Analiza immunofluorescencyjna tworzenia się granulek stresowych po prowokacji bakteryjnej komórek ssaków

Opisujemy metodę jakościowej i ilościowej analizy tworzenia się granulek stresu w komórkach ssaków po tym, jak komórki są wystawione na działanie bakterii i wielu różnych stresów. Protokół ten można zastosować do badania odpowiedzi granulek stresu komórkowego w szerokim zakresie interakcji gospodarz-bakteria.

Ogólnym celem tego eksperymentu jest ocena wpływu infekcji bakteryjnej na zdolność komórek gospodarza do tworzenia granulek stresu w odpowiedzi na stres egzogenny. Metoda ta jest cennym narzędziem w dziedzinie mikrobiologii komórkowej do oceny, czy dany patogen jest w stanie zmienić lub podważyć cały szlak granulek stresu. Główną zaletą tej techniki jest to, że granulki naprężeń mogą być analizowane jakościowo i ilościowo w rygorystyczny i zautomatyzowany sposób za pomocą bezpłatnych programów do analizy obrazu.

Metody te zapewniają wgląd w dynamikę powstawania i składu granulek stresowych oraz w jaki sposób na te parametry wpływa określony patogen. Dziękuję. Przed rozpoczęciem wyzwania zaszczepij czerwoną kolonię bakterii S.flexneri M90T ze świeżo pokrytej smugami tryptycznego czerwonego agaru sojowego 1% Kongo do 15-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej osiem mililitrów tryptycznego bulionu sojowego.

Po dokręceniu pokrywy inkubuj kolonię przez noc, wstrząsając przy 222 obr./min i 30 stopniach Celsjusza. Następnego dnia subkulturuj 150 mikrolitrów bakterii w ośmiu mililitrach świeżego bulionu sojowego przez około dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 222 obr./min, aby zainicjować późną indukcję fazy wykładniczej ekspresji genów wirulencji i zwiększyć zakaźność bakterii. Gdy gęstość optyczna subkultury wynosi od 0,6 do 0,9, przenieś jeden mililitr bakterii do 1,5 mililitrowej probówki w celu ich zebrania przez odwirowanie.

I ponownie zawiesić osad w pożywce infekcyjnej o gęstości optycznej jeden. Następnie odessać supernatanty z każdej studzienki kultury szkiełka nakrywkowego z komórek HeLa. I ostrożnie umyj komórki HeLa 500 mikrolitrami świeżej pożywki komórkowej HeLa o temperaturze pokojowej na dołek.

Zastąp płukanie 500 mikrolitrami pożywki infekcyjnej na dołek i odwiruj 24-dołkową płytkę, aby odwirować bakterie na komórkach. Przenieś osiadłe kokultury bakteryjne do inkubatora kultur tkankowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut, aby ułatwić infekcję komórek gospodarza. Pod koniec inkubacji usuń egzogenne bakterie z komórek za pomocą trzech płukań w jednym mililitrze świeżej pożywki hodowlanej HeLa o temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedno pranie.

Następnie przykryj zakażone komórki jednym mililitrem świeżej pożywki hodowlanej zawierającej gentamycynę i włóż płytkę z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych. Pod koniec inkubacji należy zastąpić pożywkę 500 mikrolitrami odpowiedniej pożywki hodowlanej, uzupełnionej czynnikiem stresogennym, który jest przedmiotem zainteresowania, i zwrócić komórki do inkubatora do hodowli tkankowych. Po godzinie całkowicie odessać supernatant i utrwalić próbki w 0,5 mililitra 4% paraformaldehydu o temperaturze pokojowej w PBS przez 30 minut.

Następnie wyrzuć utrwalacz do odpowiedniego pojemnika na odpady i myj szkiełka nakrywkowe jednym mililitrem soli fizjologicznej buforowanej trisem przez dwie minuty, delikatnie wstrząsając. Pod koniec prania całkowicie odessać TBS i przepuszczalnie komórki w każdej studzience za pomocą 500 mikrolitrów 0,3% Triton X-100 w TBS. Po 10 minutach zastąp roztwór przepuszczalny jednym mililitrem TBS, delikatnie zakręć płytką i zastąp TBS jednym mililitrem roztworu blokującego na godzinę w temperaturze pokojowej.

Aby oznaczyć komórki interesującym nas koktajlem przeciwciał pierwotnych, umieść 50 mikrolitrów mieszanki przeciwciał pierwszorzędowych na szkiełko nakrywkowe na kawałku plastikowego Parafilmu mocno przyklejonego do blatu stołu. Następnie użyj pęsety, aby podnieść pierwsze szkiełko nakrywkowe. I przetrzyj krawędź szkiełka nakrywkowego na kawałku bibuły, aby usunąć nadmiar płynu.

Ostrożnie umieścić szkiełko nakrywkowe na kropli i inkubować szkiełka nakrywkowe w odpowiednich warunkach etykietowania. Pod koniec inkubacji znakowania przeciwciałami pierwotnymi przenieść każde szkiełko nakrywkowe do indywidualnego dołka nowej 24-dołkowej płytki zawierającej jeden mililitr TBS na studzienkę i umyć komórki w temperaturze pokojowej na wytrząsarce płytkowej przez pięć minut trzy razy. Po ostatnim przemyciu oznacz komórki na każdym szkiełku nakrywkowym odpowiednią wtórną mieszanką koktajli przeciwciał, jak właśnie pokazano.

I inkubuj szkiełka nakrywkowe w ciemności przez godzinę w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji znakowania przeciwciałami wtórnymi umyć komórki w jednym mililitrze PBS trzy razy na nowej 24-dołkowej płytce z delikatnym potrząsaniem, jak właśnie pokazano, ale chronić przed światłem. Po ostatnim praniu zanurz na krótko każde szkiełko nakrywkowe w wodzie dejonizowanej, aby usunąć sól, nanieś krawędzie szkiełka nakrywkowego na chusteczkę i ostrożnie zamontuj szkiełka nakrywkowe na pięciu mikrolitrach fluorescencyjnego podłoża montażowego na szklane szkiełko mikroskopowe bez pęcherzyków.

Następnie uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci. I przechowuj szkiełka zgodnie z potrzebami do czasu obrazowania. Aby zobrazować komórki za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej, zacznij od wyboru odpowiedniego obiektywu i odpowiednich kanałów fluorescencyjnych do akwizycji obrazu.

Następnie uzyskaj stosy obrazów komórek, używając odpowiedniego oprogramowania do obrazowania. Po przechwyceniu wszystkich obrazów użyj odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazowania, aby zwinąć stosy obrazów i zapisać je jako pliki TIFF. Następnie załaduj kontrolkę i eksperymentalny obraz TIFF do platformy analizy obrazu, a następnie wybierz pozycję Tabela przeglądowa, aby otworzyć parametry kanału w oknie Sekwencja.

Kliknij wszystkie pola wyboru na karcie kanału, aby dezaktywować wszystkie kanały. Następnie kliknij kanał zerowy, a następnie kliknij pasek koloru kanału zerowego, aby wybrać preferowany kolor, zwiększając intensywność kanału w razie potrzeby, aby zobrazować wszystkie struktury. Po wybraniu i dostosowaniu każdego z odpowiednich kanałów kolorów do analizy eksperymentalnej wybierz kartę płótno i dostosuj kartę powiększenia, aby wyświetlić około 10 komórek na pole wyświetlania.

Za pomocą narzędzia wielokąta kliknij interesującą Cię komórkę i przedłuż linię wokół komórki, aby wyznaczyć granicę komórki. Aby nazwać ten obszar zainteresowania, w oknie obszaru zainteresowania kliknij prawym przyciskiem myszy komórkę zainteresowania, a następnie kliknij dwukrotnie nazwę obszaru zainteresowania, aby ją zmodyfikować. Po wybraniu i nazwaniu wszystkich interesujących komórek w ten sam sposób otwórz aplikację Spot Detector na karcie wykrywania i śledzenia.

Otwórz zakładkę Przetwarzanie wstępne i wybierz kanał, który chcesz przeanalizować. Na karcie Detektor wybierz opcję Wykryj jasne punkty na ciemnym tle i wybierz odpowiednią skalę i czułość. Na karcie Obszar zainteresowania wybierz sugerowany obszar zainteresowania z sekwencji.

Na karcie Filtrowanie wybierz pozycję NoFiltering. Na karcie Wyjście wybierz odpowiednie wyjście. Wybierz opcję Usuń poprzednie miejsca renderowane jako obszary zainteresowania i kliknij opcję Brak zaznaczonego pliku, aby wybrać folder, w którym chcesz zapisać plik.

Następnie na karcie Wyświetlanie wybierz odpowiednie opcje i kliknij przycisk Rozpocznij wykrywanie. W oprogramowaniu do analizy obrazowania detektor punktowy może być używany do identyfikacji granulek naprężeń w każdym z wyznaczonych obszarów zainteresowania. Następnie można wygenerować obraz binarny, aby wyświetlić wszystkie zidentyfikowane granulki naprężeń.

Analiza granulek naprężeń musi być starannie dostosowana do każdego analizowanego rynku granulek stresowych. Na przykład zmiana wymaganego rozmiaru wykrytego obszaru zainteresowania lub zmiana czułości parametrów wykrywania prowadzi do różnych wyników. Przy wyższych skalach rozmiaru piksela mniejsze granulki naprężeń nie będą zliczane, a liczba granulek naprężeń zmniejszy się.

Natomiast zwiększenie czułości powoduje wzrost liczby granulek stresu. Na przykład w tym eksperymencie skala dwa z czułością 100 dała najlepszy wynik z markera granulek stresu G3BP1. Natomiast dwustopniowa skala z czułością 55 dała najlepszy wynik dla markera granulek stresu EIF3B.

Pole powierzchni można następnie obliczyć na podstawie wielkości granulek naprężeń. Wykresy rozkładu częstości są przydatne do podkreślania zmian w wielkości granulek stresu między różnymi populacjami komórek. Ponadto intensywność fluorescencji może dostarczyć informacji o jakości analizowanych granulek naprężeniowych.

Po opanowaniu, wyzwanie całej komórki można wykonać w ciągu około sześciu do siedmiu godzin, a analizę można zakończyć w ciągu kolejnych dwóch do trzech godzin. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby zawsze przetwarzać próbki kontrolne i eksperymentalne w tym samym czasie i w tych samych warunkach, aby zminimalizować zmienność danych. Po tej procedurze analiza może zostać również rozszerzona do objętości trójwymiarowej, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat lokalizacji granulek naprężeń.

Ta półautomatyczna procedura pozwala na rygorystyczną i bezstronną analizę granulek stresu w niezakażonych i zakażonych komórkach. Może ujawnić nieznane wcześniej subwersje szlaku granulek stresu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak infekować komórki bakteriami, jak indukować tworzenie się granulek stresu i jak stosować półautomatyczne podejście do analizy granulek stresu w sposób jakościowy i ilościowy.

I nie zapominaj, że w przypadku Shigella flexneri i granulek stresu środki wywołujące stres, takie jak klotrimazol, mogą być niebezpieczne i że konieczne są środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek, praca w laboratorium BL2 i prawidłowe wyrzucanie wszystkich odczynników.