Wykrywanie ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczurów za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Ogólnym celem tej procedury jest skuteczne oczyszczenie i wykrycie miRNA w błonie otrzewnowej szczura. Aby rozpocząć tę procedurę, po znieczuleniu wziewnym z 4% izofluranem. Spryskaj skórę brzucha szczura 70% etanolem i zamontuj go na arkuszu korka, na jego grzbiecie.

Następnie wykonaj podłużne nacięcie w skórze brzucha, mięśniach i błonie otrzewnej zwierzęcia za pomocą nożyczek i kleszczy. Podnieś błonę otrzewnową za pomocą kleszczy i wykonaj poziome nacięcia w jej górnej części wzdłuż najniższej kości żebrowej pod przeponą. A na jego dolnej stronie w okolicy bocznej za pomocą nożyczek chirurgicznych.

Następnie wykonaj boczne podłużne nacięcia, aby usunąć błonę otrzewnową z ciała za pomocą nożyczek chirurgicznych. Następnie umyj go PPS na szalce Petriego. Wytnij i przytnij 20 miligramów próbki błony otrzewnej.

W tej procedurze należy umieścić 20-miligramową próbkę błony otrzewnowej w szklanym homogenizatorze. I dodaj 700 mikrolitrów odczynnika do lizy na bazie fenolu i guanidyny. Następnie homogenizuj próbkę błony otrzewnowej na lodzie, powoli dociskając tłuczek do próbki ze skręcaniem.

Powtórz ten proces kilkadziesiąt razy, aż próbka błony otrzewnej całkowicie rozpuści się w odczynniku do lizy na bazie fenolu guanidyny. W celu dalszej homogenizacji przenieść homogenizowany lizat do systemu rozdrabniania biopolimerów w kolumnie wirowej mikrowirówki w dwumililitrowej probówce zbiorczej. Następnie odwiruj go w temperaturze 14 000 razy G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie przenieś homogenizowany lizat do nowej mikroprobówki wirówkowej. Dodaj 140 mikrolitrów chloroformu do homogenizowanego lizatu i szczelnie zamknij probówkę. Następnie mieszaj probówkę przez odwrócenie przez 15 sekund.

Następnie inkubować próbkę przez dwie do trzech minut w temperaturze pokojowej. Następnie odwiruj go w temperaturze 12 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść 300 mikrolitrów supernatantu do nowej probówki do mikrowirówki, nie naruszając osadu.

I dodaj 450 mikrolitrów 100% etanolu. Następnie wymieszaj próbkę, wirując przez pięć sekund. Następnie odpipetować do 700 mikrolitrów próbki do kolumny wirowej opartej na membranie silikonowej, umieścić w dwumililitrowej probówce zbiorczej i zamknąć nakrętkę.

Następnie odwiruj go w temperaturze 15 000 razy G przez 15 sekund. Po odwirowaniu wyrzuć przepływ z probówki zbiorczej. Następnie dodać 700 mikrolitrów buforu płuczącego 1 do kolumny wirowej na bazie membrany silikonowej, aby dokładnie przepłukać próbkę i zamknąć nakrętkę.

Odwirować go w temperaturze 15 000 razy G przez 15 sekund. Po odwirowaniu wyrzuć przepływ z probówki zbiorczej. Dodać 500 mikrolitrów buforu płuczącego 2 do kolumny wirowej opartej na membranie krzemionkowej, aby usunąć wszelkie ślady soli i zamknąć nakrętkę.

Następnie odwiruj go w temperaturze 15 000 razy G przez 15 sekund. Po odwirowaniu wyrzuć przepływ i probówkę zbiorczą i powtórz tę procedurę ponownie. Następnie ponownie odwirować kolumnę wirową na bazie membrany krzemionkowej pod ciśnieniem 15 000 G przez jedną minutę.

Po odwirowaniu wyrzucić probówkę zbiorczą i wszelki przepływ. Umieść kolumnę wirową opartą na membranie krzemionkowej w nowej, jednopunktowej pięciomililitrowej probówce zbiorczej. Następnie przenieś 25 mikrolitrów wody wolnej od RNaz na kolumnę i zamknij nakrętkę.

Pozostawić próbkę w temperaturze pokojowej na pięć minut. Odwirować go w temperaturze 15 000 razy G przez jedną minutę. Następnie przenieś 25-mikrolitrową alouette zawierającą całkowite RNA do nowej probówki mikrowirówki i przechowuj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przed użyciem.

W tej procedurze przygotuj główny roztwór mieszanki, który zawiera dwa mikrolitry 10-krotnej mieszaniny kwasów nukleinowych, dwa mikrolitry mieszaniny odwrotnej transkryptazy i cztery mikrolitry 5-krotnego buforu Hispec, co daje w sumie 8 mikrolitrów na probówkę. Następnie dozuj 8 mikrolitrów roztworu mieszanki głównej do każdej probówki. Zmierz ilość całkowitego RNA za pomocą spektrofotometru.

Następnie dodaj jeden mikrogram wyizolowanego całkowitego RNA, oczyszczonego z próbki błony otrzewnej, do każdej probówki. Następnie dodaj wodę wolną od RNaz do każdej probówki, aby uzyskać łącznie 20 mikrolitrów. Następnie dokładnie wymieszaj go pipetując i odwirowując przez 15 sekund.

Następnie inkubować próbkę przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie inkubuj go przez pięć minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza. Przenieś nowo wygenerowane cDNA do nowej mikroprobówki wirówkowej i rozcieńcz ją 10 razy wodą wolną od RNazy.

W tej procedurze należy przygotować mieszankę wzorcową zawierającą 12 punktów pięć mikrolitrów 2x mieszanki głównej PCR, dwa pięć mikrolitrów pięciu mikromolów każdego startera miRNA rozpuszczonego w wodzie wolnej od nukleaz i jeden punkt dwa pięć mikrolitrów 10x uniwersalnego startera dla każdej studzienki. Dozuj 22 przecinki po pięć mikrolitrów tej mieszanki wzorcowej do każdego dołka na 96-dołkowej płytce. Następnie dodaj dwa przecinki po pięć mikrolitrów matrycy cDNA do każdej studzienki.

Uszczelnij 96-dołkową płytkę reakcyjną kawałkiem folii. Następnie odwirować go w temperaturze 1 000 razy G przez 30 sekund. Aby uruchomić program cykliczny PCR, ustaw płytkę w przyrządzie do PCR w czasie rzeczywistym.

W oprogramowaniu do PCR w czasie rzeczywistym zdefiniuj właściwości eksperymentalne. Następnie przypisz nazwy do próbek i docelowych miRNA w każdej studzience. Następnie w czasie rzeczywistym oprogramowanie PCR wprowadza objętość reakcji 20 mikrolitrów i następujące warunki cyklu PCR zgodnie z instrukcjami.

Wstępna inkubacja w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 15 minut. A następnie 40 cykli denaturacji w temperaturze 94 stopni Celsjusza przez 15 sekund i klęczenie w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez 30 sekund oraz rozciąganie w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 30 sekund. Na podstawie miRNA, badań przesiewowych mikromacierzy, stwierdzono, że poziomy sześciu miRNA są znacznie zwiększone w błonie otrzewnowej szczurów ze zwłóknieniem otrzewnej, w porównaniu z tymi u szczurów pozorowanych i szczurów kontrolnych, przy użyciu QRTCPR, zgodnie z protokołem przedstawionym w tym manuskrypcie.