Techniki indukcji i ilościowego oznaczania starzenia się komórek

Ogólnym celem tych technik jest zapewnienie zestawu narzędzi umożliwiających indukcję, monitorowanie i kwantyfikację starzenia się komórek. Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące identyfikacji i kwantyfikacji starzenia się komórek oraz czynników biologicznych regulujących starzenie się komórek i organizmów. Główną zaletą tych technik jest to, że obejmują one różnorodne metody monitorowania starzenia się komórek w różnych modelach, tkankach i typach komórek.

Rozpocznij od posiewu interesujących komórek proliferacyjnych wczesnego pasażu o rzadkiej gęstości w odpowiednim naczyniu do analizy. I hoduj komórki przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych. Gdy komórki są w 50-60% zlewne, odessać pożywkę wzrostową i dwukrotnie przemyć komórki PBS.

Po drugim praniu przykryj komórki cienką warstwą PBS. I wystaw komórki na pojedynczą 10-stopniową dawkę promieniowania gamma. Zastąp PBS pożywką wzrostową.

I włóż komórki z powrotem do inkubatora. Zmiana pożywki co 48 do 72 godzin z codziennym monitorowaniem zmian morfologicznych pod mikroskopem świetlnym. Siedem do 10 dni po napromieniowaniu rozmrozić wszystkie odczynniki z komercyjnego zestawu do oznaczania beta-galaktozydazy związanej ze starzeniem się w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Gdy wszystkie odczynniki osiągną temperaturę pokojową, przygotuj roztwory utrwalające i barwiące zgodnie z instrukcjami producenta. I delikatnie umyj każdą studzienkę PBS o temperaturze pokojowej. Uważaj, aby dokładnie wypłukać komórki, ponieważ komórki starcze nie przylegają dobrze i można je łatwo usunąć podczas prania.

Utrwalić komórki w każdej studzience za pomocą jednego mililitra roztworu utrwalającego na studzienkę przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dwa dwumililitrowe płukania z PBS na studzienkę. Następnie dodaj jeden mililitr roztworu barwiącego beta-galaktozydazę do każdej studzienki i przykryj płytkę folią aluminiową na 24 do 48 godzin hodowli w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza bez dwutlenku węgla.

Sprawdź komórki po 24 godzinach. Gdy komórki są wystarczająco wybarwione, zastąp roztwór beta-galu świeżym PBS i zbadaj kultury pod mikroskopem świetlnym z dołączoną kamerą przy 10-krotnym lub wyższym obiektywie. Komórki beta-galaktozydazy związane ze starzeniem będą niebieskie.

Następnie uzyskaj co najmniej pięć nienakładających się obrazów na studzienkę. I ręcznie policz całkowitą liczbę komórek beta-galaktozydazy związanych ze starzeniem się oraz całkowitą liczbę komórek na obraz, aby obliczyć procent komórek beta-galaktozydazy związanych ze starzeniem się na studzienkę. 10 dni po napromieniowaniu promieniowaniem gamma przemyć komórki trzykrotnie PBS.

Po ostatnim płukaniu zastąp PBS 2,5 mililitra wolnej pożywki surowicy, uzupełnionej antybiotykami na sześciocentymetrową miskę i włóż komórki z powrotem do inkubatora kultur tkankowych na noc. Następnego ranka przenieś pożywkę do stożkowej rurki na lodzie. I umyj komórki dwa razy świeżym PBS.

Następnie poddaj je trypsynizacji i policz komórki. Następnie odwirować supernatant zebrany z płytki do hodowli komórkowej. A następnie przefiltruj je przez sitko strzykawkowe o średnicy 0,45 mikrometra i zamroź pożywkę w porcjach o pojemności 500 mikrolitrów w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aż do ich analizy metodą ELISA.

Zwiększone barwienie beta-gal związane ze starzeniem się występuje w przypadku starzenia się wywołanego replikacją i uszkodzeniem DNA. Zwróć uwagę na powiększony płaski kształt komórek starczych w porównaniu z wrzecionowatym wyglądem proliferujących fibroblastów. W tym eksperymencie proliferujące młode lub replikujące się komórki starcze zostały utrwalone zgodnie z opisem w pisemnym protokole.

I wybarwiony przeciwciałem przeciwko biomarkerowi dla pęknięć podwójnej nici DNA i DAPI. Przy widocznym wzroście liczby podwójnej nici DNA obserwuje się pęknięcie fosi w komórkach starczych. Analiza RT-qPCR czynników fenotypu wydzielniczego związanych ze starzeniem się ujawnia, że przynajmniej niektóre czynniki są regulowane w górę po starzeniu się wywołanym promieniowaniem gamma w ludzkich diploidalnych fibroblastach o niskim pasażowaniu na poziomie MRNA.

Co jest dodatkowo potwierdzone przez test ELISA supernatantów z napromieniowanych promieniami gamma kultur komórkowych. Po opanowaniu, indukcja uszkodzeń DNA i barwienie SA beta-gal mogą zostać zakończone w ciągu około 30 minut czasu praktycznego. Pożywkę kondycyjną do ilościowego określania poziomu białka SASP można przygotować w ciągu około 30 minut.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o monitorowaniu u nich zmian morfologicznych w kulturach komórkowych przed przystąpieniem do kwantyfikacji markerów starczych. Po jego opracowaniu techniki te utorowały drogę naukowcom zajmującym się starzeniem się i rakiem do zbadania starzenia się w różnych tkankach, kulturach komórkowych i organizmach modelowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wywoływać, monitorować i określać ilościowo starzenie się komórek.