Nowy test na zimną nocycepcję u larw Drosophila

Ogólnym celem tego testu na szkodliwe zimno jest możliwość ilościowego określenia i oceny zmian w wykrywaniu nieszkodliwego lub szkodliwego zimna. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nocycepcji, w tym ułatwić identyfikację nowych, konserwatywnych, zimnych genów nocycepcji i modulatorów reakcji bólowych w chorobie i/lub urazie. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na precyzyjną manipulację szkodliwym bodźcem zimna i kwantyfikację reakcji wywołanych zimnem w różnych kontekstach środowiskowych i genetycznych.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą musiały ćwiczyć konsekwentne stosowanie sondy przed rozpoczęciem eksperymentu. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy odkryliśmy, że larwy Drosophila reagują na szkodliwe ciepło i zaciekawiło nas, czy robią to samo na szkodliwe zimno. Hoduj stada lub krzyżówki genetyczne drosophila w inkubatorze o temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Uwaga, w przypadku hodowli krzyżówki, użyj 20 do 25 dziewiczych samic i 15 do 20 samców na fiolkę zawierającą zwykłą pożywkę i kulturę much z mączki kukurydzianej przez około 48 godzin przed przeniesieniem much do nowej fiolki z pokarmem. Pięć dni po rozpoczęciu hodowli należy zebrać larwy trzeciego stadium rozwojowego o pożądanym genotypie, delikatnie wlewając strumień wody do papkowatego pokarmu i larw. Następnie wylej zawartość na średniej wielkości czystą szalkę Petriego.

Następnie delikatnie posortuj larwy według wielkości, używając kleszczy, aby wykluczyć większe, wędrujące larwy w trzecim stadium lub małe, chorowite larwy. Wyrzuć larwy zawierające jakiekolwiek niepożądane markery genetyczne lub równoważniki. Niech inny członek laboratorium oznaczy pojemniki, w których zostaną umieszczone posortowane larwy, aby eksperymentator był ślepy na warunki doświadczalne lub genotyp larw.

Użyj czerpaka, aby przenieść niewielką ilość świeżej żywności na czystą szalkę Petriego wypełnioną do połowy wodą o temperaturze pokojowej. Na koniec użyj kleszczy, aby delikatnie przesunąć posortowane larwy na pokarm, aby zapobiec głodowi lub wysuszeniu, jeśli przewiduje się, że badanie zajmie więcej niż 20 minut. Zacznij od włączenia zimnej sondy i pozwól jej ostygnąć do żądanej temperatury na kilka minut.

Zetrzyj nadmiar wilgoci z sondy chusteczką laboratoryjną. Gdy nie jest używany natychmiast, umieść nasadkę izolacyjną na sondzie, aby zarówno zaizolować, jak i utrzymać końcówkę w czystości oraz zapobiec uszkodzeniom. Następnie umieść środkową larwę trzeciego stadium rozwojowego na cienkim kawałku ciemnego, ruchomego winylu, aby pomóc w wizualizacji kontrastu i wyrównaniu sondy.

Następnie umieść ten kawałek winylu z larwą pod mikroskopem jasnego pola. Dostosuj mikroskop i jednostkę świetlną do średniej jasności, aby zapewnić kontrast i zapobiec zbyt szybkiemu wysychaniu larwy. Za pomocą wilgotnego pędzla upewnij się, że larwa jest wilgotna od wody z szalki Petriego, aby nie przykleiła się do winylu i usuń nadmiar otaczającej ją wody za pomocą KimWipe.

Przesunął sondę ręcznie w kierunku larwy pod kątem 90 stopni do przednio-tylnej osi ciała, używając winylu do przesunięcia larwy do właściwej pozycji. Ustaw końcówkę sondy tak, aby delikatnie leżała na środkowej powierzchni grzbietowej larwy z sondą pod kątem około 45 stopni do stolika mikroskopowego. Po kontakcie z sondą uruchom timer.

Zastosuj wystarczający nacisk w dół, aby lekko wciąć powierzchnię naskórka larwy, jednocześnie umożliwiając ruch do przodu lub do tyłu. Następnie przytrzymaj sondę w miejscu przez maksymalnie 10 sekund lub do momentu, gdy zaobserwuje się reakcję behawioralną wywołaną zimnem, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej. Następnie wyjmij sondę.

Rejestruj zaobserwowaną reakcję behawioralną i opóźnienie odpowiedzi. Zwróć uwagę na wszelkie niereagujące lub larwy, które nie reagują w ciągu 10 sekund. Na koniec wyrzuć larwę i przygotuj następną.

Powtarzaj procedurę, aż do osiągnięcia pożądanej liczby badanych larw. Po kontakcie z zimną sondą, wyniki tego eksperymentu wskazują, że larwy reagują następującymi zachowaniami wywołanymi zimnem, zgniatając swoje przednie i tylne segmenty w kierunku środka ciała w skurczu, CT, unosząc przednie i tylne segmenty w powietrze, aby utworzyć kształt litery U, US, unosząc w powietrze tylko tylne segmenty, PR. Co więcej, różne zachowania osiągają szczyt w różnych zimnych zakresach, tak jak PR i US osiągają szczyt od trzech do ośmiu stopni Celsjusza, podczas gdy CT osiąga szczyt około 9 do 14 stopni Celsjusza. Wreszcie, porównując opóźnienia różnych zachowań zimna, dane te pokazują, że odpowiedzi CT znacznie różniły się od PR i US przy 3 stopniach Celsjusza i 10 stopni Celsjusza oraz z USA przy 20 stopniach Celsjusza.

Po opanowaniu tej techniki można wykonać w około 30 do 40 minut dla jednego zestawu 30 larw. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zdawać sobie sprawę z nieprawidłowego poruszania się, poziomu wilgoci larwy oraz nacisku i umieszczenia zimnej sondy na larwie. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ niewłaściwe zastosowanie zimnej sondy może skutkować różnymi krzywymi reakcji na dawkę lub brakiem zachowania reakcji na zimno.

Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak obrazowanie światłem fluorescencyjnym, analiza ekspresji genów i testy behawioralne. Wszystko zależy od tego, jak ekspozycja na zimno wpłynie na aktywność komórkową, morfologię, ekspresję genów lub inne zachowania. Technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się zimną nocycepcją do badania skutków genetycznych, środowiskowych i chorobowych u drosophila.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak korzystać z narzędzia i testu zimnej sondy do analizy reakcji wywołanych zimnem i zrozumienia komórkowych i genetycznych mechanizmów zimnej nocycepcji.