA może być postrzegane jako szczyt ze względu na zwiększone wiązanie w pozycji zmiany DNA.
Prokariotyczna helikaza NER UVRB i jej eukariotyczny odpowiednik, XPD, wykazują różne strategie rozpoznawania zmian CPD, które wskazują na różne preferencje nici DNA. W szczególności zmiany CPD są rozpoznawane na translokowanej nici przez UVRB, ale preferencyjnie na przeciwnej, nietranslokowanej nici przez XPD. Po opanowaniu tej metody można ją wykonać w ciągu kilku godzin lub dni, łącznie z analizą.
Ważne jest, aby pracować z próbkami białek i DNA o wysokiej czystości, aby móc interpretować cechy na obrazach AFM i starannie zaprojektować substrat DNA w zależności od systemu biologicznego i pytania, na które chcesz odpowiedzieć. Ponadto metody zespołowe, takie jak przestrzeń elektroforezy żelowej, przesunięcie elektromobilności lub testy nacięcia DNA, są oczywiście wysoce komplementarne z tymi eksperymentami AFM; Metody te mogą pomóc w rozwiązaniu dodatkowych pytań, takich jak powinowactwo wiązania DNA lub działania związane z wycinaniem zmian w DNA. Technika ta jest stosunkowo szybkim i prostym podejściem do bezpośredniej wizualizacji kompleksów białkowych DNA, a kompleksy te dają nam dobry obraz procesów zachodzących w systemie biologicznym.
Oczywiście jest to nie tylko przydatne w zrozumieniu procesów naprawy DNA, ale może być również zastosowane do innych systemów białkowych DNA. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć całkiem niezłe pojęcie o tym, jak przygotować próbkę na swoim ulubionym białkowym systemie DNA, jak zobrazować ją za pomocą AFM i jak wyodrębnić przydatne parametry do interpretacji swoich danych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie demonstruje zastosowanie mikroskopii sił atomowych (AFM) do analizy rozpoznawania uszkodzeń DNA przez białka naprawcze. Koncentracja została położona na systemie naprawy przez wycinanie nukleotydów, wraz ze szczegółowym opisem przygotowania próbek oraz procedur eksperymentalnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mechanizmy naprawy DNA
- Skaningowa mikroskopia sił atomowych
- Interakcje białko-DNA
Wstęp
- Zrozumienie mechanizmów rozpoznawania uszkodzeń DNA jest kluczowe dla poznania procesów naprawczych.
- Mikroskopia sił atomowych umożliwia wizualizację oddziaływań molekularnych.
- System naprawy przez wycięcie nukleotydów służy jako model do badania tych oddziaływań.
- Techniki pojedynczych cząsteczek dostarczają szczegółowych informacji na temat tworzenia kompleksów.
Cel badania
- W celu rozdzielenia oddziaływań między białkami naprawy DNA a uszkodzonym DNA.
- W celu rozróżnienia różnych oddziaływań z DNA pośredniczonych przez różne kompleksy białkowe.
- W celu pogłębienia zrozumienia rozpoznawania uszkodzeń w systemach naprawy DNA.
Zastosowane metody
- Przygotowanie jednoniciowego substratu DNA z przerwą.
- Wypełnianie przerwy za pomocą zmodyfikowanych jednoniciowych oligonukleotydów DNA.
- Linearyzacja plazmidowego DNA przy użyciu enzymów restrykcyjnych.
- Wykorzystanie mikroskopii sił atomowych do wizualizacji oddziaływań białko-DNA.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja kompleksów białek naprawczych DNA w miejscach uszkodzeń.
- Identyfikacja różnych typów oddziaływań między białkami a uszkodzeniami DNA.
- Wgląd w mechanizmy rozpoznawania uszkodzeń przez system naprawy przez wycinanie nukleotydów.
- Wykazanie skuteczności AFM w badaniu oddziaływań molekularnych.
Wnioski
- Badanie przedstawia nowatorskie podejście do zrozumienia mechanizmów naprawy DNA.
- Mikroskopia sił atomowych jest potężnym narzędziem do analizy oddziaływań białko-DNA.
- Wyniki przyczyniają się do poszerzenia wiedzy na temat procesów rozpoznawania uszkodzeń DNA.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mikroskopia sił atomowych umożliwia bezpośrednią wizualizację oddziaływań białko-DNA z rozdzielczością pojedynczych cząsteczek, co wspiera walidację celów w szlakach naprawy DNA. Podejście to dostarcza wglądu w mechanizmy strategii rozpoznawania uszkodzeń, pomagając w ograniczaniu ryzyka związanego z celami terapeutycznymi zaangażowanymi w stabilność genomiczną. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną poprzez rozróżnianie kompleksów funkcjonalnych oraz ich preferencji wiązania do uszkodzonego DNA.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację odrębnych form kompleksów białko-DNA w miejscach uszkodzeń.
- Wartość naukowa: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez rozróżnianie funkcjonalnych od niefunkcjonalnych kompleksów naprawczych.
- Wartość naukowa: Wyjaśnia specyficzne dla danej ścieżki mechanizmy rozpoznawania, zwiększając pewność w doborze celów onkologicznych związanych z NER.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość użytkowa: Generuje standaryzowane, powtarzalne wyniki obrazowania do ilościowej oceny dynamiki wiązania białek.
- Wartość użytkowa: Zapewnia gotowość do analizy poprzez rozdzielanie heterogenicznych kompleksów w jednej próbce, co ułatwia przesiewy porównawcze.
- Wartość użytkowa: Stanowi skalowalną platformę do oceny wpływu związków na oddziaływania białek naprawczych DNA.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Dostarcza istotnych dla chorób wglądów w systemy poprzez powiązanie strategii rozpoznawania uszkodzeń z wydajnością naprawy w procesach NER u prokariontów i eukariontów.
- Wartość translacyjna: Wspiera ciągłość badań przedklinicznych, umożliwiając wizualizację oddziaływania z celem w ramach gatunkowo specyficznych mechanizmów naprawczych.
- Wartość translacyjna: Uzasadnia decyzje o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka dzięki bezpośredniej obserwacji wzorców wiązania specyficznych dla danego uszkodzenia.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, umożliwiając bezpośrednią wizualizację zaangażowania celu, co wspiera identyfikację związków wiodących poprzez mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku celów związanych z naprawą DNA.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez rozróżnianie strategii rozpoznawania uszkodzeń na podstawie rozmieszczenia białek i tworzenia kompleksów.
- Screening: Dostarcza ilościowych wyników za pomocą pomiarów objętości i wysokości kompleksów, co umożliwia porównanie powinowactwa wiązania i stechiometrii.
- Analityka: Generuje odczyty strukturalne, takie jak rozkłady pozycji wiązania i tworzenie pików specyficznych dla uszkodzeń, pomagając w interpretacji mechanistycznej.
- Badania translacyjne: Łączy fazę odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez ujawnianie konserwatywnych i rozbieżnych mechanizmów rozpoznawania w systemach NER.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość ponownego wykorzystania technik obrazowania w badaniach nad replikacją, transkrypcją i innymi systemami białko-DNA poza zakresem naprawy DNA.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez rozstrzygnięcie niejednoznaczności mechanistycznych w szlakach rozpoznawania zmian.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji przygotowania próbek i protokołów obrazowania.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), dostarczając bezpośrednich dowodów na zaangażowanie celu i złożoną funkcjonalność.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zwalidowane mechanizmy rozpoznawania zmian.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w oczyszczaniu białek, projektowaniu substratów DNA oraz obsłudze AFM.
- Zależne od dostępu do aparatury AFM z możliwością pracy w trybie tapping mode oraz oprogramowania analitycznego do pomiarów objętości i wysokości.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa procedur nakładania próbek, płukania i suszenia w celu zapewnienia spójności danych.
- Wymaga uwzględnienia modyfikacji przy rozszerzaniu metody na inne układy białko-DNA, szczególnie w zakresie kompatybilności buforów i warunków wiązania do powierzchni.
- Ograniczone przez wymóg stosowania próbek o wysokiej czystości, aby uniknąć sygnałów zakłócających interpretację złożonych mieszanin.
