Rekombinowana ekspresja, krystalizacja i badania biofizyczne pirofosforylazy nukleotydowej konserwowanej przez Bacillus, BcMazG

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie rekombinowanego białka z bakterii niepatogennych, aby ułatwić badania biofizyczne, chemiczne, takie jak krystalografia rentgenowska białek lub kinetyka enzymatyczna. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące przygotowania rekombinowanego białka będącego przedmiotem zainteresowania przy użyciu bakterii niepatogennych do wstępnej charakterystyki biofizycznej. Główną zaletą tej techniki jest to, że charakterystykę biofizyczną białka będącego przedmiotem zainteresowania można przeprowadzić w dowolnym laboratorium wyposażonym w powszechnie stosowane instrumenty, takie jak inkubatory do hodowli komórkowych i spektrofotometry.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować reakcję podwiązania zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Odpipetować trzy mikrolitry przygotowanej reakcji ligacji do probówki zawierającej 50 mikrolitrów chemicznie kompetentnych komórek alfa E. coli DH5. Za pomocą pipety delikatnie wymieszaj roztwór.

Zamrozić roztwór przez 30 minut. Następnie szok cieplny przez 45 sekund w temperaturze 42 stopni Celsjusza. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki LB i hoduj komórki, energicznie potrząsając z prędkością 250 obrotów na minutę, w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 minut.

Rozprowadź 100 mikrolitrów przekształconych komórek na płytce ślimakowej LB uzupełnionej 100 mikrogramami na mililitr kanamycyny. Inkubować przez 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Za pomocą sterylnej końcówki wybierz kolonie z talerza.

Hoduj komórki w trzech mililitrach uzupełnionej pożywki LB z energicznym wytrząsaniem z prędkością 250 obrotów na minutę w temperaturze 18 stopni Celsjusza przez 18 godzin. Następnie przygotuj DNA osocza i potwierdź sekwencję nukleotydów zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po ponownym przekształceniu szczepu E.coli BL21 wybierz kolonię za pomocą sterylnej końcówki i zaszczep 10 mililitrów pożywki LB zawierającej 150 mikrogramów na mililitr kanamycyny.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 godzin z energicznym wstrząsaniem z prędkością 250 obrotów na minutę. Następnie przenieś 10 mililitrów kultury przez noc do jednego litra pożywki LB i kanamycyny. Rosną w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie 0,7.

Następnie zanurz kulturę w lodowatej wodzie na 15 minut. Dodać IPTG do hodowli, tak aby końcowe stężenie wynosiło jeden milimol. Inkubować w temperaturze 18 stopni Celsjusza przez dodatkowe 16 do 18 godzin.

Następnie odwirować w temperaturze 5 000 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 50 mikrolitrach PBS zawierających 10 milimolowych imidazolów.

Następnie dwukrotnie poddaj komórki lizie na lodzie, jak opisano w protokole tekstowym. Wirować w temperaturze 25 000 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć lizat komórkowy. Następnie wymieszaj trzy mililitry kulek niklowych i 47 mililitrów PBS zawierających 10 milimolowych imidazolu w 50-mililitrowej stożkowej probówce.

Grawitacyjnie przepływa dodatkowy bufor, aby osadzić zrównoważone kulki w szklanej kolumnie chromatograficznej o wymiarach 2,5 na 10 centymetrów. Za pomocą pipety przenieść supernatant do kolumny. Inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny na kołowrotku z prędkością 20 obrotów na minutę.

Następnie pozwól supernatantowi spłynąć grawitacyjnie. Umyj kulki niklu trzy razy za pomocą 100 mililitrów PBS zawierających 10 milimolowych imidazolu do każdego prania. Następnie nałóż pięć mililitrów PBS zawierających 250 milimolowych imidazolu, aby wymyć białko RBC 1531.

Przeanalizuj 15 mikrolitrów elucji za pomocą strony SDS, jak opisano w protokole tekstowym. Pobrane frakcje należy odpipetować do probówki dializowej. Umieścić probówkę w zlewce zawierającej cztery litry buforu kompatybilnego z rozszczepianiem trombiny w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia za pomocą pipety przenieś frakcje do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Zmierz absorbancję przy 280 nanometrach, aby oszacować stężenie białka zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie przenieś 50 mikrolitrów białka RBC 1531 do kilku probówek.

Dodaj inną ilość trombiny do każdej probówki i inkubuj w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Po ustaleniu najmniejszej potrzebnej ilości trombiny dodaj 10 miligramów białka i 60 jednostek trombiny do 15-mililitrowej probówki. Inkubować w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez trzy godziny.

Następnie przenieś białko strawione trombiną do odśrodkowej rurki filtracyjnej. Odwirować w temperaturze 3 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zmniejszyć objętość do mniej niż pięciu mililitrów. Następnie należy nałożyć skoncentrowane białko na przygotowaną kolumnę chromatografii wykluczającej rozmiar.

Zbierz 60 frakcji elucji po 0,5 mililitra na probówkę. Uruchom 15 mikrolitrów każdej frakcji na 15% żelu SDS Page, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie połącz frakcje zawierające białko RBC 1531.

Aby rozpocząć, przenieś połączone frakcje do odśrodkowej rurki filtracyjnej. Wirować w temperaturze 3000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby skoncentrować białko do około 18,5 miligrama na mililitr. Następnie dodaj 50 mikrolitrów każdego roztworu do przesiewania krystalizacji do dołków 96-dołkowej płytki krystalizacyjnej.

Dodaj 0,5 mikrolitra stężonego roztworu białka na łóżku do siedzenia. Oddzielnie wymieszać roztwór białkowy z 0,5 mikrolitra roztworu studzienki. Przykryj płytkę przezroczystą folią samoprzylepną.

Inkubować w temperaturze 18 stopni Celsjusza i pozwolić na dyfuzję pary. Za pomocą mikroskopu świetlnego skanuj krople w powiększeniu od 20 do 40 razy, aby monitorować tworzenie się kryształów codziennie przez dwa do trzech tygodni. Po przygotowaniu substratów NTP dodaj każdy z nich do płytki 96-dołkowej.

Dodać 20 mikrogramów białka RBC 1531 do każdej studzienki za pomocą pipety do wymieszania. Przykryj płytkę pokrywką i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie przenieś płytkę do łaźni wodnej o temperaturze 70 stopni Celsjusza na 15 minut, aby zatrzymać reakcje katalityczne, w których pośredniczy RBC 1531.

Następnie dodaj jeden mikrolitr nieorganicznej pirofosfatazy S.cerevisiae do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie dodaj 16 mikrolitrów roztworu kwasu molibdenianowego do płytki reakcyjnej, aby uzyskać kolor.

Po 15 minutach odczytaj gęstość optyczną przy 690 nanometrach. W tym badaniu produkt białkowy genu B serious BC1531 został scharakteryzowany na poziomie molekularnym. Po oczyszczeniu metodą chromatografii powinowactwa do niklu przeprowadza się szlak trawienia trombinowego.

0,3 jednostki trombiny jest postrzegane jako najmniejsza ilość wymagana do całkowitego usunięcia znacznika powinowactwa z RBC 1531. Po strawieniu białko wolne od znaczników jest oczyszczane do czystości około 99% za pomocą chromatografii wykluczania wielkości. Następnie stan oligomeryczny szacuje się za pomocą chromatografii wykluczania wielkości.

Ponieważ RBC 1531 jest eluowany w ilości około 84 mililitrów, jego masę cząsteczkową szacuje się na 55 kilodaltonów. Obliczona masa cząsteczkowa monomeru wynosi około 13 kilodaltonów. Dlatego RBC 1531 składa się jako tetramer.

Następnie przeprowadza się przesiewanie krystalizacji przy użyciu metody dyfuzji par w pozycji siedzącej. Kryształy są widoczne po dwóch dniach z jednym molowym cytrynianem sodu i 20% glikolem polietylenowym 3 000 oraz z 0,1 molowym kakodylanem sodu i jednym molowym cytrynianem sodu. Następnie określa się aktywność NTPazy.

Nie widać widocznej zmiany koloru po dodaniu molibdenianu do reakcji hydrolizy, w której pośredniczy RBC 1531. Jednak po dodaniu pirofosfatazy obserwuje się, że kolor zmienia się na ciemnoniebieski. Gęstość optyczna przy 690 nanometrach i stężenie NTP są następnie analizowane przy użyciu regresji nieliniowej.

Określa się, że enzym RBC 1531 ma maksymalną prędkość na poziomie 0,75 i stałą Michaelisa wynoszącą 10 mikromolów. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby jak najszybciej przygotować próbki białek i odrzucić frakcje zawierające jakiekolwiek zanieczyszczenia, które utrudniają krystalizację białek lub wprowadzają błędy w testach enzymatycznych. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się enzymologią i innymi naukami o białkach do charakteryzowania interesujących białek za pomocą spektrofotometrów, które są zdobione w większości laboratoriów.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w ogólne idee przygotowania białek rekombinowanych, badań przesiewowych krystalizacji i kinetyki enzymatycznej, może być również zastosowana do biofizycznej analizy chemicznej dla innych interesujących nas białek. Nie zapomnij zachować ostrożności podczas pracy z białkami, ponieważ mogą one być bardzo niestabilne. Pożądane będą środki ostrożności, takie jak pozostawienie próbek nad lodem i przechowywanie w lodówce w temperaturze 80 stopni w celu długotrwałego przechowywania.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować rekombinowane białko z niepatogennych bakterii w celu uzyskania kryształów białka do określenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej oraz jak scharakteryzować aktywność enzymatyczną za pomocą metody kolorymetrycznej.