Prosta metoda identyfikacji kinaz, które regulują pluripotencję embrionalnych komórek macierzystych za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych inhibitorów

Ogólnym celem tego badania przesiewowego jest identyfikacja małocząsteczkowych inhibitorów kinaz białkowych, które modulują pluripotencję embrionalnych komórek macierzystych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji embrionalnych komórek macierzystych poprzez identyfikację nowych szlaków sygnałowych kinazy białkowej, które regulują pluripotencję embrionalnych komórek macierzystych. Tak więc główną zaletą tej techniki jest to, że badanie przesiewowe jest stosunkowo łatwe do wykonania przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego i łatwo dostępnych odczynników.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zdaliśmy sobie sprawę, że większość badań nad szlakami sygnałowymi pluripotencji całkowicie zignorowała ogromne fale kinamu. Przygotuj 10-centymetrowe naczynia pokryte żelatyną, dodając pięć mililitrów 0,1% żelatyny do 10-centymetrowych talerzy. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez pięć minut odessać żelatynę i pozostawić płytkę do wyschnięcia na dwie minuty.

Następnie umieść dowolną standardową linię komórkową ES myszy na powlekanych naczyniach w standardowym mysim pożywce z komórkami ES zawierającymi 100 nanogramów na mililitr LIF oznaczonego GST, 10% płodowej surowicy cielęcej i 5% wymiany surowicy nokautującej. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza 5% CO2 i wymieniaj pożywkę codziennie. Przenikaj komórki ES myszy z około 80% zbiegiem co drugi dzień, odsysając pożywkę i przemując pięcioma mililitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami na płytkę.

Następnie dodaj jeden mililitr trypsyny EDTA na płytkę mysich komórek ES i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po inkubacji ponownie zawiesić trypsynizowane komórki w czterech mililitrach pożywki i odwirować komórki z prędkością 1200 obr./min przez pięć minut. Dokładnie ponownie zawiesić powstały osad komórkowy w pięciu mililitrach pożywki, pipetując w górę iw dół, aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki.

Policz komórki, łącząc 10 mikrolitrów zawiesiny komórek i 10 mikrolitrów błękitu trypanowego. Umieść mieszaninę w komorze do liczenia komórek lub użyj hemocytometru i mikroskopu świetlnego. Następnie wysiewaj 3000 mysich komórek ES na 0,1% pokrytych żelatyną 96-dołkowych płytkach w końcowej objętości 100 mikrolitrów pożywki za pomocą wielokanałowej pipety.

Następnie nanieść inhibitory kinaz w rozcieńczeniu od 1 do 100 za pomocą pipety wielokanałowej. Delikatnie odpipetować pożywkę, aby wymieszać inhibitor i zawiesinę komórek. Następnie pozwól komórkom osiąść w kapturze do hodowli tkankowej na jedną godzinę, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie na powierzchni posiewu.

Hodować komórki przez 48 godzin bez zmiany pożywki. Aby rozpocząć analizę przesiewową, umyj 96-dołkowe płytki komórek ES myszy w 200 mikrolitrach PBS za pomocą wielokanałowego aspiratora i pipet. Po umyciu wymieszaj ekstrakty komórkowe w 150 mikrolitrach buforu do lizy.

Klarować ekstrakty przez odwirowanie w temperaturze 1500 razy G przez 30 minut na 96-dołkowych płytkach z dnem w kształcie litery V. Następnie unieruchomić 100 mikrolitrów supernatantów na membranie nitrocelulozowej za pomocą 96-dołkowego próżniowego kolektora punktowego. Wysuszyć membranę i zabarwić 40 mililitrami Ponceau S, aby zapewnić równomierne przenoszenie.

Po umyciu membrany TBST, zablokuj ją w TBST plus 3% mleka. Następnie inkubować błonę w przeciwciałach Nanog i Dnmt3b w rozcieńczeniu od jednego do 1000 w buforze blokującym przez noc. Następnego dnia umyj membranę trzy razy przez 10 minut w TBST.

Następnie inkubować go w 30 mililitrach przeciwciał drugorzędowych w rozcieńczeniu od jednego do 10 000 w buforze blokującym. Opracuj błonę za pomocą cyfrowego systemu obrazowania immunoblottingu. Bardzo ważne jest, aby przed kontynuowaniem walidacji inhibitorów kinaz zidentyfikowanych w badaniu przesiewowym za pomocą konwencjonalnego immunoblottingu.

Pomaga to usunąć wyniki fałszywie dodatnie przed dalszą analizą. Przeanalizuj dane przesiewowe i zweryfikuj inhibitory jako rzeczywiste regulatory pluripotencji, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Pokazany tutaj jest reprezentatywny wykres punktowy Nanog z wykonanego ekranu.

Zwrócono uwagę na inhibitory kontroli pozytywnej, które napędzają pluripotencję pierwotną lub wcześniejszą. Pokazany jest również reprezentatywny wykres punktowy Dnmt3b z wykonanego ekranu. Ponownie zwrócono uwagę na inhibitory kontroli pozytywnej, które napędzają pierwotną lub naiwną pluripotencję.

Na tym wykresie inhibitory zostały sklasyfikowane pod kątem stosunku Nanog do Dnmt3b. Dwustopniowy próg stosunku Nanog do Dnmt3b ma na celu identyfikację inhibitorów, które stabilizują naiwną lub zaszczepioną pluripotencję. Dostępne są również zsumowane sygnały Nanog i Dnmt3b.

Ponadto odnotowuje się inhibitory kinaz wybrane do dalszej walidacji. Pokazano tutaj konwencjonalną walidację immunoblot wybranych inhibitorów kinaz, immunoblotów Nanog i Dnmt3b, a także stosunek Nanog do Dnmt3b i całkowity sygnał. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zidentyfikować małocząsteczkowe inhibitory kinaz, które modulują pluripotencję embrionalnych komórek macierzystych.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 72 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w szlaki sygnałowe kinazy, które kontrolują pluripotencję, może być również stosowana do różnicowania embrionalnych komórek macierzystych i innych systemów regulacyjnych, takich jak modyfikatory epigenetyczne. Zgodnie z tą procedurą, inne biblioteki inhibitorów małocząsteczkowych, takie jak te ukierunkowane na modyfikatory epigenetyczne, mogą być wykorzystane do identyfikacji nowych graczy w regulacji pluripotencji.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naszej grupie badawczej do wyjaśnienia nowych szlaków sygnałowych pluripotencji. Używamy tej techniki, aby zidentyfikować nową rolę amplifikowanego szlaku w regulacji pluripotencji.