Name: Analiza immunofluorescencyjna tworzenia się granulek stresowych po prowokacji bakteryjnej komórek ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Poznaj metodę immunofluorescencyjną analizy tworzenia się granulek stresowych w komórkach ssaków po prowokacji bakteryjnej. Technika umożliwia ilościową i jakościową ocenę odpowiedzi komórkowej na infekcję.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PS jest laureatem OPP1141322 grantowego Billa i Melindy Gatesów Grand Challenge. Projekt PV był wspierany przez stypendium Swiss National Science Foundation Early Postdoc Mobility Fellowship oraz stypendium podoktoranckie Roux-Cantarini. PJS jest wspierany przez grant HHMI i ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.

<ol><li>Reineke, L. C., Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversion+of+stress+granules+and+P-bodies+during+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection.</a> Virology. 436 (2), 255-267 (2013).</li>
<li>Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules+and+cell+signaling%3A+more+than+just+a+passing+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase.</a> Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).</li>
<li>Vonaesch, P., Campbell-Valois, F. -X., Dufour, A., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+flexneri+modulates+stress+granule+composition+and+inhibits+stress+granule+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shigella flexneri modulates stress granule composition and inhibits stress granule aggregation.</a> Cell Microbiol. 18 (7), 982-997 (2016).</li>
<li>Kolobova, E., Efimov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-dependent+association+of+AKAP350A+and+CCAR1+with+RNA+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR1 with RNA stress granules.</a> Exp Cell Res. 315 (3), 542-555 (2009).</li>
<li>Anderson, P., Kedersha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules%3A+the+Tao+of+RNA+triage%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+biochemical+sciences%22%5BJournal%5D)">Stress granules: the Tao of RNA triage.</a> Trends in biochemical sciences. 33 (3), 141-150 (2008).</li>
<li>Anderson, P., Kedersha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stressful+initiations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Stressful initiations.</a> J Cell Sci. 115, Pt 16 3227-3234 (2002).</li>
<li>Mohr, I., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+translation+at+the+nexus+of+infection+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Host translation at the nexus of infection and immunity.</a> Cell Host Microbe. 12 (4), 470-483 (2012).</li>
<li>Hu, S., Claud, E. C., Musch, M. W., Chang, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granule+formation+mediates+the+inhibition+of+colonic+Hsp70+translation+by+interferon-+and+tumor+necrosis+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon- and tumor necrosis factor.</a> Am J Physiol Gastointest Liver Physiol. 298 (4), 481-492 (2010).</li>
<li>Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B., Fasano, A., Kotloff, K. L., Levine, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+pitfalls+in+Shigella+vaccine+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Progress and pitfalls in Shigella vaccine research.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).</li>
<li>Lanata, C. F., Fischer-Walker, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Causes+of+Diarrheal+Disease+Mortality+in+Children%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Global Causes of Diarrheal Disease Mortality in Children.</a> PloS One. 8 (9), 72788(2013).</li>
<li>Ashida, H., Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+deploy+multiple+countermeasures+against+host+innate+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shigella deploy multiple countermeasures against host innate immune responses.</a> Curr Opin Microbiol. 14 (1), 16-23 (2011).</li>
<li>Ashida, H., Ogawa, M., Mimuro, H., Kobayashi, T., Sanada, T., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+are+versatile+mucosal+pathogens+that+circumvent+the+host+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system.</a> Curr Opin Immunol. 23 (4), 448-455 (2011).</li>
<li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+stress+granules+and+processing+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).</li>
<li>Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+on+the+inside%3A+the+intracellular+lifestyle+of+cytosolic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Re.+Micro%22%5BJournal%5D)">Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria.</a> Nat Re. Micro. 7 (5), 333-340 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj protokół opisuje indukcję, lokalizację i analizę SG w komórkach niezakażonych i komórkach zakażonych cytozolowym patogenem S. flexneri w obecności lub braku stresu egzogennego. Korzystając z bezpłatnego oprogramowania do obrazowania, protokoły pozwalają na precyzyjną analizę jakościową i ilościową powstawania SG w celu identyfikacji i statystycznego rozwiązania różnic w danych fenotypach.
W protokole znajduje się kilka krytycznych etapów dla infekcji, indukcji SG i...

Wizualizacja interakcji gospodarz-patogen na poziomie komórkowym jest potężną metodą uzyskiwania wglądu w strategie patogenne i identyfikowania kluczowych ścieżek komórkowych. Rzeczywiście, patogeny mogą być wykorzystywane jako narzędzia do wskazywania ważnych celów lub struktur komórkowych, ponieważ patogeny ewoluowały, aby obalić centralne procesy komórkowe jako strategię własnego przetrwania lub rozmnażania. Wizualizację składników komórkowych można osiągnąć poprzez rekombinowaną ekspresję znakowanych fluorescencyjnie białek gospodarza. Chociaż pozwala to na analizę w czasie rzeczywistym, generowanie linii komórkowych ze specjalnie oznakowanymi białkami gospodarza jest bardzo pracochłonne i może powodować niepożądane skutki uboczne. Wygodniejsze jest wykrywanie czynników komórkowych za pomocą określonych przeciwciał, ponieważ wiele czynników gospodarza może być analizowanych jednocześnie i jeden nie jest ograniczony do określonego typu komórki. Wadą jest to, że można uchwycić tylko widok statyczny, ponieważ analiza immunofluorescencyjna wymaga utrwalenia komórek gospodarza. Jednak ważną zaletą obrazowania immunofluorescencyjnego jest to, że łatwo poddaje się analizie zarówno jakościowej, jak i ilościowej. To z kolei może być wykorzystane do uzyskania statystycznie istotnych różnic, aby dostarczyć nowych informacji na temat interakcji gospodarz-patogen.
Programy do analizy obrazów fluorescencyjnych są potężnymi narzędziami analitycznymi do przeprowadzania analiz 3D i 4D. Jednak wysoki koszt oprogramowania i jego utrzymania sprawia, że metody oparte na darmowym oprogramowaniu open source stają się coraz bardziej atrakcyjne. Dokładna analiza obrazu za pomocą oprogramowania do analizy biologicznej jest cenna, ponieważ potwierdza analizę wizualną, a przy przypisywaniu istotności statystycznej zwiększa pewność co do poprawności danego fenotypu. Wcześniej SG były analizowane za pomocą darmowego oprogramowania ImageJ, co wymagało ręcznej identyfikacji poszczególnych SGs4. W tym miejscu przedstawiamy protokół indukcji i analizy tworzenia się komórkowego SG w kontekście infekcji bakteryjnych przy użyciu bezpłatnego oprogramowania do analizy bioobrazów ICY (http://icy.bioimageanalysis.org) o otwartym kodzie źródłowym. Oprogramowanie do analizy obrazu biologicznego ma wbudowany program detektora punktowego, który doskonale nadaje się do analizy SG. Pozwala na precyzyjne dostrojenie procesu automatycznego wykrywania w określonych regionach zainteresowania (ROI). Eliminuje to potrzebę ręcznej analizy poszczególnych SG i eliminuje błąd systematyczny w próbkowaniu.
Wiele stresów środowiskowych powoduje powstawanie SG, które są gęstymi fazowo cytozolowymi, niebłoniastymi strukturami o średnicy 0,2 - 5 μm5,6. Ta odpowiedź komórkowa jest ewolucyjnie zachowana u drożdży, roślin i ssaków i występuje, gdy globalna translacja białek jest zahamowana. Polega na agregacji zatrzymanych kompleksów inicjujących translację do SG, które są uważane za miejsca przechowywania mRNA nieaktywnych translacyjnie, umożliwiając selektywną translację podzbioru komórkowych mRNA. Po usunięciu stresu SG rozpuszczają się i wznawiają globalne tempo syntezy białek. SG składają się z czynników inicjujących elongację translacji, białek biorących udział w metabolizmie RNA, białek wiążących RNA, a także białek rusztowania i czynników zaangażowanych w sygnalizację komórkową gospodarza2, chociaż dokładny skład może się różnić w zależności od zastosowanego stresu. Czynniki środowiskowe, które indukują powstawanie SG, obejmują głód aminokwasów, promieniowanie UV, szok cieplny, szok osmotyczny, stres retikulum endoplazmatycznego, niedotlenienie i infekcję wirusową2,7,8. Poczyniono znaczne postępy w zrozumieniu, w jaki sposób wirusy indukują, a także osłabiają powstawanie SG, podczas gdy nadal niewiele wiadomo o tym, jak inne patogeny, takie jak patogeny bakteryjne, grzybicze lub pierwotniaki, wpływają na tę komórkową reakcję na stres1,7.
Shigella flexneri jest Gram-ujemnym fakultatywnym patogenem cytozolowym ludzi i czynnikiem wywołującym ciężką biegunkę lub shigellozę. Szigelloza jest poważnym obciążeniem dla zdrowia publicznego i prowadzi do 28 000 zgonów rocznie u dzieci poniżej 5 roku życia9,10. S. flexneri infekuje nabłonek okrężnicy i rozprzestrzenia się z komórki na komórkę, przejmując kontrolę nad komponentami cytoszkieletu gospodarza11,12. Zakażenie nabłonka wspomaga replikację S. flexneri w cytozolu, ale zakażone makrofagi giną w wyniku zapalnego procesu śmierci komórki zwanego piroptozą. Infekcja prowadzi do masowej rekrutacji neutrofili i ciężkiego stanu zapalnego, któremu towarzyszy ciepło, stres oksydacyjny i niszczenie tkanek. Tak więc, podczas gdy zakażone komórki podlegają stresom wewnętrznym wywołanym infekcją, takim jak zaburzenie Golgiego, stres genotoksyczny i przegrupowania cytoszkieletu, zakażone komórki są również narażone na stresy środowiskowe spowodowane procesem zapalnym.
Charakterystyka wpływu infekcji S. flexneri na zdolność komórek do reagowania na stres środowiskowy za pomocą wielu markerów SG wykazała, że infekcja prowadzi do jakościowych i ilościowych różnic w składzie SG3. Jednak niewiele wiadomo o innych patogenach bakteryjnych. W tym miejscu opisano metodologię zakażenia komórek gospodarza cytozolowym patogenem S. flexneri, stresowania komórek o różnych stresach środowiskowych, znakowania składników SG oraz jakościowej i ilościowej analizy powstawania i składu SG w kontekście komórek zakażonych i niezakażonych. Ta metoda ma szerokie zastosowanie w przypadku innych patogenów bakteryjnych. Ponadto analiza obrazu powstania SG może być wykorzystana w przypadku infekcji wirusami lub innymi patogenami. Może być używany do analizy powstawania SG po infekcji lub wpływu infekcji na tworzenie SG w odpowiedzi na stresy egzogenne.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciała pierwotne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>eIF3b (N20), pochodzenie kozy&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-16377</td><td>Wytrzymały i szeroko stosowany marker SG. Barwienie cytozolowe umożliwia wyznaczenie komórek. Rozcieńczenie 1:300</td></tr><tr><td>eIF3b (A20), koza pochodzenia&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-16378</td><td>Ten sam cel co eIF3b (N20) i w naszych rękach był identyczny z eIF3b (N20). Rozcieńczenie 1:300</td></tr><tr><td>eIF3A (D51F4), pochodzenie królika (MC: monoklonalne)</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>3411</td><td>Część wielobiałkowego kompleksu eIF3 z eIF3b . Rozcieńczenie 1:800</td></tr><tr><td>eIF4AI, pochodzenie kozy&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-14211</td><td>Polecany przez (Ref # 13). Rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>eIF4B, pochodzenie królika</td><td>Abcam</td><td>ab186856</td><td>Dobry marker granulatu stresu w naszych rękach. Rozcieńczenie 1:300</td></tr><tr><td>eIF4B, pochodzenie królika</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>3592</td><td>Zalecane przez Ref # 13. Rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>eIF4G, pochodzenie królika</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-11373</td><td>Szeroko stosowany marker SG. (Ref # 13): może nie działać dobrze w liniach komórkowych myszy. Rozcieńczenie 1:300</td></tr><tr><td>G3BP1, pochodzenie królika (MC: monoklonalne)</td><td>BD Biosciences</td><td>611126</td><td>Szeroko stosowany marker SG. Rozcieńczenie 1:300</td></tr><tr><td>Tia-1, pochodzenie kozy&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-1751</td><td>Szeroko stosowany marker SG. Można go również znaleźć w ciałach P, gdy SG są obecne (Ref # 13). Rozcieńczenie 1: 300</td></tr><tr><td>Przeciwciała drugorzędowe sprzężone z Alexą</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A488 antykozioł, osioł pochodzenia</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11055</td><td>Wchłaniany krzyżowo. Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>A568 antykozioł pochodzenia osioł</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11057</td><td>Wchłonięty krzyżowo. Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>A488 anty-mysz, pochodzenie osioł</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21202</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>A568 anty-mysz, pochodzenie osioł</td><td>Thermo Fisher</td><td>A10037</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>A647 anty-mysz, pochodzenie osioł</td><td>Thermo Fisher</td><td>A31571</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>A488 anty-królik, pochodzenie osioł</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21206</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>A568 przeciw królikom, pochodzenie osioł</td><td>Thermo Fisher</td><td>A10042</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Inne odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shigella flexneri</td><td></td><td></td><td>Dostępne w różnych laboratoriach na życzenie</td></tr><tr><td>Tryptone Kazeina Soya (TCS) bulion</td><td>BD Biosciences</td><td>211825</td><td>Standardowe podłoże do wzrostu Shigella, zastosowanie - rozwój bakterii</td></tr><tr><td>Agar TCS</td><td>BD Biosciences</td><td>236950</td><td>Standardowy agar wzrostowy do Shigella, zastosowanie - wzrost bakterii</td></tr><tr><td>Czerwień kongijska</td><td>SERVA Electrophoresis GmbH</td><td>27215.01</td><td>Narzędzie do przycinania dla Shigell, które utraciły plazmid wirulencji, zastosowanie - wzrost bakterii</td></tr><tr><td>Poli-L-Lizyna (PLL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1274</td><td>Przydatny do powlekania bakterii w celu zwiększenia infekcji, zastosowanie - infekcja</td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>Selektywne zabijanie bakterii zewnątrzkomórkowych, ale nie cytozolowych, zastosowanie - zakażenie</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-056</td><td>Bufor pH przydatny, gdy komórki są inkubowane w temperaturze RT, zastosowanie - hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium firmy Dulbecco (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>31885</td><td>Standardowa pożywka hodowlana dla komórek HeLa, zastosowanie - hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)</td><td>Biowest</td><td>S1810-100</td><td>5% suplementacja stosowana do pożywki do hodowli komórkowych HeLa, zastosowanie - hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne (NEAA)</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td>Rozcieńczenie 1:100 stosowane do pożywki do hodowli komórek HeLa, zastosowanie - hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Rozcieńczalnik odczynnika, zastosowanie - hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Arsenin</td> <td>soduSigma-Aldrich</td><td>S7400</td><td>Silny induktor granulek stresu (Uwaga: wysoce toksyczny, wymagane specjalne obchodzenie się i utylizacja), zastosowanie - induktor stresu</td></tr><tr><td>Klotrimazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6019</td><td>Silny induktor granulek stresu (Uwaga: zagrożenie dla zdrowia, wymagane specjalne obchodzenie się i utylizacja), zastosowanie - induktor stresu</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA</td><td>Electron Microscopy Scences</td><td>15714</td><td>4% PFA służy do standardowego utrwalania komórek, zastosowanie - utrwalanie</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Stosowany w stężeniu 0,03% do przepuszczalności komórek gospodarza przed barwieniem immunofluorescencyjnym, aplikacja - przepuszczalność</td></tr><tr><td>A647-falloidyna</td><td>Thermo Fisher</td><td>A22287</td><td>Rozcieńczenie wynosi 1:40, najlepiej dodawać podczas wtórnego barwienia przeciwciałami, aplikacja - barwienie</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Barwienie kwasem nukleidowym służące do wizualizacji zarówno jądra gospodarza, jak i bakterii, zastosowanie - barwienie</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR701501</td><td>Folia parafinowa przydatna do barwienia immunofluorescencyjnego szkiełek nakrywkowych, aplikacja - barwienie</td></tr><tr><td>Prolong Gold</td><td>Thermo Fisher</td><td>36930</td><td>Solidne medium montażowe, które dobrze sprawdza się w przypadku większości fluoroforów, zastosowanie - montaż</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>Tanie i wytrzymałe podłoże montażowe, które dobrze sprawdza się w przypadku większości fluoroforów, zastosowanie - montaż</td></tr><tr><td>24-dołkowej płytki do hodowli komórkowych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3527</td><td>Standardowe płytki do hodowli tkankowych, zastosowanie - hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>12 mm&nbsp; szklane szkiełka nakrywkowe</td><td>NeuVitro</td><td>1001/12</td><td>Wspomaganie hodowli komórkowych do zastosowań immunofluorescencyjnych, zastosowanie - kleszcze do podtrzymywania komórek</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>Tani i wytrzymały nośnik montażowy, który dobrze współpracuje z większością fluoroforów, zastosowanie - montaż</td></tr><tr><td>Programy i sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td>Analiza danych i program do tworzenia wykresów z solidnymi opcjami testów statystycznych, zastosowanie - analiza danych</td></tr><tr><td>Leica SP5</td><td>Leica Microsystems Mikroskop</td><td></td><td>konfokalny, zastosowanie - obraz akwizycja</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Professional program do analizy obrazu, aplikacja - analiza danych</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Program do analizy i tworzenia wykresów danych, aplikacja - analiza danych</td></tr></tbody></table>

analiza immunofluorescencyjna tworzenia się granulek stresowych po prowokacji bakteryjnej komórek ssaków

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Obrazowanie fluorescencyjne komponentów komórkowych jest skutecznym narzędziem do badania interakcji gospodarz-patogen. Patogeny mogą wpływać na wiele różnych cech zakażonych komórek, w tym ultrastrukturę organelli, organizację sieci cytoszkieletu, a także procesy komórkowe, takie jak tworzenie granulek stresu (SG). Scharakteryzowanie tego, w jaki sposób patogeny zakłócają procesy gospodarza, jest ważną i integralną częścią dziedziny patogenezy. Podczas gdy zmienne fenotypy mogą być łatwo widoczne, dokładna analiza jakościowych i ilościowych różnic w strukturach komórkowych wywołanych przez prowokację patogenem jest niezbędna do zdefiniowania statystycznie istotnych różnic między próbkami eksperymentalnymi i kontrolnymi. Powstawanie SG jest ewolucyjnie konserwatywną reakcją na stres, która prowadzi do odpowiedzi przeciwwirusowych i od dawna jest badana przy użyciu infekcji wirusowych1. Powstawanie SG wpływa również na kaskady sygnalizacyjne i może mieć inne, wciąż nieznane konsekwencje2. Charakterystyka tej reakcji na stres na patogeny inne niż wirusy, takie jak patogeny bakteryjne, jest obecnie nowym obszarem badań3. Na razie ilościowa i jakościowa analiza powstawania SG nie jest jeszcze rutynowo stosowana, nawet w systemach wirusowych. Tutaj opisujemy prostą metodę indukowania i charakteryzowania powstawania SG w komórkach niezakażonych oraz w komórkach zakażonych cytozolowym patogenem bakteryjnym, który wpływa na powstawanie SG w odpowiedzi na różne stresy egzogenne. Analiza powstawania i składu SG jest osiągana przy użyciu wielu różnych markerów SG i wtyczki detektora punktowego ICY, narzędzia do analizy obrazów o otwartym kodzie źródłowym.

Aby wyjaśnić i zademonstrować protokół opisany w niniejszym manuskrypcie, scharakteryzowano obraz ziarnistości stresowych (SGs) indukowanych klotrymazolem w komórkach HeLa zakażonych lub nie zakażonych cytozolowym patogenem S. flexneri. Schemat procedury przedstawiono na Ryc. 1; obejmuje on wysiewanie wirulentnych i awirulentnych szczepów S. flexneri na płytki z czerwienią Konga, przygotowanie bakterii, infekcję, wywołanie stresu środowiskow...

Opisujemy metodę jakościowej i ilościowej analizy tworzenia się granulek stresu w komórkach ssaków po tym, jak komórki są wystawione na działanie bakterii i wielu różnych stresów. Protokół ten można zastosować do badania odpowiedzi granulek stresu komórkowego w szerokim zakresie interakcji gospodarz-bakteria.

Analiza immunofluorescencyjna tworzenia się granulek stresowych po prowokacji bakteryjnej komórek ssaków

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest ocena wpływu infekcji bakteryjnej na zdolność komórek gospodarza do tworzenia granulek stresowych w odpowiedzi na stres egzogenny. Metoda ta jest cennym narzędziem w dziedzinie mikrobiologii komórkowej, pozwalającym ocenić, czy dany patogen jest w stanie zmienić lub zakłócić cały szlak tworzenia granulek stresowych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość rygorystycznej i zautomatyzowanej analizy jakościowej oraz ilościowej granulek stresowych przy użyciu bezpłatnych programów do analizy obrazu.Niniejsza metoda pozwala na poznanie dynamiki powstawania i składu ziarnistości stresowych oraz tego, jak parametry te są modyfikowane przez konkretny patogen. Dziękujemy. Przed rozpoczęciem procedury, zaszczep kolonię bakterii S.flexneri M90T (czerwone kolonie) z nowo posianej płytki z agarem sojowym z tryptonem z dodatkiem 1% Congo red do probówki stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej 8 ml bulionu sojowego z tryptonem.Po dokręceniu pokrywki inkubować kolonię przez noc z wstrząsaniem przy 222 RPM i 30 °C. Następnego dnia przenieść 150 µL bakterii do 8 mL świeżego bulionu sojowo-trypsynowego i inkubować przez około dwie godziny w temperaturze 37 °C i przy 222 RPM, aby zaindukować ekspresję genów wirulencji w późnej fazie wykładniczej oraz zwiększyć zakaźność bakterii. Gdy gęstość optyczna subkultury osiągnie wartość od 0,6 do 0,9, przenieść 1 mL bakterii do probówki o pojemności 1,5 mL w celu ich zebrania poprzez wirowanie.Następnie osad należy resuspender w medium do infekcji do gęstości optycznej wynoszącej jeden. Dalej, należy odessać nadylotki z każdej studni kultury komórek HeLa na szkiełkach podstawowych. Następnie należy ostrożnie przemyć komórki HeLa 500 µL świeżego medium do hodowli komórek HeLa w temperaturze pokojowej na każdą studnię.Zastąp roztwór piorący 500 µL medium do infekcji na dołek, a następnie odwiruj płytkę 24-dołkową, aby osadzić bakterie na komórkach. Przenieś osiadłe kokultury bakteryjne do inkubatora do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C na 30 minut, aby umożliwić infekcję komórek gospodarza. Po zakończeniu inkubacji usuń egzogenne bakterie z komórek, wykonując trzy płukania w 1 mL świeżego medium hodowlanego HeLa w temperaturze 37 °C na każde płukanie.Następnie zakryj zainfekowane komórki jednym mililitrem świeżej pożywki hodowlanej zawierającej gentamycynę i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po zakończeniu inkubacji zastąp pożywkę 500 mikrolitrami odpowiedniej pożywki hodowlanej, uzupełnionej o wybrany czynnik stresowy, i przenieś komórki z powrotem do inkubatora do hodowli tkanek. Po jednej godzinie całkowicie odessij nadsącz i utrwal próbki w 0,5 mililitra 4% paraformaldehydu w PBS o temperaturze pokojowej przez 30 minut.Następnie usunąć utrwalacz do odpowiedniego pojemnika na odpady i przemyć szkiełka nakrywki za pomocą 1 ml soli buforowanej trisonem (TBS) przez dwie minuty, delikatnie wstrząsając. Po zakończeniu płukania całkowicie odessać TBS i przeprowadzić permeabilizację komórek w każdej studzience, dodając 500 µL 0,3% Triton X-100 w TBS. Po 10 minutach zastąpić roztwór permeabilizujący 1 ml TBS, delikatnie zamieszać płytkę, a następnie zastąpić TBS 1 ml roztworu blokującego i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Aby oznakować komórki wybranym koktajlem przeciwciał pierwszorzędowych, nanieś 50 µL mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych na każdy szkiełko nakrywkę, umieszczając krople na kawałku plastikowej folii Parafilm mocno przyklejonej do blatu laboratoryjnego. Następnie użyj pęsety, aby podnieść pierwsze szkiełko nakrywką. Przyciśnij krawędź szkiełka nakrywki do kawałka ręcznika papierowego, aby usunąć nadmiar cieczy.Ostrożnie nałóż szkiełko nakrywkę na kroplę i inkubuj szkiełka w odpowiednich warunkach znakowania. Po zakończeniu inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym przenieś każde szkiełko do osobnej studni nowej płytki 24-dołkowej zawierającej 1 ml TBS na studnię i przemyj komórki w temperaturze pokojowej na wytrząsarku do płytek przez pięć minut, powtarzając tę czynność trzy razy. Po ostatnim przemyciu oznakuj komórki na każdym szkiełku za pomocą odpowiedniej mieszaniny koktajlu przeciwciał wtórnych, zgodnie z wcześniejszą instrukcją.Następnie inkubować szkiełka nakrywki w ciemności przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji z przeciwciałami wtórnymi trzykrotnie przemyć komórki jednym mililitrem PBS w nowej płytce 24-dołkowej, delikatnie wstrząsając w sposób zaprezentowany powyżej, jednak w warunkach ochrony przed światłem. Po ostatnim przemyciu krótko zanurzyć każde szkiełko nakrywki w wodzie dejonizowanej w celu usunięcia soli, osuszyć krawędzie szkiełka za pomocą chusteczki i ostrożnie zamontować szkiełka nakrywki na szkiełkach przedmiotowych, nakładając 5 µL medium do montażu fluorescencji na każde szkiełko, dbając o brak pęcherzyków powietrza.Następnie zaklej krawędź szkiełka zakrywającego lakierem do paznokci. Przechowuj preparaty w odpowiedni sposób do momentu obrazowania. Aby obrazować komórki za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej, zacznij od wyboru odpowiedniego obiektywu oraz odpowiednich kanałów fluorescencji do akwizycji obrazu.Następnie, przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do obrazowania, należy przeprowadzić akwizycję stosów obrazów komórek. Po zarejestrowaniu wszystkich obrazów, należy wykorzystać odpowiednie oprogramowanie do analizy obrazu, aby spłaszczyć stosy obrazów i zapisać je w formacie plików TIFF. Następnie należy wczytać obraz TIFF z próby kontrolnej oraz eksperymentalnej do platformy analizy obrazu i wybrać opcję Lookup Table, aby otworzyć parametry kanałów w oknie Sequence.Zaznacz pola wyboru wszystkich zakładek kanałów, aby dezaktywować wszystkie kanały. Następnie kliknij kanał zero i wybierz preferowany kolor na pasku kolorów kanału zero, zwiększając intensywność kanału w razie potrzeby, aby uwidocznić wszystkie struktury. Po wybraniu i dostosowaniu odpowiednich kanałów kolorów dla analizy eksperymentalnej wybierz zakładkę płótna i dostosuj poziom powiększenia tak, aby w polu widzenia widocznych było około 10 komórek.Używając narzędzia wielokąta, kliknij wybraną komórkę i przeciągnij linię wokół niej, aby wyznaczyć granicę komórki. Aby nazwać ten obszar zainteresowania, w oknie obszarów zainteresowania kliknij prawym przyciskiem myszy na wybraną komórkę, a następnie dwukrotnie kliknij nazwę obszaru zainteresowania, aby ją zmienić. Po wybraniu i nazwaniu wszystkich interesujących komórek w ten sam sposób, otwórz aplikację Spot Detector w zakładce detekcji i śledzenia (detection and tracking).Otwórz kartę Pre Processing i wybierz kanał do analizy. W karcie Detector wybierz opcję Detect bright spots over dark background, a następnie ustaw odpowiednią skalę i czułość. W karcie Region of Interest wybierz sugerowany obszar zainteresowania z sekwencji.W zakładce Filtering wybierz opcję NoFiltering. W zakładce Output wybierz odpowiedni wyjściowy plik. Zaznacz pole Remove previous spots rendered as regions of interest i kliknij no file selected, aby wybrać folder do zapisu pliku.Następnie w karcie Wyświetlanie (Display) należy wybrać odpowiednie opcje i kliknąć Rozpocznij wykrywanie (Start Detection). W oprogramowaniu do analizy obrazu detektor punktów może zostać użyty do zidentyfikowania ziarn stresu w każdym z wyznaczonych obszarów zainteresowania. Można następnie wygenerować obraz binarny, aby wyświetlić wszystkie zidentyfikowane ziarna stresu.Analiza granulatów stresowych musi być starannie dostosowana do każdego analizowanego obszaru granulatów stresowych. Na przykład zmiana wymagań dotyczących rozmiaru wykrywanego obszaru zainteresowania lub zmiana czułości parametrów detekcji prowadzą do zróżnicowanych wyników. Przy większych skalach rozmiaru piksela mniejsze granulaty stresowe nie zostaną policzone, a liczba granulatów stresowych ulegnie zmniejszeniu.Zwiększenie czułości prowadzi do wzrostu liczby ziarnistych ciał stresowych. Na przykład w tym eksperymencie skala dwa przy czułości 100 dała najlepszy wynik dla markera ciał stresowych G3BP1, natomiast skala dwa przy czułości 55 dała najlepszy wynik dla markera ciał stresowych EIF3B.Powierzchnię można następnie obliczyć na podstawie wielkości ziarnistości stresowych. Wykresy rozkładu częstości są przydatne do podkreślenia zmian w wielkości ziarnistości stresowych pomiędzy różnymi populacjami komórek. Ponadto intensywność fluorescencji może dostarczyć informacji o jakości analizowanych ziarnistości stresowych.Po opanowaniu metody, całe wyzwanie dotyczące komórki można zrealizować w około sześciu do siedmiu godzin, a analizę można ukończyć w kolejne dwie do trzech godzin. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zawsze przetwarzać próbki kontrolne i eksperymentalne w tym samym czasie i w tych samych warunkach, aby zminimalizować zmienność danych. Po zastosowaniu tej procedury analizę można rozszerzyć na objętość trójwymiarową, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat lokalizacji ziarnistych stresomeryzacji.Ta półautomatyczna procedura umożliwia rygorystyczną i bezstronną analizę ziarnistości stresowych w komórkach niezinfekowanych i zainfekowanych. Może ona ujawnić wcześniej nieznane zaburzenia szlaku powstawania ziarnistości stresowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak infekować komórki bakteriami, jak indukować tworzenie ziarnistości stresowych oraz jak wykorzystać podejście półautomatyczne do jakościowej i ilościowej analizy ziarnistości stresowych.Należy również pamiętać, że praca z Shigella flexneri oraz czynnikami indukującymi ziarnistości stresowe, takimi jak klotrimazol, może być niebezpieczna, dlatego niezbędne jest przestrzeganie środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek, praca w laboratorium poziomu BSL-2 oraz prawidłowa utylizacja wszystkich odczynników.

immunofluorescence-analysis-stress-granule-formation-after-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Cayron, J., et al. Wieloskalowa analiza wzrostu bakterii w warunkach leczenia stresem. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje, jak przygotować i wykorzystać płytkę mikroprzepływową do obrazowania komórek bakteryjnych w warunkach stresu. Przedstawia proces wprowadzania kultury bakteryjnej i wywołującej stres pożywki antybiotykowej, a następnie ładowania komórek i ustawiania mikroskopu. Obrazowanie poklatkowe w trybie kontrastu fazowego jest następnie wykorzystywane do obserwacji rozwoju...

Mikroskopowa analiza wzrostu bakterii pod wpływem stresu przy użyciu komór mikroprzepływowych

Źródło: Vonaesch, P. i in., Analiza immunofluorescencji powstawania ziaren stresowych po bakteryjnym wyzwaniu komórek ssaków. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje zakażenie komórek nabłonkowych patogenną bakterią Shigella flexneri oraz powstałą w wyniku tego odpowiedź komórkową gospodarza. Bakteryjne białka efektorowe zakłócają translację gospodarza, wywołując powstawanie organelli bez błony zwanej granulami stresowymi, które odzwierciedlają adaptacyjną odpowiedź komórki na infekcję.

Tworzenie ziaren stresowych podczas infekcji komórek nabłonka nowotworowego Shigella

Ten film demonstruje test do charakteryzowania i ilościowego oznaczania granulek stresu u ssaków, które składają się z mRNA, białek wiążących RNA (RBP) i różnych innych białek.

Test immunofluorescencyjny do charakterystyki i ilościowego oznaczania granulek stresu ssaków

Opracowaliśmy platformę mikroprzepływową do szybkiego testowania wrażliwości na antybiotyki. Płyn jest przepuszczany z dużą prędkością przez bakterie unieruchomione na dnie kanału mikroprzepływowego. W obecności stresu i antybiotyku wrażliwe szczepy bakterii szybko giną. Jednak oporne bakterie mogą przetrwać te stresujące warunki.

Badanie wrażliwości na antybiotyki wywołane stresem na chipie

Granulki stresu (SGs) to granulki cytoplazmatycznego RNA zawierające zatrzymane cząstki rybonukleoproteiny (RNP) i ważne w odpowiedzi komórkowej na różne stresy. Dynamikę SG można śledzić w żywych komórkach, wizualizując lokalizację znakowanego składnika SG w transfekowanych komórkach pierwotnych po stresie.

Wizualizacja dynamiki granulek naprężeń G3BP w żywych komórkach pierwotnych

Granulki stresu (SGs) to niebłoniaste struktury cytoplazmatyczne, które tworzą się w komórkach narażonych na różne stresy. SG zawierają mRNA, białka wiążące RNA, małe podjednostki rybosomalne, czynniki związane z translacją i różne białka sygnalizacji komórkowej. Protokół ten opisuje przepływ pracy, który wykorzystuje kilka podejść eksperymentalnych do wykrywania, charakteryzowania i ilościowego określania SG w dobrej wierze.

Metody klasyfikacji ognisk cytoplazmatycznych jako granulek stresu ssaków

Przedstawiamy protokół użycia mikroskopii STED do jednoczesnego obrazowania struktur aktynowych, mikrotubul i białek wiążących mikrotubule plus end w komórkach B, które rozprzestrzeniły się na szkiełkach nakrywkowych pokrytych przeciwciałami przeciwko receptorowi komórek B, modelowi początkowej fazy tworzenia synaps immunologicznych.

Wizualizacja cytoszkieletów aktyny i mikrotubul w synapsie immunologicznej komórek B przy użyciu mikroskopii wyczerpywania się emisji stymulowanej (STED)

Opracowaliśmy wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek. Test ten jest kompatybilny z cytometrią przepływową, barwieniem immunologicznym i mikroskopią sił trakcyjnych, umożliwiając ilościowe pomiary interakcji biomechanicznych między komórkami, ich macierzą zewnątrzkomórkową i bakteriami chorobotwórczymi.

Wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek

Ten protokół pozwala na czasowy opis wzrostu bakterii w warunkach stresu na poziomie pojedynczej komórki i populacji komórek.

Wieloskalowa analiza wzrostu bakterii w warunkach leczenia stresem

Prezentujemy swobodnie dostępny przepływ pracy stworzony do szybkiej eksploracji i dokładnej analizy ciał komórkowych w określonych przedziałach komórkowych na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej. Ten przyjazny dla użytkownika przepływ pracy został zaprojektowany na oprogramowaniu open source Icy i wykorzystuje również funkcje ImageJ. Potok jest przystępny cenowo bez wiedzy z zakresu analizy obrazu.

Substructure Analyzer: Przyjazny dla użytkownika przepływ pracy do szybkiej eksploracji i dokładnej analizy ciał komórkowych na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej

Poznaj metodę immunofluorescencyjną analizy tworzenia się granulek stresowych w komórkach ssaków po prowokacji bakteryjnej. Technika umożliwia ilościową i jakościową ocenę odpowiedzi komórkowej na infekcję.

Analiza immunofluorescencyjna tworzenia się granulek stresowych po prowokacji bakteryjnej komórek ssaków

Przeglądaj więcej filmów