Name: Spektrometria mas i podejścia oparte na luminogenice w celu scharakteryzowania kompetencji metabolicznych fazy I kultur komórkowych in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Poznaj metodę oceny aktywności cytochromu P450 w hodowlach komórkowych przy użyciu spektrometrii mas i sond metabolicznych. Protokół umożliwia badanie metabolizmu leków in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Epithelix Sarl i Biopredic International za dostarczenie mikrofotografii komórek dróg oddechowych i komórek wątroby oraz Neilowi Smithowi za rysunek ilustrujący procedurę eksperymentalną.

<ol><li>Garcia-Canton, C., Minet, E. Metabolic Characterization of Cell Systems Used in In Vitro Toxicology Testing. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGarcia-Canton%2C+C+%22Encyclopedia+of+Drug+Metabolism+and+Interactions%22">Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions</a>. , 1-31 (2016).</li>
<li>Croom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+xenobiotics+of+human+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Mol.+Biol.+Transl.+Sci%22%5BJournal%5D)">Metabolism of xenobiotics of human environments.</a> Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).</li>
<li>Lewis, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((57+varieties%3A+the+human+cytochromes+P450%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics%22%5BJournal%5D)">57 varieties: the human cytochromes P450.</a> Pharmacogenomics. 5, 305-318 (2004).</li>
<li>Jancova, P., Anzenbacher, P., Anzenbacherova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+II+drug+metabolizing+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Pap.+Med.+Fac.+Univ+Palacky%22%5BJournal%5D)">Phase II drug metabolizing enzymes.</a> Biomed. Pap. Med. Fac. Univ Palacky. 154, Olomouc. Czech. Repub. 103-116 (2010).</li>
<li>Dekant, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+biotransformation+and+bioactivation+in+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22EXS%22%5BJournal%5D)">The role of biotransformation and bioactivation in toxicity.</a> EXS. 99, 57-86 (2009).</li>
<li>Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines%3A+a+tool+for+in+vitro+drug+metabolism+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Metab%22%5BJournal%5D)">Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies.</a> Curr. Drug Metab. 9, 1-11 (2008).</li>
<li>Guillouzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+hepatoma+HepaRG+cells%3A+a+highly+differentiated+model+for+studies+of+liver+metabolism+and+toxicity+of+xenobiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol.+Interact%22%5BJournal%5D)">The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics.</a> Chem. Biol. Interact. 168, 66-73 (2007).</li>
<li>Huang, S., Wiszniewski, L., Constant, S., Roggen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+in+vitro+reconstituted+3D+human+airway+epithelia+%28MucilAir%29+to+assess+respiratory+sensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Potential of in vitro reconstituted 3D human airway epithelia (MucilAir) to assess respiratory sensitizers.</a> Toxicol. In Vitro. 27, 1151-1156 (2013).</li>
<li>Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-digital+image+capture+and+whole-field+analysis+of+ciliary+beat+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency.</a> J. Microsc. 211, 103-111 (2003).</li>
<li>Kuehn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+assessment+of+repeated+exposure+of+organotypic+3D+bronchial+and+nasal+tissue+culture+models+to+whole+cigarette+smoke%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Impact assessment of repeated exposure of organotypic 3D bronchial and nasal tissue culture models to whole cigarette smoke.</a> J. Vis. Exp. , (2015).</li>
<li>Draper, A. J., Madan, A., Parkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+coumarin+7-hydroxylase+activity+in+human+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Inhibition of coumarin 7-hydroxylase activity in human liver microsomes.</a> Arch. Biochem. Biophys. 341, 47-61 (1997).</li>
<li>Jensen, K. G., Poulsen, H. E., Doehmer, J., Loft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+inhibition+by+fluvoxamine+of+phenacetin+O-deethylation+in+V79+cells+expressing+human+CYP1A2%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Kinetics and inhibition by fluvoxamine of phenacetin O-deethylation in V79 cells expressing human CYP1A2.</a> Pharmacol. Toxicol. 76, 286-288 (1995).</li>
<li>Yamazaki, H., Tanaka, M., Shimada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+high-performance+liquid+chromatographic+assay+for+coumarin+7-hydroxylation+and+7-ethoxycoumarin+O-deethylation+by+human+liver+cytochrome+P450+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B.+Biomed.+Sci.+Appl%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive high-performance liquid chromatographic assay for coumarin 7-hydroxylation and 7-ethoxycoumarin O-deethylation by human liver cytochrome P450 enzymes.</a> J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 721, 13-19 (1999).</li>
<li>Turpeinen, M., Raunio, H., Pelkonen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+role+of+CYP2B6+in+human+drug+metabolism%3A+substrates+and+inhibitors+in+vitro%2C+in+vivo+and+in+silico%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Metab%22%5BJournal%5D)">The functional role of CYP2B6 in human drug metabolism: substrates and inhibitors in vitro, in vivo and in silico.</a> Curr. Drug Metab. 7, 705-714 (2006).</li>
<li>Kartha, J. S., Yost, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism-based+inactivation+of+lung-selective+cytochrome+P450+CYP2F+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab.+Dispos%22%5BJournal%5D)">Mechanism-based inactivation of lung-selective cytochrome P450 CYP2F enzymes.</a> Drug Metab. Dispos. 36, 155-162 (2008).</li>
<li>Sheets, P. L., Yost, G. S., Carlson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzene+metabolism+in+human+lung+cell+lines+BEAS-2B+and+A549+and+cells+overexpressing+CYP2F1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+Mol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Benzene metabolism in human lung cell lines BEAS-2B and A549 and cells overexpressing CYP2F1.</a> J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 92-99 (2004).</li>
<li>Kharasch, E. D., Thummel, K. E., Mhyre, J., Lillibridge, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-dose+disulfiram+inhibition+of+chlorzoxazone+metabolism%3A+a+clinical+probe+for+P450+2E1%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Single-dose disulfiram inhibition of chlorzoxazone metabolism: a clinical probe for P450 2E1.</a> Clin. Pharmacol. Ther. 53, 643-650 (1993).</li>
<li>Graef, V., Furuya, E., Nishikaze, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolysis+of+steroid+glucuronides+with+beta-glucuronidase+preparations+from+bovine+liver%2C+Helix+pomatia%2C+and+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Hydrolysis of steroid glucuronides with beta-glucuronidase preparations from bovine liver, Helix pomatia, and E. coli.</a> Clin. Chem. 23, 532-535 (1977).</li>
<li>Guide to achieving reliable quantitative LC-MS measurements. RSC Analytical Methods Committee. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.lgcgroup.com/LGCGroup/media/PDFs/Our%20science/NMI%20landing%20page/Publications%20and%20resources/Guides/AMC_LCMS_Guide.pdf">http://www.lgcgroup.com/LGCGroup/media/PDFs/Our%20science/NMI%20landing%20page/Publications%20and%20resources/Guides/AMC_LCMS_Guide.pdf</a> (2013).</li>
<li>Baxter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+omics+analyses%2C+and+metabolic+enzyme+activity+assays+demonstrate+maintenance+of+key+mucociliary+characteristics+in+long+term+cultures+of+reconstituted+human+airway+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Targeted omics analyses, and metabolic enzyme activity assays demonstrate maintenance of key mucociliary characteristics in long term cultures of reconstituted human airway epithelia.</a> Toxicol. In Vitro. 29, 864-875 (2015).</li>
<li>Gomez-Lechon, M. J., Tolosa, L., Conde, I., Donato, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competency+of+different+cell+models+to+predict+human+hepatotoxic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Drug+Metab.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Competency of different cell models to predict human hepatotoxic drugs.</a> Expert. Opin. Drug Metab. Toxicol. 10, 1553-1568 (2014).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+metabolism-dependent+drug+efficacy+and+toxicity+on+a+multilayer+organs-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of metabolism-dependent drug efficacy and toxicity on a multilayer organs-on-a-chip.</a> Integr. Biol. 8, Camb. 1022-1029 (2016).</li>
<li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25947886">Three-dimensional (3D) spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells.</a> Biosci. Rep. , (2015).</li>
</ol>

A.B. i E.M. byli pracownikami British American Tobacco w czasie, gdy ten rękopis został napisany. Praca opisana w tym manuskrypcie została sfinansowana przez British American Tobacco, a opłaty za publikację tego artykułu zostały opłacone przez British American Tobacco.

Obecnie wiele znormalizowanych systemów badań toksykologicznych wykorzystuje zmodyfikowane bakterie, linie komórkowe lub komórki embrionalne, które nie są reprezentatywne dla normalnego metabolizmu człowieka1. Może to prowadzić do niedokładnych przewidywań potencjalnej toksycznej aktywności substancji chemicznej lub leku. Innowacyjne modele in vitro, takie jak hodowle komórkowe 3D i narządy na chipie, są opracowywane w celu lepszego odtworzenia normalnej morfologii i aktywności metabolicznej tkanek ludzkich 21,22,23. Kompetencja metaboliczna jest jednym z kryteriów, które można wykorzystać do rozszyfrowania, które modele najlepiej nadają się do oceny toksykologicznej i badań nad biotransformacją leków.
Protokół, który przedstawiliśmy w tym artykule, ma na celu pomiar aktywności enzymów CYP przy użyciu żywych komórek. Jest elastyczny i może być stosowany w różnych systemach komórkowych w hodowlach 2D lub 3D i oferuje możliwość zastosowania podejścia opartego na sondzie luminogenicznej lub spektrometrii mas. Obie metody są wystarczająco czułe, aby wykryć nanogramowe ilości materiałów i wymagają jedynie niewielkiej liczby komórek hodowanych w formacie wielodołkowym. Mogą być również stosowane do komórek sferoidalnych lub hodowanych w złożonych matrycach. Wybór podłoża sondy jest oczywiście krytycznym elementem protokołu. Specyficzność testu opiera się na tym, że sonda jest selektywna w stosunku do enzymu CYP, a kolejną warstwę pewności można uzyskać poprzez zastosowanie selektywnego inhibitora CYP. Substraty i inhibitory wymienione w tej pracy to tylko kilka przykładów, ale inne można znaleźć w literaturze.
Ważne jest, aby wziąć pod uwagę wielokrotne czasy inkubacji podczas pracy z nowym typem komórki, ponieważ ujemny wynik aktywności CYP może być spowodowany ekspresją enzymu na niskim poziomie. Dodanie typu ogniwa, które może być użyte jako kontrola pozytywna, jest wskazane, aby upewnić się, że wynik ujemny nie jest związany z problemem technicznym i pomóc w rozwiązywaniu problemów. Pierwotne komórki wątroby są metabolicznie kompetentne i mogą być stosowane jako kontrola, na przykład pierwotne hepatocyty w zawiesinie są bardzo łatwe w użyciu, ale ich żywotność jest ograniczona w czasie. Linie komórkowe wątroby są możliwą alternatywą, która jest stosunkowo łatwa w użyciu, jak opisano w niniejszym protokole, ale niektóre są lepsze od innych pod względem aktywności metabolicznej 6,21.
Ponieważ test jest nieniszczący, o ile białko całkowite nie zostanie określone ilościowo, możliwe jest śledzenie aktywności CYP w czasie w badaniach podłużnych20. Jest to ważny punkt, ponieważ niektóre komórki będą miały zmienną aktywność CYP w czasie w hodowli. Wynik ujemny może być związany z brakiem zbieżności, postępem w różnicowaniu lub odróżnicowaniu in vitro. W takim przypadku podejście jest półilościowe, ponieważ dane nie są normalizowane przez całkowitą ilość białka w każdej kulturze komórkowej. Nie zawsze jest możliwe lub zalecane ponowne wykorzystanie tkanki po zmierzeniu aktywności CYP, ponieważ narażenie na sondy, inhibitory lub induktory może mieć toksyczny wpływ na tkankę, jak ma to miejsce w przypadku TCDD.
Frakcje komórkowe, takie jak mikrosomy, mogą być również wykorzystane do scharakteryzowania aktywności CYP danego typu komórki. Preparaty mikrosomowe wymagają jednak dużej ilości materiału komórkowego, dodania odpowiednich kofaktorów i buforu, aby enzymy pozostały aktywne. Korzystanie z żywych komórek eliminuje skomplikowany etap przygotowania mikrosomów i ustalenia, które i kofaktory działają najlepiej.
Ogólnie rzecz biorąc, najlepszą praktyką jest dalsze scharakteryzowanie profilu ekspresji CYP w hodowlach komórkowych w celu sprawdzenia, czy odpowiada on aktywności enzymatycznej. Ten dodatkowy poziom weryfikacji jest zalecany, biorąc pod uwagę, że sondy metaboliczne nie są całkowicie specyficzne dla pojedynczego CYP i daje to większą pewność, że zmierzona aktywność metaboliczna jest dopasowana do odpowiedniej ekspresji enzymu. Ponieważ CYP są białkami błonowymi, stosunkowo trudno jest je przygotować do zachodnich plam, dlatego preferowanym podejściem do profilowania tych enzymów jest ilościowy RT-PCR20.
Należy zauważyć, że protokół ten opisuje metodę oznaczania aktywności enzymu CYP, która reprezentuje tylko jedną rodzinę enzymów metabolicznych, aczkolwiek ważną. Elastyczność podejścia opartego na spektrometrii mas pozwala na opracowanie metod akwizycji dla innych przemian metabolicznych substratów sondy. Muszą one być jednak opracowywane pojedynczo, a obecnie znanych jest mniej specyficznych sond i selektywnych inhibitorów dla innych rodzin enzymów metabolicznych. Luka ta powinna zostać wypełniona, aby umożliwić kompleksową ocenę kompetencji metabolicznych systemów komórkowych in vitro .

Metabolizm ksenobiotyków to proces, w którym substancje chemiczne obce dla organizmu są modyfikowane poprzez dodawanie grup hydrofilowych i koniugatów, aby ułatwić ich wydalanie1. Zazwyczaj metabolizm ksenobiotyków jest procesem dwuetapowym, w którym faza I składa się głównie z utleniania z dodatkiem jednej lub wielu grup hydroksylowych1,2. W fazie II grupy hydroksylowe służą jako akceptory dla koniugatu hydrofilowego, takiego jak grupa glukuronidowa lub siarczanowa1,2. Jeśli grupa akceptorowa jest już obecna w cząsteczkach, etap koniugacji może zachodzić niezależnie od metabolizmu w fazie I. Każda reakcja jest przeprowadzana przez specyficzną grupę enzymów, np. CYPs (cytochromy P450), które katalizują hydroksylację (Rycina 1) i dealkilację substratów chemicznych3. Koniugacja jest katalizowana przez sulfotransferazy, UDP-glukuronozylotransferazy (Rycina 1), transferazy S-glutationowe i N-acetylotransferazy4. Każda tkanka i organ wykazuje specyficzny profil ekspresji enzymów metabolicznych, przy czym wątroba wykazuje ekspresję większości tych białek.
<img alt="Schemat procesu metabolicznego transformacji kumaryny: utlenianie przez CYP fazy I, konjugacja przez UGT fazy II." src="/files/ftp_upload/55502/55502fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przykład metabolizmu fazy I i fazy II kumaryny. CYP2A6/CYP2A13 katalizują 7-hydroksylację kumaryny. 7-hydroksykumaryna jest konjugowana z resztą glukuronidową przez enzymy fazy II UGT, przy czym UGT1A6 i UGT1A9 wykazują najwyższą aktywność.
Zrozumienie metabolizmu ksenobiotyków ma kluczowe znaczenie w ocenie bezpieczeństwa leków oraz w ocenie ryzyka chemicznego z dwóch powodów: kinetyka reakcji determinuje, jak długo lek lub substancja chemiczna pozostanie w organizmie w formie aktywnej lub nieaktywnej przed wydaleniem, a związek macierzysty może zostać przekształcony przez enzymy metaboliczne w gatunek bardziej reaktywny, niestabilny i toksyczny. Takie reakcje, znane również jako „bioaktywacja”, są w większości napędzane przez enzymy CYP fazy I, ale rzadziej także przez konjugację fazy II5.
W związku z tym zdolność modelu in vitro do dokładnego przewidywania ryzyka związanego z lekiem lub substancją chemiczną jest w dużym stopniu zależna od kompetencji metabolicznej systemu komórkowego. Linie komórkowe pochodzące z tkanek chorobowych lub z transformacji prawidłowych komórek często tracą część, a niekiedy całość profilu enzymów metabolicznych reprezentatywnego dla tkanki pochodzenia6. Utrzymanie prawidłowego profilu enzymów metabolicznych wydaje się być lepsze w pierwotnych kulturach komórkowych (przynajmniej w kulturach krótkoterminowych), a ulega dalszej poprawie, jeśli tkanka jest hodowana w macierzy pozwalającej na zachowanie jej struktury 3D1. Dlatego też charakterystyka kompetencji metabolicznej systemu komórkowego in vitro jest istotnym krokiem wstępnym, pomagającym w podjęciu decyzji o wyborze odpowiedniego modelu komórkowego do przeprowadzenia oceny bezpieczeństwa chemicznego.
W niniejszej pracy przedstawiamy protokół do profilowania aktywności i ekspresji enzymów CYP fazy I in vitro, na przykładach ich zastosowania w linii komórkowej wątroby7 oraz w trójwymiarowych (3D) kulturach pierwotnych komórek płuc8. Opisano specyficzne substraty CYP, ich produkty metaboliczne oraz kontrole inhibitorowe, a także metody ilościowe oparte na spektrometrii mas i luminogenezie. Ponieważ niektóre CYP są indukowalne, a inne konstytutywne, przedstawione zostaną również przykłady dla obu tych scenariuszy.

<table><tbody><tr><td>Odczynnik & Komórki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 &mu; m filtr strzykawkowy</td><td>Whatman</td><td>UN203NPEORG</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>4-metylolumbelliferon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>5-fenylopentyn</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CD5001437</td><td></td></tr><tr><td>6-hydroksybupropion</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3167</td><td></td></tr><tr><td>6-hydroksychloroksazamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>UC148</td><td></td></tr><tr><td>7-etoksykumaryna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>195642</td><td></td></tr><tr><td>7-hydroksykumaryna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H24003</td><td></td></tr><tr><td>8-metoksypsoralen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3501</td><td></td></tr><tr><td>kwas octowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>acetonitryl</td><td>Fisher</td><td>A/0626/17</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-naftoflawon</td><td>Sigma Zestaw BCA Aldrich</td><td>N5757</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>b-glukuronidaza/arylosulfataza</td><td>Sigma</td><td>Aldrich G0876</td><td></td></tr><tr><td>Bupropion</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B102</td><td></td></tr><tr><td>Karbamazepina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4024</td><td></td></tr><tr><td>chlorzoksazon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4397</td><td></td></tr><tr><td>kolagen</td><td>Cell Systems</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>kumaryna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4261</td><td></td></tr><tr><td>disulfiram</td><td>Sigma Aldrich</td><td>86720</td><td></td></tr><tr><td>fluwoksamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2802</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (suplement glutaminy)</td><td>Fisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Suplement metabolizmu HepaRG</td><td>Merck</td><td>MMAD621</td><td></td></tr><tr><td>Rozmrażanie HepaRG suplement diety</td><td>Merck</td><td>MMADD671</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG</td><td>Merck</td><td>MMHPR116</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin-CEE</td><td>Promega</td><td>V8751</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Fisher</td><td>M/4056/17</td><td></td></tr><tr><td>Komórki dróg oddechowych MucilAir</td><td>Nabłonek</td><td>EP01</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do konserwacji komórek dróg oddechowych MucilAir</td><td>Nabłonek</td><td>EP04MM</td><td></td></tr><tr><td>Phenomenex Kinetex 2.6 &mu; m, PFP 100A</td><td>Phenomenex</td><td>00B-4477-AN</td><td></td></tr><tr><td>TCDD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48599</td><td></td></tr><tr><td>thioTEPA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6069</td><td></td></tr><tr><td>Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 &micro; m 2,1 x 50 mm</td><td>Wody</td><td>86003538</td><td></td></tr><tr><td>Williamsa E media</td><td>Fisher</td><td>17704-024</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPLC</td><td></td><td>Waters Acquity</td><td></td></tr><tr><td>QTRAP MS</td><td>Sciex&nbsp;</td><td>Oprogramowanie ABI Sciex 4000</td><td></td></tr><tr><td>QTRAP MS</td><td>Sciex&nbsp;</td><td>Analityk 1.4.2</td><td></td></tr><tr><td>luminometr</td><td>Urządzenia molekularne</td> Spektrofotometr <td>SpectraMax M3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Licznik komórek SpectraMax M3</td><td></td></tr> Wyparka obrotowa <tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>Vi-Cell XR</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf-5301</td><td></td></tr></tbody></table>

spektrometria mas i podejścia oparte na luminogenice w celu scharakteryzowania kompetencji metabolicznych fazy i kultur komórkowych in vitro

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Enzymy metabolizujące ksenobiotyki odgrywają kluczową rolę w biotransformacji leków i substancji toksycznych, dodając grupy funkcyjne, które zwiększają rozpuszczalność i ułatwiają wydalanie. W niektórych przypadkach te modyfikacje strukturalne prowadzą do powstawania nowych toksycznych produktów. Aby ograniczyć liczbę testów na zwierzętach, ryzyko chemiczne można ocenić przy użyciu komórek kompetentnych metabolicznie. Ekspresja enzymów metabolicznych nie jest jednak stabilna w czasie w wielu systemach hodowli pierwotnej in vitro i często jest częściowa lub nieobecna w liniach komórkowych. Dlatego badania metabolizmu leków, dodatków i zanieczyszczeń środowiska in vitro powinny być najlepiej prowadzone w układach komórkowych, w których scharakteryzowano aktywność metaboliczną. Wyjaśniamy tutaj podejście do pomiaru aktywności klasy enzymów metabolicznych (faza I u człowieka) w liniach komórkowych 2D i pierwotnych kulturach 3D przy użyciu sond chemicznych i ich produktów metabolicznych kwantyfikowalnych za pomocą spektrometrii mas i luminometrii UPLC. Metoda może być stosowana do badania aktywności metabolicznej w liniach komórkowych i komórkach pierwotnych pochodzących z różnych tkanek.

Przykłady aktywności metabolicznej zmierzonej dla dwóch par CYP-ów (CYP1A1/1B1 oraz CYP2A6/2A13) w hodowlach komórek dróg oddechowych od trzech różnych dawców (airway M360, M370, M417) oraz w linii komórkowej wątroby (Hep line) przedstawiono na Rysunku 620.
Pomiar aktywności CYP metodą luminometrii 
Rysunek 6A przedstawia względną luminescencję generowaną przez aktywność O-dealkilacji Luc-CEE (eter 6'-chloroetylowy lucyferyny) przez CYP1A1/1B1 w komórkach dróg oddechowych (3 dawcy) oraz komórkach wątroby z indukcją TCDD i bez niej. CYP1A1/1B1 są enzymami silnie indukowalnymi i zazwyczaj nie wykazują ekspresji konstytutywnej w większości tkanek. Jak widać na Rysunku 6A, w przypadku braku indukcji komórek nie wykryto sygnału luminogenicznego. Po preinkubacji obu typów komórek z TCDD, silnym induktorem CYP1A1/1B1, wykryto wyraźny sygnał luminogeniczny w porównaniu z kontrolą (Rysunek 6A). Wskazuje to na zmetabolizowanie sondy Luc-CEE, co doprowadziło do uwolnienia frakcji lucyferyny, która została następnie ilościowo określona. Ogólnie aktywność w linii komórkowej wątroby traktowanej TCDD jest niższa niż w komórkach dróg oddechowych, nawet po normalizacji względem całkowitej zawartości białka. Nie jest to zjawisko nietypowe, ponieważ linie komórkowe wykazują tendencję do mniejszej aktywności metabolicznej niż komórki pierwotne. Dodatek α-naftoflawonu wykazuje wyraźny efekt hamujący aktywność CYP1A1/1B1 we wszystkich typach komórek, co dodatkowo potwierdza zależność metabolizmu Luc-CEE od CYP.
Ilościowe oznaczanie metabolitów CYP450 przy użyciu UPLC-MS 
Rycina 6B przedstawia ilościowe oznaczanie aktywności CYP2A6/2A13 w komórkach dróg oddechowych od 3 dawców (Airway M343, M345, M347) oraz w komórkach wątroby (Hep line) po inkubacji z kumaryną w obecności i w nieobecności inhibitora 8-metoksypsoralenu. Dane zostały znormalizowane względem całkowitej zawartości białka. W kontroli z 0 min inkubacji z kumaryną nie wykryto 7-hydroksykumaryny (Rycina 6B). CYP2A6/2A13 są wyrażane konstytutywnie w niektórych tkankach, dlatego po 16 h inkubacji z kumaryną tworzenie 7-hydroksykumaryny jest wykrywalne w różnych badanych typach komórek, nawet bez indukcji. Po dodaniu 8-metoksypsoralenu, inhibitora CYP2A (Rycina 6B), tworzenie 7-hydroksykumaryny ulega znacznemu zmniejszeniu.
Należy zauważyć, że w obecności inhibitora CYP nadal normalne jest wykrywanie pewnej aktywności resztkowej, ponieważ inhibicja rzadko jest całkowita, a inne białka CYP mogą również rozpoznawać substrat, choć przetwarzają go znacznie mniej efektywnie. Można również zaobserwować, że zapisana aktywność metaboliczna może różnić się między dawcami przy użyciu komórek pierwotnych, co jest widoczne dla CYP2A6 w komórkach dróg oddechowych (Rysunek 6B). Jest to spodziewane, ponieważ aktywność CYP zależy od genotypu i polimorfizmów każdego dawcy.
<img alt="Wykres aktywności białka; wyniki testu lucyferazowego z TCDD i α-naftoflawonem w komórkach dróg oddechowych." src="/files/ftp_upload/55502/55502fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Wynik testu aktywności CYP1A1/1B1 (A) oraz aktywności CYP2A6/2A13 (B) w linii komórek wątrobowych oraz u trzech dawców komórek dróg oddechowych (M360, M370, M417). (A) Przedstawiono aktywność dealkilacji Luc-CEE z indukcją i bez indukcji CYP1A1/1B1 przez TCDD. α-naftoflawon został użyty jako inhibitor CYP1A1/1B1. Aktywność wykazano jako względne jednostki luminescencji (RLU) znormalizowane względem czasu inkubacji w minutach (min) i całkowitej zawartości białka (mg). (B) CYP2A6/2A13 nie wymagają indukcji, ponieważ są wyrażane konstytutywnie. Aktywność 7-hydroksylacji kumaryny w pmol/min/mg białka przedstawiono w różnych punktach czasowych z inhibitorem 8-metoksypsoralenem i bez niego. Wszystkie wyniki przedstawiono jako średnią z trzech niezależnych pomiarów wraz z odchyleniem standardowym średniej. Rycina została zmodyfikowana na podstawie publikacji Baxter20.
Tabela uzupełniająca 1: Ustawienia UPLC i spektrometru mas. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55502/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Kompetencja metaboliczna systemów in vitro jest kluczowym wymogiem dla biotransformacji i dystrybucji leków i substancji toksycznych. W niniejszym protokole opisano zastosowanie referencyjnych sond metabolicznych do oceny metabolizmu fazy I w hodowlach komórkowych.

Spektrometria mas i podejścia oparte na luminogenice w celu scharakteryzowania kompetencji metabolicznych fazy I kultur komórkowych in vitro

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Celem niniejszej procedury jest określenie aktywności cytochromów P450, lub CYP, w hodowlach komórkowych. CYP są kluczowymi enzymami uczestniczącymi w metabolizmie leków i toksyn, a ich ekspresja często nie jest zachowana in vitro. Prawidłowa ekspresja enzymów CYP jest często tracona podczas hodowli komórek in vitro.W związku z tym wiele modeli in vitro potencjalnie ogranicza możliwość zrozumienia metabolizmu leków i substancji toksycznych. Główną zaletą tej metody jest jej prostota przy ocenie aktywności CYP w hodowlach komórkowych. Z wykorzystaniem substratów sond i inhibitorów przedstawiono różne platformy ilościowe, w tym spektrometrię mas.Aby rozpocząć, należy przygotować probówki kriogeniczne z komórkami zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przedstawiony protokół wykorzystuje linię komórek wątroby jako przykład. Pracując w warunkach sterylnych, należy ostrożnie otworzyć probówkę kriogeniczną, aby wyrównać ewentualne nadciśnienie, a następnie przenieść pipetą zawartość probówki do probówki o pojemności 10 ml wypełnionej 9 ml uprzednio ogrzanej do 37 °C pożywki Williams'E.Wirować roztwór przez 10 minut przy 400 ×g w temperaturze pokojowej. Po odlaniu supernatantu ponownie zawiesić komórki w pięciu mililitrach zastrzeżonego medium do rozmrażania, podgrzanego wstępnie do 37 °C i uzupełnionego o glutaminę. Po policzeniu żywych komórek zgodnie z opisem w protokole tekstowym, zasiać komórki na 24-dołkowej płytce powlekanej kolagenem w zagęszczeniu 60 000 żywych komórek na dołek, w końcowej objętości 0,5 mililitra medium do rozmrażania.Po kilku dniach hodowli komórki tworzą subkonfluentną strukturę beleczkową. Optymalna aktywność metaboliczna jest zazwyczaj obserwowana między siódmym a dziesiątym dniem, natomiast najniższa w czwartym dniu. Aby przygotować hodowle zróżnicowanego nabłonka dróg oddechowych, należy wykorzystać dostępne komercyjnie w pełni zróżnicowane pierwotne nabłonki dróg oddechowych, które były hodowane na wkładce w warunkach interfejsu powietrze-ciecz.Za pomocą sterylnej pęsety delikatnie wyjmij insert komórkowy z matrycy agarozowej i przenieś go na nową płytkę, do której wcześniej nalano 700 µL zastrzeżonego medium hodowlanego. Oceń integralność tkanki dróg oddechowych, stosując metody opisane w protokole tekstowym, takie jak oporność transepithelialna lub częstotliwość uderzeń rzęsek. Przed rozpoczęciem eksperymentu przygotuj dwie serie insertów komórkowych dla komórek dróg oddechowych oraz studzienek dla komórek wątroby, z minimum trzema powtórzeniami.Jedną serię wykorzystaj do eksperymentu z inhibicją, a drugą wyłącznie do sondy metabolicznej. Przygotuj trzecią serię komórek jako kontrolę pustą z samym medium. W dniu eksperymentu zastąp pożywkę hodowlaną 450 µL świeżego medium.Dodaj 50 µL pożywki zawierającej 10x inhibitor CYP do serii komórek przygotowanych do eksperymentu hamowania i inkubuj wstępnie przez 30 minut. Następnie wymień pożywkę w serii hamowania na 450 µL świeżej pożywki i dodaj 50 µL pożywki zawierającej zarówno 10x inhibitor CYP, jak i 10x substrat sondy. Dodaj 50 µL pożywki z 10x substratem sondy do pozostałych komórek, a następnie dodaj równoważną ilość rozpuszczalnika rozcieńczonego w pożywce do pustych kontrol komórkowych.Po inkubowaniu komórek od zera do pięciu minut dla punktu czasowego jeden, kontroli tła zero, należy zebrać medium do oddzielnych, opisanych probówek i zamrozić je do późniejszej analizy. Następnie komórki dla punktu czasowego dwa inkubuje się przez 16 godzin w inkubatorze komórkowym. Po zakończeniu okresu inkubacji należy zebrać medium tą samą metodą w celu ilościowego oznaczenia produktu metabolicznego.Przenieś 250 mikrolitrów medium inkubacyjnego do mikroprowetki o pojemności 1,5 mililitra i dodaj roztwór zapasu standardu wewnętrznego 4-metylumbeliferonu, aby osiągnąć stężenie końcowe 100 nanomolarów. Dostosuj pH medium do zakresu od 4,5 do 5,0, dodając HCl o stężeniu jeden mol przez litr w ilości jednego mikrolitra na raz. Zweryfikuj pH, n nanosząc od dwóch do 10 mikrolitrów medium na pasek wskaźnika pH, a następnie dodaj 150 jednostek betaglukuronidazy arylsulfatazy z Helix pomatia.Po inkubacji przez jedną godzinę w temperaturze 37°C należy zatrzymać reakcję, dodając 250 µL zimnego metanolu. Rozpuszczalnik należy odparować za pomocą wirówki próżniowej w temperaturze 45°C. Próbki należy zrekonstytuować w 500 µL 30% roztworu acetonitrylu w wodzie.Aby przeprowadzić ilościowe oznaczenie metodą spektrometrii mas, należy dodać 250 µL każdego standardu z serii rozcieńczeń do bursztynowej fiolki szklanej do ultrawydajnej chromatografii cieczowej, przeznaczonej do wstrzykiwania do autosamplera UPLC-MS. Próbki badawcze należy również dodać do bursztynowych fiolek UPLC i umieścić je w autosamplerze UPLC. Po zrandomizowaniu wszystkich fiolek należy uruchomić analizę UPLC-MS, stosując ustawienia szczegółowo opisane w protokole tekstowym, w zależności od konkretnej badanej sondy.Użyj narzędzia Quantitate, Build Quantitation Method w narzędziach do kwantyfikacji spektrometru mas, aby wygenerować krzywą kalibracyjną z pozyskanego standardu syntetycznego i standardu wewnętrznego, a następnie użyj Kreatora Kwantyfikacji (Quantitation Wizard), aby wybrać partię próbek oraz próbki do analizy ilościowej i uruchomić metodę kwantyfikacji. Aby indukowć CYP1A1, CYP1B1, zastosuj układ płyt opisany w protokole tekstowym. Inkubuj komórki przeznaczone do indukcji w pożywce z końcowym stężeniem 10 nanomolar TCDD przez okres 72 godzin.Po tym okresie usunąć pożywkę, trzykrotnie przemyć studzienki buforem PBS i dodać świeżą pożywkę. Przed inkubacją komórek z luminogeniczną sondą reporterową, wyznaczoną podgrupę indukowanych komórek inkubować wstępnie przez 30 minut z inhibitorem CYP1A1, CYP1B1 w pożywce. Dodać sondę luminogeniczną, 6'chloroethyl ether lucyferyny, do końcowego stężenia 50 micromolar do komórek nieindukowanych, indukowanych oraz indukowanych z inhibitorem.Inkubować przez cztery godziny, a następnie przenieść 25 µL pożywki hodowlanej do białej, nieprzezroczystej płytki 96-dołkowej i dodać 25 µL odczynnika detekcyjnego lucyferyny dostarczonego przez producenta. Po inkubacji przez 20 minut w temperaturze pokojowej niezwłocznie odczytać płytkę za pomocą luminometru. Przedstawiono tutaj względną luminescencję powstałą w wyniku dealkilacji eteru 6'-chloroetylowego lucyferyny, katalizowanej przez CYP1A1 i CYP1B1.Przykład pokazuje brak aktywności enzymatycznej w warunkach bez indukcji TCDD. Po indukcji TCDD obserwuje się aktywność CYP1A1 oraz CYP1B1 zarówno w komórkach wątrobowych, jak i oddechowych. Na koniec dodanie inhibitora CYP1A1 i CYP1B1, alfa-naftoflawonu, redukuje lub eliminuje aktywność CYP.W celu oceny aktywności CYP2A6 i 2A13 w typach komórek wątroby i dróg oddechowych zmierzono ilość 7-hydroksykumaryny powstałej w wyniku hydroksylacji kumaryny przez enzym, wykorzystując metodę UPLC LC-MS. W czasie zero minut inkubacji z kumaryną wykryto jedynie sygnał tła. Po 16 godzinach zaobserwowano hydroksylację kumaryny z utworzeniem 7-hydroksykumaryny w obu typach komórek.Wreszcie, dodanie inhibitora CYP2A, 2A13 zapobiega tworzeniu się 7-hydroksykumaryny. Po opanowaniu metody, etapy inkubacji sondy i kwantyfikacji w tej technice można w większości przypadków przeprowadzić w czasie od kilku godzin do jednego dnia. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przeprowadzania różnych testów metabolizmu fazy pierwszej z wykorzystaniem różnych typów komórek, potwierdzając swoistość enzymu poprzez inhibicję i/lub indukcję, zgodnie z potrzebami.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że różne typy komórek mogą wymagać dłuższego czasu inkubacji, a niezbędne jest uwzględnienie typu komórek, który może służyć jako kontrola pozytywna. Należy pamiętać, że praca z TCDD może być niezwykle niebezpieczna i podczas przeprowadzania tej procedury zawsze należy stosować środki ostrożności, takie jak pełny sprzęt ochrony osobistej. Zastosowania tej techniki obejmują wykorzystanie odpowiednich modeli in vitro do oceny przedklinicznej nowych leków oraz oceny ryzyka substancji chemicznych i składników stosowanych w produktach konsumenckich.

mass-spectrometry-luminogenic-based-approaches-to-characterize-phase

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Nieukierunkowana metabolomika dostarcza hipotezy generującej migawkę profilu metabolicznego.  Protokół ten zademonstruje ekstrakcję i analizę metabolitów z komórek, surowicy lub tkanki.  Szereg metabolitów jest badany za pomocą ekstrakcji ciecz-faza cieczowa, ultraprzepływowej chromatografii cieczowej/spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) w połączeniu z oprogramowaniem do analizy różnicowej.

Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS)

Opisujemy kroki, które umożliwiają szybkie pobieranie próbek in situ małej części pojedynczej komórki z dużą precyzją i minimalną inwazją, przy użyciu mikropróbkowania opartego na kapilarach, aby ułatwić chemiczną charakterystykę migawki aktywności metabolicznej w żywych zarodkach przy użyciu specjalnie zbudowanej platformy do elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas z pojedynczą komórką.

Elektroforeza kapilarna z mikrosondą Spektrometria mas do metabolomiki pojedynczych komórek w żywych zarodkach żab (Xenopus laevis)

Przedstawiamy protokół pomiaru zużycia tlenu i pozakomórkowego zakwaszenia w mózgach larw i dorosłych Drosophila melanogaster. Analizator metaboliczny jest używany z dostosowanym i zoptymalizowanym protokołem. Ograniczenia mikrotkanek są kluczowym elementem tego protokołu i zostały zaprojektowane i stworzone specjalnie do ich wykorzystania w tej analizie.

Analiza metaboliczna larwalnych i dorosłych mózgów Drosophila melanogaster

Zintegrowana platforma do manipulacji komórkami została opracowana do użytku w połączeniu z jednosondowym zestawem spektrometrii mas do analizy on-line pojedynczych komórek zawiesinowych w warunkach otoczenia.

Zintegrowana platforma do manipulacji komórkami w połączeniu z pojedynczą sondą do analizy spektrometrii mas leków i metabolitów w pojedynczych komórkach zawiesinowych

Tutaj prezentujemy solidny protokół do ilościowego oznaczania 40 związków biorących udział w centralnym metabolizmie węgla i energii w reakcjach syntezy białek bez komórek. Bezkomórkowa mieszanina syntezy jest derywatyzowana aniliną w celu skutecznego rozdzielania za pomocą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami, a następnie oznaczana ilościowo za pomocą spektrometrii mas przy użyciu izotopowo znakowanych wzorców wewnętrznych.

Bezwzględna kwantyfikacja metabolizmu syntezy białek bezkomórkowych za pomocą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami i spektrometrią mas

Protokoły opisują metody wysokosprawnej chromatografii cieczowej w połączeniu z indeksem załamania światła lub detekcją spektrometryczną mas do badania reakcji metabolicznych w złożonych systemach bezkomórkowych opartych na lizacie.

Chromatografia cieczowa sprzężona z wykrywaniem indeksu refrakcji lub spektrometrii mas w celu profilowania metabolitów w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie

Tutaj prezentujemy kompilację testów do bezpośredniego pomiaru funkcji mitochondriów w komórkach ssaków, niezależnie od ich zdolności do zużywania tlenu cząsteczkowego.

Testy niezależne od tlenu do pomiaru funkcji mitochondriów u ssaków

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego i niezawodnego pomiaru metabolitów w rzadkich typach komórek. Udoskonalenia techniczne, w tym zmodyfikowany płyn osłonkowy do sortowania komórek i generowanie odpowiednich próbek ślepych, umożliwiają kompleksową ocenę ilościową metabolitów przy wkładzie zaledwie 5000 komórek na próbkę.

Ukierunkowana metabolomika rzadkich komórek pierwotnych

Protokół ten ma na celu zachowanie metabolitów komórkowych dla jednokomórkowej spektrometrii mas (SCMS) poprzez połączenie płukania lotnego roztworu soli, szybkiego hartowania ciekłym azotem, liofilizacji i przechowywania w temperaturze -8 °C. Wykazano, że hartowanie ciekłym azotem jest niezbędne do utrzymania profili metabolitów, podczas gdy długotrwałe przechowywanie w chłodni powinno być zminimalizowane, aby zapobiec zmianom metabolicznym.

Przygotowanie próbek do badań metabolomicznych spektrometrii mas pojedynczych komórek: połączone mycie, hartowanie, suszenie i przechowywanie komórek

Przedstawiono protokół profilowania metabolicznego próbek biologicznych za pomocą elektroforezy kapilarnej - spektrometrii mas z wykorzystaniem projektu interfejsu porowatej końcówki bez osłony.

Elektroforeza kapilarna bez osłonki – spektrometria mas do profilowania metabolicznego próbek biologicznych

Poznaj metodę oceny aktywności cytochromu P450 w hodowlach komórkowych przy użyciu spektrometrii mas i sond metabolicznych. Protokół umożliwia badanie metabolizmu leków in vitro.

Spektrometria mas i podejścia oparte na luminogenice w celu scharakteryzowania kompetencji metabolicznych fazy I kultur komórkowych in vitro (Wideo) | JoVE Journal

Spektrometria mas i podejścia oparte na luminogenice w celu scharakteryzowania kompetencji metabolicznych fazy I kultur komórkowych in vitro

Przeglądaj więcej filmów