Name: Wykrywanie ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczurów za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Poznaj metodę wykrywania ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczurów za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Protokół ten umożliwia badanie profili ekspresji mikroRNA w różnych warunkach patologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Miyako Shigeta za doskonałe wsparcie techniczne. Prace te były częściowo wspierane przez JSPS KAKENHI (grant nr 25461252).

Wszystkie protokoły eksperymentalne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyki zwierząt Uniwersytetu Medycznego Jichi i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi użytkowania i opieki nad zwierzętami doświadczalnymi z Przewodnika dla zwierząt laboratoryjnych Uniwersytetu Medycznego Jichi.
1. Pobieranie próbek z otrzewnej
<ol>
	<li>Zbierz następujące przedmioty: probówkę wirówkową o pojemności 50 ml z bawełną nasączoną izofluranem, arkusz korkowy, szalkę Petriego z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), nożyczki chirurgiczne i kleszcze.</li>
	<li>Poddaj szczura eutanazji z przedawkowaniem izofluoranu, a następnie spryskaj skórę brzucha szczura 70% etanolem i połóż szczura na arkuszu korka na jego grzbiecie.</li>
	<li>Wykonaj podłużne nacięcie w skórze brzucha, mięśniach i błonie otrzewnej za pomocą nożyczek i kleszczy.</li>
	<li>Podnieś błonę otrzewnową za pomocą kleszczy i wykonaj poziome nacięcia w jej górnej części wzdłuż najniższej kości żebra pod przeponą i po jej dolnej stronie w okolicy bocznej za pomocą nożyczek chirurgicznych. Następnie wykonaj boczne nacięcia podłużne, aby usunąć błonę otrzewnową z ciała za pomocą nożyczek chirurgicznych. Następnie umyj go za pomocą PBS na szalce Petriego.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy wyciąć i przyciąć 20 mg (3-5 mm2) próbek błony otrzewnej, które są odpowiednie do kolejnych kroków.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie całkowitego RNA z próbek błony otrzewnowej
UWAGA: Tutaj próbki błony otrzewnowej o wadze 20 mg są homogenizowane za pomocą homogenizatora szklanego i systemu rozdrabniania biopolimerów w kolumnie wirowej mikrowirówki. Następnie całkowity RNA z próbki błony otrzewnowej izoluje się za pomocą kolumny wirowej opartej na błonie krzemionkowej.
<ol>
	<li>Zbierz następujące elementy: 1,5 lub 2,0 ml probówek do mikrowirówek, 100% etanol, chloroform, homogenizator szklany, lód, system rozdrabniania biopolimerów w kolumnie wirowej mikrowirówki<klasa SUP = "xref">10, kolumna wirowa na bazie membrany krzemionkowej<klasa SUP = "xref">10, odczynnik do lizy na bazie fenolu/guanidyny, bufor do płukania zawierający guanidynę i etanol (bufor do płukania 1) oraz bufor do płukania zawierający etanol (bufor do płukania 2).</li>
	<li>Umieścić próbkę błony otrzewnowej o sile 20 mg w szklanym homogenizatorze i dodać 700 μl odczynnika do lizy na bazie fenolu/guanidyny.</li>
	<li>Homogenizować próbkę błony otrzewnej, powoli dociskając tłuczek do próbki, przekręcając. Powtórz ten proces kilkadziesiąt razy na lodzie, aż próbka błony otrzewnowej całkowicie rozpuści się w odczynniku do lizy na bazie fenolu/guanidyny.</li>
	<li>W celu dalszej homogenizacji przenieść homogenizowany lizat do systemu rozdrabniania biopolimerów w kolumnie wirowej mikrowirówki w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml. Następnie odwirować go w temperaturze 14 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść homogenizowany lizat do nowej probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Dodać 140 μl chloroformu do homogenizowanego lizatu i szczelnie zamknąć probówkę. Następnie mieszaj probówkę przez odwrócenie przez 15 sekund.</li>
	<li>Próbki należy inkubować przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej. Następnie odwirować je w sile 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant (zwykle 300 μl) do nowej probówki do mikrowirówki bez naruszania osadu i dodać 1,5-krotność jego objętości (zwykle 450 μl) 100% etanolu. Następnie wymieszaj próbkę przez wirowanie przez 5 s.</li>
	<li>Pobrać pipetę do 700 μl próbki do kolumny wirowej opartej na membranie krzemionkowej umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml. Zamknij zaślepkę kolumny. Następnie odwiruj go w temperaturze 15 000 x g przez 15 sekund. Po odwirowaniu wyrzucić przepływający płyn do probówki zbiorczej.</li>
	<li>Dodać 700 μl buforu płuczącego 1 do kolumny wirowej na bazie membrany krzemionkowej, aby dokładnie przepłukać próbkę. Zamknij zaślepkę kolumny. Następnie odwiruj go w temperaturze 15 000 x g przez 15 sekund. Po odwirowaniu wyrzucić przepływający płyn do probówki zbiorczej.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu płuczącego 2 do kolumny wirowej na bazie membrany krzemionkowej, aby usunąć wszelkie ślady soli. Zamknij zaślepkę kolumny. Następnie odwiruj go w temperaturze 15 000 x g przez 15 sekund. Po odwirowaniu wyrzucić przepływający płyn do probówki zbiorczej.</li>
	<li>Powtórz czynności 2.11.</li>
	<li>Ponownie odwirować kolumnę wirową na bazie membrany krzemionkowej przy 15 000 x g przez 1 minutę. Po odwirowaniu wyrzucić przepływający płyn do probówki zbiorczej.</li>
	<li>Umieść kolumnę wirową na bazie membrany krzemionkowej w nowej probówce zbiorczej o pojemności 1.5 ml. Następnie przenieś 25 μl wody wolnej od RNaz do kolumny. Zamknij zaślepkę kolumny. Pozostawić próbkę w temperaturze pokojowej na 5 minut. Następnie odwirować go w temperaturze 15 000 x g przez 1 minutę.</li>
	<li>Przenieść 25 μl eluatu zawierającego całkowite RNA do nowej probówki do mikrowirówki. Następnie przed użyciem przechowywać go w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Odwrotna transkrypcja całkowitego RNA
UWAGA: Odniesienie i przestrzeganie wytycznych Minimum Informacji do Publikacji Ilościowych Eksperymentów PCR w Czasie Rzeczywistym (MIQE) zachęca do lepszej praktyki i pomocy w uzyskiwaniu wiarygodnych i jednoznacznych wyników12. 
UWAGA: W tym przypadku łącznie 1,0 μg wyizolowanego RNA jest transkrybowane wstecznie przy użyciu odwrotnej transkryptazy, polimerazy poli(A) i startera oligo-dT.
<ol>
	<li>Zbierz następujące elementy: probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml; ośmiodołkowe probówki paskowe; Woda wolna od RNaz; lód; Zestaw do odwrotnej transkryptazy (patrz tabela materiałów)<klasa SUP="xref">11.</li>
	<li>Przygotuj roztwór mieszanki głównej, który zawiera 2,0 μl 10x mieszaniny kwasów nukleinowych, 2,0 μl mieszaniny odwrotnej transkryptazy (z zestawu) i 4,0 μl 5x buforu hi-spec, co daje łącznie 8,0 μl na probówkę.</li>
	<li>Dozować 8,0 μl roztworu mieszanki wzorcowej (z zestawu) do każdej probówki.</li>
	<li>Zmierzyć ilość całkowitego RNA za pomocą spektrofotometru. Dodać 1,0 μg wyizolowanych całkowitych RNA oczyszczonych z próbki błony otrzewnowej do każdej probówki. 
	UWAGA: qRT-PCR można przeprowadzić przy użyciu całkowitych RNA jako matrycy bez odwrotnej transkrypcji w celu kontroli jakości oczyszczonych całkowitych RNA. Jeśli jakiekolwiek DNA jest zanieczyszczone, za pomocą qRT-PCR obserwuje się nieoczekiwane produkty amplifikacji.</li>
	<li>Dodaj wodę wolną od RNaz do każdej probówki, w sumie 20 μl. Następnie dokładnie wymieszaj pipetując i odwiruj przez 15 sekund.</li>
	<li>Inkubować próbki przez 60 minut w temperaturze 37 °C. Natychmiast inkubować przez 5 minut w temperaturze 95 °C. 
	UWAGA: Ten krok można wykonać w termocyklerze.</li>
	<li>Przenieś cDNA do nowej probówki mikrowirówkowej i rozcieńcz dziesięć razy (1:10) wodą wolną od RNaz.</li>
	<li>Rozcieńczone cDNA należy tymczasowo przechowywać na lodzie i w temperaturze -80 °C przez długi czas przed użyciem.</li>
</ol>
4. qRT-PCR miRNA
UWAGA: qRT-PCR miRNA jest wykonywany przy użyciu barwnika interkalacyjnego. Zastosowano tu startery dla RNA, U6 small nuclear 2 (RNU6-2), miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 i miRNA-34a-5p.
<ol>
	<li>Zbierz następujące elementy: probówki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 ml, 96-dołkową płytkę reakcyjną do qRT-PCR, folię samoprzylepną do 96-dołkowej płytki reakcyjnej, startery specyficzne dla miRNA, zestaw PCR na bazie zielonego barwnika (patrz tabela materiałów)11 oraz przyrząd do PCR w czasie rzeczywistym.</li>
	<li>Przygotuj mieszankę wzorcową zawierającą 12,5 μl 2x mieszanki głównej PCR, 2,5 μl 5 μM każdego startera miRNA rozpuszczonego w wodzie wolnej od nukleaz i 1,25 μl 10x uniwersalnego startera dla każdej studzienki.</li>
	<li>Dozować 22,5 μl mieszanki wzorcowej do każdego dołka na 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Dodaj 2,5 μl matrycowego cDNA do każdej studzienki.</li>
	<li>Uszczelnij płytkę folią samoprzylepną do 96-dołkowej płytki reakcyjnej. Następnie odwirować płytkę o masie 1 000 x g przez 30 s.</li>
	<li>Uruchom program cykliczny PCR z urządzeniem do PCR w czasie rzeczywistym i oprogramowaniem w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Ustaw płytkę w aparacie do PCR w czasie rzeczywistym. W oprogramowaniu do PCR w czasie rzeczywistym zdefiniuj właściwości eksperymentalne (wprowadź nazwę eksperymentu, wybierz "96-dołkowe" dla eksperymentalnego typu instrumentu, wybierz "2−ΔΔCT method" dla metody oznaczania ilościowego, wybierz "SYBR green reagents" dla odczynnika, aby wykryć sekwencję docelową, wybierz "standardowa prędkość rampy" dla uruchomienia instrumentu).</li>
		<li>Następnie przypisz nazwy próbkom i docelowym miRNA w każdym dołku. Próbki są zawsze badane w dwóch lub trzech egzemplarzach, aby uzyskać wystarczającą ilość danych do walidacji wyników. Wybrać próbkę referencyjną i kontrolę endogenną. Wybierz "brak" dla barwnika, który ma być używany jako odniesienie pasywne.</li>
		<li>Wprowadzić objętość reakcji "20 μl" i następujące warunki cykliczne PCR w oprogramowaniu do PCR w czasie rzeczywistym zgodnie z instrukcjami: preinkubacja w temperaturze 95 °C przez 15 minut, a następnie 40 cykli denaturacji w temperaturze 94 °C przez 15 s, wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 30 s i przedłużenie w temperaturze 70 °C przez 30 s.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizuj dane qRT-PCR za pomocą oprogramowania urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym. Upewnij się, że próg i linia bazowa, które są automatycznie określane przez oprogramowanie, są odpowiednie w każdym dołku.</li>
	<li>Sprawdź cykl progowy docelowych miRNA w każdej próbce. Cykl progowy to przecięcie krzywej wzmocnienia i linii progowej. Następnie znormalizuj poziom ekspresji docelowych miRNA przeciwko RNU6-2 jako kontroli endogennej i oblicz względny poziom ekspresji docelowych miRNA za pomocą metody 2−ΔΔCT 13. 
	UWAGA: Należy zauważyć, że należy zweryfikować stabilność poziomu ekspresji endogennego kontrolnego miRNA. W tym eksperymencie potwierdzono, że RNU6-2 ulega ekspresji na wysokim poziomie i jest stosunkowo niezmienny w każdej grupie.</li>
</ol>

<ol><li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis%2C+function+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).</li>
<li>Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-coding+RNAs+in+Development+and+Disease%3A+Background%2C+Mechanisms%2C+and+Therapeutic+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches.</a> Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).</li>
<li>Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24407912">Noninvasive micromarkers.</a> Clin Chem. 60 (9), 1158-1173 (2014).</li>
<li>Yang, G., Yang, L., Wang, W., Wang, J., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+validation+of+extracellular%2Fcirculating+microRNAs+during+idiopathic+pulmonary+fibrosis+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression.</a> Gene. 562 (1), 138-144 (2015).</li>
<li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+miR-126+is+a+potential+biomarker+to+predict+the+onset+of+type+2+diabetes+mellitus+in+susceptible+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals.</a> Biochem Biophys Res Commun. , (2015).</li>
<li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-21+is+a+key+therapeutic+target+for+renal+injury+in+a+mouse+model+of+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes.</a> Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+urinary+cell-free+microRNA-214+as+a+diagnostic+and+prognostic+biomarker+in+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer.</a> J Surg Oncol. , (2015).</li>
<li>Morishita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiling+in+peritoneal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis.</a> Transl Res. 169, 47-66 (2016).</li>
<li>Minami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA+expression+atlas+in+male+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Data%22%5BJournal%5D)">miRNA expression atlas in male rat.</a> Sci Data. 1, 140005(2014).</li>
<li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li>
<li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+%28miRQC%29+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+guidelines%3A+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11098927">Pathophysiology of peritoneal membrane failure.</a> Perit Dial Int. 20, Suppl 4. S22-S42 (2000).</li>
<li>Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiology+of+the+peritoneal+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">The pathophysiology of the peritoneal membrane.</a> J Am Soc Nephrol. 21 (7), 1077-1085 (2010).</li>
<li>Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylglyoxal+induces+peritoneal+thickening+by+mesenchymal-like+mesothelial+cells+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol+Dial+Transplant%22%5BJournal%5D)">Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats.</a> Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).</li>
<li>Dallas, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+levels+assessed+by+oligonucleotide+microarray+analysis+and+quantitative+real-time+RT-PCR+--+how+well+do+they+correlate%3F%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate?</a> BMC Genomics. 6, 59(2005).</li>
<li>Rockett, J. C., Hellmann, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confirming+microarray+data--is+it+really+necessary%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Confirming microarray data--is it really necessary?</a> Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Korzystając z protokołu przedstawionego w tym manuskrypcie, miRNA w błonie otrzewnowej szczura udało się oczyścić i wykryć za pomocą qRT-PCR. Wiarygodność analizy danych qRT-PCR zależy od jakości oczyszczonych miRNA. W związku z tym czystość miRNA można sprawdzić przed qRT-PCR za pomocą stosunku absorbancji przy 260 nm do absorbancji przy 280 nm, którą można zmierzyć za pomocą spektrofotometru. Gdy nie można uzyskać znaczącej amplifikacji miRNA za pomocą qRT-PCR, stężenie matrycowego cDNA może być zwiększone. Stężenie ka...

MikroRNA (miRNA) to krótkie, niekodujące RNA, które po transkrypcji regulują ekspresję informacyjnego RNA (mRNA)1. Zmiany w ekspresji miRNA regulują ekspresję wielu mRNA, które odgrywają kluczową rolę w różnych stanach patologicznych, w tym raku, zapaleniu, zaburzeniach metabolicznych i zwłóknieniu2,3,4,5,6,7,8. Dlatego miRNA mają potencjał jako nowe biomarkery i cele terapeutyczne2,3,4,5,6,7,8. Profil ekspresji miRNA został określony w różnych narządach i tkankach szczura, w tym w wątrobie, sercu, płucach i nerkach9. Jednak standardowe metody oczyszczania i wykrywania miRNA w błonie otrzewnowej szczura nie zostały dobrze ugruntowane.
Ogólnym celem tego protokołu jest skuteczne oczyszczanie i wykrywanie miRNA w błonie otrzewnowej szczura. Najpierw próbkę błony otrzewnowej homogenizowano za pomocą homogenizatora szklanego, a następnie poddano działaniu systemu rozdrabniania biopolimerów w kolumnie wirowej mikrowirówki10. Następnie całkowite RNA, w tym miRNA, oczyszczono z próbki błony otrzewnej za pomocą kolumny spinowej opartej na błonie krzemionkowej10. Następnie cDNA zsyntetyzowano z oczyszczonego całkowitego RNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy, polimerazy poli(A) i startera oligo-dT11. Wreszcie, ekspresję miRNA określono za pomocą qRT-PCR przy użyciu barwnika interkalacyjnego 11. Uzasadnienie tego protokołu opiera się na wcześniejszych badaniach, które wykazały znaczne oczyszczanie i wykrywanie miRNA w tkankach w prostym procesie8,10,11. Doniesiono, że zastosowanie systemu rozdrabniania biopolimerów w kolumnie wirowej mikrowirówki i kolumnie wirowej opartej na membranie krzemionkowej może oczyścić wysokiej jakości całkowite RNA z tkanek10. Metoda syntezy cDNA z oczyszczonego całkowitego RNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy, polimerazy poli(A) i startera oligo-dT oraz metoda wykrywania ekspresji miRNA za pomocą qRT-PCR przy użyciu barwnika interkalacyjnego w tym protokole wykazały wysoką dokładność i czułość11. Ponadto jest to prosty proces, który oszczędza czas i zapobiega błędom technicznym. Dlatego protokół ten jest przydatny w badaniach, które wymagają bardzo dokładnego i czułego wykrywania miRNA w błonie otrzewnowej szczura w szerokim zakresie stanów patologicznych.

<table><tbody><tr><td>Niszczarka QIA</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>system rozdrabniania biopolimerów w mikrowirówce</td></tr><tr><td>kolumna wirowa miRNeasy Mini zestaw</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>kolumna wirowa na bazie membrany krzemionkowej</td></tr><tr><td>Odczynnik do lizy QIAzol</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>odczynnik do lizy na bazie fenolu/guanidyny</td></tr><tr><td>Bufor RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>bufor do płukania 1</td></tr><tr><td>Bufor RWT</td><td>Qiagen</td><td>1067933</td><td>wash buffer 2</td></tr><tr><td>miScript II RT kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td>zawiera 10 razy; Mieszanka nukleikowa zawierająca deoksynukleotydy, trifosforany rybonukleotydów i startery oligo-dT; miScript Mieszanka odwrotnej transkryptazy zawierająca polimerazę poli(A) i odwrotną transkryptazę oraz; Bufor miScript HiSpec</td></tr><tr><td>zestaw miScript SYBR Green PCR</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td>zawiera QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix i podkład miScript Universal Primer</td></tr><tr><td>RNU6-2&nbsp; &nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td><td>nieujawniony</td></tr><tr><td>starter miRNA-142-3p</td><td>Qiagen</td><td>MS00031451</td><td>5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3'&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>starter miRNA-21-5p</td><td>Qiagen</td><td>MS00009079</td><td>5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3'miRNA-221-3p</td></tr> <tr><td>starter</td><td>Qiagen</td><td>MS00003857</td><td>5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3'miRNA-223-3p</td></tr> <tr><td>starter</td><td>Qiagen</td><td>MS00033320</td><td>5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3'miRNA-34a-5p</td></tr> <tr><td>starter</td><td>Qiagen</td><td>MS00003318</td><td>5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3'miRNA-327</td></tr> <tr><td>starter</td><td>Qiagen</td><td>MS00000805</td><td>5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3'MicroAmp</td></tr> <tr><td>Optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna do qRT-PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4316813</td><td>96-dołkowa płytka reakcyjna</td></tr><tr><td>Optyczna folia samoprzylepna MicroAmp&nbsp;</td><td>Termo Fisher Scientific 4311971</td><td></td><td>folia samoprzylepna do 96-dołkowej płytki reakcyjnej</td></tr><tr><td>System QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>przyrząd do PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>Oprogramowanie QuantStudio 12K Flex w wersji 1.2.1.</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>oprogramowanie instrumentu do PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>methylglyoxal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0252</td><td></td></tr><tr><td>Midperic</td><td>Terumo</td><td>nie przypisać&nbsp;</td><td>płyn do dializy otrzewnowej</td></tr><tr><td>Sprague&ndash; Szczury Dawley</td><td></td><td>SLC nie są przypisane&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie ekspresji mikrorna w błonie otrzewnowej szczurów za pomocą ilościowego pcr w czasie rzeczywistym

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

MikroRNA (miRNA) to małe niekodujące RNA, które regulują ekspresję informacyjnego RNA po transkrypcji. Profil ekspresji miRNA został zbadany w różnych narządach i tkankach szczurów. Jednak standardowe metody oczyszczania miRNA i wykrywania ich ekspresji w błonie otrzewnowej szczura nie zostały dobrze ugruntowane. Opracowaliśmy skuteczną i niezawodną metodę oczyszczania i ilościowego oznaczania miRNA za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) w błonie otrzewnowej szczura. Protokół ten składa się z czterech etapów: 1) oczyszczenia próbki błony otrzewnej; 2) oczyszczanie całkowitego RNA, w tym miRNA, z próbki błony otrzewnej; 3) odwrotna transkrypcja miRNA w celu wytworzenia cDNA; oraz 4) qRT-PCR w celu wykrycia ekspresji miRNA. Korzystając z tego protokołu, udało nam się ustalić, że ekspresja sześciu miRNA (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 i miRNA-34a-5p) znacznie wzrosła w błonie otrzewnej modelu zwłóknienia otrzewnej szczura w porównaniu z tymi w grupach kontrolnych. Protokół ten może być wykorzystany do badania profilu ekspresji miRNA w błonie otrzewnowej szczurów w wielu stanach patologicznych.

Przedstawione tutaj wyniki opierają się na naszej poprzednio raportowanej analizie8. Zbadaliśmy profil ekspresji miRNA w zwłóknieniu otrzewnej. Zwłóknienie otrzewnej jest głównym powikłaniem dializy otrzewnowej. Charakteryzuje się utratą monowarstwy komórek mezotelialnych i nadmiernym gromadzeniem składników macierzy zewnątrzkomórkowej oraz wiąże się z niewydolnością błony otrzewnej14,15. Model szczurzy zwł...

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczura za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Metoda ta nadaje się do badania profilu ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczura w kilku stanach patologicznych.

Wykrywanie ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczurów za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomyślne oczyszczenie i detekcja miRNA w błonie otrzewnej szczura. Aby rozpocząć procedurę, po znieczuleniu inhalacyjnym 4% isoflurane, spryskać skórę brzucha szczura 70% ethanol i unieruchomić go na plecach na arkuszu korkowym.Następnie, używając nożyczek i pincety, wykonaj podłużne nacięcie skóry brzusznej, mięśni oraz błony otrzewnej zwierzęcia. Chwyć błonę otrzewną pincetą i wykonaj poziome nacięcia w jej górnej części wzdłuż najniższego żebra pod przeponą oraz w jej dolnej części w obszarze bocznym, używając nożyczek chirurgicznych.Następnie, używając nożyczek chirurgicznych, wykonaj boczne nacięcia wzdłużne, aby usunąć błonę otrzewną z ciała. Następnie przemyj ją roztworem PPS w szalce Petriego. Wytnij i przytnij próbkę błony otrzewnej o masie 20 mg.W tej procedurze należy umieścić 20 mg próbki błony otrzewnej w szklanym homogenizatorze. Następnie należy dodać 700 µL odczynnika lizującego na bazie guanidyny i fenolu. Po tym czasie próbkę błony otrzewnej należy homogenizować w lodzie, powoli naciskając tłuczek na próbkę z jednoczesnym obracaniem.Powtarzaj ten proces kilkadziesiąt razy, aż próbka błony otrzewnej całkowicie rozpuści się w odczynniku lizującym opartym na guanidynie fenolu. W celu dalszej homogenizacji przenieś zhomogenizowany lizat do systemu rozdrabniania biopolimerów w kolumnie wirówki mikrocentryfugi w probówce zbiorczej o pojemności 2 mL. Następnie wiruj go z prędkością 14 000 ×g przez trzy minuty w temperaturze 4 °C.Następnie przenieś zhomogenizowany lizat do nowej probówki do mikrowirówki. Dodaj 140 µL chloroformu do zhomogenizowanego lizatu i szczelnie zamknij probówkę. Następnie wymieszaj zawartość probówki, odwracając ją przez 15 sekund.Następnie inkubuj próbkę przez dwie do trzech minut w temperaturze pokojowej. Po tym czasie odwiruj ją przy 12 000 ×g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś 300 µl supernatantu do nowej probówki do mikrocentryfugi, nie naruszając osadu.Następnie dodać 450 µL 100% etanolu. Próbkę wymieszać w wirówce typu vortex przez pięć sekund. Kolejnym krokiem jest pipetowanie do 700 µL próbki do kolumny wirówkowej z membraną silikonową, umieszczonej w probówce do zbierania o pojemności 2 mL, i zamknięcie nakrętki.Następnie odwiruj próbkę z prędkością 15 000 ×g przez 15 sekund. Po wirowaniu odlej ciecz z probówki zbiorczej. Do kolumny wirówkowej z membraną krzemową dodaj 700 µL buforu do przemywania 1, aby rygorystycznie przemyć próbkę, a następnie zamknij nakrętkę.Wirować przy 15 000 ×g przez 15 sekund. Po wirowaniu odrzucić przesącz z probówki zbiorczej. Dodać 500 µL buforu płuczącego 2 do kolumny wirowej z membraną krzemionkową, aby usunąć wszelkie ślady soli, a następnie zamknąć nakrętkę.Następnie odwiruj próbkę z prędkością 15 000 ×g przez 15 sekund. Po odwirowaniu odrzuć ciecz przefiltrowaną wraz z probówką zbiorczą i powtórz tę procedurę. Następnie ponownie odwiruj koluminkę wirową z membraną krzemionkową z prędkością 15 000 ×g przez jedną minutę.Po wirowaniu należy wyrzucić probówkę zbiorczą oraz wszelki przesącz. Kolumienkę wirówkową z membraną krzemionkową należy umieścić w nowej probówce zbiorczej o objętości 1,5 ml. Następnie należy nanieść 25 µL wody wolnej od RNaz na kolumienkę i zamknąć nakrętkę.Pozostaw próbkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Odwiruj ją z prędkością 15 000 ×g przez jedną minutę. Następnie przenieś 25 µL nadsączu zawierającego całkowite RNA do nowej probówki do mikrocentryfugi i przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu użycia.W tej procedurze należy przygotować roztwór master mix zawierający 2 µL 10x nucleic acid mix, 2 µL reverse transcriptase mix oraz 4 µL 5x Hispec buffer, co daje łącznie 8 µL na probówkę. Następnie należy odmierzyć 8 µL roztworu master mix do każdej probówki. Ilość całkowitego RNA należy zmierzyć za pomocą spektrofotometru.Następnie do każdej probówki dodaj jeden mikrogram wyizolowanego całkowitego RNA, oczyszczonego z próbki błony otrzewnej. Po tym dodaj do każdej probówki wodę wolną od RNaz, aby uzyskać końcową objętość 20 mikrolitrów. Następnie wymieszaj zawartość poprzez pipetowanie i wiruj przez 15 sekund.Następnie inkubuj próbkę przez 60 minut w temperaturze 37°C. Potem inkubuj ją przez pięć minut w temperaturze 95°C. Przenieś nowo otrzymane cDNA do nowej probówki do mikrocentryfugi i rozcieńcz je 10-krotnie wodą wolną od RNaz.W tej procedurze należy przygotować master mix dla każdej studni, zawierający 12,5 µL 2x PCR master mix, 2,5 µL każdego z primerów miRNA o stężeniu 5 µM rozpuszczonych w wodzie wolnej od nukleaz oraz 1,25 µL 10x universal primer. Do każdej studni płytki 96-dołkowej należy nalać 22,5 µL tego master mixu. Następnie do każdej studni należy dodać 2,5 µL matrycy cDNA.Uszczelnij 96-dołkową płytkę reakcyjną kawałkiem folii. Następnie wiruj ją z prędkością 1 000 ×g przez 30 sekund. Aby uruchomić program cykli PCR, umieść płytkę w urządzeniu do PCR w czasie rzeczywistym.W oprogramowaniu do real-time PCR zdefiniuj parametry eksperymentu. Następnie przypisz nazwy do próbek i docelowych miRNA w każdej studzience. Wprowadź w oprogramowaniu do real-time PCR objętość reakcji 20 µL oraz następujące warunki cykli PCR zgodnie z instrukcjami.Preinkubacja w temperaturze 95 °C przez 15 minut. Następnie 40 cykli denaturacji w 94 °C przez 15 sekund, przyłączania w 55 °C przez 30 sekund oraz elongacji w 70 °C przez 30 sekund. Na podstawie przesiewu mikromacierzy miRNA ustalono, że poziomy sześciu miRNA są znacznie podwyższone w błonie otrzewnej szczurów z włóknieniem otrzewnej w porównaniu ze szczurami mock oraz szczurami kontrolnymi, co potwierdzono za pomocą qRT-PCR zgodnie z protokołem przedstawionym w niniejszym opracowaniu.

detection-microrna-expression-peritoneal-membrane-rats-using

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) jest szybką i czułą metodą badania poziomów ekspresji różnych cząsteczek mikroRNA (miRNA) w próbkach nowotworowych. Zastosowanie tej metody pozwala na amplifikację, kwantyfikację i analizę ekspresji setek różnych cząsteczek miRNA z tej samej matrycy cDNA.

Wykrywanie mikroRNA w guzach prostaty za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

Mikroglią są rezydentne makrofagi, które stanowią pierwszą linię obrony i nadzoru immunologicznego ośrodkowego układu nerwowego. MikroRNA to cząsteczki regulacyjne, które odgrywają istotną rolę w wielu procesach fizjologicznych, w tym w aktywacji i różnicowaniu makrofagów. W niniejszym artykule opisujemy metodę pomiaru mikroRNA w mikroglii.

Wykrywanie mikroRNA w mikrogleju za pomocą PCR w czasie rzeczywistym w prawidłowym OUN oraz podczas neurostanu zapalnego

Opisujemy protokół PCR w czasie rzeczywistym do profilowania mikroRNA w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Z wyjątkiem protokołów ekstrakcji RNA, procedura może zostać rozszerzona na RNA wyekstrahowane z innych płynów ustrojowych, hodowanych komórek lub próbek tkanek.

Profilowanie mikroRNA płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Krążące mikroRNA pojawiły się ostatnio jako obiecujące i nowe biomarkery dla różnych nowotworów i innych chorób. Celem tego artykułu jest omówienie trzech różnych platform i metod PCR w czasie rzeczywistym opartych na sondach, które są dostępne do ilościowego określania i określania obfitości krążących mikroRNA.

Oparte na sondzie podejścia PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego pomiaru mikroRNA

Opisujemy tutaj prosty protokół izolacji mysich makrofagów otrzewnowych. Po tej procedurze następuje ekstrakcja RNA w celu przeprowadzenia analizy ekspresji genów po stymulacji receptorów Toll-podobnych.

Izolacja mysich makrofagów otrzewnowej w celu przeprowadzenia analizy ekspresji genów po stymulacji receptorów toll-podobnych

Ten raport opisuje protokół pomiaru bezwzględnych poziomów miRNA w osoczu, przy użyciu ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym z lub bez wstępnej amplifikacji. Protokół ten pozwala lepiej zrozumieć ilość miRNA w osoczu i umożliwia jakościową ocenę odpowiednich danych z różnych badań lub laboratoriów.

Bezwzględna kwantyfikacja poziomów mikroRNA w osoczu u małp Cynomolgus przy użyciu ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym

Ten artykuł przedstawia protokół wykrywania ekspresji mikroRNA w nerkach mysiego modelu ostrego uszkodzenia nerek za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Protokół ten kładzie nacisk na mysi model niedokrwiennego uszkodzenia nerek i staranną ekstrakcję próbek mikroRNA.

Ilościowa metoda wykrywania mikroRNA w nerce mysiego modelu niedokrwiennego uszkodzenia nerki

Opisujemy metodę oceny ekspresji mikroRNA w nerkach myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu (UUO) za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją. Protokół ten jest odpowiedni do badania profili ekspresji mikroRNA nerek u myszy z UUO oraz w kontekście innych stanów patologicznych.

Ilościowa ocena ekspresji mikroRNA PCR w czasie rzeczywistym w nerce myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu

mikroRNA biorą udział w patogenezie nefropatii IgA. Opracowaliśmy niezawodną metodę wykrywania poziomów ekspresji mikroRNA w nerkach mysiego modelu nefropatii IgA (myszy HIGA). Ta nowa metoda ułatwi sprawdzenie udziału miRNA w nefropatii IgA.

Wykrywanie ekspresji mikroRNA w nerkach myszy nefropatycznych z immunoglobuliną A

Przedstawiamy metodę oceny ekspresji mikroRNA w nerkach i surowicy myszy z zależną od wieku niewydolnością nerek za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją.

Ilościowa ocena reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym ekspresji mikroRNA w nerkach i surowicy myszy z zależną od wieku niewydolnością nerek

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Poznaj metodę wykrywania ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczurów za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Protokół ten umożliwia badanie profili ekspresji mikroRNA w różnych warunkach patologicznych.

Wykrywanie ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczurów za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Przeglądaj więcej filmów