Wykrywanie internalizacji receptora sprzężonego z białkiem G aktywowanym ligandem za pomocą mikroskopii konfokalnej

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zapewnienie wydajnej i łatwej do interpretacji metody wykrywania subkomórkowej lokalizacji i internalizacji ekspresji białek fuzyjnych GPCR w komórkach ssaków. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie lokalizacji białek subkomórkowych, takie jak internalizacja receptora i recykling. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją łatwo i wydajnie stosować.

Tak więc ta metoda może zapewnić wgląd w monitorowanie i lokalizowanie GPCR. Może również mieć zastosowanie do innych układów, takich jak białka cytoplazmatyczne i jądrowe. Po odzyskaniu i pasażowaniu komórek HEK293 zgodnie z protokołem tekstowym, gdy komórki osiągną bliskie konfluencji, wyrzuć zrównoważoną pożywkę wzrostową, dodaj dwa mililitry PBS i zakręć naczyniem, aby umyć komórki.

Wyrzuć PBS i dodaj jeden mililitr trypsyny EDTA. Aby całkowicie strawić komórki, ostrożnie zakręć naczyniem i odessaj roztwór. Następnie umieść naczynie w inkubatorze C02 z płaszczem wodnym o temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy minuty.

Podczas inkubacji komórek przygotuj sześciodołkową płytkę, dodając dwa mililitry zrównoważonej pożywki wzrostowej do każdej studzienki. Następnie, gdy komórki uniosą się z dna naczynia, dodaj do naczynia jeden mililitr zrównoważonej pożywki wzrostowej. Wymieszać pipetując i natychmiast przenieść 0,1 mililitra zawiesiny komórek do każdego dołka przygotowanej płytki sześciodołkowej.

Delikatnie odpipetować zawiesinę w studzienkach i inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Następnego dnia upewnij się, że komórki są zlewające się w 85-95%. Następnie do dwóch sterylnych probówek do mikrowirówek dodać trzy mikrogramy plazmidowego DNA i 100 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy do jednej probówki.

W międzyczasie dodaj dziewięć mikrolitrów odczynnika jeden i 100 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy do drugiej probówki. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Połączyć rozcieńczoną mieszaninę plazmidu z rozcieńczonym odczynnikiem.

Następnie delikatnie wymieszaj roztwór i inkubuj go w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Odessać pożywkę komórek i dodać 1,5 mililitra świeżego DMEM bez FBS. Następnie dodaj kroplami 215 mikrolitrów mieszaniny odczynników do transfekcji DNA do każdej studzienki i delikatnie wymieszaj, obracając płytkę.

Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez cztery do ośmiu godzin. Następnie zastąp podłoże świeżym DMEM z 10% FBS. Inkubuj komórki przez kolejne 24 do 48 godzin przed przeprowadzeniem jakichkolwiek eksperymentów.

Skuteczność transfekcji może się znacznie różnić w różnych liniach komórkowych. W związku z tym może być konieczna optymalizacja osadzania w pozycji siedzącej i kłutej w zależności od konkretnego typu użytej komórki. Usuń pożywkę wzrostową z sześciodołkowej płytki hodowlanej.

Następnie użyj jednego mililitra PBS do umycia monowarstwy komórek. Dodaj 0,5 mililitra trypsyny EDTA, zakręć naczyniem i odessaj roztwór. Następnie inkubuj płytkę hodowlaną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty.

Podczas inkubacji należy włożyć sterylne szkiełka nakrywkowe o średnicy 15 milimetrów do każdego dołka płytki 12-dołkowej. Ponownie zawiesić komórki w małej objętości świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej i przenieść wymaganą liczbę komórek na płytkę 12-dołkową ze szkiełkami nakrywkowymi. Następnie inkubuj komórki przez 16 do 24 godzin.

Po 16 do 24 godzinach inkubacji, gdy komórki osiągną bliskie zbieżności, dodaj pięć mikromolowych kopru z sondy membranowej do każdej studzienki i umieść komórki z powrotem w inkubatorze na 30 minut. Usuń zrównoważoną pożywkę wzrostową i użyj zimnego PBS do dwukrotnego umycia komórek. Następnie dodaj jeden mililitr 4% PFA do każdej studzienki i mieszaj komórki przez 15 minut, aby je utrwalić.

W przypadku PBS dwukrotnie umyj utrwalone komórki, a następnie dodaj od 200 do 300 mikrolitrów DAPI do każdej studzienki i inkubuj płytkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po dwukrotnym umyciu komórek PBS ostrożnie usunąć szkiełka nakrywkowe z płytki i odciąć nadmiar buforu. Odwróć szkiełka nakrywkowe na szkiełka mikroskopowe obciążone jedną kroplą podłoża montażowego.

Następnie usuń nadmiar medium montażowego z prowadnic. Używając komórek, które urosły do prawie zbiegu, usuń zrównoważoną pożywkę wzrostową i dodaj świeżo podgrzany DMEM. Inkubuj komórki przez godzinę.

Traktuj komórki różnymi stężeniami liganda przez 30 minut. I potraktuj komórki 10 do ujemnego sześciotrzowego liganda przez różne pokazane tutaj czasy. Użyj zimnego PBS do dwukrotnego umycia komórek, a następnie dodaj jeden mililitr 4% PFA w PBS do każdej studzienki, a następnie delikatnie mieszaj komórki przez 15 minut.

Po dwukrotnym umyciu komórek w PBS, ostrożnie wyjmij szkiełka nakrywkowe z dołków płytki i zamontuj je, jak pokazano wcześniej w tym filmie. Aby przeprowadzić mikroskopię konfokalną, włącz sprzęt mikroskopu konfokalnego, w tym moc lampy rtęciowej, mikroskop komputerowy, skaner i laser. Uruchom oprogramowanie, a następnie sprawdź konfigurację i wybierz laser.

Włącz różne jednostki systemu mikroskopii konfokalnej zgodnie z instrukcjami. Umieść przygotowane szkiełko na stoliku mikroskopu i za pomocą sterownika stolika umieść próbkę nad soczewką obiektywu. W przypadku soczewki zanurzeniowej z olejkiem dodaj jedną kroplę olejku cedrowego na szkiełko nakrywkowe i ustaw szkiełko nakrywkowe tak, aby szkiełko było skierowane w stronę soczewki.

W obszarze fluorescencji znajdź interesujące Cię komórki, a następnie przełącz się w tryb skanowania i wybierz moc lasera oraz zakres widmowy fluoroforu emisyjnego. Uchwyć obrazy wysokiej jakości, dostrajając intensywność lasera i inne parametry. Ten rysunek ilustruje ekspresję pEGFP-N1 w komórkach HEK293.

Sygnał GFP wykryto w cytoplazmie i jądrze. Lokalizacja subkomórkowa w komórkach HEK293 receptorów hormonu uwalniającego gonadotropiny z S-Japonica lub SjGnRHR jest pokazana tutaj. Receptory EGFP są zaznaczone na zielono, a barwienie Dil, które podkreśla błonę komórkową, jest na czerwono.

Receptory są widoczne zlokalizowane w błonie plazmatycznej. Aby uwidocznić internalizację SjGnRHR, komórki potraktowano hormonem uwalniającym gonadotropiny w różnych stężeniach. Jak widać tutaj, internalizacja receptorów przebiegała w sposób zależny od dawki, a receptor został całkowicie zinternalizowany z powierzchni komórki za pomocą liganda od 10 do minus 6 molowego.

Po leczeniu ligandem od 10 do minus sześciu molowców przez różne okresy czasu, zinternalizowane SjGnRHR były wykrywalne 10 minut po symulacji agonistycznej, a ekstremalna internalizacja nastąpiła po 60 minutach. Jak wykazano w komórkach HEK293, w obu eksperymentach fluorescencyjne białko fuzyjne SjGnRHR EGFP było pierwotnie zlokalizowane w błonie plazmatycznej i zostało dramatycznie i szybko zinternalizowane do komórek. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o utrzymaniu komórek w odpowiednich warunkach bez zanieczyszczenia bakteriami, grzybami i mykoplazmą.

Postępując zgodnie z tą procedurą, można przeprowadzić metody takie jak sprawdzanie komórek i unieruchomienie, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak drugi w przejściu V receptorów białkowych. Po każdym z tych osiągnięć technologia ta torowała drogę naukowcom zajmującym się biologią i biochemią komórki do badania lokalizacji i internalizacji receptorów transbłonowych w różnych liniach komórkowych.