Name: In vitro Obrazowanie i kwantyfikacja skuteczności celowania w lek znakowanych fluorescencyjnie analogów GnRH (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Poznaj metodę obrazowania i kwantyfikacji wchłaniania analogów GnRH w kulturach ludzkich komórek nowotworowych. Wykorzystuje ona mikroskopię konfokalną i cytometrię przepływową do oceny skuteczności celowanego leczenia przeciwnowotworowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Projekt był wspierany przez Narodowy Fundusz Badawczy OTKA (K 104045).

1. Przygotowanie kultur komórkowych i odczynników
<ol>
	<li>Utrzymuj hodowle komórkowe w pożywce zalecanej przez producenta, uzupełnionej 10% (v/v) płodową surowicą bydlęcą i antybiotykami (zwanymi kompletną pożywką). Kolbę do hodowli komórek należy przechowywać w nawilżonym inkubatorze z atmosferą 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Śledzić proliferację i zbieganie się komórek za pomocą mikroskopu odwróconego (przy użyciu obiektywu z kontrastem fazowym 10x).</li>
	<li>Gdy komórki osiągną odpowiednią konfluację, usuń pożywkę i przemyj kulturę 2-3 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Usunąć PBS i dodać 0,5 ml, sterylnego 0,25% roztworu trypsyny-EDTA do hodowli komórkowej i inkubować w temperaturze 37 °C aż do oderwania się komórek (około 10 min).</li>
	<li>Zawieś komórki w 3-4 ml sterylnej, kompletnej pożywce, aby zatrzymać trypsynę i przenieś je do sterylnej probówki wirówkowej. Odwirować komórki przy 150 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej (RT). Ostrożnie odrzucić sklarowany osad i zawiesić osad w 2-3 ml sterylnej, kompletnej pożywki.</li>
	<li>Pobrać 100 μl zawiesiny komórek i wymieszać ze 100 μl 0,4% (m/V) roztworu błękitu trypanowego, aby zabarwić martwe komórki. Załadować 10 μl tej mieszaniny do hemocytometru i określić liczbę żywotnych komórek za pomocą odwróconego mikroskopu.</li>
	<li>Rozcieńczyć wymaganą ilość zawiesiny komórkowej przygotowanej w kroku od 1,3 do 10 ml sterylnym kompletnym podłożem, zawierającym 4 x 104 komórek/ml.</li>
	<li>Dodać 250 μl zawiesiny komórek (przygotowanej w kroku 1.5) na studzienkę (104 komórki/studzienkę) do siedmiu dołków pierwszego 8-dołkowego szkiełka mikroskopowego ze szklanym dnem. Użyj tego suwaka w metodzie wychwytu GnRH.</li>
	<li>Dodać 250 μl zawiesiny komórkowej (przygotowanej w kroku 1.5) na studzienkę (104 komórki/studzienkę) do pięciu dołków drugiego 8-dołkowego szkiełka mikroskopowego. Szkiełko to zostanie wykorzystane w metodzie ekspresji GnRH-I-R.</li>
	<li>Dodać 1 ml zawiesiny komórkowej (przygotowanej w kroku 1.5) na dołek (4 x 104 komórki/studzienkę) do siedmiu dołków płytki 12-dołkowej. Płytka ta zostanie wykorzystana w metodzie oznaczania ilościowego GnRH.</li>
	<li>Pozwól komórkom przylegać do dwóch mikroskopijnych szkiełek i płytki. Inkubować je w nawilżonym inkubatorze z 5% atmosferąCO2 w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.</li>
	<li>Po inkubacji sprawdź komórki za pomocą odwróconego mikroskopu (przy użyciu obiektywu z kontrastem fazowym 10x). Jeśli komórki są zdrowe i przyczepione, wykonaj następujące czynności.</li>
	<li>Przygotować 10 mM roztworu podstawowego GnRH-FITC w dimetylosulfotlenku (DMSO) z każdego z trzech koniugatów18. (Stosować następujące stężenia rozcieńczenia: 16,43 μg/μL [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I, 16,97 μg/μL [D-Lys6(FITC)]-GnRH-II i 16,47 μg/μL [Lys8(FITC)]-GnRH-III) Przechowuj te roztwory podstawowe w ciemnym miejscu w RT i zużyj je w ciągu kilku tygodni.</li>
	<li>Rozcieńczyć po 1,7 μl każdy z trzech 10 mM roztworów podstawowych GnRH-FITC w 1,7 ml kompletnego podłoża. Potrząśnij tymi roztworami. (Są to pożywki do obróbki 10 μM GnRH-FITC). Rozcieńczyć po 150 μl każdej z trzech pożywek 10 μM GnRH-FITC w 1,35 ml kompletnego podłoża. Wstrząśnij również tymi roztworami (są to pożywki do obróbki 1 μM GnRH-FITC). 
	UWAGA: Wszystkie pożywki zawierające GnRH-FITC należy chronić przed światłem i zużyć w ciągu kilku godzin.</li>
	<li>Podgrzej sześć pożywek GnRH-FITC (przygotowanych w kroku 1.12) i 4 ml kompletnego podłoża do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Rozcieńczyć 3 μl 5 mM roztworu sondy fluorescencyjnej (jądrowy barwnik przeciwstawny wymieniony w wykazie materiałów) w 3 ml PBS do 5 μM. Roztwór ten należy chronić przed światłem, utrzymywać go w temperaturze pokojowej i zużyć w ciągu kilku godzin.</li>
</ol>
2. Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa (CLSM)
<ol>
	<li>Metoda wychwytu GnRH
	<ol>
		<li>Pobrać pierwsze szkiełko mikroskopowe przygotowane w kroku 1.6 i odpipetować całe podłoże z każdego z siedmiu dołków. Dodać 250 μl podgrzanej kompletnej pożywki do pierwszego dołka. Użyj tego jako kontroli negatywnej. Dodać 250 μl podgrzanej pożywki do obróbki GnRH-FITC (od 1.13) do każdej z następnych sześciu studzienek (3 studzienki z 1 μM i 3 z 10 μM). Inkubować szkiełko w nawilżonym inkubatorze z atmosferą 5%CO2 w temperaturze 37 °C przez 5 godzin.</li>
		<li>Odpipetować pożywkę z każdej studzienki i przemyć komórki 250 μl PBS. Dodać 250 μl roztworu utrwalającego (10% neutralnej buforowanej formaliny) do każdej studzienki i inkubować szkiełko w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
		<li>Odpipetować roztwór utrwalający z każdej studzienki i przemyć komórki 250 μl PBS. Dodać 250 μl PBS zawierającego 5 μM roztworu sondy fluorescencyjnej przygotowanego w kroku 1.14 do każdej studzienki i inkubować szkiełko w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
		<li>Odpipetować roztwór sondy fluorescencyjnej z każdej studzienki i dokładnie umyć komórki dwukrotnie 250 μl PBS. Na koniec dodaj 3-4 krople podłoża montażowego do każdej studzienki. Trzymaj slajd w ciemności przy RT, aż do obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Metoda wyrażania GnRH-I-R
	<ol>
		<li>Weź drugie 8-dołkowe szkiełko mikroskopowe przygotowane w kroku 1.7 i odpipetuj całe podłoże z każdej z pięciu studzienek.</li>
		<li>Dodać 250 μl podgrzanej kompletnej pożywki do pierwszego dołka, użyć go jako kontroli ujemnej. Dodać 250 μl podgrzanej kompletnej pożywki również do drugiego dołka i użyć go do zbadania ekspresji GnRH-I-R przed obróbką GnRH.</li>
		<li>Dodać 250 μl każdej z trzech podgrzanych 10 μM pożywki do obróbki GnRH-FITC do następnych trzech studzienek. Użyj tych studzienek do wstępnej obróbki komórek koniugatami GnRH-FITC przed zbadaniem ekspresji GnRH-I-R. Inkubować szkiełko w nawilżonym inkubatorze z 5% atmosferąCO2 w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Odpipetować pożywkę do obróbki z każdej z trzech studzienek, które zostaną użyte do zbadania ekspresji GnRH-I-R po zabiegu GnRH, a następnie przemyć te studzienki 250 μl wstępnie podgrzanego kompletnego podłoża. Dodać 250 μl podgrzanej kompletnej pożywki do każdej z trzech studzienek. Inkubować szkiełko w nawilżonym inkubatorze z 5% atmosferąCO2 w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Odpipetować pożywkę z każdej z pięciu studzienek i przemyć komórki 250 μl PBS. Dodać 250 μl roztworu utrwalającego do każdej studzienki i inkubować szkiełko w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
		<li>Odpipetować roztwór utrwalający z każdej studzienki i przemyć komórki 250 μl PBS. Dodać 250 μl PBS zawierającego 5% roztworu blokującego albuminę surowicy bydlęcej (BSA) do każdej studzienki i inkubować szkiełko w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Rozcieńczyć 10 μl pierwszorzędowego przeciwciała GnRH-I-R w 1 ml PBS (stosunek 1:100). Trzymaj go w RT i zużyj w ciągu kilku godzin.</li>
		<li>Odpipetować roztwór blokujący BSA z każdej studzienki z wyjątkiem kontroli ujemnej (pierwsza studzienka). Przemyć komórki 250 μl PBS (z wyjątkiem studzienki kontroli ujemnej). Dodać 250 μl PBS zawierającego pierwszorzędowe przeciwciało GnRH-I-R przygotowane w kroku 2.2.7 do każdej studzienki (z wyjątkiem kontroli ujemnej). Inkubować szkiełko w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w ciemnym miejscu.</li>
		<li>Rozcieńczyć 2,5 μl przeciwciała wtórnego znakowanego Alexa 546 w 1,25 ml PBS (stosunek 1:500). 
		UWAGA: Roztwór ten należy chronić przed światłem, utrzymywać go w temperaturze pokojowej i zużyć w ciągu kilku godzin.</li>
		<li>Odpipetować roztwory z każdej z pięciu studzienek i przemyć komórki 250 μl PBS. Dodać 250 μl PBS zawierającego przeciwciało drugorzędowe znakowane AF 546 przygotowane w kroku 2.2.9 do każdej studzienki. Inkubować szkiełko w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w ciemności.</li>
		<li>Odpipetować roztwór z każdej studzienki i przepłukać komórki 250 μl PBS. Dodać 250 μl PBS zawierającego 5 μM roztworu sondy fluorescencyjnej przygotowanego w kroku 1.14 do każdej studzienki i inkubować szkiełko przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odpipetować roztwór sondy fluorescencyjnej z każdej studzienki i dokładnie umyć komórki dwukrotnie 250 μl PBS. Następnie dodaj 3-4 krople podłoża montażowego do każdej studzienki. Trzymaj szkiełko w ciemności przy RT do czasu obrazowania mikroskopowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowania
	<ol>
		<li>Zobrazuj komórki za pomocą odwróconego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (przy użyciu obiektywu 63X z olejkiem immersyjnym)
		<ol>
			<li>Użyj następujących długości fal wzbudzenia/emisji. koniugaty GnRH: 488/514 nm, przeciwciało znakowane Alexa 546: 488/546 nm (stosować tylko do metody ekspresji GnRH-I-R), sonda fluorescencyjna Draq5: 633/680 nm.</li>
			<li>Ustaw parametry obrazowania za pomocą komórek kontroli ujemnej. Użyj tych parametrów do obrazowania leczonych komórek (ryc. 3). Ponownie dostosuj parametry obrazowania na każdym szkiełku mikroskopowym na początku analizy. W razie potrzeby dostosuj i wyeksportuj obrazy za pomocą oprogramowania dostarczonego przez producenta.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS)
<ol>
	<li>Metoda oznaczania ilościowego GnRH
	<ol>
		<li>Wziąć płytkę przygotowaną w kroku 1.8 i odpipetować całe medium z każdej z siedmiu studzienek. Dodaj 1 ml podgrzanego kompletnego podłoża do pierwszego dołka. Użyj tego jako kontroli negatywnej. Dodaj po 1 ml każdego z sześciu wstępnie podgrzanych pożywek do obróbki (3 studzienki z 1 μM i 3 studzienki z 10 μM) do następnych sześciu studzienek. Inkubować płytkę w nawilżonym inkubatorze z 5% atmosferąCO2 w temperaturze 37 °C przez 5 godzin.</li>
		<li>Odpipetować pożywkę z każdej studzienki. Ostrożnie umyj komórki dwukrotnie 2 ml PBS. Dodaj 500 μl roztworu trypsyny-EDTA do każdej studzienki. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C aż do oderwania komórek (około 10 min).</li>
		<li>Dodaj 1 ml kompletnego podłoża do każdej studzienki, aby zatrzymać trypsynę. Potrząśnij talerzem. Delikatnie zawiesić komórki za pomocą pipety i przenieść zawiesinę z każdej studzienki do probówek FACS. Odwirować probówki o sile 150 x g przez 4 minuty, w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ostrożnie wylej supernatanty jednym ruchem. Dodaj 500 μl lodowatego PBS do każdej probówki FACS i delikatnie ponownie zawieś komórki. Trzymaj probówki na lodzie do końca eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza i obliczenia
	<ol>
		<li>Analizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej. Do wzbudzenia użyj długości fali lasera argonowego 488 nm, a do wykrywania użyj długości fali 530 nm. Ustaw parametry cytometru przepływowego, uruchamiając komórki kontroli ujemnej. Użyj tych parametrów do analizy leczonych komórek (ryc. 4A). Oceń dane za pomocą oprogramowania producenta, określ medianę wartości intensywności fluorescencji (MIF) i oblicz względne wartości MIF.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gilad, Y., Firer, M., Gellerman, G. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2227-9059/4/2/11">Recent Innovations in Peptide Based Targeted Drug Delivery to Cancer Cells.</a> Biomedicines. 4 (2), 11(2016).</li>
<li>Majumdar, S., Siahaan, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-mediated+targeted+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Peptide-mediated targeted drug delivery.</a> Med Res Rev. 32 (3), 637-658 (2012).</li>
<li>Ramakrishnappa, N., Rajamahendran, R., Lin, Y. M., Leung, P. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GnRH+in+non-hypothalamic+reproductive+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">GnRH in non-hypothalamic reproductive tissues.</a> Anim Reprod Sci. 88 (1-2), 95-113 (2005).</li>
<li>Schally, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+hormones+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroendocrinol%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic hormones and cancer.</a> Front Neuroendocrinol. 22 (4), 248-291 (2001).</li>
<li>Limonta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GnRH+receptors+in+cancer%3A+From+cell+biology+to+novel+targeted+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">GnRH receptors in cancer: From cell biology to novel targeted therapeutic strategies.</a> Endocr Rev. 33 (5), 784-811 (2012).</li>
<li>Ma, Y. T., Zhou, N., Liu, K. L. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/286798220_Targeting_drug_delivery_system_based_on_gonadotropin-releasing_hormone_analogs_Research_advances">Targeting drug delivery system based on gonadotropin-releasing hormone analogs: Research advances.</a> J of Int Pharm Res. 41 (2), 140-148 (2014).</li>
<li>Manea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+antitumour+effect+of+daunorubicin-GnRH-III+derivative+conjugates+on+colon+carcinoma-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Anti-Cancer+Drugs%22%5BJournal%5D)">In-vivo antitumour effect of daunorubicin-GnRH-III derivative conjugates on colon carcinoma-bearing mice.</a> Anti-Cancer Drugs. 23 (1), 90-97 (2012).</li>
<li>Argyros, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-Drug+conjugate+gnrh-sunitinib+targets+angiogenesis+selectively+at+the+site+of+action+to+inhibit+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Peptide-Drug conjugate gnrh-sunitinib targets angiogenesis selectively at the site of action to inhibit tumor growth.</a> Cancer Res. 76 (5), 1181-1192 (2016).</li>
<li>Karampelas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GnRH-Gemcitabine+conjugates+for+the+treatment+of+androgen-independent+prostate+cancer%3A+pharmacokinetic+enhancements+combined+with+targeted+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">GnRH-Gemcitabine conjugates for the treatment of androgen-independent prostate cancer: pharmacokinetic enhancements combined with targeted drug delivery.</a> Bioconjug Chem. 25 (4), 813-823 (2014).</li>
<li>Millar, R. P., Pawson, A. J., Morgan, K., Rissman, E. F., Lu, Z. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+actions+of+GnRHs+mediated+by+ligand-induced+selective+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroendocrinol%22%5BJournal%5D)">Diversity of actions of GnRHs mediated by ligand-induced selective signaling.</a> Front Neuroendocrinol. 29 (1), 17-35 (2008).</li>
<li>Millar, R. P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15082521">Gonadotropin-releasing hormone receptors.</a> Endocr Rev. 25 (2), 235-275 (2004).</li>
<li>Olberg, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+in+vitro+evaluation+of+small-molecule+%5B18F%5D+labeled+gonadotropin-releasing+hormone+%28GnRH%29+receptor+antagonists+as+potential+PET+imaging+agents+for+GnRH+receptor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Synthesis and in vitro evaluation of small-molecule [18F] labeled gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor antagonists as potential PET imaging agents for GnRH receptor expression.</a> Bioorg Med Chem Lett. 24 (7), 1846-1850 (2014).</li>
<li>Zoghi, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.degruyter.com/view/j/ract.2016.104.issue-4/ract-2015-2443/ract-2015-2443.xml">Development of a Ga-68 labeled triptorelin analog for GnRH receptor imaging.</a> Radiochimica Acta. 104 (4), 247-255 (2016).</li>
<li>Guo, H., Gallazzi, F., Sklar, L. A., Miao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+indium-111-labeled+gonadotropin-releasing+hormone+peptide+for+human+prostate+cancer+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">A novel indium-111-labeled gonadotropin-releasing hormone peptide for human prostate cancer imaging.</a> Bioorg Med Chem Lett. 21 (18), 5184-5187 (2011).</li>
<li>Nederpelt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+12+GnRH+peptide+agonists+-+A+kinetic+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Characterization of 12 GnRH peptide agonists - A kinetic perspective.</a> Br J Pharmacol. 173 (1), 128-141 (2016).</li>
<li>Szabo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+in+vitro+biological+evaluation+of+daunorubicin+containing+GnRH-I+and+GnRH-II+conjugates+developed+for+tumor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pept+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparative in vitro biological evaluation of daunorubicin containing GnRH-I and GnRH-II conjugates developed for tumor targeting.</a> J Pept Sci. 21 (5), 426-435 (2015).</li>
<li>Leurs, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GnRH-III+based+multifunctional+drug+delivery+systems+containing+daunorubicin+and+methotrexate%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">GnRH-III based multifunctional drug delivery systems containing daunorubicin and methotrexate.</a> Eur J Med Chem. 52, 173-183 (2012).</li>
<li>Murányi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+characterization+and+systematic+comparison+of+FITC-labelled+GnRH-I%2C+-II+and+-III+analogues+on+various+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pept+Sci%22%5BJournal%5D)">Synthesis, characterization and systematic comparison of FITC-labelled GnRH-I, -II and -III analogues on various tumour cells.</a> J Pept Sci. 22 (8), 552-560 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W eksperymentach opisanych w niniejszym dokumencie wykorzystano selektywnie znakowane analogi GnRH do badań przesiewowych przylegających kultur komórkowych in vitro. Metody mikroskopii konfokalnej i cytometrii przepływowej są odpowiednie do śledzenia i ilościowego określania wychwytu komórkowego tych koniugatów GnRH-FITC w sposób zależny od czasu i stężenia. Eksperymenty te składają się z następujących krytycznych etapów: 1) utrzymanie sterylnej, zdrowej hodowli komórkowej; 2) Peptydy GnRH muszą być wys...

Systemy celowanego dostarczania leków oparte na peptydach stały się szybko rozwijającym się i obiecującym obszarem terapii nowotworów w ciągu ostatnich kilku lat1,2. Ludzki receptor hormonu uwalniającego gonadotropiny typu I (GnRH-I-R) znajduje się głównie w przysadce mózgowej, ale jest również obecny w kilku innych tkankach, które są odpowiedzialne za samoreprodukcję3. GnRH-I-R ulega również ekspresji w wielu tkankach nowotworowych, związanych lub niezwiązanych z układem rozrodczym4,5. Wysoka ekspresja GnRH-I-R na kilku złośliwych komórkach nowotworowych w porównaniu ze zdrowymi tkankami daje możliwość terapii celowanej5,6.
W ciągu ostatnich kilku dekad opracowano wiele analogów hormonu uwalniającego gonadotropiny (GnRH), które mogą być używane jako ugrupowania celujące7,8,9. Peptydy te są w stanie dostarczać środki przeciwnowotworowe o wysokiej selektywności do złośliwych komórek nowotworowych, które nadmiernie eksprymują GnRH-I-R6. Zgłoszono kilka sprzężonych leków przeciwnowotworowych GnRH o wyższej selektywności i lepszej skuteczności niż odpowiadający im niesprzężony wolny lek7,8,9.
Poprzednie publikacje na temat peptydów GnRH i ich receptorów informowały, że GnRH-I-R może przyjmować różne konformacje, które mają różną selektywność dla analogów GnRH10. Wysoce zmienny GnRH-I-R ma złożone i różne szlaki sygnałowe, które są obdarzone różną aktywnością w stosunku do swoich naturalnych i sztucznych ligandów11. Fakty te sprawiają, że badanie systemów opartych na GnRH jest trudne. Z drugiej strony posiadają obiecujący potencjał terapeutyczny. Wcześniej zgłoszono kilka eksperymentów z radioznakowanymi peptydami GnRH 12,13,14,15, ale eksperymenty, w których użyto fluorescencyjnie znakowanych analogów GnRH, są nadal ograniczone. Podczas gdy znakowanie radioaktywne zapewnia wysoką czułość, znakowanie fluorescencyjne ma kilka innych zalet, na przykład łatwiejszą obsługę i możliwość przeciwdziałania barwieniu za pomocą różnych fluoroforów. Trzy popularne analogi GnRH, które z powodzeniem zostały wykorzystane do dostarczania leków, to [D-Lys6]-GnRH-I, [D-Lys6]-GnRH-II i GnRH-III, ale skuteczność tych peptydów jako ugrupowań celujących jest rzadko porównywana16,17. Z drugiej strony, wyniki oddzielnych eksperymentów, w których wykorzystano różne komórki nowotworowe i analogi GnRH, są zróżnicowane.
Na podstawie tych rozważań, skupiliśmy się na ukierunkowaniu tych peptydów GnRH na guz i potencjale dostarczania leków, a tym samym zsyntetyzowaliśmy i scharakteryzowaliśmy koniugat<y peptydowe [D-Lys> 6(FITC)]-GnRH-II i [Lys8(FITC)]-GnRH-III class="xref">18. Analogi te są selektywnie znakowane FITC w łańcuchu bocznym ich Lys lub D-Lys (stosunek peptyd-FITC 1:1 w każdym koniugacie). Pomysł polegał na tym, że selektywne znakowanie fluorescencyjne może dostarczyć nowych informacji na temat tych peptydów i umożliwić ich dobre śledzenie oraz wiarygodną ocenę ilościową. Koniugaty te charakteryzują się bezpieczną obsługą i niezawodną wykrywalnością, co ułatwia porównanie ich skuteczności w celowaniu w nowotwór oraz badań przesiewowych wielu typów złośliwych komórek nowotworowych. Mamy nadzieję, że dotychczasowe eksperymenty z tymi koniugatami peptydowymi mogą przyczynić się do opracowania nowych koniugatów leków GnRH ukierunkowanych na raka, a także pomóc w identyfikacji nowych celów terapeutycznych.
Obecny manuskrypt demonstruje kilka dobrze powtarzalnych i szybkich eksperymentów z koniugatami GnRH-FITC. Ekspresja GnRH-R na powierzchni komórki jest warunkiem determinującym wychwyt GnRH, dlatego równolegle badaliśmy poziom powierzchni komórek GnRH-I-R na badanych liniach komórkowych. Zwizualizowaliśmy koniugaty GnRH-I-R i GnRH-FITC za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM) i określiliśmy ilościowo wychwyt komórkowy koniugatów GnRH-FITC za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS).

<table><tbody><tr><td>EBC-1</td><td>Bank komórek JCRB</td><td>JCRB0820</td><td>Ludzki rak płaskonabłonkowy płuc</td></tr><tr><td>BxPC-3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1687</td><td>Ludzki gruczolakorak trzustki</td></tr><tr><td>Detroit-562</td><td>ATCC</td><td>CCL-138</td><td>Ludzki rak gardła</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Pożywka z L-glutaminą</td><td>Lonza</td><td>BE12-702F</td><td>Pożywka hodowlana dla komórek BxPC-3</td></tr><tr><td>Minimum Orła Niezbędne Pożywka</td><td>Lonza</td><td>BE12-611F</td><td>Pożywka hodowlana dla komórek EBC-1 i uzupełniona 0,1% pirogronianem sodu dla komórek Detroit-562</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>Euro Clone</td><td>ECS0180L</td><td>Uzupełnia pożywkę hodowlaną</td></tr><tr><td>MycoZap Plus-CL&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>VZA-2012</td><td>Uzupełnia pożywkę hodowlaną (antybiotyki)</td></tr><tr><td>Standardowe kolby do hodowli komórkowych</td><td>VWR</td><td>10062-872</td><td>Zapewniają spójne, sterylne środowisko wzrostu komórek</td></tr><tr><td>Mieszanina trypsyny i EDTA&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BE17-161E</td><td>Usuń przyczepione komórki</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4%</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>Służy do liczenia komórek</td></tr><tr><td>[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I</td><td>wykonane przez nas</td><td>- </td><td>Czystość &ge; 98% (HPLC)</td></tr><tr><td>[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II</td><td>wykonane przez</td> <td>nas-Czystość</td> <td>&ge; 98% (HPLC)</td></tr><tr><td>[Lys8(FITC)]-GnRH-III</td><td>wykonane przez</td> <td>nas-Czystość</td> <td>&ge; 98% (HPLC)</td></tr> <tr><td>szklane dno 8-dołkowe szkiełko mikroskopowe</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>Zastosowanie w eksperymencie CLSM</td></tr><tr><td>Płytka do hodowli komórkowej Corning Costar, 12-dołkowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3513-50EA</td><td>Zastosowanie w eksperymencie FACS</td></tr><tr><td>Roztwór utrwalający (10% neutralna buforowana formalina)</td><td>Bio-Optica</td><td>01V60P</td><td>Napraw przylegające komórki</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-10G</td><td>Zapobiegaj niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał</td></tr><tr><td>GnRHR Przeciwciało</td><td>Proteintech</td><td>19950-1-AP</td><td>Odczynnik immunocytochemiczny, wiąże się z ludzkimi receptorami GnRH typu I</td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne, koniugat Alexa Fluor 546</td><td>Odczynnik immunocytochemiczny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11035</td>, wiąże się z przeciwciałem pierwotnym</tr><tr><td>Roztwór sondy fluorescencyjnej (Draq5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62254</td><td>Jądra przeciwbarwiące</td></tr><tr><td>Fluoromount Wodne medium montażowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680-25ML</td><td>Zastosowanie w eksperymencie CLSM, zachowanie fluorescencji</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Elektro-Optika Sp. z o.&nbsp;</td><td>Alpha XDS-2T</td><td>Sprawdź fenotyp i zbieżność kultur komórkowych</td></tr><tr><td>Odwrócony konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Zeiss</td><td>LSM-710</td><td>Zastosowanie w eksperymencie CLSM</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSCalibur</td><td>Użyj w eksperymencie FACS</td></tr></tbody></table>

in vitro obrazowanie i kwantyfikacja skuteczności celowania w lek znakowanych fluorescencyjnie analogów gnrh

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

Analogi GnRH są skuteczne w zwalczaniu ugrupowań i są w stanie selektywnie dostarczać środki przeciwnowotworowe do złośliwych komórek nowotworowych, które wykazują wysoką ekspresję receptorów GnRH. Jednak analiza ilościowa wychwytu komórkowego przez analogi GnRH i badanych typów komórek w systemach dostarczania leków opartych na GnRH jest obecnie ograniczona. Wcześniej wprowadzone, selektywnie znakowane fluorescencyjne pochodne GnRH I, -II i -III zapewniają doskonałą wykrywalność i mają odpowiednie właściwości chemiczne do powtarzalnych i solidnych eksperymentów. Odkryliśmy również, że odpowiednie, aktualne metody z tymi znakowanymi analogami GnRH mogą dostarczyć nowych informacji na temat systemów dostarczania leków opartych na GnRH. Ten manuskrypt wprowadza kilka prostych i szybkich eksperymentów dotyczących wychwytu komórkowego [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I, [D-Lys6(FITC)]-GnRH-II i [Lys8(FITC)]-GnRH-III na EBC-1 (płuco), BxPC-3 (trzustka) i na komórkach nowotworowych nowotworu złośliwego Detroit-562- (gardło). Równolegle z tymi koniugatami GnRH-FITC badano również poziom powierzchni komórek receptorów GnRH-I na tych liniach komórkowych przed i po leczeniu GnRH za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. Wychwyt komórkowy koniugatów GnRH-FITC określono ilościowo za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją. W eksperymentach tych zaobserwowano niewielkie różnice między analogami GnRH i duże różnice między typami komórek. Istotne różnice między liniami komórkowymi są skorelowane z ich wyraźnym poziomem receptorów GnRH-I na powierzchni komórki. Przedstawione eksperymenty zawierają praktyczne metody wizualizacji, ilościowego określania i porównywania efektywności wychwytu koniugatów GnRH-FITC w sposób zależny od czasu i stężenia na różnych przylegających kulturach komórkowych. Wyniki te mogą pozwolić przewidzieć skuteczność koniugatów GnRH w danej hodowli komórkowej i stanowić dobrą podstawę do dalszych eksperymentów w badaniu systemów dostarczania leków opartych na GnRH.

Obrazy uzyskane za pomocą konfokalnej mikroskopii skaningowej (CLSM) dostarczają niezwykle cennych informacji o pobieraniu koniugatów GnRH-FITC przez daną hodowlę komórkową w sposób zależny od czasu i stężenia. Równolegle z badaniem koniugatów GnRH-FITC, za pomocą eksperymentu CLSM można również zweryfikować obecność GnRH-I-R na powierzchni komórek. Ponadto, dzięki zastosowaniu fluorescencyjnej sondy do barwienia DNA w zakresie dalekiej czerwieni, możliwe jest przeciwbarwienie jąder komór...

Selektywnie znakowane fluorescencyjne pochodne GnRH-I, -II i -III są niezawodnymi narzędziami do śledzenia i ilościowego określania ich absorpcji komórkowej. Niniejszy manuskrypt przedstawia eksperymenty mające na celu wizualizację, ilościowe określenie i porównanie efektywności wychwytu tych koniugatów GnRH w różnych liniach komórkowych.

In vitro Obrazowanie i kwantyfikacja skuteczności celowania w lek znakowanych fluorescencyjnie analogów GnRH

GnRH analogues are effective targeting moieties and able to deliver anticancer agents selectively into malignant tumor cells which highly express GnRH ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie i przewidzenie skuteczności systemów dostarczania leków opartych na GnRH w hodowlach ludzkich komórek nowotworowych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie ukierunkowanej terapii przeciwnowotworowej, takie jak stopień efektywności pobierania leków przeciwnowotworowych ukierunkowanych na GnRH przez komórki różnych typów ludzkich nowotworów. Główną zaletą tej metody jest wykorzystanie nowych analogów GnRH znakowanych fluorescencyjnie, które umożliwiają jednoczesne zastosowanie mikroskopii konfokalnej oraz analizy cytometrycznej.Znaczenie tej techniki rozciąga się na terapię przeciwnowotworową, ponieważ receptory GnRH są wysoce ekspresyjne w kilku typach komórek rakowych, co umożliwia ich selektywne celowanie. Procedurę zaprezentuje Bianka Gurbi, doktorantka z mojego laboratorium. Na początek należy usunąć pożywkę hodowlaną z każdej z siedmiu studzienek zasianego szkiełka mikroskopowego.Następnie dodać 250 µL podgrzanego medium kompletnego do studzienki kontrolnej negatywnej oraz 250 µL podgrzanego medium GnRH fit seed treating do każdej z pozostałych sześciu studzienek. Inkubować slajd w inkubatorze w temper

in-vitro-imaging-quantification-drug-targeting-efficiency

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisujemy metodę obrazowania odpowiedzi na leczenie przeciwnowotworowe in vivo i w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Obrazowanie na żywo odpowiedzi na leki w mikrośrodowisku guza w mysich modelach raka piersi

Opisujemy nowatorską technikę obrazowania in vivo, która łączy fluorescencyjne chimeryczne myszy z oknami wewnątrzczaszkowymi i mikroskopią 2-fotonową o wysokiej rozdzielczości. Ta platforma obrazowania wspomaga badania dynamicznych zmian w tkance mózgowej i mikrokrążeniu na poziomie pojedynczej komórki, po patologicznych urazach i jest przystosowana do oceny wewnątrzczaszkowego dostarczania i dystrybucji leków.

Nowatorska technika obrazowania in vivo o wysokiej rozdzielczości do badania dynamicznej odpowiedzi struktur wewnątrzczaszkowych na wzrost guza i terapie

Ten protokół określa kroki wymagane do przeprowadzenia walidacji ex vivo eksperymentów obrazowania ksenoprzeszczepów w bliskiej podczerwieni in vivo na myszach przy użyciu nanociał znakowanych fluoroforem i konwencjonalnych przeciwciał.

Walidacja eksperymentów obrazowania NIRF in vivo na podstawie ksenoprzeszczepu nowotworowego na myszach przy użyciu cytometrii przepływowej i mikroskopii ex vivo

Obrazowanie ex vivo całego narządu to szybka metoda określania względnych stężeń związków znakowanych fluorescencyjnie w obrębie i pomiędzy tkankami lub grupami leczenia. I odwrotnie, ilościowa histologia fluorescencji, choć bardziej pracochłonna, pozwala na ilościowe określenie bezwzględnych poziomów tkanek znakowanych cząsteczek.

Zastosowanie obrazowania ex vivo całego narządu i ilościowej histologii tkanek w celu określenia biodystrybucji cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania komórek wyrażających receptory angiotensyny typu 1a znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym podczas endocytozy zainicjowanej przez leczenie angiotensyną II. Technika ta obejmuje znakowanie lizosomów drugim markerem fluorescencyjnym, a następnie wykorzystanie oprogramowania do analizy kolokalizacji receptora i lizosomu w trzech wymiarach w czasie.

Obrazowanie żywych komórek i analiza 3D transportu receptora angiotensyny typu 1a w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Ten protokół opisuje wykrywanie za pomocą mikroskopii konfokalnej internalizacji receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR) w komórkach ssaków. Obejmuje podstawową procedurę hodowli komórek, transfekcji i mikroskopii konfokalnej oraz zapewnia wydajną i łatwą do interpretacji metodę wykrywania subkomórkowej lokalizacji i internalizacji GPCR wyrażanego fuzją.

Wykrywanie internalizacji receptora sprzężonego z białkiem G aktywowanym ligandem za pomocą mikroskopii konfokalnej

Opisujemy protokół przedklinicznego śledzenia in vivo przerzutów nowotworowych. Opiera się on na reporterze radionuklidowo-fluorescencyjnym łączącym symporter jodku sodu, wykrywany przez nieinwazyjny [18F]tetrafluoroboran-PET, oraz białko fluorescencyjne w celu usprawnionego potwierdzenia ex vivo. Metoda ma zastosowanie do przedklinicznego śledzenia komórek in vivo poza biologią guza.

Obrazowanie genu reporterowego radionuklidowo-fluorescencyjnego w celu śledzenia progresji guza w modelach guzów gryzoni

Fluorescencyjna tomografia molekularna do obrazowania in vivo ksenoprzeszczepów glejaka

Metoda autoradiografii jest rutynowo stosowana do badania wiązania radioligandów z sekcjami tkanek w celu określenia jakościowej lub ilościowej farmakologii.

Autoradiografia jako prosta i skuteczna metoda wizualizacji i charakterystyki celów farmakologicznych

Interakcje GPCR-β-aresztin to nowa dziedzina w odkrywaniu leków GPCR. Dokładne, precyzyjne i łatwe do skonfigurowania metody są niezbędne do monitorowania takich interakcji w żywych systemach. Pokazujemy test komplementacji strukturalnej do monitorowania interakcji GPCR-β-arrestin w żywych komórkach w czasie rzeczywistym i można go rozszerzyć na dowolny GPCR.

Monitorowanie interakcji GPCR-β-arrestin1/2 w żywych systemach w czasie rzeczywistym w celu przyspieszenia odkrywania leków

Opisujemy protokoły oceny stopnia transdukcji przez peptydy penetrujące komórki, wykorzystując systemy obrazowania ex vivo, a następnie zatapianie parafiny, cięcie i konfokalną mikroskopię fluorescencyjną na przykładzie peptydu celującego w serce. W naszym protokole pojedyncze zwierzę może być wykorzystane do uzyskania obu rodzajów oceny obrazowej tych samych narządów, zmniejszając w ten sposób liczbę zwierząt potrzebnych do badań o połowę.

Obrazowanie in vivo skuteczności transdukcji peptydu ukierunkowanego na serce

Poznaj metodę obrazowania i kwantyfikacji wchłaniania analogów GnRH w kulturach ludzkich komórek nowotworowych. Wykorzystuje ona mikroskopię konfokalną i cytometrię przepływową do oceny skuteczności celowanego leczenia przeciwnowotworowego.

In vitro Obrazowanie i kwantyfikacja skuteczności celowania w lek znakowanych fluorescencyjnie analogów GnRH

Przeglądaj więcej filmów