2.8: Rozdzielanie mieszanin przez wytrącanie

1. Opady CaCO₃

1. Przygotować 5 ml 1 M CaCl₂.
2. Przygotuj 5 ml 1 m Na₂CO₃.
3. Do małej probówki wirówkowej (1,5 ml) dodaj 750 μl CaCl₂ i 750 μl Na₂CO₃.
4. Odczekaj 2 minuty, aż nastąpi reakcja. Roztwór powinien stać się mętny.
5. Odwirować mieszaninę o sile 10 000 × g przez 5 minut.
6. Zdekantować supernatant.
7. Dodaj 1 ml zimnej wody do granulki.
8. Zawiesić pelet, mieszając w mieszalniku wirowym przez 10 s.
9. Odwirować mieszaninę o sile 10 000 × g przez 5 minut.
10. Zdekantować supernatant.

2. Wytrącanie białek mleka

1. Wlej mleko do zlewki i dodaj mieszadło.
2. Delikatnie podgrzej mleko do temperatury 40 °C na mieszającej płycie grzejnej. Nie podgrzewać powyżej 40 °C.
3. Przygotuj 15% (v/v) kwasu octowego, mieszając 7,5 ml kwasu octowego i rozcieńczając w wystarczającej ilości wody, aby osiągnąć 50 ml.
4. Zanurz elektrodę pH-metru w ciepłym mleku i monitoruj pH.
5. Dodawaj kwas octowy kroplami do mleka, aż do osiągnięcia pH 4,6.
6. Filtracja mleka
   1. Złóż flet na kawałku bibuły filtracyjnej i umieść go w lejku.
   2. Umieść lejek w kolbie i wlej do niego zakwaszony roztwór mleka.
   3. Podczas nalewania roztworu bibuła filtracyjna może się zatkać. Za pomocą mieszadła od czasu do czasu mieszaj roztwór i bibułę filtracyjną, aby się odblokować. Jeśli nie poprawi to przepływu roztworu, wymień bibułę filtracyjną.
   4. Umieść nową bibułę filtracyjną na blacie stołu i przenieś jak najwięcej mokrego ciała stałego na nową bibułę filtracyjną. Powinno to wchłonąć więcej wody z ciała stałego.
   5. Jeśli nowa bibuła filtracyjna stanie się zbyt mokra, kontynuuj jej wymianę, aż na bibule filtracyjnej pojawi się minimalna ilość wilgoci. Lekko dociśnij, aby w razie potrzeby wchłonąć więcej wody.
   6. Weź wysuszoną substancję stałą i ponownie zawiesić w około 70% etanolu. Przefiltruj ciało stałe ponownie, wykonując kroki od 2.6.1 do 2.6.5.
7. Wirowanie mleka (jako alternatywa dla filtracji)
   1. Przenieść 50 ml porcji mieszaniny do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.
   2. Odwirować przy 4 500 × g przez 10 minut, a następnie zdekantować supernatant.
   3. Dodaj 50 ml 70% etanolu do granulatu.
   4. Za pomocą mieszadła ponownie zawiesić granulki w etanolu.
   5. Odwirować tę zawiesinę zgodnie z krokiem 2.7.2.
8. Ponownie zawiesić granulkę w buforze do dalszej analizy, takim jak SDS-PAGE, w przeciwnym razie przechowywać ją w temperaturze 4°C.

3. Rekrystalizacja KCl

1. Odważyć 50 g KCl w kolbie Erlenmeyera i dodać 100 ml wody
2. Podgrzej mieszaninę, aż woda się zagotuje. Upewnij się, że cały proszek KCl jest rozpuszczony. Niektóre zanieczyszczenia mogą nie rozpuszczać się w wodzie.
3. Podgrzej kolejną (pustą) kolbę Erlenmeyera wraz z mieszaniną i utrzymuj ją w cieple.
4. Umieścić lejek z bibułą filtracyjną w ciepłej, pustej kolbie.
5. Przelej roztwór przez bibułę filtracyjną, aby usunąć nierozpuszczone zanieczyszczenia. Kolba odbiorcza jest utrzymywana w cieple, aby upewnić się, że podczas filtracji nie wystąpią żadne zmiany temperatury, w przeciwnym razie utworzy się surowy osad. Jeśli tak się stanie, ponownie podgrzej mieszaninę, aż cały osad się rozpuści.
6. Zdjąć kolbę z roztworem z ognia.
7. Przechowuj go w chłodnym miejscu w pomieszczeniu i pozwól mu powoli ostygnąć przez około 30 minut lub do momentu, gdy przestanie być ciepły w dotyku.
8. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej umieścić kolbę w łaźni lodowej, aby jeszcze bardziej obniżyć temperaturę. Alternatywnie można zostawić kolbę w lodówce lub pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze 4 °C.
9. Kryształy można zbierać przez filtrowanie, jak w krokach 3.4–3.5 (użyć kolby i lejka w temperaturze pokojowej).

Wytrącanie to technika stosowana do oddzielania mieszaniny na podstawie rozpuszczalności jej składników. Rozpuszczalność związku zależy od siły jonowej roztworu, jego pH i temperatury. Manipulowanie tymi czynnikami może spowodować, że związek stanie się nierozpuszczalnym ciałem stałym i wypadnie z roztworu. Nazywa się to opadami.

Nierozpuszczalne ciało stałe, zwane osadem, początkowo tworzy zawiesinę, co oznacza, że jest dobrze zdyspergowane w roztworze. Osad zazwyczaj aglomeruje, a następnie jest oddzielany od cieczy przez sedymentację, wirowanie lub filtrację. W tym filmie przedstawimy kilka metod rozdzielania związków za pomocą wytrącania oraz zademonstrujemy procedurę w laboratorium.

Rozpuszczony związek można wytrącić z roztworu poprzez wprowadzenie przeciwjonu. Na przykład srebro może zostać wytrącone z roztworu w reakcji między azotanem srebra a chlorkiem sodu. Jon azotanowy jest zastępowany przez przeciwjon, chlorek, w wyniku czego powstaje stały chlorek srebra.

Zwiększenie stężenia soli w roztworze może również wywołać wytrącanie się. Ta technika, zwana salting-out, jest powszechna w izolacji białek. Przy wysokim stężeniu soli cząsteczki wody są bardziej przyciągane do rozpuszczonej soli, pozostawiając mniej do ustabilizowania białka. W rezultacie cząsteczki białka agregują się i tworzą ciało stałe.

Opady mogą być również spowodowane zmianą pH. Przy wysokim i niskim pH białko jest ładowane i przyciągane do roztworu polarnego. W pewnym momencie ładunek netto związku spada do zera. To jest punkt izoelektryczny lub pI. Związek nie jest w stanie oddziaływać z roztworem polarnym, powodując jego agregację i wytrącanie.

Temperatura wpływa również na rozpuszczalność, ponieważ wyższa temperatura zwiększa rozpuszczalność ciał stałych. Obniżając temperaturę, rozpuszczone związki mogą ponownie zestalać się. Szybkość tworzenia się ciał stałych decyduje o względnej czystości.

Poniższe eksperymenty wykażą wytrącanie kazeiny białkowej z mleka za pomocą pH i dalszą separację metodami filtracji i wirowania.

Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj 250 ml mleka do zlewki z mieszadłem. Delikatnie podgrzej mleko do 40 ? C na mieszającej płycie grzejnej. Zanurz pH-metr w ciepłym mleku i monitoruj pH. Dodawać kwas octowy kroplami do mleka, aż pH osiągnie punkt izoelektryczny kazeiny, 4.6. Nierozpuszczalne białka mleka lub skrzep wytrącają się z roztworu w punkcie izoelektrycznym. Usuń skrzep z roztworu przez filtrację. Jeśli bibuła filtracyjna zostanie zatkana, wymieszaj szpatułką, aby ułatwić przepływ roztworu. Jeśli to nie poprawi filtracji, wymień bibułę filtracyjną. Przenieś mokre ciało stałe z zatkanej bibuły filtracyjnej na nową bibułę filtracyjną. Powinno to wchłonąć więcej płynu lub serwatki z ciała stałego. Kontynuuj wymianę bibuły filtracyjnej, aż wilgotność będzie minimalna. Lekkie naciśnięcie ciał stałych może pomóc bibułie filtracyjnej wchłonąć więcej serwatki.

Ponownie zawiesić suche masy mleka w 70% etanolu, aby wypłukać fosfolipidy ze skrzepu, a następnie powtórzyć proces filtracji. Alternatywą dla filtracji może być również oddzielanie ciał stałych białek za pomocą wirowania. Odwirować 50 ml porcji mieszanki mleka i zdekantować supernatant. Ponownie zawiesić granulat w 50 ml 70% etanolu, aby usunąć fosfolipidy ze skrzepu i powtórzyć proces wirowania.

Stałe białka mleka mogą być następnie przechowywane lub ponownie zawieszone w innym roztworze do dalszej analizy, takim jak SDS-PAGE. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz nasz film na temat tej techniki. Z analizy SDS-PAGE wynika, że wytrącanie się umożliwiło usunięcie większości zanieczyszczeń z serwatki. Cała kazeina została znaleziona w granulce, podczas gdy nie znaleziono jej w supernatancie.

Wytrącanie jest powszechnie stosowaną techniką, którą można zastosować do oddzielania różnych mieszanin lub roztworów.

Związki można wytrącić z roztworu za pomocą przeciwjonu, jak w tym przykładzie wytrącania węglanu wapnia.

Chlorek wapnia i węglan sodu są rozpuszczalne w fazie wodnej.

Po zmieszaniu wapń i węglan tworzą nierozpuszczalne ciało stałe, które można oddzielić przez odwirowanie. Aby uzyskać więcej informacji na ten temat, zobacz nasz film edukacyjny na temat zasad rozpuszczalności.

Wytrącanie może być wykorzystywane do przygotowania ciał stałych w skali nano, które znajdują się w szerokim zakresie zastosowań w nanotechnologii. W tym przykładzie nasiona w skali nano zostały wykorzystane do kontrolowania wzrostu nanokryształów.

Prekursory podgrzano, przereagowały z selenkiem trioktylofosfiny, a następnie szybko schłodziły. Do schłodzonego roztworu dodano metanol w celu wytrącenia ciał stałych. Kryształy zostały następnie odzyskane przez odwirowanie, a struktura krystaliczna poddana analizie za pomocą dyfrakcji rentgenowskiej.

Wytrącanie może być również wykorzystywane do przygotowania ligandów polimerowych do zastosowań związanych z dostarczaniem leków. W tym przykładzie ligand jest syntetyzowany i sprzężany z platyną w celu zastosowania jako terapia przeciwnowotworowa. Najpierw ligand zsyntetyzowano przy użyciu reakcji sprzęgania amidowego. Wytrącał się w miarę postępu reakcji. Następnie został odzyskany za pomocą filtracji.

Ciało stałe zostało następnie oczyszczone za pomocą rekrystalizacji i ponownie przefiltrowane. Ligand został następnie skompleksowany ze związkiem platyny, wysuszony, a następnie oczyszczony za pomocą frakcyjnego wytrącania z wody z acetonem. Sprzężenie platyny potwierdzono za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego. Związki te można następnie badać pod kątem ich skuteczności i skutków ubocznych jako środków przeciwnowotworowych.

Właśnie obejrzeli Państwo wprowadzenie JoVE do rozdzielania mieszanin za pomocą wytrącania. Powinieneś teraz zrozumieć różne metody wytrącania i jak przeprowadzać te eksperymenty w laboratorium.

Dzięki za oglądanie!