In vitro Obrazowanie i kwantyfikacja skuteczności celowania w lek znakowanych fluorescencyjnie analogów GnRH

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie i przewidzenie skuteczności systemów dostarczania leków opartych na GnRH w hodowlach ludzkich komórek nowotworowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie celowanej terapii przeciwnowotworowej, takie jak to, jak skutecznie komórki różnych typów nowotworów ludzkich przyjmują leki przeciwnowotworowe ukierunkowane na GnRH. Główną zaletą tej metody jest to, że wykorzystuje ona nowe znakowane fluorescencyjnie analogi GnRH, które umożliwiają jednoczesne stosowanie mikroskopii konfokalnej i analizy cytometrii przepływowej.

Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii przeciwnowotworowej, ponieważ receptory GnRH są silnie eksprymowane na kilku typach komórek nowotworowych, co umożliwia selektywne ich ukierunkowanie. Procedurę zademonstruje Bianka Gurbi, doktorantka z mojego laboratorium. Aby rozpocząć, usuń pożywkę hodowlaną z każdej z siedmiu studzienek mikroskopijnego szkiełka z nasionami.

Następnie dodać 250 mikrolitrów podgrzanej kompletnej pożywki do studzienki kontroli ujemnej i 250 mikrolitrów podgrzanej pożywki do zaprawiania nasion GnRH do każdej z pozostałych sześciu studzienek. Inkubuj szkiełko w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, pięciu procent dwutlenku węgla przez pięć godzin. Po pięciu godzinach inkubacji odessać pożywkę z każdej studzienki i umyć komórki 250 mikrolitrami PBS.

Następnie dodaj 250 mikrolitrów roztworu utrwalającego do każdej studzienki i inkubuj szkiełko w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po utrwaleniu komórek wyrzuć roztwór utrwalający i umyj komórki 250 mikrolitrami PBS. Dodać 250 mikrolitrów pięciomolowego roztworu sondy fluorescencyjnej przygotowanego w PBS do każdej studzienki i inkubować szkiełko w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Po wyjęciu roztworu sondy fluorescencyjnej ostrożnie umyj ogniwa dwukrotnie 250 mikrolitrami PBS. Na koniec dodaj trzy do czterech kropli podłoża montażowego do każdej studzienki. Szkiełko należy przechowywać w ciemności w temperaturze pokojowej do momentu zobrazowania pod mikroskopem.

Usunąć pożywkę hodowlaną z każdego z pięciu dołków mikroskopijnego szkiełka z nasionami. Następnie dodać 250 mikrolitrów podgrzanej kompletnej pożywki do studzienki kontroli ujemnej i do drugiej studzienki z nietraktowanymi komórkami. Wstępnie potraktować komórki w trzech pozostałych studzienkach wstępnie podgrzaną pożywką do obróbki zawierającą 10 mikromolowych GnRH FITC.

Inkubuj szkiełko w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, pięć procent dwutlenku węgla przez godzinę. Następnie usunąć pożywkę tylko z komórek poddanych działaniu substancji i przemyć komórki 250 mikrolitrami podgrzanego kompletnego podłoża. Następnie usuń medium myjące.

Następnie dodaj 250 mikrolitrów podgrzanej kompletnej pożywki do każdej z trzech studzienek. Inkubuj szkiełko w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, pięć procent dwutlenku węgla przez godzinę. Po inkubacji wyrzuć pożywkę ze wszystkich pięciu studzienek i umyj komórki 250 mikrolitrami PBS.

Następnie usuń PBS i utrwal komórki za pomocą 250 mikrolitrów roztworu utrwalającego w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie wyrzuć roztwór utrwalający i umyj komórki 250 mikrolitrami PBS. Dodaj 250 mikrolitrów roztworu blokującego do każdej studzienki i inkubuj szkiełko w temperaturze pokojowej przez godzinę.

Odessać roztwór blokujący z każdej studzienki z wyjątkiem kontroli ujemnej. Po umyciu komórek 250 mikrolitrami PBS, dodaj 250 mikrolitrów roztworu przeciwciał pierwszorzędowych do każdej studzienki. Inkubować szkiełko w temperaturze pokojowej przez godzinę w ciemnym miejscu.

Usuń roztwory z każdej z pięciu studzienek i umyj komórki 250 mikrolitrami PBS. Następnie usuń PBS i dodaj 250 mikrolitrów wtórnego roztworu przeciwciał. Inkubować szkiełko w temperaturze pokojowej przez godzinę w ciemności.

Odessać roztwór z każdej studzienki i przemyć komórki 250 mikrolitrami PBS. Usuń PBS do płukania, a następnie dodaj 250 mikrolitrów PBS zawierających pięć mikromolowych sond fluorescencyjnych do każdej studzienki. Inkubować szkiełko przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Wyjmij roztwór sondy fluorescencyjnej z każdej studzienki i ostrożnie umyj komórki dwukrotnie 250 mikrolitrami PBS. Na koniec dodaj trzy do czterech kropli podłoża montażowego do każdej studzienki. Szkiełko należy przechowywać w ciemności w temperaturze pokojowej do czasu zobrazowania pod mikroskopem.

Zobrazuj komórki pod odwróconym konfokalnym laserowym mikroskopem skaningowym. Włącz lasery 488 nm i 633 n. Sprawdź wzmocnienie lasera i rozmiar otworu.

Proszę zobrazować ujemną próbkę kontrolną. Zoptymalizuj sygnał obserwowany dla jądra i dostosuj sygnał FITC i Alexa 546 tak, aby był bliski zeru. Następnie, używając tych samych parametrów, zobrazuj poddane działaniu substancji próbki.

Wyrzuć całe podłoże ze wszystkich siedmiu dołków płytki hodowlanej z nasionami. Następnie dodać jeden mililitr podgrzanej kompletnej pożywki do studzienki kontroli ujemnej i jeden mililitr podgrzanej pożywki do obróbki do pozostałych sześciu studzienek. Inkubuj płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, pięć procent dwutlenku węgla przez pięć godzin.

Po wyrzuceniu pożywki ze wszystkich studzienek ostrożnie umyj komórki dwukrotnie dwoma mililitrami PBS. Usuń PBS, a następnie dodaj 500 mikrolitrów roztworu trypsyny EDTA do każdej studzienki. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż komórki się oderwą, co zajmie około 10 minut.

Używając jednego mililitra kompletnego podłoża, zneutralizuj trypsynę w każdym dołku i wstrząśnij płytką. Następnie zawiesić komórki przez delikatne pipetowanie. Przenieść zawiesiny do oddzielnych probówek FACS i odwirować próbki w temperaturze 150 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery minuty.

Ostrożnie zdekantować supernatanty. Następnie dodaj 500 mikrolitrów lodowatego PBS do każdej probówki FACS i delikatnie zawieś ogniwa. Trzymaj probówki na lodzie, dopóki nie zostaną przeanalizowane przez FACS.

Przedstawiono analizę wychwytu GnRH w komórkach raka gardła. Pięciogodzinne leczenie jednym mikromolowym kompleksem fluorescencyjnym GnRH spowodowało niewielkie, ale wyraźne spożycie objawiające się zielonym sygnałem fluorescencyjnym zlokalizowanym w komórkach raka gardła. Dodatkowe zwiększenie dawki kompleksu prowadziło do zwiększonego wychwytu, co świadczy o zależności od dawki wychwytu GnRH w komórkach raka gardła.

Zależny od receptora wychwyt GnRH i komórkowa dystrybucja liganda w jego receptorze w komórkach raka płuca analizowano poprzez jednoczesne leczenie fluorescencyjnym kompleksem GnRH i barwienie receptora GnRH typu pierwszego i jąder. Wyniki pokazują, że receptor GnRH typu pierwszego jest związany z błoną komórkową, podczas gdy białko GnRH jest internalizowane w komórkach i pozostaje w ich cytoplazmie. Wychwyt GnRH w komórkach raka gardła badano również za pomocą analizy FACS.

Wyniki pokazują, że wychwyt GnRH obserwowany, gdy komórki były traktowane jednym mikromolowym koniugatem GnRH, był znacznie zwiększony, gdy dawka zastosowana do komórek została zwiększona do 10 mikromolowych. Po opanowaniu tej techniki można ukończyć w ciągu ośmiu godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ochronie poddanych działaniu substancji próbek i barwników fluorescencyjnych przed bezpośrednim działaniem światła.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak testy żywotności komórek lub apoptozy, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak skuteczność leku ukierunkowanego na GnRH, który może hamować wzrost danego typu nowotworu. Po tym odkryciu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się terapią nowotworów do zbadania skuteczności systemów dostarczania leków opartych na GnRH w przylegających komórkach nowotworowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać tych znakowanych fluorescencyjnie koniugatów GnRH do badania podatności komórek rakowych na terapie celowane GnRH.