Name: Rekombinowana ekspresja, krystalizacja i badania biofizyczne pirofosforylazy nukleotydowej konserwowanej przez Bacillus, BcMazG (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Poznaj metodę ekspresji rekombinowanego białka z niepatogennych bakterii Bacillus cereus do badań biofizykochemicznych. Technika umożliwia krystalizację białek i analizę kinetyki enzymatycznej w standardowym laboratorium.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Zestawy danych dyfrakcji rentgenowskiej zostały zebrane na linii badawczej 7A w Laboratorium Akceleratora Pohang (Korea). Badanie to było wspierane przez Program Badań Podstawowych (Basic Science Research Program) zarządzany przez Narodową Fundację Badawczą Korei (NRF), finansowany przez Ministerstwo Nauki, ICT i Planowania Przyszłości (2015R1A1A01057574 do MH).

1. Produkcja i oczyszczanie rekombinowanego białka rBC1531
<ol>
	<li>Przygotowanie plazmidu o ekspresji rekombinowanego białka BC1531 (rBC1531)
	<ol>
		<li>Przygotuj genomowe DNA B. cereus10.</li>
		<li>Amplifikuj gen bc1531 z matrycy genomowego DNA B. cereus za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), używając starterów do przodu i do tyłu (patrz Lista materiałów) w celu utworzenia odpowiednio miejsc enzymów restrykcyjnych BamHI i Sal10.</li>
		<li>Trawić produkt PCR i zmodyfikowany wektor pET49b (pET49bm) przy użyciu BamHI i SalI, zgodnie z opisem11.</li>
		<li>Wymieszaj strawiony produkt PCR i wektor (stosunek 3:1) z kroku 1.1.3 przy użyciu ligazy DNA T4 w reakcji 10 μl, zgodnie z opisem11. Inkubować w temperaturze 18 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Odpipetować 3 μl reakcji ligacji do 50 μl chemicznie kompetentnych komórek E. coli DH5α w probówce. Delikatnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół, a następnie umieść na lodzie na 30 minut. Szok termiczny przez 45 s w temperaturze 42 °C. Dodać 1 ml pożywki Luria-Bertani (LB) i hodować komórki, energicznie wstrząsając (250 obr./min, 37 °C, 45 min).</li>
		<li>Pobrać 100 μl przekształconych komórek z kroku 1.1.6 i rozprowadzić je na płytkach LB-agar ze 100 μg/ml kanamycyny (Kan). Inkubować przez ~18 h w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zbierz kolonie za pomocą sterylnej końcówki i hoduj komórki w 3 ml pożywki LB ze 100 μg/ml Kan; energicznie wstrząsnąć (250 obr./min, 37 °C, 18 h).</li>
		<li>Przygotuj plazmidowe DNA przy użyciu alkalicznej metody lizy SDS, zgodnie z opisem10.</li>
		<li>Potwierdź sekwencję nukleotydów konstruktu ekspresji rBC1531 za pomocą sekwencjonowania DNA12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nadekspresja białka rBC1531
	<ol>
		<li>Ponownie przekształć szczep E. coli BL21 (DE3) z plazmidem o ekspresji rBC1531, jak opisano w krokach 1.1.5-1.1.6, w celu nadekspresji.</li>
		<li>Wybierz kolonię i hoduj ją w 10 ml pożywki LB zawierającej 50 μg/ml Kan (LB+Kan); wstrząsać energicznie przez 18 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zaszczepić 10 ml nocnej hodowli w 1 l pożywki LB+Kan i rosnąć w temperaturze 37 °C, aż OD600 (gęstość optyczna przy 600 nm) osiągnie ~0,7.</li>
		<li>Zanurz kulturę w lodowatej wodzie na ~15 minut, aby schłodzić temperaturę do 18 °C i dodaj do kultury izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG) o końcowym stężeniu 1 mM w celu ekspresji rekombinowanego białka. Hoduj kulturę w temperaturze 18 °C przez dodatkowe ~16-18 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie rBC1531
	<ol>
		<li>Zebrać komórki przez odwirowanie (5 000 x g, 4 °C, 30 min). Supernatant należy ostrożnie wyrzucić, aby nie naruszyć pracy komórek. Ponownie zawiesić komórki w 50 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanego fosforanem (PBS) zawierającego 10 mM imidazolu.</li>
		<li>Dwukrotnie poddać komórki lizie za pomocą sonikacji na lodzie, aby zapobiec przegrzaniu lizatów komórkowych (czas: 2 min 30 s; cykl wł.: 5 s; cykl wyłączony: 10 s; amplituda: 38%).</li>
		<li>Usunąć lizat komórkowy przez odwirowanie (~25 000 x g, 4 °C, 30 min).</li>
		<li>Zmieszać 3 ml kulek niklowych i 60 ml PBS zawierającego 10 mM imidazolu i grawitacyjnie przepuścić dodatkowy bufor w celu osadzenia zrównoważonych kulek niklu w szklanej kolumnie chromatograficznej o wymiarach 2,5 x 10 cm.</li>
		<li>Odpipetować do przeniesienia supernatantu z etapu 1.3.3 do kolumny ze wstępnie zrównoważonymi kulkami niklu i inkubować w temperaturze 4 °C przez 2 godziny na kołowrotku z niską prędkością (~20 obr./min).</li>
		<li>Pozostawić supernatant do grawitacyjnego spłynięcia i trzykrotnie przemyć kulki niklu w kolumnie 100 ml PBS zawierającego 10 mM imidazolu.</li>
		<li>Elute białko rBC1531 poprzez zastosowanie 4 x 5 ml PBS zawierającego 250 mM imidazolu.</li>
		<li>Weź 15 μl elucji z kroku 1.3.7 i uruchom ją na 15% SDS-PAGE. Zwizualizuj pasma białkowe na żelu za pomocą Coomassie blue staining10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuwanie znaczników powinowactwa białka rBC1531 przez proteolizę trombiny
	<ol>
		<li>Odpipetować frakcje do probówki dializacyjnej (masa cząsteczkowa odcięta: 3 kDa) i umieścić probówkę w zlewce zawierającej 4 litry buforu kompatybilnego z rozszczepianiem trombiny (20 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl i 1,5 mM β-merkaptoetanolu) w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Odpipetować frakcje i przenieść je do stożkowej probówki.</li>
		<li>Zmierz absorbancję przy 280 nm i oszacuj stężenie białka rBC1531, zgodnie z opisem13.</li>
		<li>Weź 50 μg rBC1531 do probówki o pojemności 0,5 ml i dodaj różne ilości trombiny (tj. 2, 1, 0,6 i 0,3 jednostki). Inkubować reakcje rBC1531 i trombiny w temperaturze 20 °C przez ~ 3 godziny, aby określić najmniejszą ilość trombiny wymaganą do rozszczepienia N-końcowego znacznika powinowactwa.</li>
		<li>Uruchom reakcje rBC1531 i trombiny na 15% SDS-PAGE i określ najniższą ilość trombiny (np. 0,3 jednostki trombiny na 50 μg rBC1531), która całkowicie trawi N-końcowy znacznik powinowactwa i wytwarza wolny od znaczników rBC1531.</li>
		<li>Dodać 10 mg białka rBC1531 i 60 jednostek trombiny do probówki o pojemności 15 ml i inkubować w temperaturze 20 °C przez ~ 3 godziny w celu przeprowadzenia reakcji trombiny-proteolizy.</li>
		<li>Zastosuj wzorce filtracji żelowej do kolumny chromatografii wykluczającej wielkość (SEC), aby przygotować wzorcową krzywą mas cząsteczkowych i objętości elucji, zgodnie z opisem13.</li>
		<li>Umieścić białko rBC1531 trawione przez trombinę z kroku 1.4.6 w odśrodkowej probówce filtrującej (odcięta masa cząsteczkowa: 3 kDa) i odwirować przy 3 000 g w temperaturze 4 °C do zmniejszenia do objętości mniejszej niż 5 ml.</li>
		<li>Nałóż skoncentrowane białko rBC1531 do kolumny SEC i zbierz 60 eluowanych frakcji w 0,5 ml na probówkę13.</li>
		<li>Weź 15 μl każdej frakcji, uruchom je na 15% SDS-PAGE i zabarwij żel za pomocą roztworu barwiącego Coomassie (0,15% (w/v) błękitu brylantowego Coomassie, 40% (v/v) metanolu i 10% (v/v) lodowatego kwasu octowego) zgodnie z opisem10.</li>
		<li>Odpipetować frakcje zawierające rBC1531 i zebrać je do jednej probówki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Badanie przesiewowe krystalizacji i optymalizacja rBC1531
<ol>
	<li>Warunki przesiewowe krystalizacji białka rBC1531
	<ol>
		<li>Zagęścić rBC1531 od kroku 1.4.11 do ~18.5 mg/ml za pomocą odśrodkowej rurki filtracyjnej, jak opisano w kroku 1.4.8.</li>
		<li>Dodać 50 μl każdego roztworu do przesiewania krystalizacji (patrz sekcja 2.2)14 do studzienek 96-dołkowych płytek krystalizacyjnych. Umieścić 0,5 μl 18,5 mg/ml roztworu białka rBC1531 na łóżku wypoczynkowym. Wymieszaj roztwór białka z 0,5 μl roztworu studzienki, powtarzając proces dla całej płytki.</li>
		<li>Przykryj płytkę przezroczystą folią samoprzylepną. Umieścić 96-dołkowe płytki w temperaturze 18 °C i pozostawić do dyfuzji pary.</li>
		<li>Skanuj krople w powiększeniu 20-40X za pomocą mikroskopu świetlnego, aby monitorować tworzenie się kryształów codziennie przez 2-3 tygodnie.</li>
		<li>Zbierz dane dyfrakcji rentgenowskiej12 za pomocą otrzymanych kryształów białka rBC1531.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Optymalizacja warunków krystalizacji rBC1531
	<ol>
		<li>Przygotować 500 μl wybranego roztworu do wstępnej krystalizacji (np. 0,1 M kakodylanu sodu, pH 6,5 i 1,0 M cytrynianu sodu) i napełnić 24-dołkową płytkę krystalizacyjną dla kropli do siedzenia.</li>
		<li>Dodać 0,5 μl roztworu białka rBC1531 o stężeniu 18,5 mg/ml do łóżka siedzącego, wymieszać z 0,5 μl roztworu studzienki i natychmiast przykryć płytkę przezroczystą folią klejącą. Umieścić płytkę w temperaturze 18 °C.</li>
		<li>Obserwuj wzrost kryształów pod mikroskopem świetlnym przez tydzień.</li>
		<li>Zoptymalizuj różne warunki krystalizacji, zmieniając pH (tj. pH 5,5-6,8) 0,1 M kakodylanu i zmieniając stężenie soli (tj. 0,9-1,2 M) cytrynianu sodu w celu uzyskania pojedynczych kryształów. Monitoruj wzrost kryształów przez ~1 tydzień i zbieraj dane dyfrakcji rentgenowskiej12.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Charakterystyka aktywności trifosfatazy nukleozydowej (NTPazy) rBC1531
<ol>
	<li>Walidacja badania kolorymetrycznego zależnego od fosforanów nieorganicznych
	<ol>
		<li>Przygotować zapas pirofosforanu (100 mM) i rozcieńczyć go do końcowych stężeń 0,1, 0,25, 0,5, 1,0, 5,0, 10, 50, 100 i 250 μM w 200 μl buforu reakcyjnego (20 mM HEPES, pH 7,4; 150 mM NaCl; i 2 mM MgCl2) na zduplikowanych płytkach 96-dołkowych. Użyj pierwszej płytki jako kontrolnej (nie zawiera ona pirofosfatazy). Upewnij się, że druga płytka zawiera pirofosfatazę jako płytkę roboczą, zgodnie z zaleceniami w kroku 3.1.2.</li>
		<li>Dodać 0,01 jednostki pirofosfatazy nieorganicznej Saccharomyces cerevisiae (1 μl) do studzienek płytki roboczej i inkubować w temperaturze 20 °C przez 30-60 minut.</li>
		<li>Przygotować roztwór kwasu molibdenianowego, mieszając roztwory molibdenianu amonu (0,86% v/v) i kwasu askorbinowego (14% v/v) w stosunku 7:3. Dodać 16 μl roztworu kwasu molibdenianowego zarówno do studzienki roboczej, jak i kontrolnej i odczekać 15 minut.</li>
		<li>Odczytaj gęstość optyczną przy 690 nm (OD690nm).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kolorymetryczny test NTPazy
	<ol>
		<li>Przygotować zapas 100 mM substratu trifosforanu nukleozydów (NTP) i rozcieńczyć do pożądanego stężenia (np. 0, 0,2, 4,4, 11, 22, 44, 88 lub 132 μM) w 180 μl buforu do oznaczania (20 mM HEPES, pH 7,4; 150 mM NaCl; i 2 mM MgCl2).</li>
		<li>Dodać 20 μg rBC1531 (1,5 mM) i substraty NTP z kroku 3.2.1 do 200 μl na reakcję na 96-dołkową płytkę i pipetować w górę iw dół, aby dobrze wymieszać. Przykryj płytkę pokrywką i umieść ją w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 30 minut w celu przeprowadzenia reakcji hydrolizy substratu.</li>
		<li>Przenieść płytkę do łaźni wodnej o temperaturze 70 °C i odstawić na 15 minut, aby zatrzymać reakcje katalityczne, w których pośredniczy rBC1531.</li>
		<li>Dodać 0,01 jednostki nieorganicznej pirofosfatazy S. cerevisiae (1 μl) do każdego dołka płytki reakcyjnej (z etapu 3.2.3) i inkubować w temperaturze 20 °C przez 30 min. Dodać 16 μl roztworu kwasu molibdenianowego do płytki reakcyjnej w celu uzyskania koloru (~15 min). Odczyt przy OD690nm.</li>
		<li>Analizuj za pomocą równania Michaelisa-Mentena, zgodnie z opisem12.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ivanova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+Bacillus+cereus+and+comparative+analysis+with+Bacillus+anthracis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of Bacillus cereus and comparative analysis with Bacillus anthracis.</a> Nature. 423, 87-91 (2003).</li>
<li>Spencer, R. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1769905/">Bacillus anthracis.</a> J Clin Pathol. 56, 182-187 (2003).</li>
<li>Deli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LmbE+proteins+from+Bacillus+cereus+are+de-N-acetylases+with+broad+substrate+specificity+and+are+highly+similar+to+proteins+in+Bacillus+anthracis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">LmbE proteins from Bacillus cereus are de-N-acetylases with broad substrate specificity and are highly similar to proteins in Bacillus anthracis.</a> FEBS J. 277, 2740-2753 (2010).</li>
<li>Gross, M., Marianovsky, I., Glaser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MazG+--+a+regulator+of+programmed+cell+death+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">MazG -- a regulator of programmed cell death in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 59, 590-601 (2006).</li>
<li>Galperin, M. Y., Moroz, O. V., Wilson, K. S., Murzin, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((House+cleaning%2C+a+part+of+good+housekeeping%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">House cleaning, a part of good housekeeping.</a> Mol Microbiol. 59, 5-19 (2006).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+Escherichia+coli+MazG%2C+the+regulator+of+nutritional+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of Escherichia coli MazG, the regulator of nutritional stress response.</a> J Biol Chem. 283, 15232-15240 (2008).</li>
<li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimeric+dUTPases%2C+HisE%2C+and+MazG+belong+to+a+new+superfamily+of+all-alpha+NTP+pyrophosphohydrolases+with+potential+%26%2334%3Bhouse-cleaning%26%2334%3B+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dimeric dUTPases, HisE, and MazG belong to a new superfamily of all-alpha NTP pyrophosphohydrolases with potential &#34;house-cleaning&#34; functions.</a> J Mol Biol. 347, 243-255 (2005).</li>
<li>Robinson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+house-cleaning+enzyme+encoded+within+an+integron+array%3A+1.8+A+crystal+structure+defines+a+new+MazG+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A putative house-cleaning enzyme encoded within an integron array: 1.8 A crystal structure defines a new MazG subtype.</a> Mol Microbiol. 66, 610-621 (2007).</li>
<li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+a+complex+of+Campylobacter+jejuni+dUTPase+with+substrate+analogue+sheds+light+on+the+mechanism+and+suggests+the+%26%2334%3Bbasic+module%26%2334%3B+for+dimeric+d%28C%2FU%29TPases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of a complex of Campylobacter jejuni dUTPase with substrate analogue sheds light on the mechanism and suggests the &#34;basic module&#34; for dimeric d(C/U)TPases.</a> J Mol Biol. 342, 1583-1597 (2004).</li>
<li>Green, M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.molecularcloning.com/">Molecular cloning: A laboratory Manual</a>. 1, John Inglis. (2012).</li>
<li>Brown, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrown%2C+TA+%22Gene+cloning+an+introduction%22">Gene cloning an introduction</a>. , Chapman & Hall. (1986).</li>
<li>Kim, M. I., Hong, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+Bacillus-conserved+MazG+protein%2C+a+nucleotide+pyrophosphohydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the Bacillus-conserved MazG protein, a nucleotide pyrophosphohydrolase.</a> Biochem Biophys Res Commun. 472, 237-242 (2016).</li>
<li>Sheehan, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSheehan%2C+D+%22Physical+biochemistry%3A+Principles+and+applications%22">Physical biochemistry: Principles and applications</a>. , A John Wiley & Sons. (2009).</li>
<li>Lesley, S. A., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+crystallization+at+the+joint+center+for+structural+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Funct+Genomics%22%5BJournal%5D)">Protein production and crystallization at the joint center for structural genomics.</a> J Struct Funct Genomics. 6, 71-79 (2005).</li>
<li>Jeon, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+biochemical+characterization+of+bacterial+YpgQ+protein+reveals+a+metal-dependent+nucleotide+pyrophosphohydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and biochemical characterization of bacterial YpgQ protein reveals a metal-dependent nucleotide pyrophosphohydrolase.</a> J Struct Biol. 195, 113-122 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Badania nad prawdziwymi patogenami są ograniczone ze względu na ograniczenia i przepisy bezpieczeństwa. Alternatywnie, patogeny można badać przy użyciu ewolucyjnie spokrewnionych gatunków niebędących patogenami lub mniej patogennych. Gen ba1554 jest uważany za krytyczny gen u B. anthracis. Na szczęście identyczny gen jest obecny u nieklinicznego B. cereus. Tak więc, bez poważnych obaw dotyczących bezpieczeństwa, rekombinowane białko BC1531 może być stosowane do charakterystyki biofizycznej i en...

Ekspresja białek rekombinowanych jest powszechnie stosowana do rozwiązywania problemów związanych z naturalnymi źródłami białka, takich jak ograniczone ilości białka i szkodliwe zanieczyszczenie. Co więcej, w badaniach genów i białek chorobotwórczych można wykorzystać alternatywny szczep laboratoryjny, który nie wymaga dodatkowych środków ostrożności. Na przykład Bacillus cereus jest użytecznym modelem do badania Bacillus anthracis ze względu na ich bliskie pokrewieństwo ewolucyjne1.
B. anthracis jest obowiązkowym patogenem, który powoduje śmiertelne wdychanie wąglika u ludzi i zwierząt gospodarskich i może być potencjalnie używany jako broń biologiczna2. W związku z tym badania laboratoryjne nad B. anthracis są ściśle regulowane przez amerykańskie Centra Kontroli Chorób, wymagające praktyk poziomu bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL-3), które nakazują segregację obszaru laboratoryjnego przy ujemnym ciśnieniu w pomieszczeniu. W przeciwieństwie do B. anthracis, B. cereus jest klasyfikowany jako środek BSL-1, a zatem ma minimalne obawy dotyczące bezpieczeństwa. B. cereus jest oportunistycznym patogenem, który po zakażeniu powoduje zatrucie pokarmowe, które można leczyć bez pomocy medycznej. Ponieważ jednak B. cereus dzieli wiele krytycznych genów z B. anthracis, funkcje białek B. anthracis można badać przy użyciu odpowiednich homologów B. cereus1.
Klaster genów ba1554 - ba1558 B. anthracis jest wysoce konserwatywny z klastrem bc1531- bc1535 B. cereus, jak również z klastrem bt1364-bt1368 Bacillus thuringiensis, pod względem organizacji i sekwencji genów. Co więcej, pierwsze geny (ba1554, bc1531 i bt1364) odpowiednich klastrów są absolutnie konserwatywne (tj. 100% identyczność sekwencji nukleotydów), co sugeruje krytyczną rolę produktu genu w gatunkach Bacillus. Ze względu na swoją lokalizację w tych klastrach genów, ba1554 został błędnie zidentyfikowany jako domniemany regulator transkrypcji3. Jednak analiza sekwencji aminokwasów produktu ba1554 wskazuje, że należy on do rodziny MazG, która ma aktywność pirofosfohydrolazy nukleotydowej i nie jest związana z aktywnością czynnika transkrypcyjnego4,5. Chociaż białka należące do rodziny MazG są zróżnicowane pod względem ogólnej sekwencji i długości, mają wspólną domenę MazG o długości ~100 reszt charakteryzującą się motywem EXXE12-28EXXD ("X" oznacza dowolną resztę aminokwasową, a liczba wskazuje liczbę reszt X).
Domena MazG nie zawsze bezpośrednio odpowiada za określoną aktywność katalityczną. Członek MazG z Escherichia coli (EcMazG) posiada dwie domeny MazG, ale tylko C-końcowa domena MazG jest aktywna enzymatycznie 6. Co więcej, specyficzność substratowa enzymów MazG waha się od niespecyficznych trifosforanów nukleozydów (dla EcMazG) do specyficznych dCTP/dATP (dla MazG związanych z integrynami) i dUTP (dla dUTPaz)6,7,8,9. W związku z tym konieczne są analizy biofizykochemiczne białka BA1554 w celu potwierdzenia jego aktywności NTPazy i rozszyfrowania jego specyficzności substratowej.
Tutaj udostępniamy krok po kroku protokół, który większość laboratoriów bez urządzenia BSL-3 może zastosować, aby scharakteryzować produkt białkowy genu B. cereus bc1531, który jest ortologiem B. anthracis ba1554, na poziomie molekularnym. Krótko mówiąc, rekombinowany BC1531 (rBC1531) uległ ekspresji w E. coli i został oczyszczony za pomocą znacznika powinowactwa. W przypadku eksperymentów krystalograficznych rentgenowskich warunki krystalizacji białka rBC1531 zostały przebadane i zoptymalizowane. Aby ocenić aktywność enzymatyczną rBC1531, aktywność NTPazy monitorowano kolorymetrycznie, aby uniknąć radioaktywnie znakowanych nukleotydów, które były tradycyjnie stosowane. Ostatecznie analizy uzyskanych danych biofizykochemicznych pozwoliły na określenie stanu oligomeryzacji i parametrów katalitycznych rBC1531, a także na uzyskanie danych dyfrakcji rentgenowskiej z kryształu rBC1531.

<table><tbody><tr><td>Bacillus cereus ATCC14579</td><td>Koreańska kolekcja do hodowli tkankowych</td><td>3624</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania genomowego DNA</td><td>GeneAll</td><td>106-101</td><td>Przygotowanie genomowego DNA</td></tr><tr><td>Starter do przodu</td><td>Macrogen</td><td>GAAGGATCCGGAAGCAAAAAA CGATGAAAGATATGCA</td><<td>em>BamHI strona jest podkreślona</td></tr><tr><td>Odwrotny starter</td><td>Macrogen</td><td>CTTGTCGACTTATTCTTTCTCT CCCTCATCAATACGTG</td><td>SalI strona jest podkreślona</td></tr><tr><td>nPfu-Forte</td><td>Enzynomics</td><td>P410</td><td>PCR polimeraza</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>Enzynomics</td><td>R003S</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td> Wektor ekspresyjny <td>Enzynomics</td><td>R009S</td><td></td></tr><tr><td>pET49b</td><td>Novagen</td><td>71463</td><td>Wektor ekspresji został zmodyfikowany w celu dodania znaczników powinowactwa i miejsc BamHI/SalI10</td></tr><tr><td>T4 Ligaza DNA</td><td>Enzynomics</td><td>M001S</td><td></td></tr><tr><td>Memebrane do dializy</td><td>Thermofisher</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>Suchy grzejnik blokowy</td><td>JSR</td><td>JSBL-02T</td><td></td></tr><tr><td>LB bulion (Luria-Bertani)</td><td>Roztwór LPS</td><td>LB-05</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>LPS roztwór</td><td>KAN025</td><td></td></tr><tr><td>Mini-zestaw przygotowawczy</td><td>Favorgen</td><td>FAPDE300</td><td>Preparat plazmidowego DNA</td></tr><tr><td>BL21(DE3) Właściwa komórka</td><td>Novagen</td><td>69450-3CN</td><td></td></tr><tr><td>Izopropyl &beta;-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Odczynniki Fisher</td><td>50-213-378</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Daejung</td><td>7548-4100</td><td>Materiał PBS Chlorek</td></tr><tr><td>potasu</td><td>Daejung</td><td>6566-4405</td><td>Materiał PBS</td></tr><tr><td>Fosforan potasu</td><td>Bio Basic Inc</td><td>PB0445</td><td>Materiał PBS</td></tr><tr><td>Fosforan sodu</td><td>Bio Basic Inc</td><td>S0404</td><td>Materiał PBS</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Bio Basic Inc</td><td>IB0277</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonics VCX</td><td>130</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA agaros</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>Koralik niklowy</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Finepcr</td><td>AG</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Białko Dwukolorowe standardy</td><td>Bio-rad</td><td>1610374</td><td>SDS-PAGE wzorzec białkowy</td></tr><tr><td>Coonmassie Brilliant Blue R-250</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP101-25</td><td>Roztwór barwiący Coomassie</td></tr><tr><td>Alkohol metylowy</td><td>Substancja chemiczna Samchun</td><td>M0585</td><td>Roztwór barwiący Coomassie</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Daejung</td><td>1002-4105</td><td>Roztwór barwiący Coomassie</td></tr><tr><td>Memebrane do dializy</td><td>Thermofisher</td><td>68035</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Trombin</td><td>Merckmillipore</td><td>605157-1KUCN</td><td>Przygotować podwielokrotności 20 &mu; L (1 jednostka na &mu; L) i przechowywać w temperaturze 70 stopni; C i rozmrozić przed użyciem</td></tr><tr><td>Superdex 200 16/600</td><td>General Electric</td><td>28989335</td><td>Chromatografia wykluczająca rozmiar</td></tr><tr><td>Standard filtracji żelowej</td><td>Bio-rad</td><td>151-1901</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy</td><td>Amicon</td><td>UFC800396</td><td></td></tr><tr><td>Płytki krystralizacyjne</td><td>Hampton research</td><td>HR3-083</td><td>96-dołkowa płyta opadająca</td></tr><tr><td>do siedzenia Podstawowy pakiet JCSG I-IV</td><td>Qiagen</td><td>130924-130927</td><td>Roztwór zabezpieczający krystalizację</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>Płyty Cryschem</td><td>Hampton research</td><td>HR3-158</td><td>24-dołkowa siedząca płytka kroplowa</td></tr><tr><td>Nieorganiczna pirofosfataza</td><td>Sigma</td><td>10108987001</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór molibdenianu amonu</td><td>Sigma</td><td>13106-76-8</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>50-81-7</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże NTP</td><td>Startagene</td><td>200415-51</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Biotek</td><td>SynergyH1</td> czytnik <td>mikropłytek</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5</td><td>GraphPad</td><td>Prism 5 do okna</td><td></td></tr></tbody></table>

rekombinowana ekspresja, krystalizacja i badania biofizyczne pirofosforylazy nukleotydowej konserwowanej przez bacillus, bcmazg

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Aby przezwyciężyć ograniczenia i przepisy bezpieczeństwa podczas badania genów i białek prawdziwych patogenów, można badać ich homologi. Bacillus anthracis jest obowiązkowym patogenem, który powoduje śmiertelnego wąglika wziewnego. Bacillus cereus jest uważany za użyteczny model do badania B. anthracis ze względu na jego bliskie pokrewieństwo ewolucyjne. Klaster genów ba1554 - ba1558 B. anthracis jest wysoce konserwatywny z klastrem bc1531-bc1535 w B. cereus, a także z klastrem bt1364-bt1368 w Bacillus thuringiensis, co wskazuje na krytyczną rolę powiązanych genów w rodzaju Bacillus. W tym manuskrypcie opisano metody przygotowania i scharakteryzowania produktu białkowego pierwszego genu (ba1554) z klastra genów w B. anthracis przy użyciu rekombinowanego białka jego ortologa w B. cereus, bc1531.

Charakterystyka białka będącego przedmiotem niniejszego badania rozpoczęła się od przygotowania odpowiedniej ilości rekombinowanego białka B. cereus bc1531 (rBC1531), najlepiej kilku miligramów. Fragment DNA kodujący białko BC1531 został przygotowany metodą PCR z wykorzystaniem matrycy z genomicznego DNA B. cereus, ponieważ zawiera ono geny ortologiczne identyczne z ba154. Białko rBC1531 wykazano jako nadekspresowane białko rozpuszczalne w komórkach E. coli<...

Bacillus anthracis jest obowiązkowym patogenem śmiertelnego wąglika wziewnego, więc badania nad jego genami i białkami są ściśle regulowane. Alternatywnym podejściem jest badanie genów ortologicznych. Opisujemy badania biofizykochemiczne ortologa B. anthracis w B. cereus, bc1531, wymagające minimalnego sprzętu doświadczalnego i pozbawione poważnych obaw dotyczących bezpieczeństwa.

Rekombinowana ekspresja, krystalizacja i badania biofizyczne pirofosforylazy nukleotydowej konserwowanej przez Bacillus, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie białka rekombinowanego z bakterii niepatogennych w celu ułatwienia badań biofizykochemicznych, takich jak krystalografia rentgenowska białek czy kinetyka enzymatyczna. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące sposobu przygotowania interesującego białka rekombinowanego z wykorzystaniem bakterii niepatogennych do wstępnej charakterystyki biofizycznej. Główną zaletą tej techniki jest możliwość przeprowadzenia charakterystyki biofizycznej badanego białka w dowolnym laboratorium wyposażonym w powszechnie stosowane instrumenty, takie jak inkubatory do hodowli komórkowych i spektrofotometry.Aby rozpocząć tę procedurę, przygotować reakcję ligacji zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Pipetować 3 µL przygotowanej reakcji ligacji do probówki zawierającej 50 µL chemicznie kompetentnych komórek E.coli DH5 alpha. Za pomocą pipety delikatnie wymieszać roztwór.Schładzać roztwór w lodzie przez 30 minut. Następnie przeprowadzić szok termiczny przez 45 sekund w temperaturze 42 °C. Po tym etapie dodać 1 mL pożywki LB i inkubować komórki przy intensywnym mieszaniu z wytrząsaniem z prędkością 250 obr./min w temperaturze 37 °C przez 45 minut.Nanieś 100 µL transformowanych komórek na płytkę z agarem LB z dodatkiem 100 µg/mL kanamycyny. Inkubuj przez 18 h w temperaturze 37 °C. Za pomocą sterylnego końcówki pobierz kolonie z płytki.Hodować komórki w trzech mililitrach uzupełnionego medium LB przy intensywnym wytrząsaniu z prędkością 250 obrotów na minutę w temperaturze 18 stopni Celsjusza przez 18 godzin. Następnie przygotować plazmidowe DNA i potwierdzić sekwencję nukleotydową zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po ponownej transformacji szczepu E.coli BL21 wybrać kolonię za pomocą sterylnej końcówki i zaszczepić ją w 10 mililitrach medium LB zawierającego 150 mikrogramów na mililitr kanamycyny.Inkubować w temperaturze 37°C przez 18 godzin przy intensywnym mieszaniu z prędkością 250 obr./min. Następnie przenieść 10 ml kultury nocnej do jednego litra pożywki LB z kanamycyną. Hodować w temperaturze 37°C aż do momentu, gdy gęstość optyczna przy 600 nm osiągnie wartość 0,7.Następnie zanurz kulturę w lodowatej wodzie na 15 minut. Do kultury dodaj IPTG w taki sposób, aby stężenie końcowe wynosiło 1 mM. Inkubuj w temperaturze 18 °C przez kolejne 16 do 18 godzin.Następnie odwiruj próbkę przy 5 000 ×g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usuń nadosad. Resuspenduj komórki w 50 µL PBS zawierającego 10 mM imidazolu.Następnie poddać komórki dwukrotnej lizie na lodzie, zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole tekstowym. Wirować z prędkością 25 000 ×g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu oczyszczenia lizatu komórkowego. Następnie w 50 ml probówce stożkowej zmieszać 3 ml kulek niklowych oraz 47 ml PBS zawierającego 10 mM imidazolu.Przepuść dodatkowy bufor grawitacyjnie, aby osadzić zrównoważone koraliki w szklanej kolumnie chromatograficznej o wymiarach 2,5 na 10 centymetrów. Za pomocą pipety przenieś nadsącz do kolumny. Inkubuj w temperaturze 4 °C przez dwie godziny na rotatorze przy prędkości 20 obr./min.Następnie należy pozwolić na spływanie supernatantu siłą grawitacji. Koraliki niklowe należy przemyć trzykrotnie, używając do każdego płukania 100 mililitrów PBS zawierającego 10 milimolar imidazolu. Następnie należy nałożyć pięć mililitrów PBS zawierającego 250 milimolar imidazolu, aby eluować białko RBC 1531.Przeanalizuj 15 µL eluatu za pomocą SDS-PAGE zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przenieś zebrane frakcje pipetą do probówki dializacyjnej. Umieść probówkę w zlewce zawierającej cztery litry buforu kompatybilnego z cięciem trombiną w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc.Następnego dnia za pomocą pipety przenieś frakcje do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Zmierz absorbancję przy 280 nm, aby oszacować stężenie białka zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie przenieś 50 µl białka RBC 1531 do kilku probówek.Do każdej probówki dodać różną ilość trombiny i inkubować w temperaturze 20 °C przez trzy godziny. Po określeniu najmniejszej potrzebnej ilości trombiny, dodać 10 mg białka oraz 60 j. trombiny do probówki o pojemności 15 ml. Inkubować w temperaturze 20 °C przez trzy godziny.Następnie przenieś białko trawione trombiną do probówki z filtrem wirowym. Wiruj z prędkością 3 000 ×g w temperaturze 4 °C, aby zredukować objętość do mniej niż 5 mL. Po tym etapie nanieś skoncentrowane białko na przygotowaną kolumnę do chromatografii wykluczania cząsteczek.Zbierz 60 frakcji elucji po 0,5 ml do każdej probówki. Nanieś 15 µl każdej frakcji na żel SDS-PAGE 15%, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie połącz frakcje zawierające białko RBC 1531.Aby rozpocząć, należy przenieść połączone frakcje do probówki z filtrem do wirowania. Wirować przy 3,000 ×g w temperaturze 4 °C, aby zagęścić białko do stężenia około 18.5 mg/mL. Następnie dodać 50 µL każdego roztworu z ekraningu krystalizacji do dołków 96-dołkowej płytki do krystalizacji metodą wiszącej kropli.Nanieś 0,5 µL stężonego roztworu białka na podstawkę. Oddzielnie zmieszaj roztwór białka z 0,5 µL roztworu do studzienek. Przykryj płytkę przezroczystą folią przylepną.Inkubować w temperaturze 18°C, umożliwiając dyfuzję par. Za pomocą mikroskopu świetlnego codziennie skanować krople przy powiększeniu od 20 do 40x przez dwa do trzech tygodni, aby monitorować proces krystalizacji. Po przygotowaniu substratów NTP przenieść każdy z nich do płytki 96-dołkowej.Do każdej studzienki nanieś 20 µg białka RBC 1531, mieszając za pomocą pipety. Przykryj płytkę pokrywą i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Następnie przenieś płytkę do łaźni wodnej o temperaturze 70 °C na 15 minut, aby zatrzymać reakcje katalityczne pośredniczone przez RBC 1531.Następnie do każdej dołki należy dodać jeden mikrolitr nieorganicznej pirofosfatazy z S.cerevisiae. Inkubować w temperaturze 20 °C przez 30 minut. Następnie do płytki reakcyjnej dodać 16 mikrolitrów roztworu kwasu molibdenowego w celu wywołania zabarwienia.Po 15 minutach odczytano gęstość optyczną przy 690 nanometrach. W niniejszym badaniu produkt białkowy genu BC1531 z serii B został scharakteryzowany na poziomie molekularnym. Po oczyszczaniu za pomocą chromatografii powinowactwa do niklu przeprowadzono próbne trawienie trombiną.Stwierdzono, że 0,3 jednostek trombiny to najmniejsza ilość wymagana do całkowitego usunięcia znacznika powinowactwa z RBC 1531. Po trawieniu białko pozbawione znacznika jest oczyszczane do poziomu około 99% czystości przy użyciu chromatografii wykluczania cząsteczkowego. Następnie, za pomocą chromatografii wykluczania cząsteczkowego, szacowany jest stan oligomeryczny.Ponieważ RBC 1531 eluje przy objętości około 84 ml, jego masa cząsteczkowa została oszacowana na 55 kDa. Obliczona masa cząsteczkowa monomeru wynosi około 13 kDa. Zatem RBC 1531 tworzy tetramer.Następnie przeprowadzono przesiew krystalizacji z wykorzystaniem metody dyfuzji pary w kropli osiadłej. Kryształy zaobserwowano po dwóch dniach w warunkach: 1 M cytrynianu sodu i 20% glikolu polietylenowego 3 000, a także 0,1 M kakodylanu sodu i 1 M cytrynianu sodu. Po tym etapie określono aktywność NTPazy.Po dodaniu molibdanu do reakcji hydrolizy zapośredniczonej przez RBC 1531 nie obserwuje się widocznej zmiany barwy. Jednakże po dodaniu pirofosfatazy kolor zmienia się na ciemnoniebieski. Następnie analizuje się gęstość optyczną przy 690 nanometrach oraz stężenie NTP przy użyciu regresji nieliniowej.Ustalono, że enzym RBC 1531 charakteryzuje się maksymalną prędkością na poziomie 0,75 oraz stałą Michaelisa wynoszącą 10 µM. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest niezwłoczne przygotowanie próbek białek oraz odrzucenie frakcji zawierających jakiekolwiek zanieczyszczenia, które utrudniają krystalizację białek lub wprowadzają błędy w testach enzymatycznych. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie enzymologii oraz innych nauk o białkach do charakteryzowania interesujących białek przy użyciu spektrofotometrów, które znajdują się w większości laboratoriów.Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat ogólnych zasad przygotowania białek rekombinowanych, przesiewania krystalizacji oraz kinetyki enzymatycznej, można ją również zastosować w biofizycznej analizie chemicznej innych białek będących przedmiotem zainteresowania. Należy pamiętać o zachowaniu ostrożności podczas pracy z białkami, ponieważ mogą być one niezwykle niestabilne. Zaleca się stosowanie środków ostrożności, takich jak przechowywanie próbek na lodzie oraz mrożenie w temperaturze -80 °C w celu długoterminowego przechowywania.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować białko rekombinowane z bakterii niepatogennych w celu uzyskania kryształów białka do wyznaczenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej oraz jak scharakteryzować aktywność enzymatyczną przy użyciu metody kolorymetrycznej.

recombinant-protein-expression-crystallization-biophysical-studies

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Transdukcja białek umożliwia bezpośrednie dostarczanie biologicznie czynnych białek do komórek. W przeciwieństwie do konwencjonalnych metod, takich jak transfekcja DNA czy transdukcja wirusowa, ten nieinwazyjny paradygmat pozwala na wysoce efektywną manipulację komórkową w sposób miareczkowalny, unikając toksyczności komórkowej oraz ryzyka transformacji onkogennej wynikającej z trwałej modyfikacji genetycznej.

Inżynieria białek przenikających przez błony komórkowe

Projektowanie leków w oparciu o strukturę odgrywa istotną rolę w opracowywaniu nowych preparatów terapeutycznych. Równoległe dążenie do uzyskania wielu celów znacznie zwiększa szanse na sukces w odkrywaniu związków wiodących. Poniższy artykuł przedstawia, w jaki sposób Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease wykorzystuje podejście wielocelowe w procesie wyznaczania struktury na podstawie genu dla podjednostki PB2 wirusa grypy typu A.

Podejście z zastosowaniem równoległego przetwarzania wielu celów w wyznaczaniu struktury na podstawie sekwencji genu podjednostki PB2 polimerazy wirusa grypy

Kompleksy białkowe katalizują kluczowe funkcje komórkowe. Szczegółowa charakterystyka funkcjonalna i strukturalna wielu istotnych kompleksów wymaga produkcji rekombinowanej. MultiBac to system komórkowy bakulowirusa/owadów specjalnie przystosowany do ekspresji białek eukariotycznych i ich kompleksów. MultiBac został wdrożony jako platforma o otwartym dostępie, a standardowe procedury operacyjne zostały opracowane w celu maksymalizacji jego użyteczności.

Platforma do produkcji kompleksu białkowego MultiBac w EMBL

Ekspresja białek rekombinowanych przez systemy ssaków staje się atrakcyjną metodą wytwarzania kompleksów białkowych dla biologii strukturalnej. W tym artykule przedstawiamy prosty, ale bardzo wydajny system ekspresji wykorzystujący hodowane w zawiesinie komórki ssaków do oczyszczania kompleksów białkowych do badań strukturalnych.

Ekspresja białek rekombinowanych w biologii strukturalnej w komórkach zawiesinowych HEK 293F: nowatorskie i dostępne podejście

To jest szybki, efektywny kosztowo protokół produkcji wydzielanych, glikozylowanych białek ssaków i późniejszego jednoetapowego oczyszczania z wystarczającą wydajnością jednorodnego białka do krystalografii rentgenowskiej i innych badań biofizycznych.

Wydajna ekspresja komórek ssaków i jednoetapowe oczyszczanie zewnątrzkomórkowych glikoprotein do krystalizacji

Endopeptydaza prolinowo-prolinowa-1 (PPEP-1) jest wydzielaną metaloproazą i obiecującym celem leku od ludzkiego patogenu Clostridium difficile. Poniżej opisujemy wszystkie metody niezbędne do produkcji i określenia struktury tego białka.

Produkcja, krystalizacja i oznaczanie struktury C. difficile PPEP-1 metodą mikrosiewu i-SAD

Tutaj prezentujemy protokoły wykorzystania systemu ekspresji białek komórek owadów i bakulowirusa do produkcji dużych ilości białek wydzielanych przez rośliny do krystalizacji białek. Wektor ekspresyjny bakulowirusa został zmodyfikowany za pomocą GP67 lub peptydu sygnałowego hemoliny owadów w celu ekspresji wydzielania białek roślinnych w komórkach owadów.

Modyfikowanie wektorów ekspresyjnych bakulowirusa w celu wytwarzania wydzielanych białek roślinnych w komórkach owadów

Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

System wektorów ekspresyjnych bakulowirusa (BEVS) to solidna platforma do badania ekspresji i produkcji białkowych metylotransferaz argininowych (PRMT) do wykorzystania w badaniach biochemicznych, biofizycznych i strukturalnych. Miligramowe ilości materiału mogą być produkowane dla większości PRMT i innych białek będących przedmiotem zainteresowania, wymagających eukariotycznej platformy ekspresyjnej.

Produkcja rekombinowanych białek PRMT przy użyciu systemu wektorów ekspresyjnych bakulowirusa

Ten protokół opisuje konfigurację do krystalizacji transportera steroli ABCG5/G8. ABCG5/G8 jest odtwarzany w postaci wodoroceli w celu krystalizacji w kropli wiszącej. Protokół nie wymaga specjalistycznych materiałów ani podłoży, dzięki czemu jest dostępny i łatwy do adaptacji w każdym laboratorium w celu określenia struktury białka za pomocą krystalografii rentgenowskiej.

Krystalizacja ABCG5/G8 w lipidowym środowisku bicelle do krystalografii rentgenowskiej

Poznaj metodę ekspresji rekombinowanego białka z niepatogennych bakterii Bacillus cereus do badań biofizykochemicznych. Technika umożliwia krystalizację białek i analizę kinetyki enzymatycznej w standardowym laboratorium.

Rekombinowana ekspresja, krystalizacja i badania biofizyczne pirofosforylazy nukleotydowej konserwowanej przez Bacillus, BcMazG

Przeglądaj więcej filmów