Name: Techniki indukcji i ilościowego oznaczania starzenia się komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-01T11:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Poznaj protokoły indukcji i ilościowego oznaczania starzenia się komórek w biologii komórkowej. Te metody umożliwiają monitorowanie markerów senescencji w różnych modelach komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Intramural Research Program of the National Institutes of Health, National Institute on Aging. Autorzy pragną podziękować Myriam Gorospe i Kotbowi Abdelmohsenowi za wiele pomocnych dyskusji na temat starzenia się, a Kotb Abdelmohsen za krytyczną lekturę manuskryptu. Dziękujemy również naszym pracownikom laboratorium, a w szczególności Douglasowi Dluzenowi za krytyczną lekturę manuskryptu.

<ol><li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Limited+in+Vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li>
<li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+senescent+cells+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li>
<li>Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+when+bad+things+happen+to+good+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: when bad things happen to good cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (9), 729-740 (2007).</li>
<li>Dimri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9363-9367 (1995).</li>
<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essence+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The essence of senescence.</a> Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li>
<li>Pospelova, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudo-DNA+damage+response+in+senescent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Pseudo-DNA damage response in senescent cells.</a> Cell Cycle. 8 (24), 4112-4118 (2009).</li>
<li>Narita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rb-mediated+heterochromatin+formation+and+silencing+of+E2F+target+genes+during+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence.</a> Cell. 113 (6), 703-716 (2003).</li>
<li>Ben-Porath, I., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signals+and+pathways+activating+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The signals and pathways activating cellular senescence.</a> Int J Biochem Cell Biol. 37 (5), 961-976 (2005).</li>
<li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+cells%2C+tumor+suppression%2C+and+organismal+aging%3A+good+citizens%2C+bad+neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Senescent cells, tumor suppression, and organismal aging: good citizens, bad neighbors.</a> Cell. 120 (4), 513-522 (2005).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biol. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Tominaga-Yamanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF90+coordinately+represses+the+senescence-associated+secretory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">NF90 coordinately represses the senescence-associated secretory phenotype.</a> Aging (Albany NY). 4 (10), 695-708 (2012).</li>
<li>Wiley, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Dysfunction+Induces+Senescence+with+a+Distinct+Secretory+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Dysfunction Induces Senescence with a Distinct Secretory Phenotype.</a> Cell Metab. 23 (2), 303-314 (2016).</li>
<li>Hoare, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOTCH1+mediates+a+switch+between+two+distinct+secretomes+during+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">NOTCH1 mediates a switch between two distinct secretomes during senescence.</a> Nat Cell Biol. 18 (9), 979-992 (2016).</li>
<li>Rodier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+the+senescence-associated+secretory+phenotype+%28SASP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of the senescence-associated secretory phenotype (SASP).</a> Methods Mol Biol. 965, 165-173 (2013).</li>
<li>Srikantan, S., Marasa, B. S., Becker, K. G., Gorospe, M., Abdelmohsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+microRNAs%3A+individual+gene+repressors%2C+global+translation+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Paradoxical microRNAs: individual gene repressors, global translation enhancers.</a> Cell Cycle. 10 (5), 751-759 (2011).</li>
<li>Abdelmohsen, K., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+RNA+control+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Noncoding RNA control of cellular senescence.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2015).</li>
<li>Bhaumik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+miR-146a%2Fb+negatively+modulate+the+senescence-associated+inflammatory+mediators+IL-6+and+IL-8%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs miR-146a/b negatively modulate the senescence-associated inflammatory mediators IL-6 and IL-8.</a> Aging. 1 (4), 402-411 (2009).</li>
<li>Rodier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-SCARS%3A+distinct+nuclear+structures+that+sustain+damage-induced+senescence+growth+arrest+and+inflammatory+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">DNA-SCARS: distinct nuclear structures that sustain damage-induced senescence growth arrest and inflammatory cytokine secretion.</a> J Cell Sci. 124 (PT 1), 68-81 (2011).</li>
<li>Bernardes de Jesus, B., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+cell+and+organ+senescence+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Assessing cell and organ senescence biomarkers.</a> Circ Res. 111 (1), 97-109 (2012).</li>
<li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nat Rev Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li>
<li>Rubio, M. A., Kim, S. -H., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+Manipulation+of+Telomerase+Expression+and+Telomere+Length%3A+implications+for+the+ionizing+radiation+response+and+replicative+senescence+of+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Reversible Manipulation of Telomerase Expression and Telomere Length: implications for the ionizing radiation response and replicative senescence of human cells.</a> J Biol Chem. 277 (32), 28609-28617 (2002).</li>
<li>Chen, Q. M., Prowse, K. R., Tu, V. C., Purdom, S., Linskens, M. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+the+Senescent+Phenotype+from+Telomere+Shortening+in+Hydrogen+Peroxide-Treated+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Uncoupling the Senescent Phenotype from Telomere Shortening in Hydrogen Peroxide-Treated Fibroblasts.</a> Experimental Cell Research. 265 (2), 294-303 (2001).</li>
<li>Dumont, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+replicative+senescence+biomarkers+by+sublethal+oxidative+stresses+in+normal+human+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast.</a> Free Radic Biol Med. 28 (3), 361-373 (2000).</li>
<li>Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Cell+Senescence+in+Cancer+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor Cell Senescence in Cancer Treatment.</a> Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).</li>
<li>Nyunoya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+Smoke+Induces+Cellular+Senescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cigarette Smoke Induces Cellular Senescence.</a> J Respir Cell Mol Biol. 35 (6), 681-688 (2006).</li>
<li>Bai, H., Gao, Y., Hoyle, D. L., Cheng, T., Wang, Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Transforming+Growth+Factor-%CE%B2+Signaling+Delays+Cellular+Senescence+and+Preserves+the+Function+of+Endothelial+Cells+Derived+From+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Suppression of Transforming Growth Factor-β Signaling Delays Cellular Senescence and Preserves the Function of Endothelial Cells Derived From Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cells Transl Med. , (2016).</li>
<li>Senturk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta+induces+senescence+in+hepatocellular+carcinoma+cells+and+inhibits+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta induces senescence in hepatocellular carcinoma cells and inhibits tumor growth.</a> Hepatology. 52 (3), 966-974 (2010).</li>
<li>Aird, K. M., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+senescence-associated+heterochromatin+foci+%28SAHF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF).</a> Methods Mol Biol. 965, 185-196 (2013).</li>
<li>Pospelova, T. V., Chitikova, Z. V., Pospelov, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+approach+for+monitoring+cell+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An integrated approach for monitoring cell senescence.</a> Methods Mol Biol. 965, 383-408 (2013).</li>
<li>Di Micco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+oncogene-induced+DNA+damage+response+and+heterochromatin+in+senescence+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer.</a> Nat Cell Biol. 13 (3), 292-302 (2011).</li>
<li>Wright, W. E., Pereira-Smith, O. M., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+cellular+senescence%3A+implications+for+immortalization+of+normal+human+diploid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversible cellular senescence: implications for immortalization of normal human diploid fibroblasts.</a> Mol Cell Biol. 9 (7), 3088-3092 (1989).</li>
<li>Bursuker, I., Rhodes, J. M., Goldman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-galactosidase--an+indicator+of+the+maturational+stage+of+mouse+and+human+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Beta-galactosidase--an indicator of the maturational stage of mouse and human mononuclear phagocytes.</a> J Cell Physiol. 112 (3), 385-390 (1982).</li>
<li>Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-galactosidase+staining+on+bone+marrow.+The+osteoclast+pitfall%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall.</a> Histol Histopathol. 22 (9), 971-976 (2007).</li>
<li>Witkiewicz, A. K., Knudsen, K. E., Dicker, A. P., Knudsen, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meaning+of+p16%28ink4a%29+expression+in+tumors%3A+functional+significance%2C+clinical+associations+and+future+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The meaning of p16(ink4a) expression in tumors: functional significance, clinical associations and future developments.</a> Cell Cycle. 10 (15), 2497-2503 (2011).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+p16%28Ink4a%29-positive+cells+shorten+healthy+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan.</a> Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li>
<li>Demaria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Essential+Role+for+Senescent+Cells+in+Optimal+Wound+Healing+through+Secretion+of+PDGF-AA%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">An Essential Role for Senescent Cells in Optimal Wound Healing through Secretion of PDGF-AA.</a> Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).</li>
<li>Noren Hooten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin-mediated+increase+in+DICER1+regulates+microRNA+expression+and+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Metformin-mediated increase in DICER1 regulates microRNA expression and cellular senescence.</a> Aging Cell. 15 (3), 572-581 (2016).</li>
<li>Barzilai, N., Crandall, J. P., Kritchevsky, S. B., Espeland, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+as+a+Tool+to+Target+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Metformin as a Tool to Target Aging.</a> Cell Metab. 23 (6), 1060-1065 (2016).</li>
<li>Foretz, M., Guigas, B., Bertrand, L., Pollak, M., Viollet, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin%3A+from+mechanisms+of+action+to+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Metformin: from mechanisms of action to therapies.</a> Cell Metab. 20 (6), 953-966 (2014).</li>
<li>Cahu, J., Sola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+to+quantify+senescent+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A sensitive method to quantify senescent cancer cells.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li>
<li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li>
<li>Bassaneze, V., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiluminescent+detection+of+senescence-associated+beta+galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemiluminescent detection of senescence-associated beta galactosidase.</a> Methods Mol Biol. 965, 157-163 (2013).</li>
<li>Redon, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-H2AX+detection+in+peripheral+blood+lymphocytes%2C+splenocytes%2C+bone+marrow%2C+xenografts%2C+and+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">gamma-H2AX detection in peripheral blood lymphocytes, splenocytes, bone marrow, xenografts, and skin.</a> Methods Mol Biol. 682, 249-270 (2011).</li>
<li>Kosar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+heterochromatin+foci+are+dispensable+for+cellular+senescence%2C+occur+in+a+cell+type-+and+insult-dependent+manner+and+follow+expression+of+p16%28ink4a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a).</a> Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).</li>
<li>Kennedy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+mouse+cells+fail+to+overtly+regulate+the+HIRA+histone+chaperone+and+do+not+form+robust+Senescence+Associated+Heterochromatin+Foci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Div%22%5BJournal%5D)">Senescent mouse cells fail to overtly regulate the HIRA histone chaperone and do not form robust Senescence Associated Heterochromatin Foci.</a> Cell Div. 5, 16(2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisaliśmy metody starzenia się wywołanego replikacją i uszkodzeniem DNA przy użyciu ludzkich fibroblastów diploidalnych. Ponadto uwzględniono techniki ilościowego określania poziomów białek i mRNA różnych białek związanych ze starzeniem się, a także barwienia SA-β-gal i markera uszkodzenia DNA γ-H2AX. Protokoły te mogą być szeroko stosowane do oceny fenotypów starzenia się zarówno in vitro, jak i in vivo, chociaż istnieje wiele zastrzeżeń dotyczących charakteryzowania starzenia się in...

Ponad pół wieku temu, Hayflick i współpracownicy opisali, jak nieprzekształcone komórki rozprzestrzeniają się w hodowli, ale tylko przez skończony okres czasu1. Długotrwała hodowla ludzkich fibroblastów spowodowała, że komórki przestały się namnażać; Były jednak aktywne metabolicznie i nazywano to starzeniem się komórek. Starzenie się może być korzystne dla hamowania nowotworzenia, ale może być również szkodliwe, ponieważ uważa się, że przyczynia się do utraty zdolności regeneracyjnych, która występuje wraz ze starzeniem się2,3. Wykazano, że komórki starcze gromadzą się w tkankach wraz z wiekiem człowieka4 i są zaangażowane w wiele procesów biologicznych, w tym rozwój embrionalny, gojenie się ran, naprawę tkanek i stany zapalne związane z wiekiem2.
Ciągłe przechodzenie komórek w hodowli wywołuje starzenie replikacyjne, które zostało powiązane z zanikiem telomerów i niestabilnością genomu. Różne stresy komórkowe, w tym uszkodzenia DNA i onkogeny, mogą również powodować starzenie się3. Starzenie się spowodowane czynnikami innymi niż wyczerpanie telomerów jest często nazywane starzeniem się wywołanym stresem lub przedwczesnym starzeniem i generalnie zależy od szlaku p16INK4A/Rb5. Chociaż proliferujące, nieprzekształcone komórki zwykle mają kształt wrzecionowaty, komórki starcze można zidentyfikować jako posiadające pewne cechy, w tym płaską, dużą morfologię i zwiększoną aktywność β-galaktozydazy związaną ze starzeniem się (SA-β-gal) (ryc. 1 i 2). Starzejące się komórki gromadzą również markery uszkodzenia DNA, w tym γ-H2AX (Figura 3) 6 i, potencjalnie, ogniska heterochromatyny związane ze starzeniem się (SAHF) (Figura 4) 7. Starzejące się komórki mają wyższe poziomy regulatorów cyklu komórkowego, w tym p16 (p16INK4A) i/lub p21 i p53 (ryc. 5)8,9. Co więcej, ostatnie dane wykazały, że komórki starcze mogą mieć nieautonomiczne działanie poprzez wydzielanie szeregu prozapalnych cytokin i chemokin zwanych fenotypem wydzielniczym związanym ze starzeniem się (SASP)10. Chociaż to zjawisko SASP może się różnić w zależności od typu komórki, ogólnie rzecz biorąc, przejawia się między innymi wzrostem interleukiny-6 (IL-6), IL-8, czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), α onkogenu regulowanego wzrostem (GRO-α) i GRO-β (Figura 6). Szczególny stres lub uszkodzenie, które wywołuje starzenie się, może również wpływać na fenotyp wydzielniczy11,12,13. SASP można wykryć, mierząc poziomy wydzielanych białek za pomocą testów ELISA lub tablic cytokin/białek10,14. Chociaż mechanizmy potranskrypcyjne mogą regulować poziom białka SASP11,15,16,17, w wielu przypadkach można również wykryć zmiany w poziomach mRNA. Zmiany te są na ogół bardziej czułe i łatwiejsze do ilościowego określenia niż pomiary poziomu białka. Można również ocenić inne markery starcze, w tym trwałe ogniska jądrowe uszkodzenia DNA, zwane segmentami DNA ze zmianami chromatyny wzmacniającymi starzenie się (DNA-SCARS)18, oraz różne inne markery3,19,20.
Tutaj opisujemy popularne techniki wywoływania starzenia się komórek w hodowli, a także pomiaru kilku markerów starzenia, w tym SA-β-Gal, γ-H2AX, SAHF oraz białka i mRNA cząsteczek związanych ze starzeniem.

<table><tbody><tr><td>16% żele tris-glicynowe</td><td>Invitrogen</td><td>XP00160BOX</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol ChCl3</td><td>Ambion</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 568 kozie przeciwciało anty-mysie</td><td>Invitrogen</td><td>A11031</td><td>1:300 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Podnośniki komórek</td><td>Corning Inc.</td><td>3008</td><td>Skrobak do komórek</td></tr><tr><td>ECL przeciwciało przeciw mysim HRP</td><td>Amersham</td><td>NA931V</td><td></td></tr><tr><td>ECL Plus Western Blotting</td><td>Substrate Pierce</td><td>32132</td><td></td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td> ECL<td>DAPI</td><td>MP01306</td><td>magazynie 5 mg / ml w dH2O</td></tr><tr><td>Przeciwciało GAPDH</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32233</td><td>1:1,000 - 5,000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne histonowe H3 dimetylo K9</td><td>Abcam</td><td>1220</td><td>1:500 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>ludzki IL-6 Kwantykine test ELISA</td><td>R& Systemy D</td><td>D6050</td><td></td></tr><tr><td>Test ELISA u ludzi IL-8 Quantikine</td><td>R& Systemy D</td><td>D8000C</td><td></td></tr><tr><td>Test Human GROa Quantikine ELISA</td><td>R& Systemy D</td><td>DRG00</td><td></td></tr><tr><td>N-N-dimetyloformamid&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td>DMF</td></tr><tr><td>p16 przeciwciało monoklonalne</td><td>BD Biosciences</td><td>51-1325gr</td><td>1:500 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>p21 przeciwciało monoklonalne</td><td>Millipore</td><td>05-345</td><td>1:750 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>p53 przeciwciało monoklonalne</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td>1:500 klon rozcieńczający DO-1</td></tr><tr><td>fosfo-H2AX (Ser139) Przeciwciało sprzężone FITC</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>9719</td><td>1:2,000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>POWER SYBR-green PCR master mix&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Wstępnie barwione markery masy cząsteczkowej</td><td>Biorad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antiblade&nbsp;</td>Membrana PVDF <td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia starzenia i beta;-galaktozydazy</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Ambion/Life Tech</td><td>10296028</td><td></td></tr></tbody></table>

techniki indukcji i ilościowego oznaczania starzenia się komórek

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

W odpowiedzi na stres lub uszkodzenie komórki, proliferujące komórki mogą wywołać specyficzny program, który inicjuje stan długotrwałego zatrzymania cyklu komórkowego, określany jako starzenie się komórki. Akumulacja komórek starczych następuje wraz ze starzeniem się organizmu i poprzez ciągłą hodowlę in vitro. Starcze komórki wpływają na wiele procesów biologicznych, w tym rozwój embrionalny, naprawę i regenerację tkanek, supresję guza i starzenie się. Cechy charakterystyczne komórek starczych obejmują między innymi zwiększoną aktywność β-galaktozydazy (SA-β-gal) związaną ze starzeniem się; poziomy p16INK4A, p53 i p21; wyższy poziom uszkodzeń DNA, w tym γ-H2AX; tworzenie ognisk heterochromatyny związanych ze starzeniem się (SAHF); oraz nabycie fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem się (SASP), zjawiska charakteryzującego się wydzielaniem szeregu cytokin prozapalnych i cząsteczek sygnałowych. W tym miejscu opisujemy protokoły starzenia się zarówno replikacyjnego, jak i wywołanego uszkodzeniem DNA w hodowanych komórkach. Ponadto zwracamy uwagę na techniki monitorowania fenotypu starzenia się przy użyciu kilku markerów związanych ze starzeniem, w tym barwienia SA-β-gal, γ-H2AX i SAHF, oraz ilościowego określania poziomów białek i mRNA regulatorów cyklu komórkowego i czynników SASP. Metody te mogą być stosowane do oceny starzenia się w różnych modelach i tkankach.

Ryciny 2 - 6 przedstawiają reprezentatywne wyniki barwienia SA-β-gal; barwienia na γ-H2AX oraz SAHF; oceny poziomów białek p16INK4A, p21 i p53; a także poziomów mRNA i białek cząsteczek związanych z senescencją. Zwiększone barwienie SA-β-gal występuje w przypadku senescencji replikacyjnej oraz indukowanej uszkodzeniami DNA. Należy również zwrócić uwagę na zmiany morfologiczne towarzyszące senescencji. Komórki stają się powiększone i spłaszczone w porównaniu do ...

Starzenie się komórek, nieodwracalny stan zatrzymania cyklu komórkowego, może być wywołane przez różne stresy komórkowe. W tym miejscu opisujemy protokoły indukowania starzenia się komórek oraz metody oceny markerów starzenia.

Techniki indukcji i ilościowego oznaczania starzenia się komórek

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Ogólnym celem tych technik jest zapewnienie zestawu narzędzi umożliwiających indukcję, monitorowanie i kwantyfikację starzenia się komórek. Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące identyfikacji i kwantyfikacji starzenia się komórek oraz czynników biologicznych regulujących starzenie się komórek i organizmów. Główną zaletą tych technik jest to, że obejmują one różnorodne metody monitorowania starzenia się komórek w różnych modelach, tkankach i typach komórek.Rozpocznij od posiewu interesujących komórek proliferacyjnych wczesnego pasażu o rzadkiej gęstości w odpowiednim naczyniu do analizy. I hoduj komórki przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych. Gdy komórki są w 50-60% zlewne, odessać pożywkę wzrostową i dwukrotnie przemyć komórki PBS.Po drugim praniu przykryj komórki cienką warstwą PBS. I wystaw komórki na pojedynczą 10-stopniową dawkę promieniowania gamma. Zastąp PBS pożywką wzrostową.I włóż komórki z powrotem do inkubatora. Zmiana pożywki co 48 do 72 godzin z codziennym monitorowaniem zmian morfologicznych pod mikroskopem świetlnym. Siedem do 10 dni po napromieniowaniu rozmrozić wszystkie odczynniki z komercyjnego zestawu do oznaczania beta-galaktozydazy związanej ze starzeniem się w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Gdy wszystkie odczynniki osiągną temperaturę pokojową, przygotuj roztwory utrwalające i barwiące zgodnie z instrukcjami producenta. I delikatnie umyj każdą studzienkę PBS o temperaturze pokojowej. Uważaj, aby dokładnie wypłukać komórki, ponieważ komórki starcze nie przylegają dobrze i można je łatwo usunąć podczas prania.Utrwalić komórki w każdej studzience za pomocą jednego mililitra roztworu utrwalającego na studzienkę przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dwa dwumililitrowe płukania z PBS na studzienkę. Następnie dodaj jeden mililitr roztworu barwiącego beta-galaktozydazę do każdej studzienki i przykryj płytkę folią aluminiową na 24 do 48 godzin hodowli w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza bez dwutlenku węgla.Sprawdź komórki po 24 godzinach. Gdy komórki są wystarczająco wybarwione, zastąp roztwór beta-galu świeżym PBS i zbadaj kultury pod mikroskopem świetlnym z dołączoną kamerą przy 10-krotnym lub wyższym obiektywie. Komórki beta-galaktozydazy związane ze starzeniem będą niebieskie.Następnie uzyskaj co najmniej pięć nienakładających się obrazów na studzienkę. I ręcznie policz całkowitą liczbę komórek beta-galaktozydazy związanych ze starzeniem się oraz całkowitą liczbę komórek na obraz, aby obliczyć procent komórek beta-galaktozydazy związanych ze starzeniem się na studzienkę. 10 dni po napromieniowaniu promieniowaniem gamma przemyć komórki trzykrotnie PBS.Po ostatnim płukaniu zastąp PBS 2,5 mililitra wolnej pożywki surowicy, uzupełnionej antybiotykami na sześciocentymetrową miskę i włóż komórki z powrotem do inkubatora kultur tkankowych na noc. Następnego ranka przenieś pożywkę do stożkowej rurki na lodzie. I umyj komórki dwa razy świeżym PBS.Następnie poddaj je trypsynizacji i policz komórki. Następnie odwirować supernatant zebrany z płytki do hodowli komórkowej. A następnie przefiltruj je przez sitko strzykawkowe o średnicy 0,45 mikrometra i zamroź pożywkę w porcjach o pojemności 500 mikrolitrów w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aż do ich analizy metodą ELISA.Zwiększone barwienie beta-gal związane ze starzeniem się występuje w przypadku starzenia się wywołanego replikacją i uszkodzeniem DNA. Zwróć uwagę na powiększony płaski kształt komórek starczych w porównaniu z wrzecionowatym wyglądem proliferujących fibroblastów. W tym eksperymencie proliferujące młode lub replikujące się komórki starcze zostały utrwalone zgodnie z opisem w pisemnym protokole.I wybarwiony przeciwciałem przeciwko biomarkerowi dla pęknięć podwójnej nici DNA i DAPI. Przy widocznym wzroście liczby podwójnej nici DNA obserwuje się pęknięcie fosi w komórkach starczych. Analiza RT-qPCR czynników fenotypu wydzielniczego związanych ze starzeniem się ujawnia, że przynajmniej niektóre czynniki są regulowane w górę po starzeniu się wywołanym promieniowaniem gamma w ludzkich diploidalnych fibroblastach o niskim pasażowaniu na poziomie MRNA.Co jest dodatkowo potwierdzone przez test ELISA supernatantów z napromieniowanych promieniami gamma kultur komórkowych. Po opanowaniu, indukcja uszkodzeń DNA i barwienie SA beta-gal mogą zostać zakończone w ciągu około 30 minut czasu praktycznego. Pożywkę kondycyjną do ilościowego określania poziomu białka SASP można przygotować w ciągu około 30 minut.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o monitorowaniu u nich zmian morfologicznych w kulturach komórkowych przed przystąpieniem do kwantyfikacji markerów starczych. Po jego opracowaniu techniki te utorowały drogę naukowcom zajmującym się starzeniem się i rakiem do zbadania starzenia się w różnych tkankach, kulturach komórkowych i organizmach modelowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wywoływać, monitorować i określać ilościowo starzenie się komórek.

techniques-to-induce-and-quantify-cellular-senescence

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Czy starzenie się zapobiega lub sprzyja nowotworzenia, pozostaje kwestią sporną. Ponieważ leki chemoterapeutyczne mogą indukować starzenie się komórek rakowych, badanie starzenia się jest niezbędne do zaproponowania nowych terapii. Jednak standardowy i szeroko stosowany test β-galaktozydazy ma poważne wady. Proponujemy tutaj szybki i czuły test oparty na cytometrii przepływowej w celu ilościowego określenia starzenia.

Właściwa metoda ilościowego oznaczania starzejących się komórek rakowych

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół wykrywania zarówno starczych, jak i pluripotencjalnych komórek macierzystych w mięśniach szkieletowych po urazie, podczas indukowania przeprogramowania in vivo. Metoda ta jest odpowiednia do oceny roli starzenia się komórek podczas regeneracji i przeprogramowania tkanek in vivo.

Ocena starzenia się wywołanego urazem i przeprogramowania in vivo w mięśniach szkieletowych

Tutaj omawiamy szereg protokołów do indukcji i walidacji starzenia się komórek w hodowanych komórkach. Skupiamy się na różnych bodźcach wywołujących starzenie i opisujemy kwantyfikację powszechnych markerów związanych ze starzeniem się. Przedstawiamy szczegóły techniczne na przykładzie fibroblastów, ale protokoły można dostosować do różnych modeli komórkowych.

Indukcja i walidacja starzenia się komórek w pierwotnych komórkach ludzkich

Wykazano, że wewnątrzkomórkowy ROS odgrywa ważną rolę w indukcji starzenia się komórek. W tym miejscu opisujemy czuły test do ilościowego określania poziomów ROS podczas starzenia się komórek. Udostępniamy również protokoły oceny fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem się, który podobno przyczynia się do różnych dysfunkcji związanych z wiekiem.

Ilościowy pomiar reaktywnych form tlenu i fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem się w normalnych ludzkich fibroblastach podczas starzenia się wywołanego onkogenem

Starzenie się komórek jest kluczowym czynnikiem w rozwoju przewlekłych patologii związanych z wiekiem. Identyfikacja środków terapeutycznych ukierunkowanych na komórki starcze daje nadzieję na wydłużenie procesu starzenia się w dobrym zdrowiu. W tym miejscu przedstawiamy nowatorski test do badań przesiewowych w celu identyfikacji senoterapeutyków na podstawie pomiaru aktywności związanej ze starzeniem β-galaktozydazy w pojedynczych komórkach.

Test przesiewowy oparty na SA-β-galaktozydazie do identyfikacji leków senoterapeutycznych

Ten protokół opisuje proces metabolicznego znakowania starzejących się i niedzielących się komórek za pomocą pulsacyjnego SILAC, nieukierunkowaną analizę spektrometrii mas i uproszczone obliczanie okresów półtrwania białek.

Pomiar szybkości obrotu białek w starzejących się i niedzielących się hodowanych komórkach z etykietowaniem metabolicznym i spektrometrią mas

Tutaj prezentujemy metodę opartą na cytometrii przepływowej do wizualizacji i kwantyfikacji wielu markerów związanych ze starzeniem się w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne obrazowanie i wykrywanie za pomocą cytometrii przepływowej wielu fluorescencyjnych markerów starzenia w starczych komórkach nowotworowych wywołanych terapią

Przedstawiono protokół fluorescencyjnej, cytometrycznej cytometrii przepływowej starzejących się komórek nowotworowych indukowanych przez chemioterapię w hodowli komórkowej lub w mysich modelach nowotworów. Opcjonalne procedury obejmują współbarwienie immunologiczne, utrwalanie próbki w celu ułatwienia analizy dużych partii lub punktów czasowych oraz wzbogacanie żywotnych komórek starczych przez sortowanie metodą cytometrii przepływowej.

Sonda β-galaktozydazy związana ze starzeniem się w kolorze dalekiej czerwieni do identyfikacji i wzbogacania starzejących się komórek nowotworowych za pomocą cytometrii przepływowej

Multipleksowa immunofluorescencja umożliwia sekwencyjne oznaczyć wiele markerów przeciwciał w obrębie pojedynczej sekcji tkanki, aby wspierać przestrzenną analizę architektury tkanki i populacji komórek. Tutaj przedstawiono przepływ pracy dla wielokrotnego wykrywania markerów związanych z starzeniem się, strukturalnych i immunologicznych, łącznie z manualną i zautomatyzowaną przygotowaniem szkieł i iteracyjnym obrazowaniem oraz analizą pojedynczych komórek za pomocą oprogramowania do cyfrowej...

Wielobarwne badanie immunofluorescencyjne do przestrzennej oceny markerów starzenia in vivo

Ten artykuł przedstawia protokół LysoTracker dla żywych komórek w celu zmierzenia remodelacji lizosomalnej podczas starzenia się w  fibroblastach ludzkich IMR-90.

Analiza lizosomalna z użyciem LysoTracker do ilościowej oceny starzenia komórkowego w fibroblastach ludzkich

Ta metoda bada, jak senny fibroblast skóry wpływa na zdrowe. Starzenie jest indukowane poprzez ekspozycję na UVB, a uodparniony medium jest stosowany na normalne fibroblasty. Pomaga to ocenić aktywne biologicznie związki, które mają na celu zmienioną komunikację między komórkami w starzeniu się skóry.

Nowela połączenia przeciwutleniaczy do przywrócenia zdrowej komunikacji międzykomórkowej w modelu in vitro przy użyciu pożywki warunkowej z komórek starzejących się

Poznaj protokoły indukcji i ilościowego oznaczania starzenia się komórek w biologii komórkowej. Te metody umożliwiają monitorowanie markerów senescencji w różnych modelach komórkowych.

Techniki indukcji i ilościowego oznaczania starzenia się komórek

Przeglądaj więcej filmów