Model WinCF - niedrogi i łatwy w obsłudze mikrokosmos oskrzelika zatkanego śluzem do badania mikrobiologii infekcji płuc

Ogólnym celem tej procedury jest naśladowanie środowiska płuc i hodowla patogenów w sposób bardziej zbliżony do warunków, w których wywołują one chorobę. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiologii dróg oddechowych, takie jak sposób interakcji różnorodnych patogenów bakteryjnych w płucach przy mukowiscydozie. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że umożliwia ona łatwą manipulację warunkami eksperymentalnymi.

Aby zaobserwować reakcje drobnoustrojów zbliżone do tych, które występują w rzeczywistych oskrzelach płucnych. Procedurę zaprezentuje Will Comstock z naszego laboratorium. Aby przygotować sztuczną pożywkę plwocin, połączyć 16 mililitrów wcześniej przygotowanego roztworu zapasowego muceum, 2 mililitry roztworu zapasowego chlorku potasu, 2 mililitry roztworu zapasowego chlorku sodu, 200 µL emulsji żółtka jaja, 5,6 mililitra roztworu zapasowego DNA, 120 µL roztworu zapasowego ferrytyny, 5,78 mililitra roztworu niezbędnych aminokwasów, 5,78 mililitra roztworu aminokwasów nieistotnych oraz 2,44 mililitra wody sterylnej.

Staranne przygotowanie sterylnego sztucznego medium plwociny jest niezwykle istotne, ponieważ jakiekolwiek zanieczyszczenie może w późniejszym etapie zmienić aktywność bakteryjną w inkubowanych kapilarach. Po delikatnym wstrząśnięciu w celu wymieszania, pipetą przenieś 5 ml medium do ośmiu sterylnych probówek do wirowania o pojemności 15 ml.

Pożywkę można teraz zmodyfikować, aby uzyskać pożądane warunki chemiczne. Na przykład w przypadku pożywek przedstawionych tutaj, zmieniono ich pH i dodano barwniki, aby odzwierciedlić ich różną kwasowość. Następnie, w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza, należy dodać 900 µL pożywki do każdej z ośmiu sterylnych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml.

Zhomogenizować wcześniej pobrane próbki plwociny, używając strzykawki o pojemności 3 ml do wielokrotnego zasysania i wypuszczania plwociny, aż uzyska ona gładką konsystencję. Do każdej z ośmiu probówek do mikrocentryfugi dodać 100 µL zhomogenizowanej plwociny. Następnie wymieszać zawartość probówek za pomocą wortexa.

Oznakuj kolejnych osiem sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml zgodnie z wcześniej przygotowanymi probówkami do mikrocentryfugi z pożywką. Będą one służyć jako probówki inkubacyjne. Użyj 70% roztworu etanolu do wysterylizowania ręcznika papierowego i poczekaj, aż wyschnie.

Podrzyj ręcznik na kawałki o wymiarach około czterech cali kwadratowych każdy. Następnie zgnieć jeden kawałek na dnie każdej probówki inkubacyjnej. Umieściwszy jedną grudkę papieru na dnie każdej probówki inkubacyjnej, użyj 1 mililitra sterylnej wody, aby lekko zwilżyć każdą grudkę, tworząc wewnątrz probówki wilgotne środowisko.

Dla każdej probówki z pożywką napełnić trzy szklane kapilary pożywką, trzymając jeden koniec kapilary w cieczy i przechylając ją poziomo, pozwalając, aby siły kapilarne wciągnęły pożywkę do wnętrza rurki. Przerwać napełnianie, delikatnie zakrywając palcem w rękawiczce otwarty koniec kapilary, a następnie uszczelnić drugi koniec rurki, dociskając go do bloku masy uszczelniającej do kapilar.

Każdy zestaw trzech kapilar umieść dnem uszczelnionym masą w probówkach inkubacyjnych o pojemności 15 ml. Następnie zakręć probówki i upewnij się, że są one odpowiednio oznakowane. Te trzy kapilary służą do powtórzeń każdego z warunków kontrolnych.

Po wypełnieniu wszystkich probówek inkubacyjnych odpowiednimi rurkami kapilarnymi, umieść statywy w temperaturze 37 °C w taki sposób, aby probówki były inkubowane poziomo, co zapobiegnie ucieczce wytworzonych gazów przez otwarty koniec. Inkubuj probówki przez 48 godzin.

Wyjmij probówki z inkubatora, dbając o to, aby pozostały w pozycji poziomej. Ostrożnie wyciągnij kapilary z probówek inkubacyjnych, oddzielając każdy zestaw trzech kapilar od pozostałych zestawów. Ułóż kapilary obok siebie na podświetlaczu (light box), wyrównując je tak, aby zawartość probówek była widoczna i oświetlona od dołu.

Zostaw przerwę co trzy probówki, aby oddzielić od siebie różne warunki chemiczne. Następnie ustaw ostrość aparatu na probówki bezpośrednio nad nimi w taki sposób, aby wszystkie probówki były widoczne w polu widzenia, a światło z lightboxu zapewniało wystarczający kontrast i wizualizację kolorów barwników w probówkach. Aby pobrać zawartość probówek do dalszej analizy, wyjmuj z lightboxu po jednej serii trzech powtórzeń kapilar. Wprowadź igłę tępotną o rozmiarze 25 gauge i długości 0,5 inch w zaślepiony koniec kapilary, aby przerwać uszczelnienie.

Następnie odwróć rurkę kapilarną do góry nogami, aby pożywka ściekła z górnej części do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Jeśli pożywka nie ścieka, użyj pipety o objętości 200 µL, aby wypchnąć pożywkę z rurki, naciskając tłok pipety po wprowadzeniu jej do końca rurki kapilarnej. Jak pokazano tutaj, gdy do pożywki nie dodano próbek plwociny, jedyną zmianą zaobserwowaną w całym zakresie pH po 48 godzinach inkubacji był niewielki spadek objętości pożywki wynikający z minimalnego parowania.

W zaszczepionych kapilarach zaobserwowano zmiany objętości, pojawienie się pęcherzyków gazu, zmianę zabarwienia oraz powstanie nieprzezroczystych osadów. Wyniki te wskazują, że bakterie i inne drobnoustroje zawarte w dodanej plwocinie są zdolne do wzrostu i zmian w obrębie sztucznego medium. Po inkubacji można zastosować inne metody, takie jak metabolomika i sekwencjonowanie DNA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące zachowania drobnoustrojów rozwijających się w kapilarach.

System winCF to nowatorska metoda badania aktywności mikrobiomu płuc; jest ona istotna w kontekście wielu chorób, w tym CF, COPD, astmy i innych.