Protokoły badania rozmieszczenia tkanki gospodarza, trybu transmisji i wpływu na kondycję gospodarza densowirusa w robaku bawełnianym

Ogólnym celem tego protokołu jest zbadanie wpływu Densowirusa, HaDV2, na jego gospodarza, Cotton Bollworm. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie interakcji wirusa z gospodarzem, takie jak wpływ wirusów stojących na ścieżce na ich gospodarzy. Główną zaletą tej techniki, którą larwy wykorzystują do konstruowania szczepów wirusa dodatnich i ujemnych, są te same współgospodarze, co zapewnia to samo tło genetyczne.

Aby rozpocząć eksperyment, osiem pojedynczych par nowo zamkniętych ciem kojarzy się przy użyciu plastikowej klatki na parę pokrytej bawełnianą gazą, aby zapewnić dobrą wentylację i służyć jako podłoże do pozycji komórki jajowej. Aby zwiększyć prawdopodobieństwo uzyskania kolonii wolnej od wirusa, wykorzystaj co najmniej 30 par kojarzeń jednoparowych. Nakarm dorosłe wacikiem nasączonym 10% cukrem i 2% roztworem witamin i codziennie uzupełniaj roztwór.

Dzisiejsze po kryciu, gdy dorosłe samice składają jaja na bawełnianej gazie, zaczynają codziennie zmieniać gazę. Zbieraj i utrzymuj jaja zawierające gazę w tym samym pomieszczeniu do wzrostu, co dorosłe, aż do wyklucia się jaj. Nowo wyklute larwy należy natychmiast przenieść na nowe 24-dołkowe płytki z jednym osobnikiem na studzienkę.

Pięć dni po pierwszej dacie złożenia jaj zbierz rodzicielskie i przechowuj je w ciekłym azocie. Sprawdź HaDV2 rodziców za pomocą PCR ze specyficznymi starterami i utrzymuj osoby wolne od HaDV2 jako niezakażony szczep wolny od HaDV2. Zbieraj dorosłe pojedynczo i natychmiast przechowuj je w ciekłym azocie.

Całkowicie zmiel zebrane w ciekłym azocie za pomocą wysterylizowanego moździerza i tłuczka. Przenieś około 10 mikrogramów zanieczyszczeń do czystej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Następnie przenieś pozostałe zanieczyszczenia do nowej tuby, a następnie natychmiast przechowuj je w temperaturze 80 stopni Celsjusza.

Ekstrahować DNA z 10 mikrogramów szczątków zgodnie z protokołami dostarczonymi przez producenta. Po wyizolowaniu DNA sprawdź, czy nie ma HaDV2 za pomocą protokołu. Zgodnie z wynikami podziel pozostałe szczątki na dwie grupy: HaDV2 dodatnie i HaDV2 ujemne.

Dodaj jeden mililitr soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS do każdej osoby, aby całkowicie rozpuścić pozostałe szczątki larw. Wstępnie schłodzić wirówkę o cztery stopnie Celsjusza, a następnie odwirować homogenat. Na lodzie przefiltrować ciekły supernatant za pomocą filtra membranowego o grubości 0,22 mikrona.

Zbierz 200 mikrolitrów na tubę przefiltrowanych płynów i natychmiast przechowuj je w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Określenie skuteczności infekcji jamy ustnej za pomocą zakażonych HaDV2 przefiltrowanych cieczy o różnym stężeniu poprzez rozcieńczenie płynu zawierającego HaDV2. W dygestorii równomiernie rozprowadzić 200 mikrolitrów HaDV2 zawierających przefiltrowane ciecze dla każdego stężenia na powierzchni stałej sztucznej diety.

Następnie zacznij przenosić 100 świeżo wyklutych larw do HaDV2 zawierającego sztuczną dietę na szalce Petriego. Delikatnie uderz w bawełnianą gazę, w tym świeżo wyklute larwy, aby przenieść larwy z gazy na arkusz białego papieru. Delikatnie uderz w papier, aby larwy przędziły jedwab i balon z papieru.

Użyj wysterylizowanych kleszczy, aby dotknąć jedwabiu i przenieść larwy na szalkę Petriego. Po 48 godzinach przenieś jedną pojedynczą larwę na studzienkę na sztucznej diecie na 24-dołkowe płytki. Ponownie przygotować larwy zaszczepione HaDV2, stosując te same stężenia do stadium dorosłego.

Sprawdź status infekcji HaDV2 u osób dorosłych za pomocą protokołu. Dorośli zaszczepieni od 10 do ósmej liczby kopii na mikrolitr HaDV2 uzyskali 100% zakażenie i są utrzymywani jako szczep HaDV2 dodatni. Aby zapobiec zanieczyszczeniu, wysterylizuj kleszczyki i nożyczki trzykrotnie w 75% etanolu, a następnie podgrzej je w płomieniu lampy alkoholowej.

Za pomocą wagi analitycznej zważ puste probówki, które mają być używane do przechowywania tkanek. Następnie umieść larwy i dorosłe z zakażonego szczepu na lodzie na około pięć minut. Przymocuj zamrożone larwy do cystosepimentu za pomocą dwóch szpilek owadów umieszczonych w błonach międzysegmentowych w pobliżu głowy i ostatniego segmentu odwłoka.

Następnie w tylnej części brzucha odetnij przednóżek larw, aby wypłynęła hemolimfa. Za pomocą pipety odpipetuj około 10 mikrolitrów hemolimfy larwalnej w ciągu około 10 sekund, aby zapobiec brązowieniu i koagulacji hemolimfy. Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie w naskórku, począwszy od ostatniej błony międzysegmentowej do głowy.

Za pomocą dwóch kleszczy rozetnij jelito przednie, jelito środkowe, jelito tylne, ciało tłuszczowe i kanaliki malpighiana. Aby zapobiec zanieczyszczeniu pozostałych tkanek hemolimfą podczas sekcji, należy umyć wypreparowane tkanki w buforze PBS. Wymieszaj próbki tkanek od trzech osobników razem jako jeden replikant.

Natychmiast przenieś każdą tkankę do probówek w ciekłym azocie. Na czystej szalce Petriego zawierającej bufor PBS należy rozciąć tkanki dorosłych samic i samców i natychmiast przenieść każdą tkankę do probówek w ciekłym azocie. Zważyć probówki i powyższe tkanki oddzielnie i obliczyć masę tkanek.

Wyekstrahuj DNA z tych tkanek i wykonaj kPCR, aby określić ilościowo miano wirusa w każdej tkance. Umieść co najmniej 100 poczwarek lub nowo powstałych dorosłych ciem pochodzących z niezakażonego szczepu w pokrytej bawełnianą gazą klatce z siatki drucianej o pojemności 5 litrów. Po dwóch dniach kryte dorosłe samice zaczną składać jaja na bawełnianej gazie.

Zebrać i przechowywać bawełnianą gazę zawierającą jaja. Kontynuuj inokulację larw noworodków, przenosząc larwy noworodków niezakażonego szczepu do sztucznej diety zawierającej HaDV2 w celu ustalenia zakażonego szczepu. Podobnie, przenieś larwy noworodków do sztucznej diety pokrytej przefiltrowanym płynem wolnym od HaDV2, aby ustalić grupy kontrolne, szczep niezakażony.

Do każdego zabiegu należy włączyć co najmniej 240 larw. Po 48 godzinach przenieś jedną pojedynczą larwę na studzienkę na płytki 24-dołkowe. Sekwencyjnie numeruj każdą larwę w każdej studzience i codziennie rejestruj stadium rozwoju i stan przeżycia.

Około pięć dni później, gdy sztuczna dieta ulegnie pogorszeniu, jednocześnie przenieś te osoby na nową 24-dołkową płytkę zawierającą świeżą sztuczną dietę. Zważyć larwy od siódmego do jedenastego dnia za pomocą wagi analitycznej. Po zważeniu pojedynczo umieść larwy z powrotem na 24-dołkowej płytce.

Po linieniu do piątego stadium rozwojowego, około dziesięciu dni po wykluciu, przenieś larwy do szklanych rurek. Przenieś osoby do szklanej rurki o tej samej porze każdego dnia. Larwy w piątym stadium rozwojowym można również rozpoznać po szerokości torebki głowy.

Następnie zakoduj każdą larwę oryginalnym numerem referencyjnym na szklanej rurce za pomocą farby lub markerów. Codziennie rejestruj stan larwalny. Zapisz poczwarki i datę eklozji dla każdego osobnika w szklanej probówce i zapisz masę trzydniowych poczwarek.

Po eklikezji umieść jedną samicę i jednego samca w jednej klatce z 10% sacharozą i 2% roztworem witamin. Codziennie uzupełniaj roztwór sacharozy. Zapisz datę śmierci dla każdej.

Po złożeniu jaj codziennie zmieniaj bawełnianą gazę. Natychmiast policz liczbę jaj. Na koniec policz nowo wyklute potomstwo podczas wykluwania.

Przeprowadzono próby trójdzielne, aby zapewnić jakość próbek użytych w eksperymencie. Potomstwo rodziców płci męskiej i żeńskiej, które są wolne od HaDV2, było hodowane jako szczep niezakażony. Udało nam się amplifikować gen aktyny u rodziców i potomstwa przy użyciu tej samej matrycy DNA, co sugeruje, że matryce DNA były dobrej jakości.

Losowo wybranych ośmiu potomków było również wolnych od HaDV2, HaNPV i Wolbachia. Krzywa standardowa określająca zależność między logarytmem jakości materiału wyjściowego a uzyskanymi wartościami CT wykazuje silną korelację liniową między wartościami CT a logarytmem początkowej liczby kopii genu HaDV2. Liczba kopii HaDV2 została obliczona na mikrogram każdej tkanki, a procent całkowitego miana HaDV2 dla określonej tkanki ujawnił, że HaDV2 był głównie rozprowadzany w ciele tłuszczowym.

Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o obchodzeniu się z delikatnymi larwami w ciągu pierwszych pięciu dni po wykluciu się podczas zabiegu en-tire.