Analiza immunofluorescencyjna tworzenia się granulek stresowych po prowokacji bakteryjnej komórek ssaków

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest ocena wpływu infekcji bakteryjnej na zdolność komórek gospodarza do tworzenia granulek stresowych w odpowiedzi na stres egzogenny. Metoda ta jest cennym narzędziem w dziedzinie mikrobiologii komórkowej, pozwalającym ocenić, czy dany patogen jest w stanie zmienić lub zakłócić cały szlak tworzenia granulek stresowych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość rygorystycznej i zautomatyzowanej analizy jakościowej oraz ilościowej granulek stresowych przy użyciu bezpłatnych programów do analizy obrazu.

Niniejsza metoda pozwala na poznanie dynamiki powstawania i składu ziarnistości stresowych oraz tego, jak parametry te są modyfikowane przez konkretny patogen. Dziękujemy. Przed rozpoczęciem procedury, zaszczep kolonię bakterii S.flexneri M90T (czerwone kolonie) z nowo posianej płytki z agarem sojowym z tryptonem z dodatkiem 1% Congo red do probówki stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej 8 ml bulionu sojowego z tryptonem.

Po dokręceniu pokrywki inkubować kolonię przez noc z wstrząsaniem przy 222 RPM i 30 °C. Następnego dnia przenieść 150 µL bakterii do 8 mL świeżego bulionu sojowo-trypsynowego i inkubować przez około dwie godziny w temperaturze 37 °C i przy 222 RPM, aby zaindukować ekspresję genów wirulencji w późnej fazie wykładniczej oraz zwiększyć zakaźność bakterii. Gdy gęstość optyczna subkultury osiągnie wartość od 0,6 do 0,9, przenieść 1 mL bakterii do probówki o pojemności 1,5 mL w celu ich zebrania poprzez wirowanie.

Następnie osad należy resuspender w medium do infekcji do gęstości optycznej wynoszącej jeden. Dalej, należy odessać nadylotki z każdej studni kultury komórek HeLa na szkiełkach podstawowych. Następnie należy ostrożnie przemyć komórki HeLa 500 µL świeżego medium do hodowli komórek HeLa w temperaturze pokojowej na każdą studnię.

Zastąp roztwór piorący 500 µL medium do infekcji na dołek, a następnie odwiruj płytkę 24-dołkową, aby osadzić bakterie na komórkach. Przenieś osiadłe kokultury bakteryjne do inkubatora do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C na 30 minut, aby umożliwić infekcję komórek gospodarza. Po zakończeniu inkubacji usuń egzogenne bakterie z komórek, wykonując trzy płukania w 1 mL świeżego medium hodowlanego HeLa w temperaturze 37 °C na każde płukanie.

Następnie zakryj zainfekowane komórki jednym mililitrem świeżej pożywki hodowlanej zawierającej gentamycynę i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po zakończeniu inkubacji zastąp pożywkę 500 mikrolitrami odpowiedniej pożywki hodowlanej, uzupełnionej o wybrany czynnik stresowy, i przenieś komórki z powrotem do inkubatora do hodowli tkanek. Po jednej godzinie całkowicie odessij nadsącz i utrwal próbki w 0,5 mililitra 4% paraformaldehydu w PBS o temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Następnie usunąć utrwalacz do odpowiedniego pojemnika na odpady i przemyć szkiełka nakrywki za pomocą 1 ml soli buforowanej trisonem (TBS) przez dwie minuty, delikatnie wstrząsając. Po zakończeniu płukania całkowicie odessać TBS i przeprowadzić permeabilizację komórek w każdej studzience, dodając 500 µL 0,3% Triton X-100 w TBS. Po 10 minutach zastąpić roztwór permeabilizujący 1 ml TBS, delikatnie zamieszać płytkę, a następnie zastąpić TBS 1 ml roztworu blokującego i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Aby oznakować komórki wybranym koktajlem przeciwciał pierwszorzędowych, nanieś 50 µL mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych na każdy szkiełko nakrywkę, umieszczając krople na kawałku plastikowej folii Parafilm mocno przyklejonej do blatu laboratoryjnego. Następnie użyj pęsety, aby podnieść pierwsze szkiełko nakrywką. Przyciśnij krawędź szkiełka nakrywki do kawałka ręcznika papierowego, aby usunąć nadmiar cieczy.

Ostrożnie nałóż szkiełko nakrywkę na kroplę i inkubuj szkiełka w odpowiednich warunkach znakowania. Po zakończeniu inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym przenieś każde szkiełko do osobnej studni nowej płytki 24-dołkowej zawierającej 1 ml TBS na studnię i przemyj komórki w temperaturze pokojowej na wytrząsarku do płytek przez pięć minut, powtarzając tę czynność trzy razy. Po ostatnim przemyciu oznakuj komórki na każdym szkiełku za pomocą odpowiedniej mieszaniny koktajlu przeciwciał wtórnych, zgodnie z wcześniejszą instrukcją.

Następnie inkubować szkiełka nakrywki w ciemności przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji z przeciwciałami wtórnymi trzykrotnie przemyć komórki jednym mililitrem PBS w nowej płytce 24-dołkowej, delikatnie wstrząsając w sposób zaprezentowany powyżej, jednak w warunkach ochrony przed światłem. Po ostatnim przemyciu krótko zanurzyć każde szkiełko nakrywki w wodzie dejonizowanej w celu usunięcia soli, osuszyć krawędzie szkiełka za pomocą chusteczki i ostrożnie zamontować szkiełka nakrywki na szkiełkach przedmiotowych, nakładając 5 µL medium do montażu fluorescencji na każde szkiełko, dbając o brak pęcherzyków powietrza.

Następnie zaklej krawędź szkiełka zakrywającego lakierem do paznokci. Przechowuj preparaty w odpowiedni sposób do momentu obrazowania. Aby obrazować komórki za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej, zacznij od wyboru odpowiedniego obiektywu oraz odpowiednich kanałów fluorescencji do akwizycji obrazu.

Następnie, przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do obrazowania, należy przeprowadzić akwizycję stosów obrazów komórek. Po zarejestrowaniu wszystkich obrazów, należy wykorzystać odpowiednie oprogramowanie do analizy obrazu, aby spłaszczyć stosy obrazów i zapisać je w formacie plików TIFF. Następnie należy wczytać obraz TIFF z próby kontrolnej oraz eksperymentalnej do platformy analizy obrazu i wybrać opcję Lookup Table, aby otworzyć parametry kanałów w oknie Sequence.

Zaznacz pola wyboru wszystkich zakładek kanałów, aby dezaktywować wszystkie kanały. Następnie kliknij kanał zero i wybierz preferowany kolor na pasku kolorów kanału zero, zwiększając intensywność kanału w razie potrzeby, aby uwidocznić wszystkie struktury. Po wybraniu i dostosowaniu odpowiednich kanałów kolorów dla analizy eksperymentalnej wybierz zakładkę płótna i dostosuj poziom powiększenia tak, aby w polu widzenia widocznych było około 10 komórek.

Używając narzędzia wielokąta, kliknij wybraną komórkę i przeciągnij linię wokół niej, aby wyznaczyć granicę komórki. Aby nazwać ten obszar zainteresowania, w oknie obszarów zainteresowania kliknij prawym przyciskiem myszy na wybraną komórkę, a następnie dwukrotnie kliknij nazwę obszaru zainteresowania, aby ją zmienić. Po wybraniu i nazwaniu wszystkich interesujących komórek w ten sam sposób, otwórz aplikację Spot Detector w zakładce detekcji i śledzenia (detection and tracking).

Otwórz kartę Pre Processing i wybierz kanał do analizy. W karcie Detector wybierz opcję Detect bright spots over dark background, a następnie ustaw odpowiednią skalę i czułość. W karcie Region of Interest wybierz sugerowany obszar zainteresowania z sekwencji.

W zakładce Filtering wybierz opcję NoFiltering. W zakładce Output wybierz odpowiedni wyjściowy plik. Zaznacz pole Remove previous spots rendered as regions of interest i kliknij no file selected, aby wybrać folder do zapisu pliku.

Następnie w karcie Wyświetlanie (Display) należy wybrać odpowiednie opcje i kliknąć Rozpocznij wykrywanie (Start Detection). W oprogramowaniu do analizy obrazu detektor punktów może zostać użyty do zidentyfikowania ziarn stresu w każdym z wyznaczonych obszarów zainteresowania. Można następnie wygenerować obraz binarny, aby wyświetlić wszystkie zidentyfikowane ziarna stresu.

Analiza granulatów stresowych musi być starannie dostosowana do każdego analizowanego obszaru granulatów stresowych. Na przykład zmiana wymagań dotyczących rozmiaru wykrywanego obszaru zainteresowania lub zmiana czułości parametrów detekcji prowadzą do zróżnicowanych wyników. Przy większych skalach rozmiaru piksela mniejsze granulaty stresowe nie zostaną policzone, a liczba granulatów stresowych ulegnie zmniejszeniu.

Zwiększenie czułości prowadzi do wzrostu liczby ziarnistych ciał stresowych. Na przykład w tym eksperymencie skala dwa przy czułości 100 dała najlepszy wynik dla markera ciał stresowych G3BP1, natomiast skala dwa przy czułości 55 dała najlepszy wynik dla markera ciał stresowych EIF3B.

Powierzchnię można następnie obliczyć na podstawie wielkości ziarnistości stresowych. Wykresy rozkładu częstości są przydatne do podkreślenia zmian w wielkości ziarnistości stresowych pomiędzy różnymi populacjami komórek. Ponadto intensywność fluorescencji może dostarczyć informacji o jakości analizowanych ziarnistości stresowych.

Po opanowaniu metody, całe wyzwanie dotyczące komórki można zrealizować w około sześciu do siedmiu godzin, a analizę można ukończyć w kolejne dwie do trzech godzin. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zawsze przetwarzać próbki kontrolne i eksperymentalne w tym samym czasie i w tych samych warunkach, aby zminimalizować zmienność danych. Po zastosowaniu tej procedury analizę można rozszerzyć na objętość trójwymiarową, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat lokalizacji ziarnistych stresomeryzacji.

Ta półautomatyczna procedura umożliwia rygorystyczną i bezstronną analizę ziarnistości stresowych w komórkach niezinfekowanych i zainfekowanych. Może ona ujawnić wcześniej nieznane zaburzenia szlaku powstawania ziarnistości stresowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak infekować komórki bakteriami, jak indukować tworzenie ziarnistości stresowych oraz jak wykorzystać podejście półautomatyczne do jakościowej i ilościowej analizy ziarnistości stresowych.

Należy również pamiętać, że praca z Shigella flexneri oraz czynnikami indukującymi ziarnistości stresowe, takimi jak klotrimazol, może być niebezpieczna, dlatego niezbędne jest przestrzeganie środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek, praca w laboratorium poziomu BSL-2 oraz prawidłowa utylizacja wszystkich odczynników.