Name: Wszechstronna metoda modelowania białek i komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Poznaj metodę wypełniania mikrokanalików komórkami i substratami przy użyciu niskiego ciśnienia próżniowego. Ta technika umożliwia badanie interakcji komórkowych w biologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Fundusze na te badania zostały zapewnione przez New Jersey Commission on Spinal Cord Research (NJCSCR) (dla FHK), grant CSCR14IRG005 (dla BLF), grant NIH grant R15NS087501 (dla CHC) oraz Fundację F.M. Kirby'ego (dla ETA).

UWAGA: Proszę zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS) przed użyciem. Niektóre substancje chemiczne użyte w tym protokole są toksyczne i rakotwórcze. Podczas stosowania materiałów toksycznych lub kwasowych/zasadowych należy stosować wszystkie odpowiednie praktyki bezpieczeństwa (dygestorium, komora podręczna) i środków ochrony osobistej (okulary ochronne, rękawice, fartuch laboratoryjny, długie spodnie, buty z zakrytymi palcami).
1. Wytwarzanie wzorcowych form do miękkiej litografii za pomocą fotolitografii
<ol>
	<li>Narysuj układ mikrokanału za pomocą narzędzia do rysowania wspomaganego komputerowo (CAD).</li>
	<li>Wydrukuj układ na czystej płycie maski za pomocą laserowego programu do zapisywania masek.</li>
	<li>Opłucz 4-calową płytkę krzemową acetonem, a następnie izopropanolem i osusz pistoletem pneumatycznym z azotem, aby upewnić się, że na płytce nie pozostał rozpuszczalnik</li>.
	<li>Wafel odwodnić, piecząc go na gorącej płycie w temperaturze 200 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Wybierz fotorezystor ujemny zaprojektowany dla żądanej wysokości mikrokanałów. Na przykład użyj fotorezystu ujemnego SU-8 50, aby uzyskać mikrokanały o wysokości 50 μm.</li>
	<li>Pozwól wafli ostygnąć do temperatury pokojowej, a następnie wyrównaj wafel na uchwycie wirówki.</li>
	<li>Dozuj 4 ml (1 ml / cal średnicy płytki) ujemnego fotorezystu na środek płytki.</li>
	<li>Odwiruj wafel dwuetapowym cyklem wirowania za pomocą wirówki. Najpierw zastosuj cykl rozsiewania 500 obr./min z przyspieszeniem 100 obr./min przez 10 s. Następnie zastosuj cykl wirowania 2 000 obr./min z przyspieszeniem 300 obr./min2 przez 30 s, aby uzyskać 50 μm powłokę fotorezystu na płytce.</li>
	<li>Wafelek upieczemy na miękko w dwóch krokach na gorącej płycie zgodnie ze wskazówkami producenta. Aby uzyskać powłokę fotorezystu o grubości 50 μm, najpierw wstępnie upiecz wafel w temperaturze 65 °C przez 6 minut, a następnie natychmiast zwiększ temperaturę płyty grzejnej, aby po upieczeniu płytki w temperaturze 95 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Pozwól wafli ostygnąć do temperatury pokojowej, a następnie załaduj ją na stolik litograficzny.</li>
	<li>Wyrównaj maskę na płytce za pomocą wyrównywacza maski i wystaw wafel na działanie światła UV (zgodnie z instrukcjami producenta) o intensywności 1,5 mW/cm2 przez 146 s, aby zastosować całkowitą dawkę UV 220 mJ/cm2 wymaganą dla warstwy fotorezystu o grubości 50 μm.</li>
	<li>Nałóż piec po ekspozycji na wafel w dwóch krokach na gorącej płycie. Aby uzyskać powłokę fotorezystu o grubości 50 μm, najpierw wstępnie upiecz wafel w temperaturze 65 °C przez 1 minutę i natychmiast zwiększ temperaturę płyty grzejnej, aby upiec go w temperaturze 95 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Rozwiń wafel, zanurzając go w wywoływaczu SU-8 i delikatnie potrząsając, aż cechy staną się wyraźne na płytce. Wywołaj wafel przez ~6 minut dla fotorezystu o grubości 50 μm.</li>
	<li>Spłucz nadmiar wywoływacza izopropanolem i etanolem, a następnie wysusz wafel za pomocą pistoletu pneumatycznego z azotem.</li>
	<li>Wafel silikonowy pieczemy na twardo na płycie grzejnej w temperaturze 150 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Umieścić wafel w eksykatorze z 25 μl środka silanizującego tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylo-1-trichlorosilanu. 
	UWAGA: Środek silanizujący ma działanie, dlatego powinien być stosowany w dygestorium kwasowo-zasadowym, z odpowiednimi środkami ochrony osobistej (okulary ochronne, rękawice, fartuch laboratoryjny, spodnie na całej długości, buty z zakrytymi palcami).</li>
	<li>Zastosuj próżnię na 5 minut i wystawij wafel na działanie oparów silanu przez 30 minut bez uwalniania próżni.</li>
	<li>Przełóż wafel na szalkę Petriego o odpowiedniej wielkości.</li>
</ol>
2. Wytwarzanie form wzorcowych do miękkiej litografii za pomocą taśmy klejącej
<ol>
	<li>Narysuj układ mikrokanału za pomocą narzędzia do rysowania CAD i wydrukuj rysunek na białym papierze.</li>
	<li>Wyczyść szkiełko wystarczająco duże, aby pomieścić konstrukcję, za pomocą izopropanolu, a następnie wysusz szkiełko za pomocą pistoletu pneumatycznego.</li>
	<li>Przymocuj taśmę klejącą do oczyszczonego szkiełka podstawowego. Uważaj, aby nie uwięzić żadnych pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Przyklej boki szklanego szkiełka do papieru z wzorem, taśmą do góry.</li>
	<li>Użyj skalpela, aby przeciąć taśmę na szkiełku, używając wzoru papieru jako odniesienia, a następnie odklej taśmę z niechcianych obszarów szkiełka.</li>
	<li>Przepłukać szkiełko izopropanolem, a następnie wysuszyć pistoletem pneumatycznym. Piecz szkiełko w piekarniku w temperaturze 65 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Delikatnie przetocz taśmę gumowym wałkiem, aby usunąć pęcherzyki powietrza i pozwól szkiełku ostygnąć do temperatury pokojowej.</li>
</ol>
3. Produkcja miękkiej litografii urządzeń PDMS
<ol>
	<li>Wymieszać elastomer PDMS i jego utwardzacz w stosunku 10:1 (w:w), energicznie wymieszać mieszaninę, a następnie odgazować mieszaninę, umieszczając ją w komorze próżniowej, aż w mieszaninie nie pojawią się pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Wlej mieszaninę na silanizowaną formę silikonową lub formę z taśmą klejącą na szalce Petriego, aby uzyskać warstwę PDMS o grubości ~2 mm i odgazowuj, aż wszystkie pęcherzyki powietrza znikną.</li>
	<li>Utwardzić PDMS w piecu w temperaturze 65 °C przez 2 godziny.</li>
	<li>Za pomocą skalpela odetnij warstwę PDMS w odległości co najmniej 5 mm od elementów, a następnie oderwij utwardzony PDMS od formy za pomocą pęsety.</li>
	<li>Przebić pojedynczy otwór wlotowy dziurkaczem do biopsji o średnicy 1 mm w dowolnym miejscu mikrokanału, najlepiej na końcu sieci mikrokanałów, jak pokazano na rysunkach 2a i 4b.</li>
	<li>Wyczyść odlew PDMS taśmą samoprzylepną, aby usunąć cząsteczki kurzu zaadsorbowane na urządzeniu. Wysterylizuj urządzenie mikrokanałowe PDMS (odlew PDMS), spłukując roztworem 70% etanolu, a następnie sterylną wodą dejonizowaną (DI) i wystawiając na działanie promieniowania UV przez 30 minut.</li>
	<li>Sterylne urządzenie PDMS należy przechowywać na sterylnej szalce Petriego do czasu użycia.</li>
</ol>
4. Wzór podłoża
<ol>
	<li>Umieść sterylny odlew PDMS za pomocą pęsety na sterylnym szklanym szkiełku nakrywkowym lub szalce Petriego i delikatnie dociśnij końcówką pęsety. 
	UWAGA: Odlew PDMS tworzy konforemne, ale odwracalne uszczelnienie ze szklanym szkiełkiem nakrywkowym lub szalką Petriego tworzącą mikrokanaliki bez użycia kleju.</li>
	<li>Umieścić kroplę (20 - 40 μl) roztworu podłoża na wlocie, całkowicie zakrywając otwór wlotowy. Wzór poli-D-lizyny (PDL), umieszczając 20 μl kropli PDL w buforze tetraboranu sodu na wlocie mikrokanałów.</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego w próżni ~254 mmHgA (odpowiednik próżni domowej w laboratoriach biologicznych) na 10 minut i obserwuj powietrze wydobywające się z kanału w postaci pęcherzyków.</li>
	<li>Zwolnij próżnię i obserwuj, jak roztwór substratu wpływa do mikrokanału.</li>
	<li>Inkubować naczynie w odpowiednich warunkach dla przylegania podłoża. Patrz tabele 1 i 2, aby zapoznać się z warunkami inkubacji (różnią się one w zależności od podłoża). W celu wykonania wzoru PDL inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Ostrożnie odklej stempel PDMS za pomocą sterylnej pęsety i trzykrotnie umyj wzór na szklanym szkiełku nakrywkowym wodą DI.</li>
	<li>Dodać 1% roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do szalki Petriego, aby przykryć szalkę lub szkiełko nakrywkowe i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Zmniejszy to niespecyficzne przyleganie w obszarach niepowlekanych.</li>
	<li>Odessać 1% roztwór BSA, a wzorzyste podłoże jest teraz gotowe do użycia.</li>
</ol>
5. Pośrednie wzorowanie komórek
<ol>
	<li>Przygotować zawiesinę komórkową w pożywce hodowlanej bez surowicy. Typ komórki i gęstość komórek są wymienione w tabeli 1.</li>
	<li>Dodaj zawiesinę komórkową do wzorzystej szalki Petriego i całkowicie zanurz wzorzysty obszar w zawiesinie komórek.</li>
	<li>Inkubować szalkę Petriego w temperaturze 37 °C w inkubatorze przez 15 minut, aby umożliwić komórkom przyczepienie się do podłoża wzorzystego.</li>
	<li>Odessać nadmiar zawiesiny komórkowej z szalki Petriego i trzykrotnie przemyć wzorzyste komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), delikatnie potrząsając przez 10 sekund w celu usunięcia nieprzyłączonych komórek.</li>
	<li>Dodać odpowiednią pożywkę do wzorzystych kultur komórkowych i inkubować wzorzyste komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 .</li>
</ol>
6. Bezpośrednie wzorowanie komórek
UWAGA: Ta technika jest alternatywą dla pośredniego wzorcowania komórek opisanego w kroku 5. Jednak w przeciwieństwie do kroku 5, w tej technice komórki są wzorowane na powierzchniach kultur tkankowych z powłoką substratową lub bez.
<ol>
	<li>Wysterylizuj urządzenie mikroprzepływowe, spłukując je roztworem 70% etanolu, a następnie wodą DI.</li>
	<li>Namocz urządzenie na noc w roztworze 1% BSA, aby zapobiec przyleganiu komórek do PDMS.</li>
	<li>Wysuszyć urządzenie w temperaturze pokojowej i przymocować je do dna szalki Petriego poddanej działaniu kultur tkankowych.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę komórkową w pożywkach hodowlanych bez surowicy. Typ komórki i gęstość komórek są wymienione w tabeli 2.</li>
	<li>Umieść kroplę (4 - 8 μl) zawiesiny komórek, wystarczającą do wypełnienia mikrokanalików, na wlocie, całkowicie zakrywając otwór wlotowy.</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego w próżni na 10 minut i obserwuj, jak powietrze wydobywa się z kanału w postaci bąbelków. Zwolnij podciśnienie i obserwuj zawiesinę komórek wpływającą do mikrokanału.</li>
	<li>Inkubować szalkę Petriego w inkubatorze, aby pobudzić adhezję komórek zgodnie z warunkami inkubacji (w zależności od rodzaju wzoru komórek) wymienionymi w tabeli 2. Dodaj PBS do szalki Petriego, zanurzając urządzenie PDMS.</li>
	<li>Ostrożnie oderwij PDMS od szalki Petriego pęsetą i umyj wzór PBS. Dodać pożywkę do hodowli komórkowych na szalkę Petriego i umieścić kulturę komórkową w inkubatorze.</li>
</ol>

<ol><li>Kane, R. S., Takayama, S., Ostuni, E., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+proteins+and+cells+using+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Patterning proteins and cells using soft lithography.</a> Biomaterials. 20 (23-24), 2363-2376 (1999).</li>
<li>Lin, R. Z., Ho, C. T., Liu, C. H., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dielectrophoresis+based-cell+patterning+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Dielectrophoresis based-cell patterning for tissue engineering.</a> Biotechnol J. 1 (9), 949-957 (2006).</li>
<li>Veiseh, M., Zareie, M. H., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/la025529j">Highly Selective Protein Patterning on Gold-Silicon Substrates for Biosensor Applications.</a> Langmuir. 18 (17), 6671-6678 (2002).</li>
<li>Kung, F., Wang, J., Perez-Castillejos, R., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position+along+the+nasal%2Ftemporal+plane+affects+synaptic+development+by+adult+photoreceptors%2C+revealed+by+micropatterning%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Position along the nasal/temporal plane affects synaptic development by adult photoreceptors, revealed by micropatterning.</a> Integr Biol. 7 (3), 313-323 (2015).</li>
<li>Dickinson, L. E., Lutgebaucks, C., Lewis, D. M., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+microscale+extracellular+matrices+to+study+endothelial+and+cancer+cell+interactions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Patterning microscale extracellular matrices to study endothelial and cancer cell interactions in vitro.</a> Lab Chip. 12 (21), 4244-4248 (2012).</li>
<li>Khademhosseini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+of+human+embryonic+stem+cells+with+murine+embryonic+fibroblasts+on+microwell-patterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates.</a> Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).</li>
<li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+cell-cell+communication+in+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Studying cell-cell communication in co-culture.</a> Biotechnol J. 8 (4), 395-396 (2013).</li>
<li>Choi, Y., Lee, S. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/BF02916509">Guided cell growth through surface treatments.</a> J of Mech Sci Technol. 19 (11), 2133-2137 (2005).</li>
<li>Hwang, I. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Immobilization+and+Patterning+of+Biomolecules+on+Poly%28ethylene+terephthalate%29+Films+Functionalized+by+Ion+Irradiation+for+Biosensor+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interf%22%5BJournal%5D)">Efficient Immobilization and Patterning of Biomolecules on Poly(ethylene terephthalate) Films Functionalized by Ion Irradiation for Biosensor Applications.</a> ACS Appl Mater Interf. 3 (7), 2235-2239 (2011).</li>
<li>Clark, P., Britland, S., Connolly, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone+guidance+and+neuron+morphology+on+micropatterned+laminin+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Growth cone guidance and neuron morphology on micropatterned laminin surfaces.</a> J Cell Sci. 105 (1), 203-212 (1993).</li>
<li>Théry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> J Cell Sci. 123 (24), 4201-4213 (2010).</li>
<li>Douvas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+photolithographic+process+for+the+patterning+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Biocompatible photolithographic process for the patterning of biomolecules.</a> Biosens Bioelectron. 17 (4), 269-278 (2002).</li>
<li>Alom, R. S., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2007/SM/B613349E">Microcontact printing: A tool to pattern.</a> Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).</li>
<li>Essö, C. <a target="_blank" href="http://www.diva-portal.org/smash/get/diva2:121034/fulltext01">Modifying Polydimethylsiloxane (PDMS) surfaces.</a> Institutionen för biologi och kemiteknik. , (2007).</li>
<li>Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+PDMS+surface+modification+for+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices.</a> Electrophoresis. 31 (1), 2-16 (2010).</li>
<li>Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+elastomeric+stencils+for+micropatterning+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures.</a> J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).</li>
<li>Yeo, W. S., Yousaf, M. N., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+interfaces+between+cells+and+surfaces%3A+electroactive+substrates+that+sequentially+release+and+attach+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Dynamic interfaces between cells and surfaces: electroactive substrates that sequentially release and attach cells.</a> J Am Chem Soc. 125 (49), 14994-14995 (2003).</li>
<li>Bhatia, S. N., Toner, M., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+adhesion+of+hepatocytes+on+patterned+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Selective adhesion of hepatocytes on patterned surfaces.</a> Ann N Y Acad Sci. 745, 187-209 (1994).</li>
<li>Song, E., Kim, S. Y., Chun, T., Byun, H. -J., Lee, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+scaffolds+derived+from+a+marine+source+and+their+biocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Collagen scaffolds derived from a marine source and their biocompatibility.</a> Biomaterials. 27 (15), 2951-2961 (2006).</li>
<li>Yamato, M., Konno, C., Utsumi, M., Kikuchi, A., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermally+responsive+polymer-grafted+surfaces+facilitate+patterned+cell+seeding+and+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Thermally responsive polymer-grafted surfaces facilitate patterned cell seeding and co-culture.</a> Biomaterials. 23 (2), 561-567 (2002).</li>
<li>Takayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+cells+and+their+environments+using+multiple+laminar+fluid+flows+in+capillary+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (10), 5545-5548 (1999).</li>
<li>Kim, D. S., Lee, K. -C., Kwon, T. H., Lee, S. S. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0960-1317/12/3/307/meta">Micro-channel filling flow considering surface tension effect.</a> J of Micromech Microeng. 12 (3), 236(2002).</li>
<li>Kim, E., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja960151v">Micromolding in Capillaries: Applications in Materials Science.</a> J Am Chem Soc. 118 (24), 5722-5731 (1996).</li>
<li>Kim, E., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v376/n6541/abs/376581a0.html">Polymer Microstructures Formed by Molding in Capillaries.</a> Nature. 376 (6541), 581-584 (1995).</li>
<li>Jeon, N. L., Choi, I. S., Xu, B., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="https://gmwgroup.harvard.edu/pubs/pdf/665.pdf">Large-area patterning by vacuum-assisted micromolding.</a> Adv Mater. 11 (11), 946(1999).</li>
<li>Shrirao, A. B., et al. System and method for novel microfluidic device. US patent. , 61/414,237 (2010).</li>
<li>Merkel, T. C., Bondar, V. I., Nagai, K., Freeman, B. D., Pinnau, I. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/202178954_Gas_Sorption_Diffusion_and_Permeation_in_PolyDimethylsiloxane">Gas sorption, diffusion, and permeation in poly(dimethylsiloxane).</a> J Polym Sci Part B Polym Phys. 38 (3), 415-434 (2000).</li>
<li>Shrirao, A. B., Hussain, A., Cho, C. H., Perez-Castillejos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive-tape+soft+lithography+for+patterning+mammalian+cells%3A+application+to+wound-healing+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Adhesive-tape soft lithography for patterning mammalian cells: application to wound-healing assays.</a> Biotechniques. 53 (5), 315-318 (2012).</li>
<li>Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. <a target="_blank" href="http://blogs.rsc.org/chipsandtips/2010/05/17/simple-fabrication-of-microfluidic-devices-by-replicating-scotch-tape-masters/">Chips & tips: simple fabrication of microfluidic devices by replicating scotch-tape masters.</a> Lab Chip. , (2010).</li>
<li>Anil, B. S., Frank, H. K., Derek, Y., Cheul, H. C., Ellen, T. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vacuum-assisted+fluid+flow+in+microchannels+to+pattern+substrates+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Vacuum-assisted fluid flow in microchannels to pattern substrates and cells.</a> Biofabrication. 6 (3), 035016(2014).</li>
<li>Yuen, P. K., Goral, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost+rapid+prototyping+of+flexible+microfluidic+devices+using+a+desktop+digital+craft+cutter%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Low-cost rapid prototyping of flexible microfluidic devices using a desktop digital craft cutter.</a> Lab on a Chip. 10 (3), 384-387 (2010).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-loading+and+cell+culture+in+one+layer+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Self-loading and cell culture in one layer microfluidic devices.</a> Biomed Microdevices. 11 (3), 679-684 (2009).</li>
<li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+mammalian+cells+under+high+vacuum+condition+for+ion+bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Survival of mammalian cells under high vacuum condition for ion bombardment.</a> Cryobiology. 49 (3), 241-249 (2004).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).</li>
<li>Fan, D. -H., Yuan, S. -W., Shen, Y. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+modification+with+BSA+blocking+based+on+in+situ+synthesized+gold+nanoparticles+in+poly+%28dimethylsiloxane%29+microchip%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf%2C+B%22%5BJournal%5D)">Surface modification with BSA blocking based on in situ synthesized gold nanoparticles in poly (dimethylsiloxane) microchip.</a> Colloids Surf, B. 75 (2), 608-611 (2010).</li>
<li>Hideshima, S., Sato, R., Inoue, S., Kuroiwa, S., Osaka, T. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400511008902">Detection of tumor marker in blood serum using antibody-modified field effect transistor with optimized BSA blocking.</a> Sens Actuator B-Chem. 161 (1), 146-150 (2012).</li>
<li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+immunoassay+through+in-channel+microfluidic+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">High-throughput immunoassay through in-channel microfluidic patterning.</a> Lab on a Chip. 12 (14), 2487-2490 (2012).</li>
<li>MacLeish, P., Barnstable, C., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+monoclonal+antibody+as+a+substrate+for+mature+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Procs+Nat+Acad+of+Sci%22%5BJournal%5D)">Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro.</a> Procs Nat Acad of Sci. 80 (22), 7014-7018 (1983).</li>
<li>Suchodolskis, A., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/sia.3763/abstract">Elastic properties of chemically modified baker's yeast cells studied by AFM.</a> Surf Interface Anal. 43 (13), 1636-1640 (2011).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podczas gdy konwencjonalna fotolitografia jest dobrze ugruntowaną techniką tworzenia form do miękkiej litografii, sprzęt, materiały i umiejętności niezbędne do korzystania z konwencjonalnej fotolitografii nie są łatwo dostępne dla większości laboratoriów. Dla laboratoriów, które nie mają dostępu do tych zasobów, przedstawiliśmy wytwarzanie taśm klejących jako metodę tworzenia form o stosunkowo prostych funkcjach do urządzeń mikroprzepływowych. Metoda ta pozwala każdemu laboratorium na tworzenie i wykorzystywanie urządzeń...

W inżynierii tkankowej i biodetekcji, możliwość kontrolowania organizacji przestrzennej białek i komórek w skali μm, stała się coraz ważniejsza w ciągu ostatnich czterech dekad1,2,3. Precyzyjna organizacja przestrzenna białek i komórek pozwoliła naukowcom zbadać interakcję między komórkami a substratami zawierającymi podobne lub różne typy komórek, kierować wzrostem komórek i unieruchamiać biomolekuły w celu wytworzenia biosensorów4,5,6,7,8,9.
Obecne metody modelowania białek obejmują fotowzorce i druk mikrokontaktowy. Fotowzorzec wykorzystuje materiał wrażliwy na światło, który jest sieciowany pod wpływem światła ultrafioletowego (UV). Światło UV skierowane na fotomaskę (składającą się z przezroczystych obszarów z ciemniejszymi obszarami, aby zapobiec transmisji światła UV) powoduje sieciowanie w określonych obszarach, które można następnie wykorzystać do późniejszego dołączenia biomateriałów lub komórek10,11. Chociaż schemat ten jest bardzo dokładny i pozwala na precyzyjną kontrolę topografii powierzchni hodowli, jest ograniczony do wrażliwych na promieniowanie UV biomolekuł, które mogą być modelowane przez promieniowanie UV12. Druk mikrokontaktowy to kolejna popularna metoda modelowania określonych białek13,14. W tej metodzie stempel polidimetylosiloksanu (PDMS) jest traktowany różnymi odczynnikami do modyfikacji powierzchni przed namoczeniem w roztworze wybranego substratu biomolekularnego. Następnie jest delikatnie dociskany do szklanego szkiełka nakrywkowego lub innej powierzchni, "stemplując" w ten sposób biomolekułę na powierzchni hodowli. Tłoczenie jest jednak ograniczone do rodzaju materiału, który może zostać przeniesiony, a także do zwilżalności biomolekuł na powierzchnię PDMS stamp15.
Bezpośrednie tworzenie wzorów komórek może być trudniejsze i opiera się na skomplikowanych metodach, takich jak przełączalne podłoża, metody oparte na szablonach lub wzorowanie z określonymi cząsteczkami adhezyjnymi komórek16,17. Metody te mają ograniczoną zdolność do modelowania komórek ze względu na brak kompatybilnych substratów adhezyjnych komórek, niezgodność procesu z wrażliwymi komórkami biologicznymi i ograniczeniami, niespójność w odtwarzaniu wzorów i złożoność procedury. Na przykład, w przypadku przełączanych podłoży, niestandardowe podłoża muszą być zaprojektowane dla każdego typu ogniwa, aby zmienić ich przyleganie do określonych typów komórek bez degradacji po wystawieniu na działanie światła UV i ciepła używanego w procesie17,18,19,20. Metody tworzenia wzorów oparte na szablonach są wszechstronne pod względem zdolności do tworzenia wzorów komórek; jednak trudno jest wyprodukować szablony PDMS o odpowiednich grubościach do użytku16,21. Bezpośrednia iniekcja komórek do kanałów mikroprzepływowych PDMS ma pewne zalety, takie jak: 1) łatwość wytwarzania kanałów mikroprzepływowych i 2) przydatność dla wielu różnych komórek i substratów. Jednak powszechny problem wychwytywania pęcherzyków powietrza podczas procesu iniekcji ze względu na hydrofobowość PDMS bez użycia czyszczenia plazmowego lub innych metod zmniejszania pęcherzyków powietrza, utrudnia konsekwentne tworzenie wzorzystych komórek na powierzchniach szklanych lub plastikowych21.
Ta praca rozszerza temat mikroformowania kapilarnego22,23,24,25,26 i przedstawia metodę wstrzykiwania zawiesin białkowych i komórkowych do mikrokanałów. Zastosowana tutaj metoda demonstruje modelowanie substratów oraz zarówno bezpośrednie, jak i pośrednie wzorowanie określonych typów komórek. Technika ta przezwycięża wysoką hydrofobowość PDMS i eliminuje obecność pęcherzyków podczas wstrzykiwania substratów lub komórek, wykorzystując przepuszczalność gazów PDMS27. W artykule przedstawiono zastosowanie tej techniki z kilkoma różnymi podłożami i typami komórek. W artykule omówiono również wytwarzanie form do miękkiej litografii przy użyciu konwencjonalnej fotolitografii, a także prostą i tanią metodę taśmy klejącej, przydatną w ustawieniach o ograniczonych zasobach28,29.

<table><tbody><tr><td>CorelDRAW X4 CAD Narzędzia do rysowania Corel</td><td>Corporation, Kanada</td><td>X4 Wersja 14.0.0.701</td><td>Narzędzie CAD służące do rysowania układu urządzenia mikroprzepływowego</td></tr><tr><td>Drukarka laserowa HP</td><td>Hewlett Packard, CA</td><td>1739629</td><td>Służy do drukowania układu urządzenia mikroprzepływowego do techniki taśmy klejącej</td></tr><tr><td>Bel-Art Dessicator</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>08-594-16B</td><td>Służy do odgazowywania mieszaniny</td></tr> <tr><td>PDMSSamoprzylepna taśma klejąca</td><td>3M Produkt, MN</td><td>Tape 600</td><td>Służy do produkcji taśmy samoprzylepnej Master</td></tr><tr><td>PDMS Sylgard 184</td><td>Dow Corning, MI</td><td>1064291</td><td>Odlew polimerowy</td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>08-772-23</td><td>Służy do utrzymywania formy do odlewu za pomocą PDMS</td></tr><tr><td>Skalpel ze stali nierdzewnej z ostrzem (# 11)</td><td>Feather Safety Razor Co. Ltd. Japonia</td><td>2976#11</td><td>Służy do cięcia PDMS</td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Ted Pella, CA</td><td>5627-07</td><td>Służy do obsługi odlewu PDMS podczas obierania</td></tr><tr><td>Szkiełka szklane</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>12-546-2</td><td>Używane jako powierzchnia do modelowania podłoża</td></tr><tr><td>Szkiełka szklane</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>12-544-4</td><td>Używane jako powierzchnia do modelowania podłoża</td></tr><tr><td>Gumowy wałek</td><td>Dick Blick Art Materials, IL</td><td>40104-1004</td><td>Służy do mocowania taśmy klejącej na szkle bez zatrzymywania pęcherzyków powietrza</td></tr><tr><td>Laser Mask Writer</td><td>Heidelberg Instruments, Niemcy</td><td>DWL66fs</td><td>Służy do produkcji maski kwarcowej używanej w procesie produkcji fotolitografii</td></tr><tr><td>EVG Mask Aligner (narzędzie do fotolitografii do ekspozycji UV)</td> <td>EVG Group, Niemcy</td><td>EVG 620T(B)</td><td>Służy do wystawiania fotorezystu na działanie światła UV</td></tr><tr><td>Spin Coater Headway</td><td>Headway Research Inc, TX</td><td>PWM32-PS-CB15PL</td><td>Służy do wirowania powłoki fotorezystu na wafli krzemowej</td></tr><tr><td>Fotorezystu SU-8 50</td><td>MicroChem, MA</td><td>Y131269</td><td>Ujemny fotorezystor stosowany do produkcji form</td></tr><tr><td>SU-8 Devloper</td><td>MicroChem, MA</td><td>Y020100</td><td>Twórca fotorezystu</td></tr><tr><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooktylo-1-Trichlorosilan</td><td>UCT Specialties, PA</td><td>T2492-KG</td><td>Forma płaszcza, aby uniknąć przylegania PDMS</td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>190764</td><td>Rozpuszczalnik czyszczący</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>24102</td><td>Rozpuszczalnik do sterylizacji</td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-D-lizyny (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>P0899-10MG</td><td>Roztwór PDL wytwarza się w 0,1 mg/ml w buforze tetraboranu sodu</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>L2020</td><td>Laminina podzielona na 10 &mikro; L podwielokrotności i rozcieńczone do 20 &mikro; g/&mikro; L w PBS przed użyciem</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>BP1605100</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>C2C12 Komórka mioblastyczna lline</td><td>ATCC, VA</td><td>CRL-1722</td><td>Służy do demonstracji wzoru C2C12</td></tr><tr><td>Linia komórkowa PC12</td><td>ATCC, VA</td><td>CRL-1721</td><td>Służy do demonstracji wzorca PC12</td></tr><tr><td>Kolagen typu 1, ogon szczura</td><td>BD Biosciences</td><td>40236</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, MA</td><td>11965-084</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Surowica końska, inaktywowana termicznie</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>26050-070</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Izotiocyjanian falloidyny-tetrametylorodaminy B (TRITC)</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>P1951</td><td>Do oznaczania komórek</td></tr><tr><td>Calcein-AM zestaw do oznaczania żywych martwych komórek</td><td>Invitrogen, MA</td><td>L-3224</td><td>Test żywotności komórek</td></tr><tr><td>Biopsja Dziurkacz</td><td>Ted Pella, CA</td><td>15110-10</td><td>Otwór otworowy w PDMS</td></tr></tbody></table>

wszechstronna metoda modelowania białek i komórek

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Techniki modelowania substratów i komórek są szeroko stosowane w biologii komórki do badania interakcji między komórkami i między komórkami. Konwencjonalne techniki wzornictwa sprawdzają się tylko w przypadku prostych kształtów, małych powierzchni i wybranych biomateriałów. W artykule opisano metodę dystrybucji zawiesin komórkowych oraz roztworów substratów do złożonych, długich, zamkniętych (ślepych uliczek) mikrokanałów polidimetylosiloksanu (PDMS) przy użyciu podciśnienia. Metoda ta umożliwia naukowcom modelowanie wielu substratów, w tym fibronektyny, kolagenu, przeciwciał (Sal-1), poli-D-lizyny (PDL) i lamininy. Modelowanie substratów pozwala na pośrednie modelowanie różnych komórek. Przetestowaliśmy mioblasty C2C12, linię komórek neuronalnych PC12, embrionalne neurony korowe szczura i neurony siatkówki. Ponadto wykazaliśmy, że technika ta może bezpośrednio modelować fibroblasty w kanałach mikroprzepływowych poprzez krótkie zastosowanie niskiej próżni na zawiesiny komórek. Niska próżnia nie zmniejsza znacząco żywotności komórek, jak wykazano w testach żywotności komórek. Omówiono modyfikacje dotyczące zastosowania metody do różnych typów komórek i substratów. Technika ta pozwala naukowcom na modelowanie komórek i białek w określone wzory bez konieczności stosowania egzotycznych materiałów lub sprzętu i może być wykonana w dowolnym laboratorium z próżnią.

Metoda ta umożliwia wzorcowanie białek oraz pośrednie wzorcowanie komórek z wykorzystaniem ślepych kanałów mikrofluidycznych o wymiarach rzędu 10 µm i sprzętu dostępnego w niemal każdym laboratorium biologicznym, po uprzednim wykonaniu formy matrycy. Technikę tę można stosować w przypadku kanałów mikrofluidycznych z PDMS stworzonych za pomocą tradycyjnej miękkiej fotolitografii lub kanałów mikrofluidycznych z PDMS wykonanych metodą z użyciem taśmy klejącej (Rysunek 1)<sup...

Ten raport opisuje prostą, łatwą do wykonania technikę, wykorzystującą próżnię niskociśnieniową, do wypełniania kanałów mikroprzepływowych komórkami i substratami do badań biologicznych.

Wszechstronna metoda modelowania białek i komórek

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wzorcowanie komórek lub podłoży poprzez ich rozmieszczanie w złożonych, długich i zamkniętych mikrokanałach przy użyciu prostych narzędzi laboratoryjnych dostępnych w większości laboratoriów biologicznych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biologii dotyczące oddziaływań międzykomórkowych oraz oddziaływań między komórkami a białkami. Główną zaletą tej techniki jest łatwość jej wykonania oraz fakt, że wymaga ona jedynie narzędzi powszechnie dostępnych w większości laboratoriów biologicznych.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ wymaga ona optymalizacji warunków inkubacji dla komórek i substratów wybranych przez badacza. Demonstracja wizualna tej metody jest kluczowa, ponieważ prawidłowe umieszczenie stempla PDMS oraz roztworu znacząco poprawia powtarzalność eksperymentu. Pracę należy rozpocząć od zaprojektowania układu mikrokanału przy użyciu narzędzia do rysowania CAD.Następnie wydrukuj rysunek na białym papierze. Potem użyj izopropanolu, aby oczyścić szkiełko przedmiotowe wystarczająco duże, by pomieścić projekt. Następnie wysusz szkiełko za pomocą pistoletu z gorącym powietrzem.Przyklej taśmę klejącą do oczyszczonego szkiełka przedmiotowego, dbając o to, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza. Następnie przyklej boki szkiełka do papieru z projektem, tak aby strona z taśmą była skierowana do góry. Za pomocą skalpela wytnij w taśmie na szkiełku kształt, korzystając z projektu na papierze jako wzoru.Po wycięciu odklej taśmę z niepożądanych obszarów szkiełka przedmiotowego. Następnie opłucz szkiełko izopropanolem, aby usunąć pozostałości kleju. Na koniec użyj pistoletu powietrznego, aby wysuszyć powierzchnię.Po nałożeniu wzoru i oczyszczeniu, wypiecz szkiełko w piekarniku w temperaturze 65 °C przez 30 minut. Następnie delikatnie przejedź po taśmie wałkiem gumowym, aby usunąć pęcherzyki powietrza, i pozostaw szkiełko do ostygnięcia do temperatury pokojowej w szalce Petriego. Rozpocznij od zmieszania 10 części elastomeru PDMS z 1 częścią utwardzacza i energicznie wymieszaj roztwór.Następnie umieść mieszaninę w komorze próżniowej, aby ją odgazować, aż do całkowitego usunięcia pęcherzyków powietrza. Wlej warstwę mieszaniny o grubości 2mm na formę z taśmy klejącej i odgazowuj formę, aż wszystkie pęcherzyki powietrza znikną. Po ostygnięciu użyj skalpela, aby wyciąć warstwę PDMS w odległości co najmniej 5mm od struktur.Następnie, za pomocą pęsety odklej utwardzony PDMS z formy. Wykonaj pojedynczy otwór wlotowy za pomocą wycinaka do biopsji o średnicy 1mm, najlepiej na końcu sieci mikrokanałów. Następnie oczyść odlew z PDMS za pomocą taśmy klejącej, aby usunąć z urządzenia cząsteczki kurzu.Sterylizuj urządzenie z mikrokanałami z PDMS, płucząc je roztworem 70% etanolu, a następnie sterylną wodą dejonizowaną, i naświetlaj światłem UV przez 30 minut. Używając pęsety, umieść sterylny odlew z PDMS na sterylnej szkiełku nakrywce i wywier delikatny nacisk końcówką pęsety. Następnie nanieś kroplę poli-D-lizyny w buforze tetraboranu sodu na wlot mikrokanałów.Umieść szalkę Petriego pod próżnią na 10 minut. W tym czasie obserwuj powietrze uciekające z kanału w postaci pęcherzyków. Zwolnij próżnię i obserwuj przepływ roztworu podłoża do mikrokanału. Inkubuj szalkę w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę.Następnie ostrożnie odczep stempel PDMS za pomocą sterylnej pęsety i przemyj wzór trzykrotnie wodą dejonizowaną. Aby zmniejszyć niespecyficzne przyleganie, nanieś na szkiełko nakrywowe 1% roztwór BSA i inkubuj próbkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia odessaj roztwór BSA.Aby rozpocząć pośrednie wzorcowanie komórek, przygotuj zawiesinę komórkową w wolnym od surowicy medium hodowlanym zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Dodaj zawiesinę komórkową do wzorcowanej szalki Petriego, całkowicie zanurzając obszar wzorcowany w zawiesinie. Następnie inkubuj szalkę Petriego w temperaturze 37 °C w inkubatorze przez 15 minut, aby umożliwić przywieranie komórek do wzorcowanego podłoża.Po inkubacji odessać nadmiar zawiesiny komórek z szalki Petriego i trzykrotnie przemyć wzorowane komórki roztworem PBS, delikatnie potrząsając przez dziesięć sekund w celu usunięcia nieprzytwierdzonych komórek. Następnie dodać odpowiednią pożywkę do kultur wzorowanych komórek i inkubować je w temperaturze 37 °C w inkubatorze z buforem dwutlenku węgla. W przypadku bezpośredniego wzorowania komórek, najpierw wysterylizować urządzenie mikroprzepływowe, płucząc je roztworem 70% etanolu, a następnie wodą dejonizowaną.Następnie moczyć urządzenie przez noc w roztworze 1% BSA, aby zapobiec niespecyficznej adhezji komórek do PDMS. Osuszyć urządzenie w temperaturze pokojowej, a następnie przymocować je do dna płytki Petri traktowanej do hodowli tkankowej. Nanieść na wlot od 4 do 8 µl zawiesiny komórkowej, w ilości wystarczającej do wypełnienia mikrokanałów, całkowicie zakrywając otwór.Następnie umieść szalkę Petriego w komorze próżniowej na 10 minut. Zwolnij próżnię i obserwuj przepływ zawiesiny komórek do mikrokanału. Inkubuj szalkę Petriego w temperaturze 37°C w inkubatorze z buforem dwutlenku węgla przez maksymalnie jedną godzinę.Następnie wyjmij płytkę z inkubatora i za pomocą pęsety ostrożnie oddziel PDMS od płytki. Przemyj wzór PBS, a następnie dodaj pożywkę hodowlaną do płytki Petriego. Po zakończeniu umieść komórki z powrotem w inkubatorze.Przedstawiono tutaj embrionalne neurony korowe szczura ułożone w wzory na powierzchniach z poli-D-lizyny i lamininy. Położenie komórek wykazuje ogólną adhezję do obszarów wzorowanych oraz wzrost wzdłuż pasów PDL i lamininy. Poniżej, przy większym powiększeniu, pokazano mioblasty C2C12.Ten typ komórek również przylega do obszarów wzorowanych i wykazuje fuzję w wielojądrowe miotuby. Technika ta została również zaadaptowana do bezpośredniego wzorowania komórek, co pokazano tutaj na przykładzie fibroblastów. Ta metoda bezpośredniego wzorowania komórek nie wywiera negatywnego wpływu na przeżywalność komórek.Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak mikroskopia fluorescencyjna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące lokalizacji białek lub oddziaływań komórka-podłoże. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że prawidłowe umieszczenie kropli zawiesiny komórek lub roztworu podłoża w taki sposób, aby pokryły one cały wkład, jest kluczowe dla powodzenia eksperymentu. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie neuronauki do eksploracji prowadzenia aksonów fotoreceptorów w biologii siatkówki.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak wzorować komórki i podłoże za pomocą przepuszczalnych dla gazów urządzeń mikroprzepływowych z PDMS z wykorzystaniem podciśnienia. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentu.

a-versatile-method-of-patterning-proteins-and-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przedstawiamy prostą metodę rozmieszczania komórek w wybranych miejscach na podłożu. Metoda ta polega na tworzeniu wzorów komórkowych poprzez odwrócenie krzemowego chipa zawierającego wypełnione komórkami mikrownęki i dociśnięcie go do podłoża. Metoda ta stanowi nowy sposób modulowania sygnalizacji dyfuzyjnej oraz jukstakrynnej między komórkami.

Wzorowanie embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem Bio Flip Chip

Drukowanie mikrokontaktowe jest szeroko stosowane do wzorowania białek i innych cząsteczek na powierzchniach materiałów. Demonstrujemy podstawowe kroki tego procesu, polegające na stemplowaniu wzorów fibronektyny na szkle.

Mikrodruk białek w biologii komórki

Wodne systemy dwufazowe były używane do jednoczesnego modelowania wielu populacji komórek. Ta szybka i łatwa metoda modelowania komórek wykorzystuje separację faz wodnych roztworów dekstranu i glikolu polietylenowego oraz napięcie międzyfazowe, które istnieje między tymi dwoma roztworami polimerów.

Modelowanie kohodowli komórkowych przy użyciu wodnych systemów dwufazowych

Ten protokół opisuje metodę tworzenia wzorów komórkowych na SiO2 kompatybilną z mikrofabrykacją. Predefiniowany wzór parylenu-C jest drukowany fotolitograficznie na płytkach SiO2. Po inkubacji z surowicą (lub innym roztworem aktywacyjnym) komórki przylegają specyficznie (i rosną zgodnie z zgodnością) leżącego poniżej parylenu-C, będąc jednocześnie odpychane przez regiony SiO2.

Wzorcowanie komórek na zdefiniowanych fotolitograficznie 
Parylene-C: Substraty SiO2

W tej metodzie, używamy technik fotopolimeryzacji i chemii kliknięć do tworzenia wzorów białkowych lub peptydowych na powierzchni hydrożeli glikolu polietylenowego (PEG), dostarczając unieruchomionych sygnałów bioaktywnych do badania odpowiedzi komórkowych in vitro.

Wzorowanie bioaktywnych białek lub peptydów na hydrożelu przy użyciu fotochemii do zastosowań biologicznych

Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje mikrowzorce wraz z obrazowaniem ilościowym, aby ujawnić organizację przestrzenną w kulturach ssaków. Technika ta jest łatwa do wdrożenia w standardowym laboratorium biologii komórki i oferuje elastyczny system do badania wzorców in vitro.

Mapowanie wyłaniającej się organizacji przestrzennej komórek ssaków za pomocą mikrowzorców i obrazowania ilościowego

Naszym ogólnym celem jest zrozumienie, w jaki sposób komórki wyczuwają sygnały zewnątrzkomórkowe, które prowadzą do ukierunkowanego wzrostu aksonów. W tym miejscu opisujemy metodologię indukowanej światłem adsorpcji molekularnej białek, używaną do wytwarzania zdefiniowanych mikrowzorów składników macierzy zewnątrzkomórkowej w celu zbadania określonych zdarzeń, które rządzą wzrostem aksonów i odnajdywaniem ścieżki.

Indukowana światłem adsorpcja molekularna białek z wykorzystaniem systemu PRIMO do mikrowzorcowania w celu zbadania odpowiedzi komórek na białka macierzy zewnątrzkomórkowej

Tutaj prezentujemy protokół do mikrowzorcowania komórek w rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą adhezji programowanej przez DNA. Protokół ten wykorzystuje laboratoryjną platformę fotolitograficzną do tworzenia wzorów oligonukleotydów DNA na szkiełku szkiełkowym, a następnie znakuje błony komórkowe dostępnymi na rynku komplementarnymi oligonukleotydami. Hybrydyzacja oligonukleotydów powoduje zaprogramowaną adhezję komórek.

Proste, niedrogie i modułowe modelowanie komórek za pomocą DNA

Przedstawiony tutaj protokół umożliwia zautomatyzowane wytwarzanie mikrowzorów, które standaryzują kształt komórki, do badania struktur cytoszkieletu w komórkach ssaków. Ta przyjazna dla użytkownika technika może być skonfigurowana z dostępnymi na rynku systemami obrazowania i nie wymaga specjalistycznego sprzętu niedostępnego dla standardowych laboratoriów biologii komórki.

Kontrola geometrii komórki za pomocą mikromodelowania wspomaganego laserem w podczerwieni

Opisujemy ulepszenia standardowej metody pomiaru sił trakcyjnych komórek, opartej na drukowaniu mikrokontaktowym z pojedynczym krokiem subtraktywnego tworzenia wzorów układów punktowych białek macierzy zewnątrzkomórkowej na miękkich hydrożelach. Metoda ta pozwala na prostsze i bardziej spójne wytwarzanie wzorów wyspowych, niezbędnych do kontrolowania kształtu klastrów komórek.

Generowanie wzorców dla mikroskopii trakcyjnej mikrowzorców

Tradycyjnie, hodowla komórkowa jest przeprowadzana na płaskich podłożach, które słabo naśladują naturalne środowisko komórek in vivo. W tym miejscu opisujemy metodę wytwarzania substratów do hodowli komórkowych o fizjologicznie istotnych zakrzywionych geometriach i mikrowzorach białek zewnątrzkomórkowych, co pozwala na systematyczne badania nad komórkowym wykrywaniem tych zewnątrzkomórkowych sygnałów.

Generowanie wielokierunkowych mikrośrodowisk komórkowych za pomocą fotomodelingu UV trójwymiarowych substratów do hodowli komórkowych

Poznaj metodę wypełniania mikrokanalików komórkami i substratami przy użyciu niskiego ciśnienia próżniowego. Ta technika umożliwia badanie interakcji komórkowych w biologii.

Wszechstronna metoda modelowania białek i komórek

Przeglądaj więcej filmów