Rekombinowana ekspresja, krystalizacja i badania biofizyczne pirofosforylazy nukleotydowej konserwowanej przez Bacillus, BcMazG

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie białka rekombinowanego z bakterii niepatogennych w celu ułatwienia badań biofizykochemicznych, takich jak krystalografia rentgenowska białek czy kinetyka enzymatyczna. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące sposobu przygotowania interesującego białka rekombinowanego z wykorzystaniem bakterii niepatogennych do wstępnej charakterystyki biofizycznej. Główną zaletą tej techniki jest możliwość przeprowadzenia charakterystyki biofizycznej badanego białka w dowolnym laboratorium wyposażonym w powszechnie stosowane instrumenty, takie jak inkubatory do hodowli komórkowych i spektrofotometry.

Aby rozpocząć tę procedurę, przygotować reakcję ligacji zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Pipetować 3 µL przygotowanej reakcji ligacji do probówki zawierającej 50 µL chemicznie kompetentnych komórek E.coli DH5 alpha. Za pomocą pipety delikatnie wymieszać roztwór.

Schładzać roztwór w lodzie przez 30 minut. Następnie przeprowadzić szok termiczny przez 45 sekund w temperaturze 42 °C. Po tym etapie dodać 1 mL pożywki LB i inkubować komórki przy intensywnym mieszaniu z wytrząsaniem z prędkością 250 obr./min w temperaturze 37 °C przez 45 minut.

Nanieś 100 µL transformowanych komórek na płytkę z agarem LB z dodatkiem 100 µg/mL kanamycyny. Inkubuj przez 18 h w temperaturze 37 °C. Za pomocą sterylnego końcówki pobierz kolonie z płytki.

Hodować komórki w trzech mililitrach uzupełnionego medium LB przy intensywnym wytrząsaniu z prędkością 250 obrotów na minutę w temperaturze 18 stopni Celsjusza przez 18 godzin. Następnie przygotować plazmidowe DNA i potwierdzić sekwencję nukleotydową zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po ponownej transformacji szczepu E.coli BL21 wybrać kolonię za pomocą sterylnej końcówki i zaszczepić ją w 10 mililitrach medium LB zawierającego 150 mikrogramów na mililitr kanamycyny.

Inkubować w temperaturze 37°C przez 18 godzin przy intensywnym mieszaniu z prędkością 250 obr./min. Następnie przenieść 10 ml kultury nocnej do jednego litra pożywki LB z kanamycyną. Hodować w temperaturze 37°C aż do momentu, gdy gęstość optyczna przy 600 nm osiągnie wartość 0,7.

Następnie zanurz kulturę w lodowatej wodzie na 15 minut. Do kultury dodaj IPTG w taki sposób, aby stężenie końcowe wynosiło 1 mM. Inkubuj w temperaturze 18 °C przez kolejne 16 do 18 godzin.

Następnie odwiruj próbkę przy 5 000 ×g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usuń nadosad. Resuspenduj komórki w 50 µL PBS zawierającego 10 mM imidazolu.

Następnie poddać komórki dwukrotnej lizie na lodzie, zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole tekstowym. Wirować z prędkością 25 000 ×g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu oczyszczenia lizatu komórkowego. Następnie w 50 ml probówce stożkowej zmieszać 3 ml kulek niklowych oraz 47 ml PBS zawierającego 10 mM imidazolu.

Przepuść dodatkowy bufor grawitacyjnie, aby osadzić zrównoważone koraliki w szklanej kolumnie chromatograficznej o wymiarach 2,5 na 10 centymetrów. Za pomocą pipety przenieś nadsącz do kolumny. Inkubuj w temperaturze 4 °C przez dwie godziny na rotatorze przy prędkości 20 obr./min.

Następnie należy pozwolić na spływanie supernatantu siłą grawitacji. Koraliki niklowe należy przemyć trzykrotnie, używając do każdego płukania 100 mililitrów PBS zawierającego 10 milimolar imidazolu. Następnie należy nałożyć pięć mililitrów PBS zawierającego 250 milimolar imidazolu, aby eluować białko RBC 1531.

Przeanalizuj 15 µL eluatu za pomocą SDS-PAGE zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przenieś zebrane frakcje pipetą do probówki dializacyjnej. Umieść probówkę w zlewce zawierającej cztery litry buforu kompatybilnego z cięciem trombiną w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc.

Następnego dnia za pomocą pipety przenieś frakcje do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Zmierz absorbancję przy 280 nm, aby oszacować stężenie białka zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie przenieś 50 µl białka RBC 1531 do kilku probówek.

Do każdej probówki dodać różną ilość trombiny i inkubować w temperaturze 20 °C przez trzy godziny. Po określeniu najmniejszej potrzebnej ilości trombiny, dodać 10 mg białka oraz 60 j. trombiny do probówki o pojemności 15 ml. Inkubować w temperaturze 20 °C przez trzy godziny.

Następnie przenieś białko trawione trombiną do probówki z filtrem wirowym. Wiruj z prędkością 3 000 ×g w temperaturze 4 °C, aby zredukować objętość do mniej niż 5 mL. Po tym etapie nanieś skoncentrowane białko na przygotowaną kolumnę do chromatografii wykluczania cząsteczek.

Zbierz 60 frakcji elucji po 0,5 ml do każdej probówki. Nanieś 15 µl każdej frakcji na żel SDS-PAGE 15%, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie połącz frakcje zawierające białko RBC 1531.

Aby rozpocząć, należy przenieść połączone frakcje do probówki z filtrem do wirowania. Wirować przy 3,000 ×g w temperaturze 4 °C, aby zagęścić białko do stężenia około 18.5 mg/mL. Następnie dodać 50 µL każdego roztworu z ekraningu krystalizacji do dołków 96-dołkowej płytki do krystalizacji metodą wiszącej kropli.

Nanieś 0,5 µL stężonego roztworu białka na podstawkę. Oddzielnie zmieszaj roztwór białka z 0,5 µL roztworu do studzienek. Przykryj płytkę przezroczystą folią przylepną.

Inkubować w temperaturze 18°C, umożliwiając dyfuzję par. Za pomocą mikroskopu świetlnego codziennie skanować krople przy powiększeniu od 20 do 40x przez dwa do trzech tygodni, aby monitorować proces krystalizacji. Po przygotowaniu substratów NTP przenieść każdy z nich do płytki 96-dołkowej.

Do każdej studzienki nanieś 20 µg białka RBC 1531, mieszając za pomocą pipety. Przykryj płytkę pokrywą i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Następnie przenieś płytkę do łaźni wodnej o temperaturze 70 °C na 15 minut, aby zatrzymać reakcje katalityczne pośredniczone przez RBC 1531.

Następnie do każdej dołki należy dodać jeden mikrolitr nieorganicznej pirofosfatazy z S.cerevisiae. Inkubować w temperaturze 20 °C przez 30 minut. Następnie do płytki reakcyjnej dodać 16 mikrolitrów roztworu kwasu molibdenowego w celu wywołania zabarwienia.

Po 15 minutach odczytano gęstość optyczną przy 690 nanometrach. W niniejszym badaniu produkt białkowy genu BC1531 z serii B został scharakteryzowany na poziomie molekularnym. Po oczyszczaniu za pomocą chromatografii powinowactwa do niklu przeprowadzono próbne trawienie trombiną.

Stwierdzono, że 0,3 jednostek trombiny to najmniejsza ilość wymagana do całkowitego usunięcia znacznika powinowactwa z RBC 1531. Po trawieniu białko pozbawione znacznika jest oczyszczane do poziomu około 99% czystości przy użyciu chromatografii wykluczania cząsteczkowego. Następnie, za pomocą chromatografii wykluczania cząsteczkowego, szacowany jest stan oligomeryczny.

Ponieważ RBC 1531 eluje przy objętości około 84 ml, jego masa cząsteczkowa została oszacowana na 55 kDa. Obliczona masa cząsteczkowa monomeru wynosi około 13 kDa. Zatem RBC 1531 tworzy tetramer.

Następnie przeprowadzono przesiew krystalizacji z wykorzystaniem metody dyfuzji pary w kropli osiadłej. Kryształy zaobserwowano po dwóch dniach w warunkach: 1 M cytrynianu sodu i 20% glikolu polietylenowego 3 000, a także 0,1 M kakodylanu sodu i 1 M cytrynianu sodu. Po tym etapie określono aktywność NTPazy.

Po dodaniu molibdanu do reakcji hydrolizy zapośredniczonej przez RBC 1531 nie obserwuje się widocznej zmiany barwy. Jednakże po dodaniu pirofosfatazy kolor zmienia się na ciemnoniebieski. Następnie analizuje się gęstość optyczną przy 690 nanometrach oraz stężenie NTP przy użyciu regresji nieliniowej.

Ustalono, że enzym RBC 1531 charakteryzuje się maksymalną prędkością na poziomie 0,75 oraz stałą Michaelisa wynoszącą 10 µM. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest niezwłoczne przygotowanie próbek białek oraz odrzucenie frakcji zawierających jakiekolwiek zanieczyszczenia, które utrudniają krystalizację białek lub wprowadzają błędy w testach enzymatycznych. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie enzymologii oraz innych nauk o białkach do charakteryzowania interesujących białek przy użyciu spektrofotometrów, które znajdują się w większości laboratoriów.

Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat ogólnych zasad przygotowania białek rekombinowanych, przesiewania krystalizacji oraz kinetyki enzymatycznej, można ją również zastosować w biofizycznej analizie chemicznej innych białek będących przedmiotem zainteresowania. Należy pamiętać o zachowaniu ostrożności podczas pracy z białkami, ponieważ mogą być one niezwykle niestabilne. Zaleca się stosowanie środków ostrożności, takich jak przechowywanie próbek na lodzie oraz mrożenie w temperaturze -80 °C w celu długoterminowego przechowywania.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować białko rekombinowane z bakterii niepatogennych w celu uzyskania kryształów białka do wyznaczenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej oraz jak scharakteryzować aktywność enzymatyczną przy użyciu metody kolorymetrycznej.