Przygotowanie i charakterystyka nowych nanocząstek naśladujących HDL do enkapsulacji czynnika wzrostu nerwów

Ogólnym celem niniejszego artykułu jest przedstawienie metod przygotowania i charakterystyki nanocząstek naśladujących lipoprotein o wysokiej gęstości, obciążonych czynnikiem wzrostu nerwów. Do przygotowania standardowych nanocząstek naśladujących lipoprotein o wysokiej gęstości zastosowano prostą homogenizację. Procedura ta jest prosta i skalowalna.

Ponadto nanocząsteczka znacznie poprawiła wydajność enkapsulacji, w tym również w przypadku NGF oraz APOA1 w nanocząsteczkach. Pokonano różne trudności związane z charakterystyką nanocząsteczki, w tym oddzielenie niezaładowanego NGF od nanocząsteczek NGF, przeprowadzenie wiarygodnych badań promienia in vitro oraz ocenę biodostępności nanocząsteczek NGF. W celu rozpoczęcia, wymieszaj 10 µL NGF z 10 µL protaminy USP w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL i pozostaw na 10 minut w temperaturze pokojowej w celu utworzenia kompleksu.

Następnie do szklanej fiolki dodaj 59 µL fosfatydylocholiny i 11 µL sfingomieliny. Dodaj również 4 µL fosfatydyloseryny, 15 µL oleinianu cholesterylu oraz 45 µL bursztynianu tokoferylu z glikolem polietylenowym. Wymieszaj i odparuj etanol pod delikatnym strumieniem azotu przez około pięć minut.

Wszystkie substancje pomocnicze powinny utworzyć cienką, tłustą warstwę na dnie szklanej fiolki. Do fiolki należy dodać 1 mL wody ultrapure i homogenizować przy 9 500 rpm przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby utworzyć prototypowe nanocząstki (NPs). Następnie do prototypowych NPs należy dodać przygotowany kompleks.

Inkubować zawiesinę w temperaturze 37 °C przez 30 minut przy mieszaniu, używając małego mieszadełka magnetycznego w fiolce szklanej. Schłodzić NP, mieszając w temperaturze pokojowej przez kolejne 30 minut. Po schłodzeniu dodać 106 µL apolipoproteiny A-1 i mieszać w temperaturze pokojowej przez noc, aby utworzyć końcowe NP naśladujące HDL z NGF.

Zmierz wielkość cząstek i potencjał zeta za pomocą analizatora cząstek zgodnie z instrukcjami producenta. Do oddzielenia niewiązanego NGF od nanocząstek naśladujących HDL z NGF oraz do oznaczenia wydajności enkapsulacji NGF wykorzystuje się kolumnę do chromatografii żelowej z sieciowanym żelem. W celu przygotowania kolumny przenieś 15 ml zawiesiny sepharose 4B CL do zlewki o pojemności 50 ml.

Wymieszać zawiesinę kulek i przelać jej część do kolumny. Delikatnie opukać kolumnę, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Pozostawić rozpuszczalnik do odpłynięcia i odczekać kilka minut, aż kulki osiądą.

Kontynuuj dodawanie pozostałej zawiesiny. Przepłucz wewnętrzną ściankę kolumny, aby oczyścić koraliki. Odcedź rozpuszczalnik, aż jego poziom znajdzie się nieco powyżej górnej krawędzi fazy stacjonarnej.

Następnie należy wypłukać i przygotować kolumnę przy użyciu 20 ml 1X soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Aby zmierzyć wydajność uwięzienia NGF, na kolumnę należy nałożyć 200 µl NPs naśladujących HDL z NGF i przeprowadzić elucję za pomocą 1X PBS. Podobnie jak poprzednio, należy zebrać łącznie 12 frakcji po 1 ml każda.

Przygotuj osiem rurek dializacyjnych zgodnie z instrukcją producenta. Do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml dodaj 30 ml medium uwalniającego. Następnie podgrzej je do 37 °C w inkubatorze wytrząsowym przy prędkości wytrząsania 135 rpm.

Zamknąć probówkę dializacyjną i umieścić ją w medium uwalniającym. Szybko pobrać 100 µL medium uwalniającego spoza probówki dializacyjnej jako próbkę dla czasu zero. Natychmiast umieścić próbkę w temperaturze -20 °C do późniejszej analizy.

Dodaj 100 µL świeżego medium uwalniającego do probówki wirówkowej, aby zastąpić pobraną próbkę. Następnie uruchom stoper. Po 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 i 72 godzinach pobierz 100 µL medium uwalniającego i zastąp je 100 µL świeżego medium.

Pobrane próbki natychmiast umieścić w temperaturze -20 °C w celu późniejszej analizy. Po trzechminutowej homogenizacji uzyskano spójne rozmiary cząstek dla prototypowych nanocząsteczek. Finalne nanocząsteczki NGF miały rozmiar cząstek 170 nm z wąskim i monodyspersyjnym rozkładem wielkości.

Niezaładowany NGF i nanocząsteczki zostały całkowicie rozdzielone na kolumnie do filtracji żelowej. Nanocząsteczki wypłukano w frakcjach od drugiej do czwartej. Pomiar ELISA wykazał, że wolny NGF został wypłukany w frakcjach od 7 do 10.

Obliczona wydajność enkapsulacji NGF wyniosła około 66%. Przedstawiono tutaj uwalnianie nanocząsteczek NGF in vitro. Po dodaniu PBS i BSA do medium uwalniającego, wolny NGF przeniknął przez membranę dializacyjną z odzyskiem przekraczającym 85%. Z kolei nanocząsteczki NGF wykazały profil powolnego uwalniania, przy czym w ciągu 72 godzin z nanocząsteczek uwolniło się około 10% NGF. Nanocząsteczki NGF stymulowały wzrost neurytów w komórkach PC12 w stopniu podobnym do wolnego NGF.

Wzrost neurytów był wyraźnie widoczny pod mikroskopem dla obu grup przy dawce 50 ng/mL. Nanocząsteczki NGF znacznie zwiększyły stężenie w osoczu i zmniejszyły wychwyt NGF w wątrobie, nerkach i śledzionie myszy. Nanocząsteczki naśladujące HDL wspomagały NGF, zapewniając długi okres półtrwania i stabilność in vivo.

Po opanowaniu techniki monodyspersyjne nanocząstki mogą zostać przygotowane w ciągu trzech minut przy użyciu metody homogenizacji, pod warunkiem jej prawidłowego przeprowadzenia. Podczas realizacji tej procedury należy pamiętać o zastosowaniu łagodnego strumienia azotu w celu odparowania rozpuszczalnika oraz upewnić się, że po homogenizacji na ściankach naczynia nie pozostały żadne osady lipidowe. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać wiedzę na temat przygotowania nanocząstek naśladujących HDL przy użyciu metody homogenizacji oraz sposobu charakterystyki nanocząstek obciążonych NGF.