Spektrometria mas i podejścia oparte na luminogenice w celu scharakteryzowania kompetencji metabolicznych fazy I kultur komórkowych in vitro

Celem tej procedury jest określenie aktywności cytochromu P450 lub CYP w hodowanych komórkach. CYP są kluczowymi enzymami biorącymi udział w metabolizmie leków i substancji toksycznych, a ich ekspresja często nie jest zachowywana in vitro. Prawidłowa ekspresja enzymów CYP jest często tracona, gdy komórki są hodowane in vitro.

W związku z tym wiele modeli in vitro może ograniczać swoje znaczenie do zrozumienia metabolizmu leków i substancji toksycznych. Główną zaletą tej metody jest jej prostota w ocenie aktywności CYP w hodowanych komórkach. Za pomocą substratów sondowych i inhibitorów prezentowane są różne platformy kwantyfikacji, w tym spektrometria mas.

Na początek zaopatrz się w fiolki kriogeniczne z komórkami, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dostarczony protokół wykorzystuje jako przykład linię komórek wątroby. Podczas pracy w sterylnych warunkach ostrożnie otwórz fiolkę kriogeniczną, aby uwolnić nadmierne ciśnienie, a następnie pipetuj zawartość fiolki kriogenicznej do 10-mililitrowej probówki wypełnionej dziewięcioma mililitrami wstępnie podgrzanej pożywki Williamsa w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Odwirowywać roztwór przez 10 minut w temperaturze 400 razy g w temperaturze pokojowej. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawieś komórki w pięciu mililitrach zastrzeżonej pożywki do rozmrażania, wstępnie podgrzanej do 37 stopni Celsjusza i uzupełnionej glutaminą. Po policzeniu żywotnych komórek zgodnie z opisem w protokole tekstowym, zasiej komórki na 24-dołkowej płytce pokrytej kolagenem o gęstości 60 000 żywotnych komórek na dołek i końcowej objętości 0,5 mililitra pożywki do rozmrażania.

Po kilku dniach w hodowli komórki tworzą subkonlewną strukturę beleczkową. Optymalna aktywność metaboliczna jest zwykle obserwowana między siódmym a dziesiątym dniem, a najniższa w czwartym dniu. Aby przygotować zróżnicowane kultury nabłonka dróg oddechowych, należy użyć dostępnego na rynku, w pełni zróżnicowanego pierwotnego nabłonka dróg oddechowych, który został wyhodowany na granicy faz powietrze-ciecz na wkładce.

Za pomocą sterylnej pęsety delikatnie wyjmij wkładkę komórkową z matrycy agarozy i przenieś ją na nową płytkę wstępnie załadowaną 700 mikrolitrami zastrzeżonej pożywki hodowlanej. Oceń integralność tkanki dróg oddechowych za pomocą metod, do których odwołuje się protokół tekstowy, takich jak opór przeznabłonkowy lub częstotliwość uderzeń rzęsek. Przed eksperymentem należy przygotować dwie serie wkładek komórkowych dla komórek dróg oddechowych i studzienek dla komórek wątroby z co najmniej trzema powtórzeniami.

Użyj jednej serii do eksperymentu hamowania, a drugiej tylko do sondy metabolicznej. Przygotuj trzecią serię komórek jako kontrolkę ślepej próby nośnika. W dniu eksperymentu należy zastąpić pożywkę do hodowli komórkowej 450 mikrolitrami świeżej pożywki.

Dodać 50 mikrolitrów pożywki zawierającej 10-krotny inhibitor CYP do serii komórek przygotowanych do eksperymentu inhibicji i wstępnie inkubować przez 30 minut. Następnie zastąp pożywkę z serii inhibicji 450 mikrolitrami świeżej pożywki i dodaj 50 mikrolitrów pożywki zawierającej zarówno 10x inhibitor CYP, jak i 10x substrat sondy. Dodać 50 mikrolitrów pożywki z 10-krotnym substratem sondy do pozostałych komórek, a następnie dodać równoważną ilość nośnika rozcieńczonego w pożywce do kontrolnych komórek ślepych.

Po inkubacji komórek przez zero do pięciu minut przez punkt czasowy pierwszy, zerowa kontrola tła, zbierz pożywkę do oddzielnych oznakowanych probówek i zamroź pożywkę do przyszłego przetwarzania. Następnie inkubować punkt czasowy dwie komórki przez 16 godzin w inkubatorze komórkowym. Pod koniec okresu inkubacji należy zebrać pożywkę, stosując tę samą metodę oznaczania ilościowego produktu przemiany materii.

Przenieś 250 mikrolitrów pożywki inkubacyjnej do mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra i dodaj 4-metylolumbelliferon wewnętrzny roztwór podstawowy, aby osiągnąć końcowe stężenie 100 nanomolowców. Dostosuj pH pożywki do poziomu od 4,5 do 5,0, dodając jeden molowy HCl, po jednym mikrolitrze na raz. Sprawdź pH, pipetując od dwóch do 10 mikrolitrów pożywki na pasek pH, a następnie dodaj 150 jednostek betaglukuronidazy arylosulfatazy z Helix pamatia.

Po godzinnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza zatrzymaj reakcję, dodając 250 mikrolitrów zimnego metanolu. Odparować rozpuszczalnik za pomocą wirówki próżniowej w temperaturze 45 stopni Celsjusza. Rozpuść próbki w 500 mikrolitrach 30% roztworu acetonitrylu do wody.

Aby przeprowadzić kwantyfikację opartą na spektrometrii mas, dodaj 250 mikrolitrów każdego wzorca do seryjnego rozcieńczania do bursztynowej fiolki ze szkła do ultrasprawnej chromatografii cieczowej do wstrzykiwań w automatycznym próbniku UPLC-MS. Dodaj również próbki testowe do bursztynowych fiolek UPLC i umieść je w automatycznym próbniku UPLC. Po randomizacji wszystkich fiolek, uruchom UPLC-MS przy użyciu ustawień wyszczególnionych w protokole tekstowym w zależności od konkretnej sondy, która ma być oznaczona ilościowo.

Użyj narzędzia Quantitate, Build Quantitation Method w narzędziach do kwantyfikacji spektrometru mas, aby wygenerować krzywą kalibracyjną na podstawie uzyskanego wzorca syntetycznego i wzorca wewnętrznego, a następnie użyj Kreatora kwantyfikacji, aby wybrać partię próbki i próbki do ilościowego określenia i wykonania metody oznaczania ilościowego. Aby indukować CYP1A1, CYP1B1, należy użyć układu płytek znajdującego się w protokole tekstowym. Komórki przeznaczone do indukcji inkubować o końcowym stężeniu 10 nanomolowych TCDD w pożywce przez okres 72 godzin.

Po tym okresie usuń pożywkę, trzykrotnie przepłucz studzienki PBS i dodaj trochę świeżego podłoża. Przed inkubacją komórek za pomocą luminogenicznej sondy reporterowej należy wstępnie inkubować wyznaczony podzbiór indukowanych komórek przez 30 minut z inhibitorem CYP1A1, CYP1B1 w pożywce. Dodać luminogeniczny propbe, eter 6'chloroetylowy lucyferyny o końcowym stężeniu 50 mikromolów do nieindukowanych, indukowanych i indukowanych komórek z inhibitorem.

Inkubować przez cztery godziny, a następnie przenieść 25 mikrolitrów pożywki hodowlanej na białą, nieprzezroczystą płytkę 96-dołkową i dodać 25 mikrolitrów odczynnika do wykrywania lucyferyny dostarczonego przez producenta. Po inkubacji przez 20 minut w temperaturze pokojowej należy natychmiast odczytać płytkę za pomocą luminometru. Przedstawiono tutaj względną luminescencję wytwarzaną przez dealkilowanie eteru 6'chloroetylowego lucyferyny, który jest katalizowany przez CYP1A1, CYP1B1.

Przykład wykazuje brak aktywności enzymatycznej przy braku indukcji TCDD. Po indukcji TCDD, CYP1A1, aktywność CYP1B1 obserwuje się zarówno w typie komórek wątroby, jak i układu oddechowego. Wreszcie, dodanie inhibitora CYP1A1, alfa-naftoflawonu, inhibitora CYP1B1, zmniejsza lub eliminuje aktywność CYP.

Aby ocenić aktywność CYP2A6, 2A13 w typach komórek wątroby i dróg oddechowych, ilość 7-hydroksykumaryny wytwarzanej w wyniku hydroksylacji kumaryny przez enzym mierzono za pomocą UPLC LC-MS. Przy zerowej minucie inkubacji z kumaryną wykrywane jest tylko tło. Po 16 godzinach obserwuje się hydroksylację kumaryny z tworzeniem się 7-hydroksykumaryny w dwóch typach komórek.

Wreszcie, dodanie inhibitora CYP2A, 2A13 zapobiega tworzeniu się 7-hydroksykumaryny. Po opanowaniu, inkubacja sondy i kwantyfikacja w tej technice mogą być wykonane w większości przypadków w ciągu kilku godzin do nawet jednego dnia. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać różne testy metabolizmu pierwszej fazy przy użyciu różnych typów komórek, potwierdzając specyficzność enzymu za pomocą hamowania i/lub indukcji w zależności od potrzeb.

Próbując tej procedury, należy pamiętać, że różne typy komórek mogą wymagać dłuższego czasu inkubacji i ważne jest, aby uwzględnić typ komórek, który można wykorzystać jako kontrolę pozytywną. Nie zapominaj, że praca z TCDD może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak pełne środki ochrony osobistej. Implikacje tej techniki obejmują wykorzystanie odpowiednich modeli in vitro do przedklinicznej oceny nowych leków oraz oceny ryzyka związanego z chemikaliami i składnikami stosowanymi w produktach konsumenckich.