Transfekcja małego RNA w pierwotnych ludzkich komórkach Th17 za pomocą elektroporacji nowej generacji

Ogólnym celem niniejszej procedury jest efektywna transfekcja pierwotnych ludzkich limfocytów T za pomocą reagentów małych RNA z wykorzystaniem elektroporacji nowej generacji. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii limfocytów T, takie jak wpływ konkretnych produktów genów na regulację różnicowania limfocytów T oraz ich funkcję odpornościową. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona wysoce wydajną i niezawodną metodę transfekcji pierwotnych ludzkich limfocytów T sRNA oraz innymi syntetycznymi reagentami małych RNA.

Metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat biologii ludzkich komórek Th17, ale może być również zastosowana do innych układów, takich jak inne limfocyty ludzkie lub mysie. W dniu zerowym pokryć płytki tkankowe z sześcioma dołkami 1,5 ml na dołek przeciwciał anty-CD3 i anty-CD28 przeciwko antygenom ludzkim w PBS z dodatkiem wapnia i magnezu przez co najmniej dwie godziny w temperaturze 37°C. Po wyizolowaniu i przemyciu mononuklearnych komórek krwi pępowinowej (CBMCs), przeprowadzić izolację limfocytów T CD4+ poprzez selekcję negatywną przy użyciu komercyjnego zestawu do izolacji ludzkich limfocytów T CD4+.

Dodać bufor izolacyjny i ponownie zawiesić komórki mononuklearne. Przenieść komórki do nowej probówki o pojemności pięciu mililitrów, następnie dodać 100 µL surowicy bydlęcej płodu, czyli FBS, oraz 100 µL mieszanki przeciwciał do każdej probówki, a następnie inkubować każdą probówkę w temperaturze 4 °C przez 20 minut na wytrząsarku orbitalnym w celu dokładnego wymieszania. Po inkubacji dodać od trzech do czterech mililitrów buforu izolacyjnego, aby wypłukać komórki.

Wirować komórki z prędkością 300 ×g przez osiem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu odwirowania osadu komórkowego. Ostrożnie odessać nadsącz. Przenieść kulki magnetyczne do nowej probówki i dodać taką samą objętość buforu do izolacji, aby wypłukać kulki.

Używając mikropipety o objętości 1 ml, dokładnie wymieszaj kuleczki, a następnie umieść probówkę w magnesie na co najmniej jedną minutę. Ostrożnie odessaj supernatant i ponownie zawieś magnetyczne kuleczki w tej samej objętości, która została przeniesiona przed etapem płukania. Do każdej probówki dodaj 500 µl buforu izolacyjnego i ponownie zawieś komórki, a następnie dodaj 500 µl uprzednio wypłukanych kuleczek magnetycznych.

Inkubować komórki z kulkami magnetycznymi przez 15 minut na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej w celu zapewnienia dokładnego wymieszania. Po inkubacji, używając mikropipety o objętości jednego mililitra, dokładnie pipetować komórki co najmniej 10 razy, następnie dodać od trzech do czterech mililitrów buforu do izolacji i umieścić każdą probówkę w magnesie na dwie minuty. Ostrożnie przenieść negatywnie wyselekcjonowane komórki T CD4-dodatnie znajdujące się w supernatancie do nowej probówki.

Po zakończeniu izolacji limfocytów T CD4 dodatnich należy przechowywać komórki w lodzie i ocenić ich liczbę za pomocą hemocytometru. Płytki pokryte przeciwciałami należy przemyć dwukrotnie PBS, a następnie do każdej studni dodać 1,5 mililitra dwukrotnego stężenia mieszaniny pożywki polaryzującej Th17. Następnie należy odwirować ludzkie limfocyty T CD4 dodatnie w celu osadzenia komórek.

Ostrożnie odessać supernatant i go usunąć, następnie zawiesić komórki ponownie w podstawowej pożywce bez surowicy i wysiać komórki tak, aby końcowa objętość wynosiła 3 mL na studzienkę, a cytokiny polaryzujące znajdowały się w stężeniu końcowym 1X, po czym umieścić płytki w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C na dwie doby. Drugiego dnia pokryć płytki hodowlane 48-dołkowe 250 µL na studzienkę przeciwciał anty-CD3 i anty-CD28 przeciwko ludzkim antygenom w PBS z dodatkiem wapnia i magnezu przez co najmniej dwie godziny w temperaturze 37 °C. Aby przygotować małe RNA do transfekcji, odmierzyć 1 µL z 5 µM roztworu zapasowego siRNA do probówki mikrocentryfugowej o pojemności 1,5 mL dla każdej transfekcji.

Wszystkie probówki należy przechowywać w lodzie. Następnie płytki pokryte przeciwciałami należy przemyć dwukrotnie roztworem PBS, a potem dodać 500 µL jednokrotnej pożywki polaryzującej Th17 do każdej studni. Po przygotowaniu płytek hodowlanych i odczynników do transfekcji, komórki należy resuspender za pomocą mikropipety o objętości 1 mL, pipetując delikatnie, ale tak, aby upewnić się, że wszystkie komórki oddzieliły się od dna studni.

Połączyć komórki w probówce stożkowej i odwirować probówki z prędkością 500 ×g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie odessać supernatant, a następnie zawiesić komórki ponownie w co najmniej jednym mililitrze PBS w celu przemycia. Policzyć żywe komórki Th17 za pomocą hemocytometru, stosując wykluczanie błękitu trypanu w celu oceny żywotności, a następniet zgranulować komórki w probówce do mikrocentryfugi.

Ostrożnie odessaj supernatant i resuspenduj komórki, używając dołączonego do zestawu buforu do resuspensji. Przechowuj komórki w temperaturze pokojowej. Do każdej probówki do mikrocentryfugi dodaj 9 µL zawiesiny komórek i 1 µL małego RNA.

Pipetuj raz, aby wymieszać komórki i małe cząsteczki RNA przed transfekcją, a następnie przenieś komórki do dołączonej końcówki elektrody pipety. Aby zapewnić optymalną transfekcję, unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza do końcówki elektrody pipety przed rozpoczęciem procesu. Dodajemy 9,5 µL zawiesiny komórkowej, aby upewnić się, że objętość mieszaniny jest wystarczająca, by zapobiec powstawaniu pęcherzyków w pipecie do elektroporacji.

Napełnij dostarczoną kuwetę trzema mililitrami buforu elektrolitycznego o temperaturze pokojowej. Umieść kuwetę w stacji pipetującej Neon, a następnie wprowadź pipetę do wnętrza kuwety. Natychmiast przeprowadź elektroporację każdej 10 µL mieszaniny komórek i małego RNA.

Po zakończeniu elektroporacji bezpośrednio przenieś mieszaninę komórek do 500 µL jednokrotnego (1X) medium polaryzującego Th17 w przygotowanych dołkach płytki hodowlanej. Na koniec umieść płytki w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C na kolejne dwa dni. Pracuj starannie, lecz szybko, aby zapobiec śmierci komórek.

Jeśli do elektroporacji przeznaczono wiele próbek, komórki można zbierać i transfekować partiami. Ten wykres konturowy pokazuje, że limfocyty T hodowane w warunkach polaryzujących Th17 wykazują ekspresję receptora chemokinowego CCR6 oraz czynnika transkrypcyjnego ROR gamma T, których nie stwierdzono w przypadku limfocytów T hodowanych w warunkach bez polaryzacji. Limfocyty T hodowane w warunkach polaryzujących Th17 produkowały również IL-17A po ponownej stymulacji, czego nie zaobserwowano w warunkach ThN.

Różnicowanie komórek Th17 nadal zachodzi po transfekcji małymi cząsteczkami RNA, jednak w niektórych eksperymentach obserwuje się zmniejszenie częstotliwości produkcji IL-17A. Wskazuje to na znaczenie zastosowania kontroli w postaci małych RNA o dopasowanej chemii do porównania w obrębie każdego eksperymentu. Żywotność po transfekcji małymi cząsteczkami RNA zostaje zachowana i zazwyczaj wynosi powyżej 70%. Transfekcja ludzkich komórek Th17 w drugim dniu za pomocą puli siRNA celującej w gen PTPRC, który koduje CD45, silnie zredukowała ekspresję CD45 w porównaniu z kontrolnym siRNA o dopasowanej chemii.

Jednomodalna zmiana populacji w ekspresji CD45, widoczna tutaj, wskazuje na wydajność transfekcji bliską 100%. Redukcja ekspresji ROR gamma T za pomocą RNAi wywołała efekt funkcjonalny, ponieważ komórki te wykazały obniżoną produkcję IL-17A w porównaniu z komórkami transfekowanymi kontrolnym siRNA. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić transfekcję małymi cząsteczkami RNA w polaryzowanych in vitro ludzkich komórkach Th17 przy użyciu elektroporacji nowej generacji.