Name: Przygotowanie i charakterystyka nowych nanocząstek naśladujących HDL do enkapsulacji czynnika wzrostu nerwów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Poznaj metodę przygotowania nanocząstek naśladujących HDL z enkapsulacją czynnika wzrostu nerwów. Prosta homogenizacja zwiększa wydajność wiązania NGF i APOA1, umożliwiając skalowalne zastosowania terapeutyczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH R03 NS087322-01 do Dong, X.

UWAGA: Badania na zwierzętach zawarte we wszystkich procedurach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania w Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Północnego Teksasu.
1. Przygotowanie nanocząstek naśladujących HDL NGF
<ol>
	<li>Rozpuścić substancje pomocnicze, fosfatydylocholinę (PC), sfingomielinę (SM), fosfatydyloserynę (PS), oleinian cholesterolu (CO) i bursztynian glikolu polietylenowego D-α-tokoferylu (TPGS), w etanolu w celu przygotowania roztworów podstawowych o stężeniu 1 mg/ml. 
	UWAGA: Roztwory podstawowe podzielono na porcje i przechowywano w temperaturze -20 °C. Oleinian cholesterolu był przechowywany w ciemnych butelkach. Roztwory podstawowe PC, SM, PS i CO były stabilne odpowiednio do 6, 3, 12 i 12 miesięcy w temperaturze -20 °C. Roztwór TPGS był stabilny przez co najmniej 12 miesięcy w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Wymieszaj 10 μl NGF (1 mg/ml w wodzie) z 10 μl protaminy USP (1 mg/ml w wodzie) w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i odstaw na 10 minut w temperaturze pokojowej, aby utworzyć kompleks. 
	UWAGA: Roztwory podstawowe NGF i protaminy podawano na porcje i przechowywano w temperaturze -20 °C. Nie zaleca się wielokrotnego zamrażania i rozmrażania w przypadku roztworu NGF.</li>
	<li>Do szklanej fiolki dodać 59 μl PC, 11 μl SM, 4 μl PS, 15 μl CO i 45 μl TPGS. Wymieszać i odparować etanol pod delikatnym strumieniem azotu przez około 5 minut; Wszystkie substancje pomocnicze powinny tworzyć oleisty, cienki film na dnie szklanej fiolki.</li>
	<li>Dodać 1 ml ultraczystej (typu 1) wody do fiolki i homogenizować przy 9 500 obr./min (8 600 x g) przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby utworzyć prototypowe nanocząsteczki.</li>
	<li>Dodać kompleks przygotowany w kroku 1.2 do prototypowych nanocząsteczek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, mieszając, używając małego pręta mieszającego w szklanej fiolce.
	<ol>
		<li>Schłodzić NP, mieszając w temperaturze pokojowej przez kolejne 30 minut. Po ostygnięciu dodaj 106 μl Apo A-I (1,49 mg / ml) i mieszaj w temperaturze pokojowej przez noc, aby utworzyć końcowe NP naśladujące HDL NGF.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Charakterystyka nanocząstek naśladujących HDL NGF
<ol>
	<li>Zmierz wielkość cząstek i potencjał zeta za pomocą analizatora cząstek (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Użyj usieciowanej kolumny chromatografii filtracyjnej z żelem agarozowym, aby oddzielić nieobciążony NGF od nanocząsteczek naśladujących HDL NGF i określić skuteczność uwięzienia NGF.
	<ol>
		<li>W celu przygotowania kolumny przenieść 15 ml zawiesiny Sepharose 4B-CL do zlewki o pojemności 50 ml. Wymieszaj zawiesinę z koralików za pomocą szklanego pręta i wlej trochę do kolumny (30 cm długości × 1 cm średnicy, z frytą szklaną na dole). Delikatnie dotknij kolumny, aby pozbyć się bąbelków. Pozwól rozpuszczalnikowi spłynąć, a kulki osiądą na kilka minut.</li>
		<li>Kontynuuj dodawanie pozostałego zawieszenia. Opłucz wewnętrzną ścianę kolumny, aby wyczyścić koraliki. Opróżnij rozpuszczalnik do momentu, gdy poziom rozpuszczalnika znajdzie się nieco powyżej górnej krawędzi fazy stacjonarnej. Przemyć i kondycjonować kolumnę 20 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, zawierającej 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4 i 2 mM KH2PO4).</li>
		<li>Aby oznaczyć frakcje zawierające nieobciążony NGF, należy załadować 200 μl roztworu NGF (10 μg/ml) na żelową kolumnę filtracyjną (25 cm długości x 1 cm średnicy) i eluować 1x PBS.</li>
		<li>Zbierz w sumie 12 frakcji (1 ml na każdą frakcję) i zmierz stężenie NGF w każdej frakcji za pomocą zestawu Sandwich ELISA dla NGF.</li>
		<li>Wykrywanie NGF od frakcji od 6 do 10 za pomocą zestawu Sandwich ELISA. Uzyskać chromatogram nieobciążonego NGF na kolumnie. Przemyć kolumnę 20 ml PBS.</li>
		<li>Aby określić frakcje zawierające nanocząsteczki naśladujące NGF HDL, należy załadować 200 μl nanocząsteczek na kolumnę i eluować 1x PBS. Zbierz w sumie 12 frakcji (1 ml dla każdej frakcji) i zmierz intensywność cząstek w każdej frakcji za pomocą analizatora wielkości cząstek. Wykrywanie nanocząsteczek NGF od frakcji 2 do 4, 
		UWAGA: Intensywność jest parametrem mierzonym przez analizator cząstek, który mówi, ile nanocząstek może znajdować się w roztworze testowym. Im więcej nanocząsteczek znajduje się w roztworze, tym wyższa jest intensywność. Dzięki takiemu podejściu możemy potwierdzić, że kolumna może oddzielać NP NGF od nieobciążonego NGF.</li>
		<li>Aby zmierzyć skuteczność uwięzienia NGF, załaduj 200 μl nanocząsteczek naśladujących NGF HDL na kolumnę i eluuj 1x PBS. Zbierz w sumie 12 frakcji (1 ml na każdą frakcję).</li>
		<li>Zmierz stężenie niezaładowanego NGF od frakcji 6 do 10 za pomocą zestawu Sandwich ELISA.</li>
		<li>Dodać ilości NGF zmierzone od frakcji 6 do 10 razem jako nieobciążony NGF i obliczyć skuteczność uwięzienia NGF, korzystając z następującego równania: 
		%EE = (1 - niezaładowany NGF/całkowity NGF dodany do NP) x 100% Równanie (1)</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Uwalnianie in vitro nanocząstek naśladujących HDL NGF
<ol>
	<li>Badaj równolegle wolne NGF (10 μg / ml w wodzie; n = 4) i nanocząsteczki naśladujące HDL NGF (10 μg / ml; n = 4).</li>
	<li>Poddać wstępnej obróbce 8 probówek dializacyjnych (granica masy cząsteczkowej: 300 kDa), postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przygotować 5% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w PBS jako pożywkę antyadhezyjną. Dodać 30 ml pożywki antyadhezyjnej do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i podgrzać ją do temperatury 37 °C w wytrząsarce o prędkości wytrząsania 135 obr./min. Umieść kolejne 50 ml pożywki antyadhezyjnej w wytrząsarce w celu wymiany.</li>
	<li>Dodać 400 μl pożywki antyadhezyjnej do rurki dializacyjnej i szybko dodać 200 μl badanej próbki, aby uzyskać objętość wystarczającą do dializy.</li>
	<li>Zamknąć probówkę i szybko umieścić rurkę dializacyjną w pożywce antyadhezyjnej (probówce wirówkowej). Szybko pobrać 100 μl pożywki antyadhezyjnej z zewnętrznej rurki dializacyjnej jako próbkę dla czasu 0. Natychmiast umieścić próbkę w temperaturze -20 °C do późniejszej analizy. Dodać 100 μl świeżej pożywki o świeżym uwalnianiu do probówki wirówkowej w celu zastąpienia pobranej próbki. Uruchom minutnik.</li>
	<li>Po 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 i 72 godzinach pobrać 100 μl pożywki antyadhezyjnej i zastąpić ją 100 μl świeżej pożywki. Pobrane próbki należy natychmiast umieścić w temperaturze -20 °C w celu późniejszej analizy.</li>
	<li>Po 72 godzinach wyjąć wszystkie próbki o temperaturze od -20 °C i rozmrozić je w temperaturze pokojowej. Zmierzyć stężenia NGF w uwalnianych próbkach za pomocą zestawu Sandwich ELISA.</li>
</ol>
4. Bioaktywność nanocząstek naśladujących HDL NGF (badanie wzrostu neurytu)
<ol>
	<li>Hodowla komórek PC12 w pożywce RPMI-1640 uzupełniona 10% inaktywowaną termicznie surowicą końską, 5% płodową surowicą bydlęcą, 100 μg/ml streptomycyny i 100 jednostek/ml penicyliny. Utrzymuj komórki w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 .</li>
	<li>Gdy komórki osiągną ~70-80% konfluencji, usuń pożywkę hodowlaną i umyj komórki 1x PBS (około 2 ml na 10 cm2 powierzchni hodowli). Usuń roztwór myjący. Trypsynizować komórki, dodając 0,25% roztwór trypsyny-EDTA (0,25% trypsyny i 1 mM EDTA; 0,5 ml na 10cm2 powierzchni hodowli) do kolby i inkubować w temperaturze 37 °C aż do odłączenia większości komórek.</li>
	<li>Dodać dwie objętości pożywki hodowlanej i wirować w temperaturze 180 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml pożywki hodowlanej. Przefiltruj komórki przez igłę o gramaturze 22 G, 1/2 cala, aby rozbić skupiska komórek.</li>
	<li>Podzielić komórki w stosunku 1:3 do nowej kolby do hodowli komórkowych. Po inkubacji przez noc usuń nieprzyłączone komórki PC12. Pozwól przyczepionym komórkom pozostać do dalszego wzrostu.</li>
	<li>Powtórz tę procedurę dla 3 pasaży, aby wybrać subkulturę PC12, która ma silne właściwości adhezyjne. Wstępnie pokryj 6-dołkową płytkę 800 μl/dołek kolagenu typu I z ogona szczura (100 μg/ml).</li>
	<li>Trypsynizuj wybrane komórki PC12 zgodnie z opisem w kroku 4.2 i przefiltruj je przez igłę 22 G, 1/2 cala, aby rozbić skupiska komórek. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Wysiewaj komórki przez noc o gęstości 10 000 komórek/dołek na wstępnie powlekanej 6-dołkowej płytce w kroku 4.5, aby umożliwić komórkom przyczepienie się do płytki.</li>
	<li>Rozcieńczyć wolny NGF (10 μg/ml) i nanocząsteczki naśladujące HDL NGF (10 μg/ml) za pomocą pożywki hodowlanej (opisanej w kroku 4.1) w celu przygotowania stężeń 0,5, 1, 5, 10, 50 i 100 ng/ml. Usuń 2 ml pożywki z każdej studzienki i zastąp 2 ml rozcieńczonego wolnego NGF lub nanocząsteczek naśladujących NGF HDL. Hodowla przez 4 dni.</li>
	<li>W 4. dniu należy zmienić pożywkę na świeżą (opisaną w kroku 4.1) zawierającą odpowiednią dawkę pokarmową i kontynuować leczenie przez kolejne 3 dni.</li>
	<li>W dniu 7 wizualizuj komórki za pomocą mikroskopu światła odwróconego i wyobraz sobie każdą studzienkę w losowych miejscach pod 10-krotnym powiększeniem.</li>
</ol>
5. Biodystrybucja nanocząstek naśladujących HDL NGF
<ol>
	<li>Użyj dorosłych myszy BALB/c (samce, 25-30 g), aby przetestować rozmieszczenie tkanek NP NGF. Losowo podziel myszy na trzy grupy po 3 myszy na grupę. Użyj plastikowego ogranicznika w kształcie stożka (np. dekapikonu), aby powstrzymać mysz i przetrzyj ogon etanolem, aby zwiększyć rozszerzenie naczyń krwionośnych i widoczność żyły.</li>
	<li>Wstrzyknąć 100 μl soli fizjologicznej, wolnego NGF lub nanocząsteczek naśladujących NGF HDL każdej grupie myszy (3 grupy) przez żyły ogonowe w dawce 40 μg/kg NGF. Użyj igły 301/2 G dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Po 30 minutach od wstrzyknięcia znieczulić myszy za pomocą 3% wziewnego izofluranu (w tlenie o natężeniu przepływu 2 l/min). Wykonaj uszczypnięcie ogona i palców u nóg, aby określić głębokość znieczulenia. Zbierz krew przez nakłucie serca.
	<ol>
		<li>Pobrać około 1 ml krwi z serca. Poddaj każdą mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść tuszę myszy w pozycji leżącej grzbietowej. Otwórz brzuch za pomocą nożyczek chirurgicznych i odsuń tłuszcz i jelito na bok za pomocą bawełnianego wacika, aby odsłonić wątrobę, śledzionę i nerki. Zbierz te tkanki i opłucz je w 1x PBS, aby oczyścić krew.</li>
	<li>Natychmiast odwirować próbki krwi w temperaturze 3 400 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut w celu uzyskania osocza. Przechowywać osocze i tkanki w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia analiz.</li>
	<li>Aby przeanalizować próbki tkanek, przenieś próbki z temperatury od -80 °C do 4 °C i zawiesij 100 mg próbki tkanki w 10-krotnym objętości buforu ekstrakcyjnego (0,05 M octan sodu, 1,0 M chlorek sodu, 1% tryton X-100, 1% BSA, 0,2 mM fluorek fenylometanosulfonylu i 0,2 mM chlorek benzethonium). Homogenizować przy 10 000 obr./min i w temperaturze 4 °C przez 5 min.</li>
	<li>Uśmierc dwie nieleczone myszy w celu zebrania ślepej próby osocza i tkanek, jak opisano w krokach 5.3 i 5.4. Przygotować roztwory wzorcowe NGF przy użyciu ślepej próby osocza lub homogenatów tkanek ślepej próby.</li>
	<li>Oznaczyć stężenia NGF w homogenatach osocza i tkanek za pomocą zestawu Sandwich ELISA, jak opisano powyżej.</li>
</ol>

<ol><li>Bruno, B. J., Miller, G. D., Lim, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basics+and+recent+advances+in+peptide+and+protein+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Ther+Deliv%22%5BJournal%5D)">Basics and recent advances in peptide and protein drug delivery.</a> Ther Deliv. 4 (11), 1443-1467 (2013).</li>
<li>Mo, Z. C., Ren, K., Liu, X., Tang, Z. L., Yi, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-density+lipoprotein-mediated+drug+delivery+system%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">A high-density lipoprotein-mediated drug delivery system.</a> Adv Drug Deliv Rev. 106 (Pt A), 132-147 (2016).</li>
<li>Lacko, A. G., Sabnis, N. A., Nagarajan, B., McConathy, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL+as+a+drug+and+nucleic+acid+delivery+vehicle%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">HDL as a drug and nucleic acid delivery vehicle.</a> Front Pharmacol. 6, 247-252 (2015).</li>
<li>Vaishya, R., Khurana, V., Patel, S., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+delivery+of+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Long-term delivery of protein therapeutics.</a> Expert Opin Drug Deliv. 12 (3), 415-440 (2015).</li>
<li>Lasic, D. D., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLasic%2C+DD+%22Medical+application+of+liposomes%22">Medical application of liposomes</a>. , Elsevier. (1998).</li>
<li>Samad, A., Sultana, Y., Aqil, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+drug+delivery+systems%3A+an+update+review%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Liposomal drug delivery systems: an update review.</a> Curr Drug Deliv. 4 (4), 297-305 (2007).</li>
<li>Bezemer, J. M., Radersma, R., Grijpma, D. W., Dijkstra, P. J., van Blitterswijk, C. A., Feijen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microspheres+for+protein+delivery+prepared+from+amphiphilic+multiblock+copolymers%3A+2.+Modulation+of+release+rate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Microspheres for protein delivery prepared from amphiphilic multiblock copolymers: 2. Modulation of release rate.</a> J Control Release. 67 (2-3), 249-260 (2000).</li>
<li>Patel, A., Patel, M., Yang, X., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+protein+and+peptide+drug+delivery%3A+a+special+emphasis+on+polymeric+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Pept+lett%22%5BJournal%5D)">Recent advances in protein and peptide drug delivery: a special emphasis on polymeric nanoparticles.</a> Protein Pept lett. 21 (11), 1102-1120 (2014).</li>
<li>Kuai, R., Li, D., Chen, Y. E., Moon, J. J., Schwendeman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+lipoproteins%3A+nature%27s+multifunctional+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">High-density lipoproteins: nature's multifunctional nanoparticles.</a> ACS Nano. 10 (3), 3015-3041 (2016).</li>
<li>Gursky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+stability+and+functional+remodeling+of+high-density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Structural stability and functional remodeling of high-density lipoproteins.</a> FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2627-2639 (2015).</li>
<li>McMahon, K. M., Thaxton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+lipoproteins+for+the+systemic+delivery+of+short+interfering+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">High-density lipoproteins for the systemic delivery of short interfering RNA.</a> Expert Opin Drug Deliv. 11 (2), 231-247 (2014).</li>
<li>McMahon, K. M., Foit, L., Angeloni, N. L., Giles, F. J., Gordon, L. I., Thaxton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+high-density+lipoprotein-like+nanoparticles+as+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat+Res%22%5BJournal%5D)">Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles as cancer therapy.</a> Cancer Treat Res. 166, 129-150 (2015).</li>
<li>Lerch, P. G., Förtsch, V., Hodler, G., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+a+reconstituted+high+density+lipoprotein+for+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of a reconstituted high density lipoprotein for therapeutic applications.</a> Vox Sang. 71 (3), 155-164 (1996).</li>
<li>Zhang, Z., Chen, J., Ding, L., Jin, H., Lovell, J. F., Corbin, I. R., Cao, W., Lo, P. C., Yang, M., Tsao, M. S., Luo, Q., Zheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL-mimicking+peptide-lipid+nanoparticles+with+improved+tumor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">HDL-mimicking peptide-lipid nanoparticles with improved tumor targeting.</a> Small. 6 (3), 430-437 (2010).</li>
<li>Kim, Y., Fay, F., Cormode, D. P., Sanchez-Gaytan, B. L., Tang, J., Hennessy, E. J., Ma, M., Moore, K., Farokhzad, O. C., Fisher, E. A., Mulder, W. J., Langer, R., Fayad, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+step+reconstitution+of+multifunctional+high-density+lipoprotein-derived+nanomaterials+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Single step reconstitution of multifunctional high-density lipoprotein-derived nanomaterials using microfluidics.</a> ACS Nano. 7 (11), 9975-9983 (2013).</li>
<li>Prathipati, P., Zhu, J., Dong, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+novel+HDL-mimicking+%CE%B1-tocopherol-coated+nanoparticles+to+encapsulate+nerve+growth+factor+and+evaluation+of+biodistribution%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+and+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Development of novel HDL-mimicking α-tocopherol-coated nanoparticles to encapsulate nerve growth factor and evaluation of biodistribution.</a> Eur J Pharm and Biopharm. 108, 126-135 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym badaniu pokazujemy prostą metodę przygotowania nanocząsteczek naśladujących HDL do enkapsulacji NGF. Badano różne systemy dostarczania NP pod kątem dostarczania białek. Obecnie wiele preparatów NP obejmuje dializę, wytrącanie rozpuszczalnikiem i uwodnianie filmu. Procesy te są na ogół skomplikowane i trudne w przypadku zwiększania skali. Podczas tego rozwoju NP stwierdzono, że lipidy mają silną przyczepność do szklanej ścianki pojemnika, co doprowadziło do trudności w uwodnieniu cienkiej warstwy i skutecznym miesza...

Makrocząsteczki, takie jak białka, peptydy i kwasy nukleinowe, pojawiły się jako obiecujące leki i zyskały znaczną uwagę w ostatnich dziesięcioleciach1,2. Ze względu na wysoką skuteczność i specyficzne tryby działania, wykazują duży potencjał terapeutyczny w leczeniu raka, chorób immunologicznych, HIV i schorzeń pokrewnych3,4. Jednak właściwości fizykochemiczne, takie jak ich duży rozmiar cząsteczkowy, trójwymiarowa struktura, ładunki powierzchniowe i hydrofilowy charakter, sprawiają, że dostarczanie tych makrocząsteczek in vivo jest bardzo trudne. To znacznie utrudnia ich kliniczne zastosowanie4. Niedawne postępy w systemach dostarczania leków, takich jak mikrocząstki, nanocząstki polimerowe (NP), liposomy i nanocząsteczki lipidowe, przezwyciężyły te wyzwania i znacznie poprawiły dostarczanie makrocząsteczek in vivo. Ujawniono jednak pewne wady dotyczące tych ładunków dostawczych, w tym niską zdolność ładowania leków, niską skuteczność chwytania, krótki okres półtrwania, utratę bioaktywności i niepożądane skutki uboczne5,6,7,8. Obszarem zainteresowań badawczych pozostają efektywne systemy nośne. Co więcej, opracowanie metod analitycznych do charakteryzowania nanocząsteczek obciążonych lekami jest trudniejsze w przypadku makrocząsteczek niż w przypadku małych cząsteczek.
Lipoprotein o wysokiej gęstości (HDL) to naturalny NP składający się z rdzenia lipidowego, który jest pokryty apolipoproteinami i monowarstwą fosfolipidową. Endogenny HDL odgrywa kluczową rolę w transporcie lipidów, białek i kwasów nukleinowych poprzez interakcję z docelowymi receptorami, takimi jak SR-BI, ABCAI i ABCG1. Został zbadany jako narzędzie do dostarczania różnych środków terapeutycznych9,10,11,12. Opracowano różne metody przygotowania nanocząsteczek naśladujących HDL. Dializa jest popularnym podejściem. W tej metodzie NP powstają przez uwodnienie filmu lipidowego za pomocą roztworu cholanu sodu. Sól jest następnie usuwana przez 2-dniową dializę z trzema13. Metody sonikacji wytwarzają nanocząsteczki poprzez sonikację mieszaniny lipidów przez 60 minut w warunkach ogrzewania; Nanocząsteczki są dalej oczyszczane za pomocą chromatografii żelowej14. Mikrofluidyka generuje nanocząsteczki za pomocą urządzenia mikroprzepływowego, które miesza fosfolipidy i roztwory apolipoproteiny A-I (APO A-I), tworząc mikrowiry we wzorze ogniskowania15. Oczywiście metody te mogą być czasochłonne, surowe i trudne do skalowania na skalę przemysłową.
W tym artykule przedstawiamy przygotowanie i charakterystykę nowych nanocząsteczek naśladujących HDL do enkapsulacji czynnika wzrostu nerwów (NGF). NGF jest homodimerem polipeptydowym związanym z dwusiarczkiem zawierającym dwa monomery polipeptydowe o masie 13,6 kDa. Opracowano nowatorską procedurę przygotowania nanocząsteczek poprzez homogenizację, a następnie enkapsulację NGF w nanocząsteczkach. Nanocząsteczki naśladujące HDL NGF scharakteryzowano pod kątem wielkości cząstek, rozkładu wielkości, potencjału zeta i uwalniania in vitro. Ich bioaktywność oceniano pod kątem wzrostu neurytów w komórkach PC12. Biodystrybucję nanocząsteczek naśladujących HDL NGF porównano z dystrybucją wolnego NGF po wstrzyknięciu dożylnym u myszy.

<table><tbody><tr><td>Rekombinowana ludzka beta-NGF</td><td>Creative Biomart</td><td>NGF-05H</td><td></td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatydylocholina (PC)</td> <td>Avanti</td><td>131601P</td><td>95%, jaja,</td></tr><tr><td>sfingomielina kurczaka (SM)</td> <td>Avanti</td><td>860062P</td><td>mózg,</td></tr><tr><td>fosfatydyloseryna świńska (PS)</td> <td>Avanti</td><td>840032P</td><td>Mózg,</td></tr><tr><td>oleinian cholesterolu cholesterylowego (CO)</td> <td>Sigma</td> <td>ze świńC9253</td><td></td></tr><tr><td>Bursztynian glikolu polietylenowego D-&alfa-tokoferylu (TPGS)</td><td>BASF</td><td>9002-96-4</td><td>Bursztynian glikolu polietylenowego witaminy E</td></tr><tr><td>Siarczan protaminy</td><td>Sigma</td><td>P3369</td><td>spełnia specyfikacje testowe USP</td></tr><tr><td>Apolipoproteina A1, osocze ludzkie</td><td>Badania i Technologia</td><td>16-16-120101</td><td>1 mg w 671 i mikro; L 10 mM NH4HCO3, pH 7,4</td></tr><tr><td>Sefaroza 4B-CL</td><td>Sigma</td><td>CL4B200</td><td>Agaroza usieciowana,&nbsp; Materiał wypełniający kolumnę do chromatografii z filtracją żelową</td></tr><tr><td>Zestaw ELISA typu sandwich dla NGF</td><td>R& System D</td><td>DY008</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>SH30096.02</td><td></td></tr><tr><td>Surowica końska</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>SH30074.03</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>PC12</td><td>komórki</td><td>ATCC CRL-1721</td><td></td></tr><tr><td>Ogon szczura kolagen typu I</td><td>Sigma</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>31414</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek benzethonium</td><td>Sigma</td><td>B8879</td><td></td></tr><tr><td> Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator</td><td>Tekmar</td><td>T 25-S1</td><td></td></tr><tr><td>Analizator cząstek Delsa Nano HC</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Delsa Nano HC</td><td></td></tr><tr><td>Float-A-Lyzer G2 Urządzenie do dializy</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>G235036</td><td>Odcięcie molekuły 300 kDa</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendoff</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator Polytron</td><td>Kinematica</td><td>PT 1200C</td><td></td></tr><tr><td>DecapiCone</td><td>&nbsp; Braintree Scientific Inc.</td><td>Prąd DC-M200</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie i charakterystyka nowych nanocząstek naśladujących hdl do enkapsulacji czynnika wzrostu nerwów

Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

Celem tego artykułu jest wprowadzenie metod przygotowania i charakterystyki nanocząstek (NP) o wysokiej gęstości i naśladujących lipoproteiny (HDL) naładowanych czynnikiem wzrostu nerwów (NGF). HDL są endogennymi NP i zostały zbadane jako nośniki do dostarczania środków terapeutycznych. Opracowano różne metody przygotowania nanocząsteczek naśladujących HDL. Są one jednak na ogół skomplikowane, czasochłonne i trudne do skalowania na skalę przemysłową. W tym badaniu zastosowano jednoetapową homogenizację w celu wymieszania substancji pomocniczych i utworzenia prototypowych nanocząsteczek. NGF jest rozpuszczalnym w wodzie białkiem o masie 26 kDa. Aby ułatwić enkapsulację NGF w środowisku lipidowym nanocząsteczek naśladujących HDL, zastosowano protaminę USP do utworzenia kompleksu par jonowych z NGF w celu zneutralizowania ładunków na powierzchni NGF. Kompleks NGF/protamina został następnie wprowadzony do prototypowych nanocząsteczek. Apolipoproteina A-I została ostatecznie pokryta na powierzchni nanocząsteczek. Nanocząsteczki naśladujące NGF HDL wykazały korzystne właściwości pod względem wielkości cząstek, rozkładu wielkości, skuteczności uwięzienia, uwalniania in vitro, bioaktywności i biodystrybucji. Dzięki starannemu zaprojektowaniu i zbadaniu homogenizacji w nanocząsteczkach naśladujących HDL, procedura została znacznie uproszczona, a nanocząsteczki stały się skalowalne. Ponadto udało się przezwyciężyć różne wyzwania, takie jak oddzielenie nieobciążonego NGF od nanocząsteczek, przeprowadzenie wiarygodnych badań uwalniania in vitro oraz pomiar bioaktywności nanocząsteczek.

Schemat konstrukcyjny naśladujących HDL nanocząsteczek (NP) NGF powlekanych α-tokoferolem, przygotowanych za pomocą strategii par jonowych, przedstawiono na Rysunku 1. W celu zneutralizowania ładunków powierzchniowych NGF zastosowano protaminę USP jako czynnik tworzący pary jonowe w celu utworzenia kompleksu z NGF. Aby chronić bioaktywność, zaprojektowano prototypowe NP naśladujące HDL, wykorzystując najpierw homogenizację, a następnie enkapsulowano kompleks NGF/protamina...

Prosta homogenizacja została wykorzystana do przygotowania nowatorskich, wysokiej gęstości, naśladujących lipoproteiny nanocząsteczek do enkapsulacji czynnika wzrostu nerwów. W artykule opisano wyzwania, szczegółowe protokoły przygotowania nanocząstek, charakterystyki in vitro oraz badań in vivo.

Przygotowanie i charakterystyka nowych nanocząstek naśladujących HDL do enkapsulacji czynnika wzrostu nerwów

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...

Ogólnym celem niniejszego artykułu jest przedstawienie metod przygotowania i charakterystyki nanocząstek naśladujących lipoprotein o wysokiej gęstości, obciążonych czynnikiem wzrostu nerwów. Do przygotowania standardowych nanocząstek naśladujących lipoprotein o wysokiej gęstości zastosowano prostą homogenizację. Procedura ta jest prosta i skalowalna.Ponadto nanocząsteczka znacznie poprawiła wydajność enkapsulacji, w tym również w przypadku NGF oraz APOA1 w nanocząsteczkach. Pokonano różne trudności związane z charakterystyką nanocząsteczki, w tym oddzielenie niezaładowanego NGF od nanocząsteczek NGF, przeprowadzenie wiarygodnych badań promienia in vitro oraz ocenę biodostępności nanocząsteczek NGF. W celu rozpoczęcia, wymieszaj 10 µL NGF z 10 µL protaminy USP w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL i pozostaw na 10 minut w temperaturze pokojowej w celu utworzenia kompleksu.Następnie do szklanej fiolki dodaj 59 µL fosfatydylocholiny i 11 µL sfingomieliny. Dodaj również 4 µL fosfatydyloseryny, 15 µL oleinianu cholesterylu oraz 45 µL bursztynianu tokoferylu z glikolem polietylenowym. Wymieszaj i odparuj etanol pod delikatnym strumieniem azotu przez około pięć minut.Wszystkie substancje pomocnicze powinny utworzyć cienką, tłustą warstwę na dnie szklanej fiolki. Do fiolki należy dodać 1 mL wody ultrapure i homogenizować przy 9 500 rpm przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby utworzyć prototypowe nanocząstki (NPs). Następnie do prototypowych NPs należy dodać przygotowany kompleks.Inkubować zawiesinę w temperaturze 37 °C przez 30 minut przy mieszaniu, używając małego mieszadełka magnetycznego w fiolce szklanej. Schłodzić NP, mieszając w temperaturze pokojowej przez kolejne 30 minut. Po schłodzeniu dodać 106 µL apolipoproteiny A-1 i mieszać w temperaturze pokojowej przez noc, aby utworzyć końcowe NP naśladujące HDL z NGF.Zmierz wielkość cząstek i potencjał zeta za pomocą analizatora cząstek zgodnie z instrukcjami producenta. Do oddzielenia niewiązanego NGF od nanocząstek naśladujących HDL z NGF oraz do oznaczenia wydajności enkapsulacji NGF wykorzystuje się kolumnę do chromatografii żelowej z sieciowanym żelem. W celu przygotowania kolumny przenieś 15 ml zawiesiny sepharose 4B CL do zlewki o pojemności 50 ml.Wymieszać zawiesinę kulek i przelać jej część do kolumny. Delikatnie opukać kolumnę, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Pozostawić rozpuszczalnik do odpłynięcia i odczekać kilka minut, aż kulki osiądą.Kontynuuj dodawanie pozostałej zawiesiny. Przepłucz wewnętrzną ściankę kolumny, aby oczyścić koraliki. Odcedź rozpuszczalnik, aż jego poziom znajdzie się nieco powyżej górnej krawędzi fazy stacjonarnej.Następnie należy wypłukać i przygotować kolumnę przy użyciu 20 ml 1X soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Aby zmierzyć wydajność uwięzienia NGF, na kolumnę należy nałożyć 200 µl NPs naśladujących HDL z NGF i przeprowadzić elucję za pomocą 1X PBS. Podobnie jak poprzednio, należy zebrać łącznie 12 frakcji po 1 ml każda.Przygotuj osiem rurek dializacyjnych zgodnie z instrukcją producenta. Do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml dodaj 30 ml medium uwalniającego. Następnie podgrzej je do 37 °C w inkubatorze wytrząsowym przy prędkości wytrząsania 135 rpm.Zamknąć probówkę dializacyjną i umieścić ją w medium uwalniającym. Szybko pobrać 100 µL medium uwalniającego spoza probówki dializacyjnej jako próbkę dla czasu zero. Natychmiast umieścić próbkę w temperaturze -20 °C do późniejszej analizy.Dodaj 100 µL świeżego medium uwalniającego do probówki wirówkowej, aby zastąpić pobraną próbkę. Następnie uruchom stoper. Po 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 i 72 godzinach pobierz 100 µL medium uwalniającego i zastąp je 100 µL świeżego medium.Pobrane próbki natychmiast umieścić w temperaturze -20 °C w celu późniejszej analizy. Po trzechminutowej homogenizacji uzyskano spójne rozmiary cząstek dla prototypowych nanocząsteczek. Finalne nanocząsteczki NGF miały rozmiar cząstek 170 nm z wąskim i monodyspersyjnym rozkładem wielkości.Niezaładowany NGF i nanocząsteczki zostały całkowicie rozdzielone na kolumnie do filtracji żelowej. Nanocząsteczki wypłukano w frakcjach od drugiej do czwartej. Pomiar ELISA wykazał, że wolny NGF został wypłukany w frakcjach od 7 do 10.Obliczona wydajność enkapsulacji NGF wyniosła około 66%. Przedstawiono tutaj uwalnianie nanocząsteczek NGF in vitro. Po dodaniu PBS i BSA do medium uwalniającego, wolny NGF przeniknął przez membranę dializacyjną z odzyskiem przekraczającym 85%. Z kolei nanocząsteczki NGF wykazały profil powolnego uwalniania, przy czym w ciągu 72 godzin z nanocząsteczek uwolniło się około 10% NGF. Nanocząsteczki NGF stymulowały wzrost neurytów w komórkach PC12 w stopniu podobnym do wolnego NGF.Wzrost neurytów był wyraźnie widoczny pod mikroskopem dla obu grup przy dawce 50 ng/mL. Nanocząsteczki NGF znacznie zwiększyły stężenie w osoczu i zmniejszyły wychwyt NGF w wątrobie, nerkach i śledzionie myszy. Nanocząsteczki naśladujące HDL wspomagały NGF, zapewniając długi okres półtrwania i stabilność in vivo.Po opanowaniu techniki monodyspersyjne nanocząstki mogą zostać przygotowane w ciągu trzech minut przy użyciu metody homogenizacji, pod warunkiem jej prawidłowego przeprowadzenia. Podczas realizacji tej procedury należy pamiętać o zastosowaniu łagodnego strumienia azotu w celu odparowania rozpuszczalnika oraz upewnić się, że po homogenizacji na ściankach naczynia nie pozostały żadne osady lipidowe. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać wiedzę na temat przygotowania nanocząstek naśladujących HDL przy użyciu metody homogenizacji oraz sposobu charakterystyki nanocząstek obciążonych NGF.

preparation-characterization-novel-hdl-mimicking-nanoparticles-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Źródło: Rosenberg, M., et al. Projektowanie porowatych filmów krzemowych jako nośników czynnika wzrostu nerwów. J. Vis. Exp. (2019).Ten film demonstruje zastosowanie degradowalnej nanostrukturalnej porowatej folii krzemowej (PSi) do przedłużonego uwalniania czynnika wzrostu nerwów (NGF) w celu wspierania różnicowania komórek PC12. NGF jest adsorbowany na porach folii poprzez oddziaływania elektrostatyczne i jest stopniowo uwalniany do mediów w wyniku dyfuzji i degradacji rusztowania. To...

Trwałe dostarczanie czynnika wzrostu nerwów za pomocą porowatego filmu krzemowego w komórkach guz chromochłonnego szczura 12

Źródło: Zhu, J., et al., Przygotowanie i charakterystyka nowych nanocząstek naśladujących HDL do enkapsulacji czynnika wzrostu nerwów. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje stopniowe składanie nanocząstek naśladujących HDL obciążonych NGF przy użyciu enkapsulacji wspomaganej protaminą i samoorganizacji opartej na lipidach w potencjalnych zastosowaniach neurotroficznych.

Kapsułkowanie czynnika wzrostu nerwów w nanocząstkach naśladujących lipoproteiny o dużej gęstości

Ten protokół łączy elektroprzędzenie i mikrosfery w celu opracowania rusztowań inżynierii tkankowej do kierowania neuronami. Czynnik wzrostu nerwów zamknięto w mikrosferach PLGA i elektroprzędzono w rusztowania włókniste z kwasem hialuronowym (HA).  Bioaktywność białka badano poprzez wysiewanie rusztowań pierwotnymi zwojami korzenia grzbietowego piskląt i hodowlę przez 4-6 dni.

Elektroprzędzenie Czynnik wzrostu uwalniający mikrosfery do włóknistych rusztowań

Celem tego protokołu jest włączenie SDF-1α, czynnika naprowadzającego komórki macierzyste, do nanocząsteczek siarczanu dekstranu i chitozanu.  Powstałe cząstki są mierzone pod kątem ich wielkości i potencjału zeta, a także zawartości, aktywności i szybkości uwalniania in vitro SDF-1α z nanocząstek.

Przygotowanie i charakterystyka nanocząstek siarczanu SDF-1α-chitozan-dekstranu

Nanonośnik ciekłokrystalicznej nanocząstki (LCNP) jest wykorzystywany jako narzędzie do kontrolowanego dostarczania hydrofobowego ładunku do błony komórkowej żywych komórek.

Celowane dostarczanie przez błonę plazmatyczną hydrofobowego ładunku zamkniętego w nośniku nanocząstek ciekłokrystalicznych

Tutaj prezentujemy protokół projektowania i wytwarzania nanostrukturalnych porowatych folii krzemowych (PSi) jako degradowalnych nośników dla czynnika wzrostu nerwów (NGF). Różnicowanie neuronalne i wzrost komórek PC12 i neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) myszy są charakteryzowane po leczeniu nośnikami PSi załadowanymi NGF.

Projektowanie porowatych filmów krzemowych jako nośników czynnika wzrostu nerwów

Ten artykuł opisuje enkapsulację falkarindiolu w pokrytych lipidami nanocząstkach o długości fali 74 nm. Komórkowy wychwyt nanocząstek przez ludzkie komórki macierzyste do kropelek lipidów jest monitorowany za pomocą obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego. Nanocząstki są wytwarzane metodą szybkiego wstrzykiwania rozpuszczalnika, a ich rozmiar mierzy się za pomocą techniki dynamicznego rozpraszania światła.

Wychwyt nowych nanocząstek pokrytych lipidami zawierających falkarindiol przez ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste

To badanie opisuje klasyczną hydratację przy użyciu metody cienkiego filmu lipidowego do przygotowania nanoliposomów, a następnie charakterystyki nanocząstek. Hydrofilowe i globularne białko o masie 47 kDa, taryna, jest z powodzeniem kapsułkowane jako strategia poprawiająca stabilność, unikająca szybkiego klirensu i promująca kontrolowane uwalnianie. Metoda może być dostosowana do enkapsulacji cząsteczek hydrofobowych.

Otrzymywanie i charakterystyka nanoliposomów do uwięzienia bioaktywnych hydrofilowych białek kulistych

Nanocząsteczki lipidowe są opracowywane przy użyciu mikroprzepływowej platformy mieszania do enkapsulacji mRNA i DNA.

Formułowanie i charakteryzowanie nanocząstek lipidowych do dostarczania genów przy użyciu platformy mieszania mikroprzepływowego

Tutaj opisujemy produkcję i charakterystykę czynników bioaktywnych zawierających nanodyski. Nanodyski amfoterycyny B są traktowane jako przykład, aby opisać protokół w sposób krokowy.

Formulacja i charakterystyka czynnika bioaktywnego zawierającego nanodyski

Poznaj metodę przygotowania nanocząstek naśladujących HDL z enkapsulacją czynnika wzrostu nerwów. Prosta homogenizacja zwiększa wydajność wiązania NGF i APOA1, umożliwiając skalowalne zastosowania terapeutyczne.

Przygotowanie i charakterystyka nowych nanocząstek naśladujących HDL do enkapsulacji czynnika wzrostu nerwów

Przeglądaj więcej filmów