Ocena spontanicznej przemiany, rozpoznawania nowych obiektów i zaciskania kończyn w transgenicznych mysich modelach β amyloidu i neuropatologii tau
28 maja 2017
Opisane tutaj jest etapowe, behawioralne podejście przesiewowe, które może być użyte do badania przesiewowego pod kątem związków wykazujących skuteczność in vivo na poznawcze i funkcjonalne zachowania motoryczne w transgenicznych mysich modelach β-amyloidozy i tauopatii. Metody te są zoptymalizowane pod kątem badań przesiewowych związków pod kątem aktywności w zadaniach pamięci krótkotrwałej i roboczej.
Ogólnym celem tej procedury jest zmierzenie nieprawidłowych zachowań, które są powszechne w mysich modelach choroby Alzheimera w ustandaryzowany sposób, w celu zbadania związków, które mogą mieć korzystne działanie. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie przedklinicznego odkrywania leków na chorobę Alzheimera, takie jak to, czy związek jest skuteczny lub jak może działać. Główną zaletą tej techniki jest to, że monitoruje ona szereg różnych zachowań przy użyciu podejścia etapowego, które jest zarówno wrażliwe, jak i specyficzne.
Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat skutecznych metod leczenia choroby Alzheimera, może być również stosowana do innych mysich modeli demencji lub dysfunkcji poznawczych, takich jak otępienie czołowo-skroniowe, urazowe uszkodzenie mózgu lub autyzm. Przed użyciem labiryntu Y dokładnie wyczyść go bezzapachową chusteczką bakteriobójczą z wybielaczem. Następnie przetrzyj go 70% etanolem i spłucz wodą.
Przygotuj system akwizycji danych lub kamery wideo, aby prawidłowo śledzić myszy podczas uruchamiania labiryntu. Podczas tego procesu nagraj obraz kija pomiarowego w labiryncie, aby skalibrować odległości, w których się znajdują. Teraz bardzo delikatnie przenieś klatkę myszy na stół w bliskiej odległości od labiryntu.
Wyjmij mysz z klatki i delikatnie umieść ją w jednym ramieniu labiryntu Y skierowanym do środka. Następnie odsuń się na tyle daleko od labiryntu, aby mysz Cię nie widziała i natychmiast rozpocznij nagrywanie wideo. Nagrywaj mysz przez 10 minut.
Po 10 minutach delikatnie wyjmij mysz i umieść ją z powrotem w klatce domowej. Przed przystąpieniem do następnej myszy ponownie dokładnie umyj labirynt Y, stosując trzyetapową procedurę mycia. Przed tym testem umyj arenę na otwartym polu, tak jak w przypadku labiryntu Y.
Dzień przed ekspozycją na obiekt przyzwyczaj myszy do areny. Upewnij się, że system śledzenia działa. I kalibruj odległości za pomocą miarki, tak jak poprzednio.
Również w oprogramowaniu do tagowania zaznacz rogi areny. Teraz delikatnie umieść klatkę myszy na stole w pobliżu areny. Wyjmij mysz i delikatnie umieść ją na środku areny.
Następnie szybko rozpocznij nagrywanie i pozwól myszy eksplorować arenę przez pół godziny. Upewnij się, że jesteś poza zasięgiem wzroku zwierzęcia i nie przeszkadzaj mu podczas testu. Po sesji habituacji wróć myszy do ich domowej klatki.
I dokładnie wyczyść arenę, tak jak poprzednio, zanim przyzwyczaisz się do następnej myszy. Dwie do trzech godzin później wykonaj fazę próbki testu pamięci. Zmodyfikuj arenę, umieszczając w niej dwa identyczne obiekty, oba równo wyrównane do jednej ściany.
Zamocuj przedmioty na miejscu za pomocą szpachli montażowej. W oprogramowaniu zanotuj pozycje dwóch obiektów, a także narożniki areny. Umyj obiekty i arenę jak zwykle, zanim pojawi się mysz.
Przeprowadź test jak sesję habituacyjną, umieszczając mysz na arenie przodem do obiektów. Teraz pozwól myszce eksplorować arenę tylko przez 15 minut. Dwie do trzech godzin później przeprowadź ostatnią fazę testu pamięci.
W tej sesji zachowaj jeden znajomy obiekt w tym samym miejscu i usuń drugi znajomy obiekt, zastępując go nowo wprowadzonym nowym obiektem. Pozostaw wystarczającą odległość między ścianami a przedmiotami, aby myszy mogły swobodnie eksplorować obiekty pod każdym kątem. I tak jak poprzednio, zabezpiecz przedmioty kitem.
We wszystkich grupach testowych w badaniu upewnij się, że masz równowagę pozycji dla nowych i znanych obiektów. Przeprowadź ostatnią sesję, tak jak pozostałe dwie sesje, ale nagrywaj zachowanie myszy tylko przez 10 minut. Zaciskanie kończyn to funkcjonalny test motoryczny, który określa ilościowo deficyty funkcji korowo-rdzeniowej.
Do tego testu użyj urządzenia przenośnego, aby nagrać wideo całą sesję. Zacznij od umieszczenia domowej klatki na czystym stole i udokumentowania dowodu tożsamości zwierzęcia. Następnie delikatnie wyjmij mysz z klatki i przytrzymaj ją zawieszoną za ogon przez pięć do 10 sekund, skupiając wideo na ruchach tylnej i przedniej łapy zwierzęcia. Posługiwanie się myszą w taki sposób, aby nie próbowała uciec, wymaga praktyki.
Po nagraniu co najmniej pięciu sekund filmu przywróć mysz do klatki domowej. I włóż klatkę z powrotem do stojaka. Następnie wyczyść stół przed powtórzeniem procedury na następnej myszy.
Później oceń zachowanie w filmach w skali od zera do czterech. Korzystając z testu labiryntu Y, starzejąca się transgeniczna linia myszy, która wykazuje patologię podobną do choroby Alzheimera, ujawniła oczekiwany spontaniczny defekt przemiany. W przeciwieństwie do tego, inna modelowa linia myszy z chorobą Alzheimera wykazywała zwiększoną spontaniczną przemianę, która była spowodowana skrajną nadpobudliwością i stereotypami w linii.
Zachowania te znacząco zakłócają pomiar spontanicznej naprzemienności. W teście nowego obiektu, podczas habituacji, można ocenić nadpobudliwość i inne stereotypowe zachowania. Podczas fazy pobierania próbek, eksploracja każdego obiektu była mierzona osobno w celu identyfikacji zwierząt bez stronniczości obiektu.
Otwarte kręgi pokazują zwierzęta, które wykazywały stronniczość i zostały wykluczone z fazy testu. Faza testowa została przeanalizowana na trzy różne sposoby. Gdy całkowity czas eksploracji był porównywalny między grupami, analizowano surowy czas eksploracji każdego obiektu.
Gdy porównywane grupy badały przez różny okres czasu, do oceny testu użyto preferencji nowości lub wskaźnika dyskryminacji. Zaciskanie kończyn, które nie jest miarą poznawczą, zaobserwowano w kilku transgenicznych modelach myszy ogonowych. To zachowanie podsumowuje niektóre funkcjonalne deficyty motoryczne obserwowane w późnym stadium choroby Alzheimera.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o delikatnym obchodzeniu się z myszami i zminimalizowaniu wszelkich zakłóceń w środowisku testowym, takich jak głośne dźwięki lub nowe zapachy. Zgodnie z tą procedurą, można zastosować inne metody, takie jak przestrzenny labirynt wodny lub kontekstowe warunkowanie strachu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy związek konkretnie wpływa na funkcję hipokampa. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać skuteczność związków w mysich modelach choroby Alzheimera za pomocą testu Y-labirynt, testu rozpoznawania nowych obiektów i testu zaciskania kończyn.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia podejście do przesiewowych badań behawioralnych w celu oceny skuteczności związków w zakresie funkcji poznawczych i motorycznych u transgenicznych modeli mysich w chorobie Alzheimera. Metody koncentrują się na ocenie zadań związanych z pamięcią krótkotrwałą i roboczą, zapewniając ustandaryzowany sposób pomiaru nieprawidłowych zachowań.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Ocena behawioralna
- Badania nad chorobą Alzheimera
Wstęp
- Choroba Alzheimera charakteryzuje się deficytami poznawczymi i motorycznymi.
- Do badania tych deficytów wykorzystuje się transgeniczne modele mysie.
- Ustandaryzowane testy behawioralne mogą pomóc w identyfikacji potencjalnych związków terapeutycznych.
- Kluczowymi metodami w tych badaniach są test labiryntu Y oraz test nowej manipulacji obiektem.
Cel badania
- Pomiar funkcji poznawczych i motorycznych w modelach mysich choroby Alzheimera.
- Przesiewowe poszukiwanie związków, które mogą poprawić te funkcje.
- Dostarczenie informacji przydatnych w przedklinicznym odkrywaniu leków.
Zastosowane metody
- Test labiryntu Y do oceny pamięci i funkcji poznawczych.
- Test nowego obiektu w celu oceny zachowań eksploracyjnych i pamięci.
- Test przykurczu kończyn (limb clasping) do ilościowej oceny deficytów funkcji motorycznych.
- Standaryzowane czyszczenie i przygotowanie środowisk testowych.
Główne wyniki
- Testy behawioralne wykazały różnice w sprawności poznawczej pomiędzy liniami myszy transgenicznych.
- Odnotowano nadpobudliwość oraz zachowania stereotypowe, które wpłynęły na wyniki testów.
- Zbadano skuteczność związków w poprawie funkcji poznawczych i motorycznych.
- Wyniki potwierdzają zasadność stosowania tych metod do oceny potencjalnych terapii choroby Alzheimera.
Wnioski
- Etapowe podejście do przesiewowych badań behawioralnych jest skuteczne w ocenie efektywności leków.
- Zdobyte informacje mogą stanowić wytyczne dla przyszłych badań nad terapiami choroby Alzheimera.
- Dalsze badania mogą obejmować dodatkowe testy behawioralne w celu przeprowadzenia kompleksowej oceny.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten paradygmat przesiewania behawioralnego umożliwia przedkliniczną ocenę skuteczności związków w odniesieniu do punktów końcowych funkcji poznawczych i motorycznych w modelach choroby Alzheimera, wspierając walidację celów terapeutycznych oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego. Dzięki integracji testów spontanicznej alternacji, rozpoznawania nowych obiektów oraz przykurczu kończyn (limb clasping), podejście to zapewnia ilościowe, powtarzalne wyniki dla pamięci krótkotrwałej, pamięci operacyjnej oraz funkcji korowo-rdzeniowych. Taki etapowy schemat pracy ułatwia priorytetyzację związków o aktywności biologicznej istotnej dla choroby przed przejściem do bardziej zasobożernych badań.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na badanie funkcji obwodów hipokampalnych i korowych istotnych dla patofizjologii choroby Alzheimera, umożliwiając weryfikację hipotez dotyczących celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia jasno określone punkty końcowe z wbudowanymi kontrolami jakości, co redukuje zmienność w badaniach przesiewowych na wczesnym etapie.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez powiązanie efektów działania związków z domenami funkcjonalnymi uszkodzonymi w przebiegu choroby u ludzi.
Przesiewy i rozwój testów
- Wartość naukowa: Pomiar dyskryminacji nowych obiektów oraz spontanicznej alternacji jako wskaźników pojemności pamięci krótkotrwałej i operacyjnej.
- Wartość operacyjna: Zaprojektowany dla umiarkowanej przepustowości przy minimalnej interwencji badacza, co ułatwia przesiewanie bibliotek związków.
- Gotowość do analizy: Obejmuje znormalizowane procedury czyszczenia, habituacji i rozmieszczania obiektów w celu zapewnienia powtarzalności między seriami pomiarowymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Chwytanie kończyn pozwala na ilościowe określenie deficytów korowo-rdzeniowych modelujących zaburzenia motoryczne w późnym stadium choroby Alzheimera, co umożliwia dopasowanie funkcjonalnych biomarkerów.
- System istotny dla choroby: Metoda jest stosowalna w transgenicznych modelach amyloidozy i tauopatii, co wspiera walidację angażowania celu terapeutycznego.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Identyfikacja związków przywracających funkcje poznawcze i motoryczne, co dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji go/no-go w procesie optymalizacji wiodących kandydatów na leki.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkrywania leków – od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego – zapewniając fenotypowanie behawioralne, które łączy wyniki in vitro z efektywnością przedkliniczną.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących modulacji obwodów poznawczych i ruchowych przez związki w systemach istotnych dla danej choroby.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych pomiarów zmiennych zależnych (procent naprzemienności, indeks dyskryminacji, wynik claspingu) do porównania związków.
- Analityka: Generuje wyniki statystyczne (preferencja nowości, indeks dyskryminacji) w celu oceny efektów leczenia w różnych grupach.
- Badania translacyjne: Łączy fenotypy pamięciowe i ruchowe z symptomatologią choroby Alzheimera, wspierając walidację przedkliniczną.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia standaryzowaną platformę behawioralną stosowalną w wielu modelach otępienia i dysfunkcji poznawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w zakresie modulacji celu za pomocą poznawczych i funkcjonalnych odczytów motorycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność w różnych ośrodkach badawczych i partiach związków.
- Wartość strategiczna: Świadoma selekcja portfolio na podstawie danych z przesiewu mechanistycznego i fenotypowego.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko, oparta na przywróceniu zachowań istotnych dla danej choroby.
Uwagi dotyczące implementacji
- Doświadczenie w pracy z gryzoniami, neuronaukach behawioralnych oraz w obsłudze systemów śledzenia opartych na analizie wideo.
- Instrumentacja do testów w labiryncie Y i w otwartym polu, rejestracja wideo oraz kalibracja oprogramowania do śledzenia.
- Standaryzacja protokołów czyszczenia, habituacji i rozmieszczania obiektów w obrębie zespołów.
- Uwzględnienie adaptacji dla różnych szczepów myszy, grup wiekowych oraz modeli chorobowych wykazujących nadaktywność lub zachowania stereotypowe.
- Ograniczenia praktyczne obejmują potencjalne zakłócenia wynikające z nadaktywności, co wymaga określenia kryteriów wykluczenia oraz zastosowania przeciwwagi w rozmieszczeniu obiektów.
