Wszechstronna metoda modelowania białek i komórek
February 26th, 2017
Ten raport opisuje prostą, łatwą do wykonania technikę, wykorzystującą próżnię niskociśnieniową, do wypełniania kanałów mikroprzepływowych komórkami i substratami do badań biologicznych.
Ogólnym celem tej procedury jest modelowanie komórek lub substratów poprzez rozprowadzanie ich w złożone, długie i zamknięte mikrokanały za pomocą prostych narzędzi dostępnych w większości laboratoriów biologicznych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny biologii dotyczące interakcji międzykomórkowych i międzyludzkich. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest łatwa do wykonania i wymaga jedynie narzędzi, które są łatwo dostępne w większości laboratoriów biologicznych.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ wymaga ona optymalizacji warunków inkubacji dla komórek i substratów wybranych przez badacza. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ właściwe umieszczenie stempla i roztworu PDMS znacznie poprawia odtwarzalność eksperymentu. Zacznij od narysowania układu mikrokanału za pomocą narzędzia do rysowania CAD.
Następnie wydrukuj rysunek na białym papierze. Następnie użyj izopropanolu do wyczyszczenia szklanego szkiełka, które jest wystarczająco duże, aby pomieścić projekt. A następnie osusz szkiełko za pomocą pistoletu pneumatycznego.
Przymocuj taśmę klejącą do oczyszczonego szkiełka, uważając, aby nie zatrzymać pęcherzyków powietrza. Następnie przyklej boki szkiełka do papieru z wzorem, tak aby strona z taśmą była skierowana do góry. Użyj skalpela, aby przeciąć taśmę na szklanym szkiełku, używając wzoru papieru jako odniesienia.
Po przecięciu odklej taśmę z niechcianych obszarów szkiełka podstawowego. Następnie przepłucz szkiełko izopropanolem, aby usunąć resztki kleju. A następnie użyj pistoletu pneumatycznego, aby wysuszyć powierzchnię.
Po uformowaniu i oczyszczeniu szklane szkiełko pieczemy w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie delikatnie przetocz taśmę gumowym wałkiem, aby usunąć pęcherzyki powietrza i pozwól szkiełku ostygnąć do temperatury pokojowej na szalce Petriego. Zacznij od wymieszania 10 części elastomeru PDMS z 1 częścią jego utwardzacza i energicznie wymieszaj mieszaninę.
Następnie umieść mieszaninę w komorze próżniowej, aby odgazować mieszaninę, aż nie pozostaną żadne pęcherzyki powietrza. Wlej warstwę mieszanki o grubości 2 mm na formę z taśmą klejącą i odgazuj formę, aż wszystkie pęcherzyki powietrza znikną. Po schłodzeniu użyj skalpela, aby odciąć warstwę PDMS w odległości co najmniej 5 mm od elementów.
A następnie oderwij utwardzony PDMS od formy za pomocą pęsety. Przebić pojedynczy otwór wlotowy dziurkaczem do biopsji o średnicy 1 mm, najlepiej na końcu sieci mikrokanałów. Następnie wyczyść odlew PDMS taśmą klejącą, aby usunąć cząsteczki kurzu z urządzenia.
Wysterylizuj urządzenie mikrokanałowe PDMS, spłukując je roztworem 70% ehtanolu, a następnie sterylną wodą dejonizowaną i wystawiając na działanie światła UV przez 30 minut. Za pomocą pęsety umieść sterylny odlew PDMS na sterylnym szklanym szkiełku nakrywkowym i delikatnie dociśnij końcówką pęsety. Następnie umieść kroplę poli d lizyny w buforze tetraboranu sodu na wlocie mikrokanalików.
Umieść szalkę Petriego pod próżnią na 10 minut. W tym czasie obserwuj powietrze wydobywające się z kanału w postaci pęcherzyków. Zwolnij próżnię i obserwuj roztwór substratu wpływający do mikrokanalika Inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.
Następnie ostrożnie odklej stempel PDMS za pomocą sterylnej pęsety i trzykrotnie umyj wzór wodą dejonizowaną. Dodać 1% roztwór BSA do szklanego szkiełka nakrywkowego, aby zmniejszyć niespecyficzną przyczepność, i inkubować próbkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia odessać roztwór BSA.
Aby rozpocząć pośrednie tworzenie wzorców komórkowych, należy przygotować zawiesinę komórek w pożywce do hodowli wolnej od surowicy, zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Dodaj zawiesinę komórkową do wzorzystej szalki Petriego, całkowicie zanurzając wzorzysty obszar w zawiesinie komórek. Następnie inkubuj szalkę Petriego w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze przez 15 minut, aby komórki mogły przyczepić się do wzorzystego podłoża.
Po inkubacji odessać nadmiar zawiesiny komórkowej z szalki Petriego i trzykrotnie umyć wzorzyste komórki PBS, delikatnie potrząsając przez dziesięć sekund, aby usunąć nieprzyłączone komórki. Następnie dodaj odpowiednią pożywkę do wzorzystych kultur komórkowych i inkubuj wzorzyste komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze buforowanym dwutlenkiem węgla. W celu bezpośredniego modelowania komórek, najpierw wysterylizuj urządzenie mikroprzepływowe, przepłukując je roztworem 70% etanolu, a następnie wodą dejonizowaną.
Następnie namocz urządzenie na noc w roztworze 1% BSA, aby zapobiec niespecyficznemu przyleganiu komórek do PDMS. Wysuszyć urządzenie w temperaturze pokojowej, a następnie przymocować je do dna szalki Petriego poddanej działaniu kultur tkankowych. Umieść od 4 do 8 mikrolitrów zawiesiny komórek, wystarczającą do wypełnienia mikrokanalików, na wlocie, całkowicie zakrywając otwór.
Następnie umieść szalkę Petriego w komorze próżniowej na 10 minut. Zwolnij podciśnienie i obserwuj zawiesinę komórek wpływającą do mikrokanału. Inkubować szalkę Petriego w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze buforowanym dwutlenkiem węgla przez maksymalnie jedną godzinę.
Następnie wyjmij naczynie z inkubatora i za pomocą pęsety ostrożnie oderwij PDMS od naczynia. Umyj wzór PBS, a następnie dodaj pożywkę do hodowli komórkowych na szalkę Petriego. Po zakończeniu umieść komórki z powrotem w inkubatorze.
Pokazane tutaj są embrionalne neurony korowe szczura wzorowane na powierzchniach poli d lizyny i lamininy. Lokalizacja komórek wskazuje na ogólne przyleganie do wzorzystych obszarów i wzrost wzdłuż pasków PDL i lamininy. Pokazane tutaj, w większym powiększeniu, są mioblasty C2C12.
Ten typ komórek przylega również do wzorzystych obszarów i wykazuje fuzję w wielojądrowe miotuby. Technika ta została również zaadaptowana do bezpośredniego modelowania komórek, co pokazano tutaj za pomocą fibroblastów. Ta metoda bezpośredniego modelowania komórek nie ma negatywnego wpływu na przeżycie komórek.
Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak mikroskopia fluorescencyjna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące lokalizacji białek lub interakcji komórka-substrat. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że prawidłowe umieszczenie kropli komórek lub roztworu substratu w celu pokrycia całej wkładki ma kluczowe znaczenie dla powodzenia. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny neurobiologii do zbadania wskazówek dotyczących aksonów fotoreceptorów w biologii siatkówki.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć wzór komórek i podłoża za pomocą przepuszczalnych dla gazów urządzeń mikroprzepływowych PDMS przy użyciu podciśnienia. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymencie.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejszy raport opisuje prostą, łatwą do wykonania technikę, wykorzystującą próżnię niskiego ciśnienia, do wypełniania mikrokanałów komórkami i substratami w badaniach biologicznych. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii dotyczące interakcji komórka-komórka i komórka-białko.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Badania biologiczne
- Mikrofluidyka
- Interakcje komórek
Tło
- Technika wykorzystuje próżnię niskiego ciśnienia do wypełniania mikrokanałów.
- Jest zaprojektowana do użycia z powszechnie dostępnymi narzędziami laboratoryjnymi.
- Optymalizacja warunków inkubacji jest konieczna do pomyślnego zastosowania.
- Demonstracja wizualna poprawia powtarzalność metody.
Cel badania
- Uzyskanie wzorców komórek lub substratów w mikrokanalach.
- Ułatwienie badań nad interakcjami komórek.
- Dostarczenie prostej metody dla naukowców.
Stosowane metody
- Zastosowanie próżni niskiego ciśnienia do wypełniania mikrokanałów.
- Projektowanie układów mikrokanałów za pomocą narzędzi CAD.
- Umieszczanie stempli PDMS dla poprawienia wyników.
- Optymalizacja warunków dla określonych komórek i substratów.
Główne wyniki
- Pomyślne wypełnienie mikrokanałów komórkami i substratami.
- Poprawiona powtarzalność dzięki właściwej technice.
- Wykazana skuteczność w badaniu interakcji biologicznych.
- Dostępna metoda dla naukowców w laboratoriach biologicznych.
Wnioski
- Technika jest łatwa do wykonania i skuteczna w badaniach biologicznych.
- Pozwalla na skomplikowane wzorce komórek i substratów.
- Pomocne narzędzia wizualne są kluczowe dla pomyślnej implementacji.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables precise spatial control of proteins and cells in complex microfluidic geometries using accessible laboratory tools, supporting mechanistic studies of cell-substrate and cell-cell interactions. By eliminating the need for specialized equipment or exotic materials, it lowers technical barriers for target validation and assay development in early discovery. The approach enhances predictive confidence in phenotypic screening by enabling reproducible, disease-relevant microenvironments for mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through controlled presentation of substrates like fibronectin, collagen, and laminin to assess cell adhesion and signaling.
- Operational Value: Supports functional target validation by patterning multiple cell types including neuronal lines and fibroblasts to evaluate pathway-specific responses.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking by allowing direct comparison of cell behavior on defined protein patterns, improving target confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized protein-patterned substrates for quantitative assessment of compound effects on cell attachment, spreading, or differentiation.
- Operational Value: Enables assay reproducibility through vacuum-driven filling of long, closed PDMS microchannels, reducing variability in substrate coating.
- Scalability: Supports platform reuse across different cell and substrate types with minimal retooling, enhancing screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Patterns primary and stem cell-derived neurons (e.g., embryonic rat cortical, amphibian retinal) to model disease-relevant neural networks for preclinical target evaluation.
- Mechanistic De-risking: Enables study of neurite outgrowth and axon guidance on patterned laminin or PDL, supporting predictive modeling of neurotherapeutic efficacy.
- Risk-Adjusted Advancement: Allows indirect patterning of diverse cell types via substrate pre-coating, facilitating cross-model consistency in target engagement studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, enabling mechanistic interrogation before compound screening.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by patterning substrates to isolate integrin-mediated signaling or neuronal guidance cues in controlled microenvironments.
- Screening: Delivers quantitative, spatially resolved readouts of cell-substrate interactions when combined with fluorescence microscopy, enabling condition comparison.
- Analytics: Generates imaging-compatible patterns that support morphometric analysis of cell alignment, fusion (e.g., myotube formation), or neurite length as phenotypic endpoints.
- Translational Research: Connects to preclinical work by patterning disease-relevant neurons to assess substrate-dependent survival or maturation, only when supported by source.
- Enterprise Reuse: Functions as a adaptable patterning module for multiple projects, reducing dependency on specialized microfabrication core facilities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in cell-substrate interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through vacuum-assisted filling, minimizing user-dependent variability in protein deposition.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of compound effects on adhesion or morphology in physiologically relevant contexts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing mechanistic data on target engagement before significant investment in lead optimization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic design, PDMS handling, and sterile technique for cell culture applications.
- Depends on access to vacuum chambers, CAD tools, and standard cell culture incubators for optimization and execution.
- Necessitates cross-team standardization of incubation times, vacuum duration, and substrate concentrations to ensure reproducibility across users.
- Involves adaptation considerations when extending to new cell types or matrix proteins, as noted in the need for condition optimization.
- Includes practical limitations such as the requirement for precise droplet placement to fully fill microchannel networks, which impacts success rate.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:00
Fabrication of Master Molds for Soft Lithography Using Adhesive Tape
2:32
Soft Lithography Fabrication of PDMS Devices
4:02
Substrate Patterning
5:22
Indirect Patterning of Cells
6:29
Direct Patterning of Cells
8:05
Results: Direct and Indirect Patterning of Cells
8:56
Conclusion
