Name: Oznaczanie aktywności kinazy białkowej za pomocą znakowanego radioaktywnie ATP (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Poznaj metodę oznaczania aktywności kinaz białkowych za pomocą znakowanego radioaktywnie ATP. Ta wszechstronna technika ilościowa pozwala badać specyficzność kinaz i ich odpowiedź na różne warunki doświadczalne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują wszystkim obecnym i byłym członkom laboratorium Cobba za cenną pracę i dyskusje, a Dionne Ware za pomoc administracyjną. Badania te były wspierane przez National Institutes of Health Grant R37 DK34128 oraz Welch Foundation Grant I1243 dla M.H.C.

1. Zasoby do oczyszczania kinaz i ogólny rurociąg immunoprecypitacji
UWAGA: Kinazy do użycia z tym testem mogą być pozyskiwane z immunoprecypitatów hodowanych komórek lub za pomocą środków rekombinowanych, takich jak oczyszczanie z tagiem powinowactwa6. Poniżej znajduje się ogólny protokół immunoprecypitacji oznaczonej flagą, który może wymagać modyfikacji w zależności od kinazy będącej przedmiotem zainteresowania. Jeśli to możliwe, wszystko powinno być trzymane na lodzie.
<ol>
	<li>Dodać 2 μl przeciwciała 1 mg/ml do 200 μl lizatów komórkowych (zwykle ~1 mg/ml całkowitego stężenia białka) i inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę podczas kołysania.</li>
	<li>Przemyć kulki sefarozy białka A 2-3 razy buforem do lizy (patrz poniżej), krótko wirując w temperaturze 4 °C przez 30 s do 1 minuty przy 5 000 x g ("wirowanie dotykowe"), usuwając supernatant pipetą i ponownie umieszczając kulki w buforze.
	<ol>
		<li>Przygotuj bufor do lizy: 50 mM HEPES pH 7,7, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 10% glicerol, 0,2 mM ortowanadan sodu, 100 mM fluorek sodu, 50 mM β-glicerofosforan, 0,1% Triton X 100 lub 0,1% NP-40.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 30 μl 50% zawiesiny białka A sefarozy w buforze do lizy do lizaty; inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę podczas kołysania.</li>
	<li>Odwirować w temperaturze 4 °C, aby obrać granulki i usunąć supernatant.</li>
	<li>Przemyć 3 razy 1 ml buforu do płukania kulek (1 M NaCl, 20 mM Tris pH 7,4).</li>
	<li>Przemyć raz 1x buforem reakcyjnym kinazy (10 mM HEPES pH 8,0, 10 mM MgCl2). Usuń jak najwięcej bufora bez usuwania koralików.</li>
</ol>
2. Inicjalizacja reakcji kinazy
UWAGA: Dla testów kinazy IP, ~15 μL niezawieszonych kulek to typowa próbka wyjściowa. W przypadku testów rekombinowanej kinazy białkowej typowe ilości wyjściowe wahają się od 0,1-1,0 μg w 1-10 dla 25-50 μl końcowych objętości reakcji. Dostosuj objętość rekombinowanych próbek białek tak, aby była równa buforowi, w którym są przechowywane, przed inicjalizacją testu. W przypadku stosowania dużych ilości kinazy należy dołączyć białko nośnikowe, takie jak BSA, aby pomóc w utrzymaniu stabilności białka przez cały czas trwania testu.
<ol>
	<li>Przygotuj 5-krotny bufor reakcyjny kinazy podany poniżej: 
	50 mM HEPES pH 8,0 
	50 mM MgCl2 
	50 mM Benzamidyna (inhibitor proteazy) 
	50 mM DTT (środek redukcyjny) 
	250 μM ATP (nieoznakowane lub "zimne")</li>
	<li>Próbki kinaz należy przechowywać na lodzie w probówkach o pojemności 1,5 ml. Przygotować następującą mieszaninę reakcyjną w oddzielnych, schłodzonych probówkach o pojemności 1,5 ml: 
	21 μL H2O 
	6 μL 5x bufor reakcyjny kinazy 
	1 μl znakowanego radioizotopowo ("gorącego") ATP 
	2 μL substratu (~5 mg/mL) 
	UWAGA: W przypadku testów kinaz rekombinowanych objętość można dostosować, aby pomieścić oczyszczone białko. Obliczyć tak, aby końcowa objętość reakcji wynosiła 30 μl. Użyj tego przepisu, aby przygotować mieszankę wzorcową. Po otrzymaniu znakowanego ATP rozcieńczyć materiał wH2Odo określonej aktywności 0,01 mCi/μL przed dodaniem do mieszaniny reakcyjnej.</li>
	<li>Aby zainicjować test, dodać całą mieszaninę reakcyjną do próbki kinazy i inkubować reakcję w temperaturze 30 °C przez 5 minut do 1 godziny, w zależności od aktywności oznaczanej kinazy. 
	UWAGA: Podczas pracy z kinazą, której aktywność nie została wcześniej oznaczona, należy wykonać przebieg czasowy aktywności kinazy z 5-minutowymi przerwami między punktami czasowymi.</li>
</ol>
3. Zakończenie reakcji i SDS-PAGE
<ol>
	<li>Zatrzymaj reakcję, umieszczając ją na lodzie i dodając 7,5 μl 5x bufor próbki Laemmli 6.</li>
	<li>Podgrzewać w temperaturze 100 °C przez 30 s do 2 minut w bloku grzewczym.</li>
	<li>Odwiruj dotykowo i załaduj 20 μl na studzienkę 10-15% żelu SDS-PAGE. Uruchom żel wystarczająco długo, aby oddzielić kinazę i substrat (zwykle 1 godzinę przy stałej mocy 5 W) Upewnij się, że aparat żelowy jest ekranowany, aby ograniczyć ekspozycję do 32P.
	<ol>
		<li>Tutaj użyj domowych aparatów żelowych, ale standardowe dostępne na rynku mini-żele są doskonale odpowiednie. Użyj wymiarów w następujący sposób: 
		Żele: 8 cm szerokości, 5,5 cm długości (rozdzielcze), grubość 1,5 mm. 
		Grzebienie: 15 dołków, grubość 1,5 mm, szerokość 2,9 mm, głębokość 16 mm</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Barwienie i suszenie żelu
Uwaga: Dla wszystkich kroków upewnij się, że zmniejszysz osobiste narażenie na 32P poprzez użycie radioaktywnego ekranu i noszenie osobistego sprzętu ochronnego. Aby uzyskać więcej informacji na temat konkretnych kroków, dołączono kilka pomocnych odniesień.
<ol>
	<li>Usuń żel ze szklanych płytek / tlenku glinu i umieść w 50 ml barwnika Coomassie (10% lodowatego kwasu octowego, 50% metanolu, 0,25% barwnika R-250) na 1 godzinę na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 50 obr./min. Do tego kroku użyj pojemnika, który jest nieco większy niż sam żel. 8</li>
	<li>Przenieś żel z plamy do roztworu utrwalającego (10% lodowatego kwasu octowego, 20% metanolu) w celu odbarwienia. Ubijaj żel w 600-700 ml roztworu utrwalającego przez noc na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 50 obr./min. Umieść kawałki pianki lub zawiązanych chusteczek laboratoryjnych w pojemniku z żelem, aby wchłonąć barwnik Coomassie 8,9.</li>
	<li>Usuń żel z roztworu utrwalającego i moczyć w 200 ml metanolu przez 1-2 minuty, delikatnie mieszając, aż żel zmieni kolor na mlecznobiały. Pomoże to zapobiec pękaniu na etapie suszenia.</li>
	<li>Zwilż kawałek wysokiej jakości bibuły filtracyjnej o wymiarach 14 cm x 14 cm metanolem i umieść na suszarce próżniowej z żelem do płyt. Połóż żel na bibule filtracyjnej z przodu skierowaną do góry.</li>
	<li>Ostrożnie przykryj żel folią, aby uniknąć zmarszczek i pęcherzyków powietrza. Uruchom suszarkę na 1,5 godziny w temperaturze 80 °C. Po osiągnięciu próżni otwórz pokrywę i w razie potrzeby rozwałkuj wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą miękkiej gumowej ściernicy.</li>
</ol>
5. Autoradiogram i zliczenia scyntylacyjne
<ol>
	<li>Usuń zaschnięty żel i przymocuj marker autorad, fosforyzującą linijkę lub kropki do bibuły filtracyjnej z boku żelu. Jeśli używasz kropek, upewnij się, że są one w asymetrycznym wzorze. Spowoduje to wyrównanie żelu z filmem po naświetleniu i wywołaniu.</li>
	<li>Użyj licznika Geigera, aby sprawdzić intensywność sygnału. W przypadku słabszych sygnałów ekspozycja w temperaturze od -70 °C do -80 °C z ekranem intensyfikującym zwiększy gęstość pasma filmu.</li>
	<li>W ciemnym pomieszczeniu umieść wysuszony żel w kasecie filmowej z folią i ekranem intensyfikującym w następującej kolejności od góry do dołu: żel, folia, ekran intensyfikujący.</li>
	<li>Przymocuj sitko intensyfikujące do pokrywy kasety i przyklej żel taśmą, aby ułatwić ten krok. Ekran intensyfikujący emituje światło, gdy jest naświetlany przez cząstki beta z 32P. Te emisje światła wnikają w folię skuteczniej niż cząstki beta.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że długość fali emitowanej z ekranu intensyfikującego odpowiada długości fali, na którą film jest najbardziej wrażliwy.</li>
		<li>Użyj licznika Geigera, aby określić, na jak długo należy pozostawić ekspozycję: jeśli liczba cpm wynosi ~100 lub mniej, spróbuj przez noc w temperaturze -70 °C. Jeśli liczba wynosi ~10 000, zacznij od 1-godzinnej ekspozycji i od tego momentu optymalizuj.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu naświetlania usuń film i wywołaj w procesorze filmów medycznych/rentgenowskich. Jeśli naświetlanie przeprowadzono w temperaturze od -70 do -80 °C, pozwól kasecie ogrzać się do temperatury pokojowej, aby zminimalizować kondensację na kliszy, lub usuń film bezpośrednio przed utworzeniem kondensacji10.</li>
	<li>Połóż folię na wysuszonym żelu/bibule filtracyjnej i wyrównaj obraz markera/kropek z markerami/kropkami na wysuszonym żelu. Zaznacz na folii prążki odpowiadające wzorcom białka. Oznacz wzorce białek i pasy, w których występują reakcje, aby móc z nich skorzystać w przyszłości.</li>
	<li>Usunąć z żelu pasma odpowiadające pasmom będącym przedmiotem zainteresowania na folii i umieścić je w fiolkach scyntylacyjnych o pojemności 7 ml. Dodaj 4 ml płynu scyntylacyjnego i policz za pomocą licznika scyntylacji cieczy. Upewnij się, że licznik jest ustawiony na monitorowanie prawidłowego okna widma energii dla 32P. 
	UWAGA: Pamiętaj również, aby wyciąć pasmo odpowiadające substratowi z pasa kontroli bez kinazy. Zostanie to wykorzystane do obliczenia promieniowania tła, które zostanie odjęte od wszystkich zliczeń scyntylacyjnych próbki.</li>
</ol>
6. Analiza wyników
UWAGA: Autoradiogram dostarcza jakościowej wizualizacji wyników. W celu dokładnego określenia ilościowego można zmierzyć inkorporację 32P za pomocą licznika scyntylacyjnego. Dane są zwykle wyrażane w kategoriach względnej aktywności, jak pokazano na rysunku 1B. Tak długo, jak utrzymywane są jednolite warunki dla wszystkich próbek, względne pomiary specyficznej aktywności są wystarczające do porównania zabiegów.
<ol>
	<li>Obliczając bezwzględne wartości aktywności właściwej, należy przeprowadzić rygorystyczną optymalizację wszystkich warunków reakcji, w tym stężeń kinazy, substratu i zimnego ATP, w celu zapewnienia liniowego zakresu aktywności w czasie (np. 2 x [kinaza] = 2 x aktywność właściwa). W przypadku kinaz o wysokiej aktywności właściwej należy wykonać testy ze zwiększonym stężeniem substratu w przypadku, gdy aktywność kinazy jest ograniczona przez ilość substratu.</li>
	<li>Obliczyć aktywność właściwą kinazy będącej przedmiotem zainteresowania w jednostkach nanomoli fosforanu przenoszonego na minutę na kinazę mg.
	<ol>
		<li>Odejmij puste miejsca od cpm w zliczonych pasmach.</li>
		<li>Oblicz rozpad gorącego ATP: [(1/2)^(t / t1/2)] x 0,95 gdzie t to liczba dni od daty referencyjnej (powinna być podana przez dostawcę), t1/2 to okres półtrwania 32P, który wynosi 14,3 dnia, a 0,95 odzwierciedla wydajność licznika scyntylacyjnego. Przykład: jeśli używasz gorącego ATP, który ma 28 dni, wartość rozpadu powinna wynosić 0,245.</li>
		<li>Obliczyć pikole (pmol) całkowitego ATP w teście (zwykle jest to równe ilości zimnego ATP w reakcji): objętość testu (μL) x [zimne ATP] (μM) = całkowite ATP (pmols). Przykład: 30 μL x 50 μM = 1500 pmol</li>
		<li>Obliczać cpm/pmol ATP: [μL gorącego ATP x (2,2 x 107) x współczynnik rozpadu]/ pmol zimnego ATP. 
		UWAGA: Wartość 2,2 x 107 konwertuje 0,01 mCi/μL ATP na cpm.</li>
		<li>Obliczyć ilość kinazy w teście w mg. Zarówno w przypadku kinazy rekombinowanej, jak i kinaz immunoprecypitowanych, do określenia stężeń wyjściowych odpowiednie są standardowe metody, takie jak testy BCA. Przykład: wtERK2 0,0002 μg/μL w reakcji kinazy 50 μL wynosi 0,01 μg, czyli 1 x 10-5 mg.</li>
		<li>Oblicz całkowitą cpm w teście. Zebrać 30 μl reakcji i przeprowadzić 20 μl z każdej reakcji na żelu. Pomnóż zliczoną wartość cpm (po odjęciu ślepej próby) przez współczynnik całkowitej objętości testu/objętości załadowanego testu. Kontynuując powyższy przykład, pomnóż wszystkie liczby przez 1,5 lub 30/20.</li>
		<li>Obliczyć aktywność specyficzną badanej kinazy: 
		Całkowity cpm w teście)/(cpm/pmol ATP)/(czas testu w minutach)/(ilość kinazy w mg) 
		UWAGA: Podzielenie powyższej wartości przez 1,000 daje aktywność właściwą w nanomolach/minutę/mg</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz, ile moli fosforanu jest włączonych do substratu (o ile znana jest jego masa cząsteczkowa). Służy to do określenia liczby fosfozytów w danym białku po zakończeniu reakcji. 
	Całkowita cpm w teście)/(cpm/pmol ATP)]/(ilość substratu w pmols)</li>
</ol>

<ol><li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li>
<li>Wellbrock, C., Arozarena, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Complexity+of+the+ERK%2FMAP-Kinase+Pathway+and+the+Treatment+of+Melanoma+Skin+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 4, 33(2016).</li>
<li>Yang, T., Terman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+PKA-Mediated+Phosphorylation+of+Plexin+Using+Purified+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins.</a> Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).</li>
<li>Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+method+for+the+assay+of+many+serine%2Fthreonine-specific+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases.</a> Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).</li>
<li>Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array-based+fluorescence+assay+for+serine%2Fthreonine+kinases+using+specific+chemical+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction.</a> Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).</li>
<li>Cold Spring Harbor Protocols. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/">http://cshprotocols.cshlp.org/</a> (2016).</li>
<li>Dalby, K. N. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja9856856">Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology.</a> J Am Chem Soc. 121 (51), 12215(1999).</li>
<li>Roland, J. Coomassie Staining and Destaining. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.cytographica.com/lab/protocols/gel_destain.html">http://www.cytographica.com/lab/protocols/gel_destain.html</a> (2007).</li>
<li>Autoradiography. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography">https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography</a> (2011).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalker%2C+JM+%22The+Protein+Protocols+Handbook%22">The Protein Protocols Handbook</a>. , 3 edn, Humana Press. (2009).</li>
<li>Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WNK1%2C+a+novel+mammalian+serine%2Fthreonine+protein+kinase+lacking+the+catalytic+lysine+in+subdomain+II%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II.</a> J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).</li>
<li>McReynolds, A. C. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.biochem.6b00096">Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding.</a> Biochemistry. 55 (12), 1909-1917 (2016).</li>
<li>Carlson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+discovery+of+ERK2+substrates+identifies+ERK-mediated+transcriptional+regulation+by+ETV3%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3.</a> Sci Signal. 4 (196), rs11(2011).</li>
<li>Courcelles, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+dynamics+reveal+novel+ERK1%2F2+MAP+kinase+substrates+with+broad+spectrum+of+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions.</a> Mol Syst Biol. 9, 669(2013).</li>
<li>Myers, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Screening+and+Hit+Validation+of+Extracellular-Related+Kinase+5+%28ERK5%29+Inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb+Sci%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors.</a> ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kinazy to zróżnicowana rodzina białek, które rozwinęły rozległą funkcjonalność w wielu kontekstach, a testy kinaz były niezwykle przydatne w badaniu kilku białek sygnałowych i znacznie przyczyniły się do naszego obecnego zrozumienia komunikacji komórkowej. Warto zauważyć, że ten sam podstawowy test został użyty do scharakteryzowania dwóch różnych kinaz pomimo dużych różnic w strukturze i aktywności. Kinaza WNK1 zawiera nietypową kieszeń katalityczną, w której krytyczna lizyna przesunęła się do unikalnej pozycji i wiadomo...

Kinazy białkowe to zaawansowane enzymy niezbędne do przekazywania sygnałów komórkowych do odpowiednich odpowiedzi1. Biorąc pod uwagę ich rolę w utrzymaniu homeostazy i zapobieganiu lub promowaniu stanów chorobowych2, biochemiczne metody oceny aktywności kinaz nadal są potężnymi narzędziami do określania szczegółów sygnalizacji eukariotycznej3. Chociaż strategie wykorzystujące przeciwciała specyficzne dla fosfony były bardzo pouczające pod względem pomiaru wpływu różnych warunków leczenia na stan sygnalizacji komórkowej4, test kinazy pozwala na pomiar skutków różnych warunków leczenia bezpośrednio pod względem aktywności enzymatycznej kinazy będącej przedmiotem zainteresowania. Chociaż istnieje kilka opcji podobnych testów, które nie wykorzystują materiałów radioaktywnych5, nadal polegamy na tej metodzie w celu uzyskania solidnej oceny ilościowej wyników. Istnieją dwa typowe zastosowania tego testu, oba cenne z różnych powodów: test kinazy immunoprecypitowanej (IP) (ryc. 1) i test rekombinowanej kinazy białkowej (ryc. 2).
Test kinazy IP jest niezwykle przydatny do identyfikacji czynników zdolnych do aktywacji określonych kinaz białkowych, jak również do oceny warunków leczenia hamującego. Krótko mówiąc, kinaza znakowana epitopem, będąca przedmiotem zainteresowania, jest transfekowana do hodowanych komórek eukariotycznych, poddawana różnorodnym zabiegom, immunoprecypitowana i testowana pod kątem zdolności do włączenia znakowanego radioaktywnie fosforanu do modelowego substratu (np. zasadowego białka mieliny (MBP)). Test kinazy IP można również przeprowadzić bez uciekania się do nadekspresji, zarówno poprzez immunoprecypitację endogennego białka, jak i dowolną liczbę technik edycji genomu. Ponieważ zabiegi są podawane w hodowli, metoda ta może wykrywać stymulacje przenoszone przez wiele czynników poprzedzających lub równoległe ścieżki poprzez odczyt in vitro. Jedną z głównych zalet tej metody jest to, że nie wymaga ona wcześniejszej wiedzy na temat bezpośrednich czynników poprzedzających lub następujących po niej lub znajdujących się w nich miejsc fosforylacji. Ponadto, po zidentyfikowaniu określonych substratów dla kinazy będącej przedmiotem zainteresowania, ten sam protokół oznaczania kinaz może być stosowany ze składnikami rekombinowanymi do pomiaru specyficznej aktywności w stosunku do naturalnych substratów i identyfikacji określonych miejsc fosforylacji w połączeniu z analizą spektrometrii mas. Miejsca zidentyfikowane w ten sposób mogą być dalej weryfikowane za pomocą testów kinaz wykorzystujących mutanty substratów. Wreszcie, metoda ta może być również stosowana do wykrywania i pomiaru autofosforylacji.
Protokół tutaj przedstawiony zakłada albo zoptymalizowany schemat oczyszczania białka, albo metodę transfekcji do wyrażania kinazy o powinowactwie w hodowanych komórkach. Aby uzyskać bardziej szczegółowe informacje na temat protokołów transfekcji, lizy, immunoprecypitacji i oczyszczania białek, sugerujemy zapoznanie się z Cold Spring Harbor Protocols6. Więcej informacji na temat opracowywania i modyfikacji testów można znaleźć w artykule Fosforylacja białek: wybrane metody w enzymologii7.

<table><tbody><tr><td>Białko A Sefaroza CL-4B</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0963-03</td><td></td></tr><tr><td>Znakowane radioaktywnie [&gamma;-32P] ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG035C010MC</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610737</td><td></td></tr><tr><td>Ekranowanie radioaktywne</td><td>Produkty Międzynarodowe</td><td>BR-006</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik R-250 (Coomassie)</td><td>Thermo Fisher</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Jakościowa bibuła filtracyjna Whatman Grade 3</td><td>Whatman</td><td>1003-917</td><td></td></tr><tr><td>Suszarka próżniowa z żelem do płyt</td><td>Bio-Rad</td><td>Model 583 Suszarka żelowa #1651745&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marker Autorad</td><td>Agilent Technologies</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Linijka fosforyzująca</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8133</td><td></td></tr><tr><td>Kropki fosforyzujące</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5149</td><td></td></tr><tr><td>Licznik Geigera</td><td>Ludlum</td><td>Model 3 z detektorem</td><td></td>44-9</tr><tr><td>BioMax Kaseta 8 x 10"</td><td>Carestream Health</td><td>107 2263</td><td></td></tr><tr><td>BioMax Folia MS 8" x 10"</td> <td>Carestream Health</td><td>829 4985</td><td></td></tr><tr><td>Ekran wzmacniający BioMax MS 8" x 10"</td> <td>Carestream Health</td><td>851 8706</td><td></td></tr><tr><td>Procesor filmów medycznych/rentgenowskich</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki scyntylacyjne</td><td>Research Products International</td><td>125500</td><td></td></tr><tr><td>Płyn scyntylacyjny</td><td>MP Biomedicals</td><td>188245305</td><td></td></tr><tr><td>Beckman LS 6500 Licznik scyntylacyjny</td><td>Beckman</td><td>LS 6500</td><td></td></tr></tbody></table>

oznaczanie aktywności kinazy białkowej za pomocą znakowanego radioaktywnie atp

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Kinazy białkowe są w stanie zarządzać zmianami komórkowymi na dużą skalę w odpowiedzi na złożone zestawy bodźców, a wiele wysiłku włożono w odkrycie allosterycznych szczegółów ich regulacji. Kinazy składają się z sieci sygnałowych, których defekty są często cechami charakterystycznymi wielu form raka i chorób pokrewnych, co sprawia, że platforma testowa jest podatna na manipulację czynnikami regulacyjnymi i walidację wymagań dotyczących reakcji, co ma kluczowe znaczenie w poszukiwaniu ulepszonych środków terapeutycznych. W tym miejscu opisujemy podstawowy test kinazy, który można łatwo dostosować do konkretnych pytań eksperymentalnych, w tym między innymi do testowania działania czynników biochemicznych i farmakologicznych, manipulacji genetycznych, takich jak mutacja i delecja, a także warunków hodowli komórkowej i zabiegów w celu zbadania mechanizmów sygnalizacji komórkowej. Test ten wykorzystuje znakowane radioaktywnie [γ-32P] ATP, co pozwala na porównania ilościowe i przejrzystą wizualizację wyników, a także może być modyfikowane do stosowania z immunoprecypitowaną lub rekombinowaną kinazą, specyficznymi lub typowymi substratami, w szerokim zakresie warunków reakcji.

Analizy kinazy WNK1 po immunoprecypitacji
WNK1 z tagiem Myc przetransfekowano do komórek HEK293 i wyprecypitowano immunologicznie za pomocą przeciwciała anty-Myc1. Immunoprecypitat wykazał aktywność kinazową wobec substratu modelowego MBP, a także autokinazę (Rysunek 1A). Następnie w ten sam sposób przetestowano aktywność kinazową mutantów WNK1 wobec MBP, wykorzystując tym razem konstrukty z...

Kinazy białkowe to wysoce rozwinięte enzymy sygnalizacyjne i rusztowania, które są kluczowe dla między- i wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału. Przedstawiamy protokół pomiaru aktywności kinazy za pomocą znakowanego radioaktywnie trifosforanu adenozyny ([γ-32P] ATP), niezawodnej metody pomagającej w wyjaśnieniu regulacji sygnalizacji komórkowej.

Oznaczanie aktywności kinazy białkowej za pomocą znakowanego radioaktywnie ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Ogólnym celem niniejszego testu jest pomiar aktywności enzymatycznej kinaz białkowych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji kinaz, takie jak stopień aktywności kinazy lub jej mutantu, jej specyficzność oraz to, czy jej aktywność jest wrażliwa na różne zabiegi komórkowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona jednocześnie wszechstronna i ilościowa.Procedurę zaprezentuje Steve Stippec, naukowiec z Cobb Laboratory, który posiada duże doświadczenie w przeprowadzaniu tego testu. Aby rozpocząć, należy dodać 2 µL przeciwciała w stężeniu 1 mg/mL do 200 µL lizatów komórkowych i inkubować w temperaturze 4 °C przez jedną godzinę przy ciągłym mieszaniu na wytrząsarce. Kuleczki protein A-Sepharose należy przemyć dwa do trzech razy, dodając bufor do lizy, a następnie wirować w temperaturze 4 °C przez 30 sekund do jednej minuty przy 5000 ×g, po czym usunąć nadsącz za pomocą pipety i ponownie zawiesić kuleczki w buforze.Następnie do lizatów należy dodać 30 µL 50% zawiesiny kulek Protein A-Sepharose i buforu do lizy. Lizaty należy inkubować w temperaturze 4 °C przez jedną godzinę podczas kołysania. Następnie należy wykonać krótkie wirowanie w temperaturze 4 °C w celu osadzenia kulek i usunąć nadsącz.Przemyj koraliki trzykrotnie za pomocą 1 ml buforu do płukania koralików, a następnie wykonaj krótkie wirowanie, po czym przemyj koraliki raz za pomocą 1X buforu do reakcji kinazy. Po krótkim wirowaniu usuń jak najwięcej buforu, uważając, aby nie usunąć koralików. Aby zainicjować analizę, dodaj całą mieszaninę reakcyjną do próbki kinazy.Inkubować reakcję w temperaturze 30 °C od pięciu minut do jednej godziny, w zależności od aktywności badanego kinazy. Przerwać reakcję, umieszczając próbkę na lodzie i dodając 7,5 µL 5X buforu do próbek Laemmli, a następnie podgrzewać reakcję w temperaturze 100 °C przez trzy do pięciu minut w bloku grzejnym. Po krótkim odwirowaniu próbki, nanieść 20 µL na każdą studzienkę żelu SDS-PAGE 10-15%.Należy upewnić się, że aparat do elektroforezy żelowej jest osłonięty w celu ograniczenia ekspozycji na fosfor-32, ponieważ jest on wysokoenergetycznym emitorem beta. Przebieg elektroforezy powinien trwać wystarczająco długo, aby oddzielić kinazę od substratu. Po zakończeniu procesu należy wyjąć żel z szklanych i aluminiowych płyt, a następnie umieścić go w 50 mililitrach barwnika Coomassie na jedną godzinę w wytrząsarku orbitalnym ustawionym na 50 RPM.W tym kroku należy użyć pojemnika nieco większego niż sam żel. Aby odbarwić żel, należy przenieść go z barwnika do roztworu utrwalającego. Do pojemnika z żelem należy włożyć kawałki gąbki lub zwinięte chłonne ręczniki laboratoryjne w celu absorpcji barwnika Coomassie.Kołysz żel w 600 do 700 mililitrach roztworu utrwalającego przez noc na wytrząsarce orbitalnej przy 50 RPM. Następnego dnia wyjmij żel z roztworu utrwalającego i mocz go w 200 mililitrach metanolu przez jedną do dwóch minut przy łagodnym mieszaniu, aż żel stanie się mlecznobiały. Pomoże to zapobiec pękaniu podczas etapu suszenia.Następnie zwilż kawałek papieru filtracyjnego jakościowego o wymiarach około 14 cm na 14 cm metanolem i umieść go na suszarce próżniowej do żeli płytkowych. Połóż żel na papierze filtracyjnym stroną przednią do góry. Ostrożnie przykryj żel folią spożywczą, a następnie włącz suszarkę i zastosuj próżnię.Po osiągnięciu próżni, co następuje po zaledwie kilku sekundach, należy usunąć pęcherzyki powietrza za pomocą miękkiego gumowego wałka. Kontynuować proces przez 90 minut. Wyjąć wysuszony żel i przymocować znacznik do autoradiografii, taki jak fosforyzująca linijka lub kropka, do papieru filtracyjnego z boku żelu, a następnie umieścić go w kasecie zawierającej ekran wzmacniający.Użyj licznika Geigera, aby sprawdzić intensywność sygnału. W przypadku słabszych sygnałów naświetlanie w temperaturze od -70 °C do -80 °C z zastosowaniem ekranu wzmacniającego zwiększy gęstość prążka na kliszy. W ciemni umieść fragment kliszy na wysuszonym żelu wewnątrz kasety do klisz zawierającej ekran wzmacniający.Jeśli wartość CPM wynosi 100 lub mniej, należy spróbować naświetlania przez noc w temperaturze od -70 do -80 °C. Alternatywnie, jeśli wartość jest bliższa 10 000, należy rozpocząć od jednej godziny naświetlania i na tej podstawie zoptymalizować proces. Po zakończeniu naświetlania należy wyjąć film przed jego wywołaniem w procesorze filmów medycznych lub rentgenowskich.Zaznacz na błonie prążki odpowiadające standardom białkowym. Oznacz również standardy białkowe oraz ścieżki reakcyjne dla późniejszych odniesień. Wytnij z żelu prążki odpowiadające prążkom zainteresowania na błonie.Umieść prążki w siedmiomililitrowych fiolkach scyntylacyjnych i dodaj cztery mililitry płynu scyntylacyjnego. Zmierz prążki za pomocą licznika scyntylacyjnego z cieczą. Upewnij się, że licznik jest ustawiony na monitorowanie odpowiedniego okna widma energii dla fosforu-32.Następnie należy przeprowadzić analizę wyników zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Oczyszczone frakcje ERK2 wykorzystano w teście kinazy z MBP w obecności lub przy braku MEK1R4F, który jest konstytutywnie aktywnym stymulatorem aktywności kinazy ERK2. W podobnym eksperymencie zastosowano test kinazy MBP w celu pomiaru aktywności rekombinowanych mutantów ERK2 oczyszczonych z kultur bakteryjnych w stosunku do białka typu dzikiego.Chociaż ERK2 była w stanie ufosforylować MBP po stymulacji przez MEK1R4F, aktywność kinazy ERK2 zostaje drastycznie zniesiona w wyniku mutacji lizyny katalitycznej lub treoniny znajdującej się blisko kanonicznych miejsc podwójnej fosforylacji. ERK2 T188D oraz ERK2 T188E wykazują marginalną aktywność kinazy wobec niewielkiego elastycznego peptydu. Jednakże nie są one w stanie skutecznie ufosforylować znanych substratów ERK2, takich jak Nup153 i PDX1, co ma miejsce w przypadku ERK2 typu dzikiego.Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w ciągu jednego do dwóch dni. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania znakowanego izotopem promieniotwórczym ATP do oznaczania aktywności kinaz białkowych, co pozwoli lepiej zrozumieć sieci sygnalizacyjne, w których one uczestniczą. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby zoptymalizować protokół wytrącania aminokwasów w celu wyizolowania interesujących kinaz, uwzględniając równe ilości białka, oraz zmierzyć stężenia białek rekombinowanych, aby zapewnić dokładne porównanie aktywności kinaz.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny sygnalizacji komórkowej do eksplorowania konkretnych szlaków transdukcji i ich roli w regulacji homeostatycznej, a także ich wpływu na progresję chorób. Należy pamiętać, że praca z materiałami radioaktywnymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy zachować środki ostrożności, takie jak stosowanie osobistych środków ochrony indywidualnej.

assaying-protein-kinase-activity-with-radiolabeled-atp

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Kinaza 2 z powtórzeniami bogatymi w leucynę (LRRK2) jest dużą, wielodomenową kinazą, której mutacje stanowią najczęstszą genetyczną przyczynę choroby Parkinsona. Analiza aktywności kinazowej tego białka okazała się kluczowym narzędziem w zrozumieniu biologii i dysfunkcji tego białka. W niniejszej pracy opisano badanie aktywności kinazowej LRRK2 oraz wybranych jej mutantów in vitro, zapewniając system eksperymentalny do badania fosforylacji domniemanych substratów oraz potencjalnej dysfunkcji...

Oznaczanie aktywności kinazy LRRK2 in vitro

Opisano wpływ aktywacji izoformy kinazy białkowej C (PKC) na funkcje mitochondrialne związane z oddychaniem i fosforylacją oksydacyjną oraz na żywotność komórek. Podejście to adaptuje technikę adenowirusową w celu selektywnej nadekspresji izoform PKC w pierwotnych hodowlach komórkowych oraz szereg analiz służących do określenia funkcji mitochondriów i stanu energetycznego komórki.

Ocena funkcji mitochondriów i żywotności komórek w komórkach nerkowych z nadekspresją izoform kinazy białkowej C

Ten film demonstruje test enzymatyczny oparty na chromatografii cienkowarstwowej do określenia aktywności pirofosfokinazy przy użyciu znakowanych radioaktywnie nukleotydów. Metoda dostarcza informacji na temat syntezy nukleotydów i reakcji fosfotransferu.

Test aktywności enzymatycznej oparty na chromatografii cienkowarstwowej: technika określania aktywności pirofosfokinazy in vitro za pomocą chromatografii cienkowarstwowej

Bogate w leucynę kinazy powtórzeniowe 1 i 2 (LRRK1 i LRRK2) są wielodomenowymi białkami, które kodują zarówno domeny GTPazy, jak i kinazy, i które są fosforylowane w komórkach. W tym miejscu przedstawiamy protokół znakowania LRRK1 i LRRK2 w komórkach za pomocą ortofosforanu 32P, zapewniając w ten sposób sposób sposób sposób sposób na pomiar ich ogólnego poziomu fosforylacji komórkowej.

Znakowanie metaboliczne bogatych w leucynę kinaz powtórzeniowych 1 i 2 radioaktywnym fosforanem

Tutaj opisujemy testy biochemiczne, które mogą być użyte do scharakteryzowania zależnych od ATP enzymów przebudowujących chromatynę pod kątem ich zdolności do 1) katalizowania przesuwania się nukleosomów zależnych od ATP, 2) angażowania się w substraty nukleosomów i 3) hydrolizy ATP w sposób zależny od nukleosomu lub DNA.

Testy biochemiczne do analizy aktywności enzymów remodelujących chromatynę zależnych od ATP

Opisujemy podstawowy protokół ilościowego oznaczania aktywności ATPazy in vitro. Protokół ten można zoptymalizować w oparciu o poziom aktywności i wymagania dla danej oczyszczonej ATPazy.

Pomiar aktywności ATPazy in vitro w celu charakterystyki enzymatycznej

Przedstawiamy i demonstrujemy zoptymalizowany test wiązania nitrocelulozy, który może być użyty do ilościowego określenia autofosforylacji oczyszczonych bakteryjnych kinaz histydynowych. Nasza metoda ma kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi technikami opartymi na SDS-PAGE, stanowiąc cenną alternatywę dla charakterystyki tych ważnych białek.

Kwantyfikacja autofosforylacji bakteryjnej kinazy histydynowej przy użyciu testu wiązania nitrocelulozy

Testy konkurencji peptydowej są szeroko stosowane w różnych eksperymentach molekularnych i immunologicznych. W artykule opisano szczegółową metodę testu kinazy konkurującej z oligopeptydami in vitro i związane z nią procedury walidacyjne, które mogą być przydatne do znalezienia określonych miejsc fosforylacji.

Test konkurencji oligopeptydowej do oznaczania miejsca fosforylacji

Scharakteryzowaliśmy nowe białko kinazy za pomocą solidnych podejść biochemicznych: analiza Western Blot z dedykowanym specyficznym przeciwciałem na różnych liniach komórkowych i tkankach, interakcje za pomocą eksperymentów z koimmunoprecypitacją, aktywność kinazy wykryta przez Western Blot przy użyciu przeciwciała specyficznego dla fosfy oraz znakowanie γ[32P] ATP.

Charakterystyka na poziomie molekularnym przy użyciu solidnych podejść biochemicznych nowego białka kinazy

Ten protokół opisuje nieradioaktywny test do pomiaru aktywności kinaz polinukleotydowych (PNK) na małych substratach DNA i RNA.

Test nieradioaktywny do pomiaru fosforylacji polinukleotydów małych substratów nukleotydowych

Poznaj metodę oznaczania aktywności kinaz białkowych za pomocą znakowanego radioaktywnie ATP. Ta wszechstronna technika ilościowa pozwala badać specyficzność kinaz i ich odpowiedź na różne warunki doświadczalne.

Oznaczanie aktywności kinazy białkowej za pomocą znakowanego radioaktywnie ATP

Przeglądaj więcej filmów