Name: Wykrywanie internalizacji receptora sprzężonego z białkiem G aktywowanym ligandem za pomocą mikroskopii konfokalnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Poznaj metodę wykrywania internalizacji receptora GPCR w komórkach ssaczych przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia precyzyjną lokalizację białek wewnątrzkomórkowych i jest łatwa w interpretacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy tego artykułu chcieliby podziękować prof. Jiayanowi Xie za pomoc techniczną i korzystanie z sprzętu. Prace te były wspierane finansowo przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (41406137).

1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Odzyskiwanie komórek
	<ol>
		<li>Przenieść kriokonserwowane ludzkie komórki embrionalne nerki 293 (HEK293) ze zbiornika z ciekłym azotem do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i wstrząsać w sposób ciągły przez 1-2 minuty.</li>
		<li>Dodać 10 ml zbilansowanej pożywki wzrostowej (zmodyfikowana pożywka Eagle's Eagle firmy Dulbecco (DMEM), 10% płodowa surowica bydlęca (FBS) i 1% roztwór penicyliny-streptomycyny) do 10-centymetrowego naczynia do hodowli komórkowej. Delikatnie dodaj rozmrożone komórki do zrównoważonej pożywki wzrostowej.</li>
		<li>Inkubować komórki w inkubatorze CO2 z płaszczem wodnym o temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 95% powietrza i 5% CO2 przez 2 - 4 godziny.</li>
		<li>Po 2 - 4 godzinach sprawdź, czy ogniwa są przymocowane. Wymień zrównoważoną pożywkę wzrostową i kulturę na kolejne 24 - 48 h. 
		UWAGA: Zmiana zrównoważonej pożywki wzrostowej jest przydatna, ponieważ usuwa dimetylosulfotlenek (DMSO) i chroni przed uszkodzeniem komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przejście komórkowe
	<ol>
		<li>Po 24 - 48 godzinach, gdy komórki osiągną bliskie zbieżności, wyrzuć zrównoważoną pożywkę wzrostową i przemyj komórki 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Delikatnie zakręć naczyniem.</li>
		<li>Wyrzuć PBS i dodaj 1 ml trypsyny-EDTA (sól fizjologiczna, 0,25% trypsyny i 0,02% EDTA). Aby całkowicie strawić komórki, ostrożnie zakręć naczyniem i odessaj roztwór trypsyny-EDTA. Umieść naczynie w inkubatorze CO2 z płaszczem wodnym o temperaturze 37 °C na 3 min. 
		UWAGA: W tym okresie przygotuj trzy nowe 10-centymetrowe szalki do hodowli komórkowych i dodaj do każdej z nich 10 ml zrównoważonej pożywki wzrostowej.</li>
		<li>Za pomocą mikroskopu świetlnego określ, czy komórki podniosły się z dna naczynia. Dodaj 2 ml zrównoważonej pożywki wzrostowej do naczynia. Wymieszać pipetując i natychmiast odpipetować 0,6 ml zawiesiny komórek do każdej z nowych szalek. Delikatnie wymieszać pipetując i pozostawić komórki do inkubacji w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Sadzenie komórek
<ol>
	<li>Po 24 - 48 godzinach, gdy pasażowane komórki osiągną bliskie zbiegowisko, wyrzuć zrównoważoną pożywkę wzrostową i umyj komórki 2 ml PBS. Delikatnie zakręć naczyniem.</li>
	<li>Wyrzuć PBS i dodaj 1 ml trypsyny-EDTA. Aby całkowicie strawić komórki, ostrożnie zakręć naczyniem i odessaj Trypsynę-EDTA. Umieść naczynie w inkubatorze CO2 z płaszczem wodnym o temperaturze 37 °C na 3 min. 
	UWAGA: W tym okresie przygotuj 6-dołkową płytkę, dodając 2 ml zbilansowanej pożywki wzrostowej do każdej studzienki.</li>
	<li>Dodać 1 ml zrównoważonej pożywki wzrostowej do szalki, jeśli pod mikroskopem obserwuje się, że komórki mają zostać podniesione z dna naczynia. Wymieszać pipetując i natychmiast odpipetować 0,1 ml zawiesiny komórek (objętość jest dostosowana do gęstości wzrostu komórek) do każdego dołka przygotowanej płytki 6-dołkowej (bezkomórkowej płytki 6-dołkowej z 2 ml zrównoważonej pożywki wzrostowej). Delikatnie wymieszać pipetując i pozostawić komórki do inkubacji w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
</ol>
3. Transfekcja komórkowa
<ol>
	<li>Metoda transfekcji 1, z preparatami liposomowymi 
	UWAGA: Proszę zapoznać się z tabelą materiałów dla odczynnika do transfekcji 1.
	<ol>
		<li>Następnego dnia upewnij się, że komórki powinny zlewać się w 85 - 95%.</li>
		<li>Dodać 3 μg plazmidowego DNA (500 ng/μl) i 100 μl zredukowanej pożywki surowicy do sterylnej probówki do mikrowirówki i delikatnie wymieszać. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przygotować 9 μl odczynnika 1 i 100 μl zredukowanej pożywki surowicy w innej probówce do mikrowirówek i delikatnie wymieszać. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Połączyć rozcieńczoną mieszaninę plazmidu z rozcieńczonym odczynnikiem 1 (całkowita objętość = 215 μl). Delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odessać pożywkę z płytki z hodowli komórkowej i dodać 1,5 ml świeżego DMEM bez FBS.</li>
		<li>Dodać kroplami 215 μl mieszaniny odczynników do transfekcji DNA do każdej studzienki i delikatnie wymieszać, obracając płytkę.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 4 - 8 godzin. Zastąp świeży DMEM 10% FBS.</li>
		<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez kolejne 24 - 48 godzin przed przeprowadzeniem jakichkolwiek eksperymentów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Metoda transfekcji 2, z preparatami liposomowymi 
	UWAGA: Proszę zapoznać się z tabelą materiałów odczynnika do transfekcji 2.
	<ol>
		<li>Dodać 2 μg plazmidowego DNA (500 ng/μl), 4 μl odczynnika 2 i 100 μl zredukowanej pożywki surowicy do sterylnej probówki mikrowirówkowej. Delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodaj mieszaninę transfekcji do komórek kroplami.</li>
		<li>Po transfekcji inkubować komórki przez 24 - 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przed przeprowadzeniem jakichkolwiek eksperymentów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Hodowla komórkowa na szkiełkach nakrywkowych
<ol>
	<li>Usuń pożywkę wzrostową z 6-dołkowej płytki hodowlanej.</li>
	<li>Umyj monowarstwę komórek 1 ml PBS bez wapnia i magnezu.</li>
	<li>Dodaj 0,5 ml trypsyny-EDTA. Ostrożnie zakręć naczyniem i odessaj Trypsin-EDTA. Inkubować płytkę hodowlaną przez 3 minuty w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Rzeczywisty czas inkubacji różni się w zależności od użytej linii komórkowej. 
	UWAGA: W tym okresie należy przygotować nową płytkę 12-dołkową i dodać do każdej studzienki sterylne szkiełka nakrywkowe o średnicy 15 mm. Szkiełka nakrywkowe pokryte lizyną, lamininą lub kolagenem mogą poprawić przyczepianie się komórek HEK293, które łatwo się odłączają.</li>
	<li>Po odłączeniu komórek dodaj 1 ml wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki wzrostowej do każdej studzienki. Wymieszać pipetując i natychmiast przenieść wymaganą liczbę komórek na płytkę 12-dołkową ze szkiełkami nakrywkowymi. Dodaj świeżą, kompletną pożywkę wzrostową do każdej studzienki, aby dostosować całkowitą objętość do 1 ml</li>
	<li>Inkubować komórki przez 16 - 24 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
	UWAGA: Po 30 - 60 minutach większość komórek przylgnie do sterylnych szkiełek nakrywkowych.</li>
</ol>
5. Wykrywanie mikroskopii konfokalnej
<ol>
	<li>Lokalizacja komórkowa
	<ol>
		<li>Po 16-24 godzinach, gdy komórki osiągną bliskie zbieżność na sterylnych szkiełkach nakrywkowych na 12-dołkowej płytce, dodać sondę membranową DiI do każdej studzienki, uzyskując końcowe stężenie 5 μM. Pozostawić komórki do inkubacji przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Po 30 minutach usunąć zrównoważoną pożywkę wzrostową i dwukrotnie umyć komórki w zimnym PBS (2 - 8 °C).</li>
		<li>Utrwal komórki, dodając 1 ml 4% roztworu paraformaldehydu (w PBS) do każdej studzienki. Delikatnie mieszać przez 15 min. 
		Uwaga: Paraformaldehyd jest umiarkowanie toksyczny w kontakcie ze skórą lub wdychaniu i jest oznaczony jako prawdopodobny czynnik rakotwórczy dla ludzi. Podczas ważenia i obchodzenia się z paraformaldehydem należy używać dygestoriów chemicznych, wentylowanych obudów wagowych lub innych środków ochronnych.</li>
		<li>Umyj stałe komórki dwukrotnie w PBS. Dodać 200-300 μl roztworu DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindolowego) (0,5 μg/ml) do każdego dołka i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj komórki dwukrotnie PBS. Ostrożnie zdejmij szkiełka pokrywy z płyty i odchabnij nadmiar PBS. Odwrócić na szkiełka mikroskopowe obciążone jedną kroplą podłoża mocującego (50% v/v glicerol/woda). Usuń nadmiar medium montażowego z prowadnic.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Internalizacja komórkowa
	<ol>
		<li>Po 16-24 godzinach, gdy komórki osiągną bliskie zbieżność na sterylnych szkiełkach nakrywkowych w 12-dołkowej płytce, należy usunąć zrównoważoną pożywkę wzrostową i dodać świeżą, ogrzaną pożywkę DMEM (37 °C). Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Traktuj komórki różnymi stężeniami liganda (0, 10-12, 10-9 i 10-6 M) przez 30 minut i traktuj je ligandem 10-6 M przez różne czasy (0, 10, 30 i 60 minut).</li>
		<li>Umyć komórki dwukrotnie w zimnym PBS (2 - 8 °C). Utrwal komórki, dodając 1 ml 4% roztworu paraformaldehydu (w PBS) do każdej studzienki. Delikatnie mieszać przez 15 min.</li>
		<li>Umyj komórki dwukrotnie w PBS. Ostrożnie zdejmij szkiełka pokrywy z płyty i odchabnij nadmiar PBS. Odwrócić na szkiełka mikroskopowe obciążone jedną kroplą podłoża mocującego (50% v/v glicerol/woda). Usuń nadmiar medium montażowego z prowadnic.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikroskopia konfokalna
	<ol>
		<li>Włącz sprzęt mikroskopu konfokalnego, w tym moc lampy rtęciowej, mikroskop komputerowy, skaner i laser. Zaloguj się na konto systemu operacyjnego, uruchom oprogramowanie, sprawdź konfigurację i wybierz laser. Włącz różne jednostki systemu mikroskopii konfokalnej w kolejności zgodnie z instrukcjami.</li>
		<li>Umieść przygotowane szkiełka na stoliku mikroskopu. Umieścić próbkę nad soczewką obiektywu za pomocą sterownika stolika. Dodaj jedną kroplę olejku cedrowego na szkiełko nakrywkowe, gdy wybrana jest soczewka zanurzeniowa z olejkiem. Umieść szkiełka nakrywkowe na szkiełkach skierowanych w stronę obiektywu.</li>
		<li>Znajdź interesujące Cię komórki pod mikroskopią fluorescencyjną.</li>
		<li>Przełącz na tryb skanowania. Wybierz moc lasera i zakres spektralny fluoroforu emisyjnego. Uchwyć wysokiej jakości obrazy konfokalne, dostrajając intensywność lasera i inne parametry.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+and+molecular+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Endocytosis and molecular sorting.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 575-625 (1996).</li>
<li>Hausott, B., Klimaschewski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+turnover+and+receptor+trafficking+in+regenerating+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neuro%22%5BJournal%5D)">Membrane turnover and receptor trafficking in regenerating axons.</a> Eur J Neuro. 43, 309-317 (2016).</li>
<li>Kallal, L., Benovic, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+green+fluorescent+proteins+to+study+G-protein-coupled+receptor+localization+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Using green fluorescent proteins to study G-protein-coupled receptor localization and trafficking.</a> Trends Pharmacol Sci. 21, 175-180 (2000).</li>
<li>Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+structure+of+the+Aequorea+victoria+green-fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein.</a> Gene. 111, 229-233 (1992).</li>
<li>Spector, D. L., Goldman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+and+Expressing+GFP+Fusion+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Constructing and Expressing GFP Fusion Proteins.</a> CSH protocols. 2006, (2006).</li>
<li>Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+an+indicator+to+monitor+membrane+protein+overexpression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 507, 220-224 (2001).</li>
<li>von Arnim, A. G., Deng, X. W., Stacey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+vectors+for+the+expression+of+green+fluorescent+protein+fusion+proteins+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Cloning vectors for the expression of green fluorescent protein fusion proteins in transgenic plants.</a> Gene. 221, 35-43 (1998).</li>
<li>Webb, C. D., Decatur, A., Teleman, A., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+green+fluorescent+protein+for+visualization+of+cell-specific+gene+expression+and+subcellular+protein+localization+during+sporulation+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Use of green fluorescent protein for visualization of cell-specific gene expression and subcellular protein localization during sporulation in Bacillus subtilis.</a> J Bacteriol. 177, 5906-5911 (1995).</li>
<li>Kain, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+reporter+of+gene+expression+and+protein+localization%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a reporter of gene expression and protein localization.</a> BioTechniques. 19, 650-655 (1995).</li>
<li>Fukunaga, S., Setoguchi, S., Hirasawa, A., Tsujimoto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+ligand-mediated+internalization+of+G+protein-coupled+receptor+as+a+novel+pharmacological+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Monitoring ligand-mediated internalization of G protein-coupled receptor as a novel pharmacological approach.</a> Life Sci. 80, 17-23 (2006).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agonist-Activated+Bombyx+Corazonin+Receptor+Is+Internalized+via+an+Arrestin-Dependent+and+Clathrin-Independent+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Agonist-Activated Bombyx Corazonin Receptor Is Internalized via an Arrestin-Dependent and Clathrin-Independent Pathway.</a> Biochemistry. 55, 3874-3887 (2016).</li>
<li>Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+G+protein-coupled+receptor+kinases+and+arrestins+during+receptor+desensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Regulation of G protein-coupled receptor kinases and arrestins during receptor desensitization.</a> Mol Pharmacol. 63, 9-18 (2003).</li>
<li>Ferguson, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+beta-arrestin+in+mediating+agonist-promoted+G+protein-coupled+receptor+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of beta-arrestin in mediating agonist-promoted G protein-coupled receptor internalization.</a> Science. 271, 363-366 (1996).</li>
<li>Stojilkovic, S. S., Reinhart, J., Catt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadotropin-releasing+hormone+receptors%3A+structure+and+signal+transduction+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Gonadotropin-releasing hormone receptors: structure and signal transduction pathways.</a> Endocr Rev. 15, 462-499 (1994).</li>
<li>Yan, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Expression+Profile+of+the+Gonadotropin-Releasing+Hormone+Receptor+in+Common+Chinese+Cuttlefish%2C+Sepiella+japonica%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool+A+Ecol+Genet+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification and Expression Profile of the Gonadotropin-Releasing Hormone Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica.</a> J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. , (2016).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+activation+of+the+G+protein-coupled+receptor+BNGR-A21+by+the+neuropeptide+corazonin+from+the+silkworm%2C+Bombyx+mori%2C+dually+couples+to+the+G%28q%29+and+G%28s%29+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific activation of the G protein-coupled receptor BNGR-A21 by the neuropeptide corazonin from the silkworm, Bombyx mori, dually couples to the G(q) and G(s) signaling cascades.</a> J Biol Chem. 288, 11662-11675 (2013).</li>
<li>Lu, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning%2C+Characterization%2C+and+Expression+Profile+of+Estrogen+Receptor+in+Common+Chinese+Cuttlefish%2C+Sepiella+japonica%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool+A+Ecol+Genet+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cloning, Characterization, and Expression Profile of Estrogen Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica.</a> J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 325, 181-193 (2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Przedstawiony tutaj protokół zapewnia wydajną i łatwą do interpretacji metodę wykrywania subkomórkowej lokalizacji i internalizacji ekspresji białka fuzyjnego GPCR w komórkach HEK293. Technikę tę można łatwo dostosować do wielu różnych genów i typów komórek, takich jak lokalizacja komórkowa i internalizacja receptora korazoniny z Bombyx mori w komórkach HEK293 i BmN16.
Pomyślne zastosowanie tego potężnego testu zależy od kilku kluczowych czynników. Przede wszys...

Komórki posiadają maszynerię do transportu materiałów pozakomórkowych - takich jak ligandy, mikroorganizmy, składniki odżywcze i białka transbłonowe - do komórki w celu uzyskania informacji, energii i innych celów1,2. Ma kluczowe znaczenie dla homeostazy komórkowej, funkcji tkanek i ogólnego przeżycia komórek. Ekspresja fluorescencyjnych białek fuzyjnych oparta na komórkach jest skutecznym sposobem badania lokalizacji i internalizacji receptorów transbłonowych, takich jak receptory sprzężone z białkiem G (GPCR), w szlakach sygnałowych3.
Ekspresja białek fuzyjnych oznaczonych zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) meduzy Aequorea victoria, w połączeniu z technikami bezpośredniego wykrywania fluorescencji, zyskała szeroką akceptację w badaniach nad białkami4,5,6. Detekcja oparta na GFP ma tę zaletę, że umożliwia obrazowanie żywych komórek w czasie rzeczywistym przy jednoczesnym uniknięciu artefaktów fiksacji7. Seria wszechstronnych wektorów klonowania została skonstruowana w celu ułatwienia ekspresji fuzji białek z GFP w różnych komórkach8,9. Wektor pEGFP-N1 jest szeroko stosowanym i skomercjalizowanym wektorem plazmidowym kodującym ulepszone białko zielonej fluorescencji (EGFP), które zostało zoptymalizowane z GFP typu dzikiego w celu uzyskania jaśniejszej fluorescencji i wyższej ekspresji w komórkach ssaków. Aby zaobserwować sygnał fluorescencyjny EGFP wyrażony w komórkach ssaków, należy przeprowadzić mikroskopię fluorescencyjną ze wzbudzeniem przy 488 nm i emisją przy 507 nm, najlepiej za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Monitorowanie subkomórkowej lokalizacji i internalizacji receptorów za pośrednictwem ligandów jest powszechną techniką badania transdukcji sygnału i funkcji GPCRs10,11. W większości przypadków internalizacja prowadzi do odczulania GPCR (tłumienie odpowiedzi na bodziec pomimo obecności agonistów)12,13. Zinternalizowane receptory mogą zostać włączone do lizosomu i zdegradowane lub mogą zostać poddane recyklingowi z powrotem na powierzchnię komórki, w zależności od charakteru receptorów i linii komórkowych użytych w eksperymentach.
Receptory hormonu uwalniającego gonadotropiny (GnRHRs) należą do rodziny GPCR i mają typową strukturę białka GPCR, z zewnątrzkomórkowym zakończeniem aminowym , wewnątrzkomórkowym zakończeniem -COOH i siedmioma domenami transbłonowymi (TM)14. Transfekcja rekombinowanego plazmidu SjGnRHR-EGFP (z genem GnRHR z Sepiella japonica) i wykrywanie mikroskopią konfokalną znakowanego EGFP SjGnRHR (wyrażanego w komórkach HEK293) zostało zgłoszone wcześniej, a fluorescencja GFP została ustalona jako reporter dla transbłonowych testów lokalizacji białek15. Teraz internalizacja SjGnRHR, aktywowana przez hormon uwalniający gonadotropiny S. japonica (SjGnRH), została wykazana w sposób zależny od czasu i dawki za pomocą mikroskopii konfokalnej.

<table><tbody><tr><td>Linia komórkowa HEK293&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Hycon o wysokiej zawartości glukozy</td><td></td><td>SH30022.01</td><td>Wysoki poziom glukozy 4,0 mM L-glutamina</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>PuFei</td><td>1101-100</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Genom</td><td>GNM10010</td> Genom penicyliny-streptomycyny GNM15140 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,25% trypsyny i 0,02%</td><td>genomu</td> <td>EDTA</td><td></td>GNM25200</tr><tr><td>Opti-MEM (1x)</td><td>GIBCO, firmy Life Technologies</td><td>31985-062</td><td>zredukowane podłoże surowicy</td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000 Odczynnik do transfekcji</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td>Odczynnik 1</td></tr><tr><td>X-tremeGENE HP DNA Odczynnik do transfekcji</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td>2</td></tr><tr><td>Roztwór do barwienia DAPI</td><td>Beyotime</td><td>C1006</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>Beyotime</td><td>C1036</td><td></td></tr><tr><td>Medium do montażu przeciwblaknięcia</td><td>Beyotime</td><td>P0126</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co. (SCRC)</td><td>80096618</td><td></td></tr><tr><td>100 mm hodowla komórkowa</td><td>CORNING</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>płytka 6-dołkowa&nbsp;</td><td>ExCell Bio</td><td>CS016-0092</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 12-dołkowa&nbsp;</td><td>ExCell Bio</td><td>CS016-0093</td><td></td></tr><tr><td>Szkło osłonowe</td><td>NEST</td><td>801007</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Citoglas</td><td>10127105P-G</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Forma Inkubator CO2</td><td>Thermo</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP5II laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td>5100001311</tr></tbody></table>

wykrywanie internalizacji receptora sprzężonego z białkiem g aktywowanym ligandem za pomocą mikroskopii konfokalnej

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa (CLSM) to technika obrazowania optycznego do obrazowania o wysokim kontraście. Jest to potężne podejście do wizualizacji fluorescencyjnych białek fuzyjnych, takich jak białko zielonej fluorescencji (GFP), w celu określenia ich ekspresji, lokalizacji i funkcji. Subkomórkowa lokalizacja białek docelowych jest ważna dla identyfikacji, charakterystyki i analiz funkcjonalnych. Internalizacja jest jednym z dominujących mechanizmów kontrolujących sygnalizację receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR) w celu zapewnienia odpowiednich odpowiedzi komórkowych na bodźce. Tutaj opisujemy eksperymentalną metodę wykrywania subkomórkowej lokalizacji i internalizacji GPCR w komórkach HEK293 za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ponadto eksperyment ten dostarcza pewnych szczegółów na temat hodowli komórkowej i transfekcji. Protokół ten jest kompatybilny z wieloma powszechnie dostępnymi markerami fluorescencyjnymi i ma zastosowanie do wizualizacji subkomórkowej lokalizacji większości białek, a także do internalizacji GPCR. Technika ta powinna umożliwić naukowcom skuteczne manipulowanie ekspresją genu GPCR w liniach komórkowych ssaków i ułatwić badania nad lokalizacją i internalizacją subkomórkową GPCR.

Rysunek 1 przedstawia przykład systemu mikroskopu konfokalnego. Rysunek 2 prezentuje ekspresję pEGFP-N1 w komórkach HEK293. Sygnał GFP wykryto w cytoplazmie i jądrze komórkowym. Rysunek 3 pokazuje lokalizację subkomórkową GnRHR z S. japonica w komórkach HEK293, co jest zgodne z naszymi wcześniej opublikowanymi wynikami15. Białko fuzyjne z tagiem EGFP na C-końcu SjGnRHR (SjGnRHR-EGFP) w ty...

Ten protokół opisuje wykrywanie za pomocą mikroskopii konfokalnej internalizacji receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR) w komórkach ssaków. Obejmuje podstawową procedurę hodowli komórek, transfekcji i mikroskopii konfokalnej oraz zapewnia wydajną i łatwą do interpretacji metodę wykrywania subkomórkowej lokalizacji i internalizacji GPCR wyrażanego fuzją.

Wykrywanie internalizacji receptora sprzężonego z białkiem G aktywowanym ligandem za pomocą mikroskopii konfokalnej

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest przedstawienie wydajnej i łatwo interpretowalnej metody wykrywania lokalizacji subkomórkowej oraz internalizacji ekspresyjnych białek fuzyjnych GPCR w komórkach ssaków. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu subkomórkowej lokalizacji białek, takie jak internalizacja i recykling receptorów. Główną zaletą tej techniki jest możliwość jej łatwego i efektywnego zastosowania.W związku z powyższym, metoda ta może dostarczyć cennych informacji w zakresie monitorowania i lokalizacji GPCR. Można ją również zastosować w innych układach, takich jak białka cytoplazmatyczne i jądrowe. Po odzyskaniu i pasażowaniu komórek HEK293 zgodnie z protokołem tekstowym, gdy komórki osiągną niemal pełną konfluencję, należy usunąć zrównoważone medium wzrostowe, dodać 2 ml PBS i delikatnie zakręcić naczyniem, aby wypłukać komórki.Odlać PBS i dodać jeden mililitr trypsyny EDTA. Aby całkowicie zdigerować komórki, ostrożnie zakręcić naczyniem i odessać roztwór. Następnie umieścić naczynie w inkubatorze CO2 z płaszczem wodnym o temperaturze 37 °C na trzy minuty.Podczas inkubacji komórek przygotować płytkę sześcio-dołkową, dodając 2 ml zrównoważonego medium wzrostowego do każdego dołka. Następnie, gdy komórki odkleją się od dna naczynia, dodać do naczynia 1 ml zrównoważonego medium wzrostowego. Wymieszać zawiesinę poprzez pipetowanie, a następnie niezwłocznie przenieść 0,1 ml zawiesiny komórkowej do każdego dołka przygotowanej płytki sześcio-dołkowej.Ostrożnie nanieś zawiesinę pipetą do dołków, a następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Następnego dnia upewnij się, że konfluencja komórek wynosi 85-95%. Następnie do dwóch sterylnych probówek do mikrocentryfugi dodaj trzy µg plazmidowego DNA oraz 100 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy do jednej z probówek.W tym czasie do innej probówki należy dodać 9 µL odczynnika jeden oraz 100 µL zredukowanego medium serum. Probówki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie należy połączyć rozcieńczoną mieszaninę plazmidów z rozcieńczonym odczynnikiem jeden.Następnie delikatnie wymieszaj roztwór i inkubuj go w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Odessaj pożywkę z komórek i dodaj 1,5 mililitra świeżej pożywki DMEM bez FBS. Następnie do każdej studzienki dodaj kroplami 215 mikrolitrów mieszaniny odczynnika do transfekcji DNA i delikatnie wymieszaj, delikatnie kołysząc płytką.Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez cztery do ośmiu godzin. Następnie wymień medium na świeże DMEM z 10% FBS. Inkubuj komórki przez kolejne 24 do 48 godzin przed przeprowadzeniem jakichkolwiek eksperymentów.Wydajność transfekcji może znacznie różnić się w zależności od linii komórkowej. Dlatego, w zależności od użytego typu komórek, konieczna może być optymalizacja metody depozycji „sit and stab”. Usunąć pożywkę wzrostową z płytki hodowlanej z sześcioma dołkami.Następnie użyj 1 ml PBS do przemycia monowarstwy komórek. Dodaj 0,5 ml trypsyny z EDTA, zakręć naczyniem i odessij roztwór. Następnie inkubuj płytkę hodowlaną w temperaturze 37 °C przez trzy minuty.Podczas inkubacji umieść sterylne szkiełka nakrywki o średnicy 15 milimetrów w każdej studni płytki 12-dołkowej. Resuspenduj komórki w niewielkiej objętości świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej, a następnie przenieś wymaganą liczbę komórek na płytkę 12-dołkową ze szkiełkami nakrywkami. Następnie inkubuj komórki przez 16 do 24 godzin.Po 16 do 24 godzinach inkubacji, gdy komórki osiągną niemal pełną konfluencję, do każdej studzienki należy dodać sondę błonową DiI w stężeniu 5 µM i umieścić komórki ponownie w inkubatorze na 30 minut. Następnie należy usunąć zrównoważone podłoże hodowlane i dwukrotnie przemyć komórki zimnym PBS. Potem do każdej studzienki dodaje się 1 mL 4% PFA i miesza przez 15 minut w celu utrwalenia komórek.Komórki utrwalone przemyj dwukrotnie buforem PBS, następnie do każdej studzienki dodaj od 200 do 300 µL DAPI i inkubuj płytkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po dwukrotnym przemyciu komórek buforem PBS ostrożnie wyjmij szkiełka podstawowe z płytki i usuń nadmiar buforu za pomocą chłonnego papieru. Odwróć szkiełka podstawowe na preparaty do mikroskopu, na które nanieśliśmy jedną kroplę medium montażowego.Następnie usuń nadmiar medium montażowego z szkiełek. Wykorzystując komórki, które osiągnęły niemal pełną konfluencję, usuń zrównoważone medium wzrostowe i dodaj świeże, ogrzane DMEM. Inkubuj komórki przez jedną godzinę.Inkubuj komórki z różnymi stężeniami liganda przez 30 minut. Następnie inkubuj komórki z ligandem w stężeniu 10⁻⁶ M przez różne przedziały czasowe wskazane tutaj. Przemyj komórki dwukrotnie zimnym PBS, a następnie dodaj 1 ml 4% PFA w PBS do każdej studzienki, po czym delikatnie mieszaj zawiesinę przez 15 minut.Po dwukrotnym przemyciu komórek w PBS ostrożnie wyjmij szkiełka nakrywki z dołków płytki i zamontuj je tak, jak pokazano wcześniej w tym filmie. Aby przeprowadzić mikroskopię konfokalną, włącz sprzęt mikroskopu konfokalnego, w tym zasilanie lampy rtęciowej, komputer mikroskopowy, skaner oraz laser. Uruchom oprogramowanie, a następnie sprawdź konfigurację i wybierz laser.Włącz poszczególne moduły systemu mikroskopii konfokalnej zgodnie z instrukcją. Umieść przygotowany preparat na stoliku mikroskopu i za pomocą kontrolera stolika ustaw próbkę nad obiektywem. W przypadku obiektywu imersyjnego nanieś jedną kroplę olejku cedrowego na szkiełko nakrywką i zorientuj preparat tak, aby szkiełko nakrywka było skierowane w stronę obiektywu.Pod nasadą fluorescencyjną należy zlokalizować interesujące komórki, następnie przełączyć urządzenie w tryb skanowania oraz wybrać moc lasera i zakres widmowy fluoroforu emisji. Należy wykonać wysokiej jakości obrazy, dostrajając intensywność lasera i pozostałe parametry. Rysunek ten przedstawia ekspresję pEGFP-N1 w komórkach HEK293.Sygnał GFP wykryto w cytoplazmie i jądrze komórkowym. Przedstawiono tutaj lokalizację subkomórkową receptorów hormonu uwalniającego gonadotropiny z S-Japonica, czyli SjGnRHR, w komórkach HEK293. Receptory EGFP zaznaczono kolorem zielonym, a barwienie Dil, które uwidacznia błonę komórkową, kolorem czerwonym.Receptory lokalizują się w błonie plazmatycznej. Aby zwizualizować internalizację SjGnRHRs, komórki poddano działaniu hormonu uwalniającego gonadotropiny w różnych stężeniach. Jak widać, internalizacja receptorów przebiegała w sposób zależny od dawki, a przy stężeniu liganda 10⁻⁶ M receptor został całkowicie zinternalizowany z powierzchni komórki.Po potraktowaniu ligandem w stężeniu 10⁻⁶ M przez różne okresy czasu, zinternalizowane receptory SjGnRHR były wykrywalne 10 minut po stymulacji agonistą, a maksymalna internalizacja nastąpiła do 60 minuty. Jak wykazano w komórkach HEK293, w obu eksperymentach fluorescencyjne białko fuzyjne SjGnRHR EGFP lokalizowało się głównie w błonie komórkowej i było gwałtownie oraz szybko internalizowane do wnętrza komórek. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby utrzymywać komórki w odpowiednich warunkach, bez zanieczyszczeń bakteriami, grzybami i mykoplazmami.Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować metody takie jak sprawdzanie komórek i unieruchomienie, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące drugiej domeny przejściowej receptorów białkowych. Wraz z każdym kolejnym rozwojem technologia ta utorowała drogę badaczom z dziedziny biologii komórki i biochemrii do badania lokalizacji i internalizacji receptorów transbłonowych w różnych liniach komórkowych.

detection-ligand-activated-g-protein-coupled-receptor-internalization

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wykorzystując system obrazowania z dwufotonową mikroskopią o rozdzielczości spektralnej, uzyskano mapy wydajności transferu energii rezonansowej Förstera (FRET) na poziomie pikseli dla komórek ekspresujących receptory błonowe, w których przypuszcza się tworzenie kompleksów homo-oligomerycznych. Na podstawie map wydajności FRET możliwe jest oszacowanie informacji stechiometrycznych dotyczących badanego kompleksu oligomeru.

In vivo ilościowe oznaczanie oddziaływań receptorów sprzężonych z białkiem G z wykorzystaniem spektroskopowo rozdzielczej mikroskopii dwufotonowej

W niniejszej pracy opisujemy szczegółowe metody obrazowania żywych komórek służące do badania chemotaksji. Przedstawiamy metody mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania dynamiki czasowo-przestrzennej zdarzeń sygnalizacyjnych w migrujących komórkach. Pomiar zdarzeń sygnalizacyjnych pozwala nam lepiej zrozumieć, w jaki sposób sieć sygnalizacyjna GPCR umożliwia wyczuwanie gradientu chemoatraktantów i kontroluje kierunkową migrację komórek eukariotycznych.

Obrazowanie zdarzeń sygnalizacyjnych pośredniczonych przez receptory sprzężone z białkiem G (GPCR), które kontrolują chemotaksję Dictyostelium discoideum

Kodujemy genetycznie nienaturalny aminokwas, p-azydo-L-fenyloalaninę w różnych docelowych miejscach w GPCR i pokazujemy wszechstronność grupy azydologicznej w różnych zastosowaniach. Obejmują one ukierunkowaną technologię fotosieciowania w celu identyfikacji reszt w kieszeni wiążącej ligand GPCR oraz specyficzną dla miejsca bioortogonalną modyfikację GPCR za pomocą znacznika peptydowo-epitopowego lub sondy fluorescencyjnej.

Genetycznie kodowane sondy molekularne do badania receptorów sprzężonych z białkiem G

Opisujemy metodę znakowania białka na powierzchni żywych neuronów za pomocą specyficznego poliklonalnego przeciwciała przeciwko epitopom zewnątrzkomórkowym. Białko związane przez przeciwciało na powierzchni komórki, a następnie internalizowane przez endocytozę, można odróżnić od białka pozostającego na powierzchni lub transportowanego na powierzchnię podczas inkubacji.

Znakowanie różnicowe białek powierzchniowych i zinternalizowanych po karmieniu przeciwciałami żywych hodowanych neuronów

Opisany tutaj test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji jest średnioprzepustowym systemem badań przesiewowych farmakologii odwrotnej do identyfikacji funkcjonalnie aktywujących ligandów sierocych receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR).

Charakterystyka receptorów sprzężonych z białkiem G za pomocą testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Endocytoza za pośrednictwem klatryny, szybki i bardzo dynamiczny proces internalizuje wiele białek, w tym receptory sygnałowe. Opisany tutaj protokół bezpośrednio wizualizuje kinetykę poszczególnych zdarzeń endocytarnych. Ma to zasadnicze znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób rdzeniowi członkowie maszynerii endocytarnej koordynują się ze sobą i jak ładunek białka wpływa na ten proces.

Wizualizacja endocytozy receptorów sprzężonych z białkiem G za pośrednictwem klatryny w rozdzielczości pojedynczego zdarzenia za pomocą mikroskopii TIRF

Ruch receptorów moduluje sygnalizację i reakcję komórki na ligandy i sam reaguje na warunki komórkowe, w tym sygnalizację indukowaną przez ligand. W tym miejscu opisujemy potężną i elastyczną technikę ilościowej oceny transportu receptorów indukowanego przez lek za pomocą znakowania immunologicznego i analizy kolokalizacyjnej.

Śledzenie zmian wywołanych przez leki w transporcie receptorów po internalizacji za pomocą analizy kolokalizacyjnej

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania komórek wyrażających receptory angiotensyny typu 1a znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym podczas endocytozy zainicjowanej przez leczenie angiotensyną II. Technika ta obejmuje znakowanie lizosomów drugim markerem fluorescencyjnym, a następnie wykorzystanie oprogramowania do analizy kolokalizacji receptora i lizosomu w trzech wymiarach w czasie.

Obrazowanie żywych komórek i analiza 3D transportu receptora angiotensyny typu 1a w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Przedstawiono łatwy test fluorescencyjny w celu oceny skuteczności par syntetazy amino-acyl-tRNA/tRNA zawierających niekanoniczne aminokwasy (ncAA) do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Opisano zastosowanie ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), w tym fotosieciowanie miejsc wiązania i bioortogonalne znakowanie GPCR na żywych komórkach.

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

W tej pracy opisano wysokoprzepustowy, wewnątrzkomórkowy test fluorescencji wapnia dla 384-dołkowych płytek do badania bibliotek małych cząsteczek na rekombinowanych receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR). Cel, receptor kininowy kleszcza pomoru bydła, Rhipicephalus microplus, ulega ekspresji w komórkach CHO-K1. Ten test identyfikuje agonistów i antagonistów przy użyciu tych samych komórek w jednym teście "podwójnej addycji".

Test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G

Poznaj metodę wykrywania internalizacji receptora GPCR w komórkach ssaczych przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia precyzyjną lokalizację białek wewnątrzkomórkowych i jest łatwa w interpretacji.

Wykrywanie internalizacji receptora sprzężonego z białkiem G aktywowanym ligandem za pomocą mikroskopii konfokalnej

Przeglądaj więcej filmów