Name: Izolacja kropelek lipidów do ilościowej analizy spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Naucz się izolacji kropelek lipidów do ilościowej analizy spektrometrii mas w badaniach wirusa zapalenia wątroby typu C. Ta metoda pozwala zrozumieć mechanizmy replikacji patogenów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy R. Bartenschlagerowi (Uniwersytet w Heidelbergu) za konstrukty Jc1, C.M. Rice (Uniwersytet Rockefellera) za komórki Huh7.5, J. McLauchlanowi (Medical Research Council Virology Unit) za konstrukt JFH1, T. Wakita (National Institute of Infectious Diseases, Japonia) za JFH1, oraz B. Websterowi i W.C. Greene'owi (Gladstone Institute of Virology and Immunology) za konstrukcje reporterowe HCVcc. Prace te były wspierane przez fundusze DFG (HE 6889/2-1 (EH), INST 337/15-1 2013 i INST 337/16-1 2013 (HS)). Instytut Heinricha Pettego, Instytut Wirusologii Eksperymentalnej im. Leibniza jest wspierany przez Wolne i Hanzeatyckie Miasto Hamburg oraz Federalne Ministerstwo Zdrowia. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

1. Przygotowanie pożywki do znakowania stabilnych izotopów aminokwasami w hodowli komórkowej (SILAC)
UWAGA: Tutaj, do znakowania SILAC użyto zestawu do oznaczania SILAC Protein Quantitation Kit - DMEM uzupełnionego o 50 mg 13C6 L-arginina-HCl. Dializowana płodowa surowica cielęca (FCS) jest dostarczana z zestawem do oznaczania ilościowego białka SILAC.
<ol>
	<li>Usunąć 50 ml z każdej butelki pożywki DMEM i dodać 50 ml dializowanego FCS.</li>
	<li>Rozpuścić 50 mg 13C6 L-lizyny-2HCl i 50 mg 13C6 L-argininy-HCl w 1 ml pożywki. Dokładnie wymieszaj i dodaj aminokwasy do pożywki DMEM + FCS.</li>
	<li>Dodaj 1x Pen/Strep i 1x substytut L-glutaminy. Przefiltruj pożywkę w sterylny sposób za pomocą filtra 0,45 μm. Oznacz butelkę jako "ciężkie" podłoże SILAC.</li>
	<li>Aby przygotować "lekką" pożywkę, powtórz kroki 1,1 - 1,3 używając 50 mg L-Argininy-HCl i 50 mg L-Lizyny-2HCl. Oznacz butelkę jako "lekkie" podłoże SILAC.</li>
</ol>
2. Znakowanie SILAC i kontrola inkorporacji aminokwasów
<ol>
	<li>Trypsynizuj komórki (1x Trypsin-EDTA) i podziel 1 x 105 komórek Huh7.5 na 2 dołki 6-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej 2 ml pożywki, jedną studzienkę z "ciężką" pożywką SILAC i jedną z "lekką" pożywką SILAC.</li>
	<li>Hoduj komórki przez co najmniej 6 pasaży (stosunek podziału: 1:6); po 6 pasażach włączenie "ciężkich" aminokwasów powinno wynosić ponad 95%.</li>
	<li>Zbierz 1 x 106 komórek z populacji komórek znakowanych "ciężkimi" i "lekkimi", aby przeanalizować skuteczność inkorporacji. Umyć komórki w 1x PBS i granulować komórki przez odwirowanie przez 5 minut w temperaturze 160 x g i 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osady komórkowe w 150 μl buforu MS (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,4 i 1 mM EDTA uzupełnione 1x koktajlem inhibitorów proteazy) i inkubować komórki na lodzie przez 30 minut. Lizować komórki przez sonikację w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Poniżej przedstawiono używane tutaj ustawienia sonikacji: timer, hold; sterowanie wyjściem, 8; cykl pracy, 80%; i 2 x 30 impulsów.</li>
	<li>Usunąć resztki komórek przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 11 000 x g i temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki i oznaczyć stężenie białka za pomocą testu białkowego kompatybilnego z detergentem.</li>
	<li>Wymieszać 75 μg białka z 6 razy buforem próbki (375 mM Tris-HCl, pH 6,8, 25,8% glicerolu, 123 mg/ml SDS, 600 μg/ml błękitu bromofenolowego i 60 μl/ml β-merkaptoetanolu), gotować w temperaturze 95 °C przez 5 minut i oddzielić białka za pomocą SDS-PAGE w buforze do pracy SDS (3,02 g/L zasady Tris, 18,8 g/l glicyny i 1 g/l SDS) przy napięciu 180 V przez około 1 godzinę lub zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przenieś żel do koloidalnego roztworu barwiącego Coomassie. Wyciąć ten sam pasek białka z każdego pasa. Trawić białka za pomocą trypsyny i analizować skuteczność inkorporacji za pomocą analizy MS, zgodnie z opisem22.</li>
</ol>
3. Izolacja kropelek lipidów komórek Huh7.5 znakowanych SILAC
<ol>
	<li>Zainfekuj jedną populację komórek (tj. te znakowane "lekkimi" aminokwasami) wirusem reporterowym HCV poprzez inkubację z zapasami wirusów (np. Jc1NS5AB-mKO2-BSD, MOI 1) przez 4 godziny w temperaturze 37 °C, zgodnie z opisem21. 
	UWAGA: Jc1NS5AB-mKO2-BSD jest wirusem HCV przenoszącym reporter fluorescencyjny (monomeryczny Kusabira Orange 2, mKO2) do monitorowania wskaźników infekcji, po których następuje gen oporności na blastydynę (BSD) między zduplikowanym miejscem cięcia NS5A-NS5B, opisanym wcześniej21,23. Praca z HCV wymaga przestrzegania zasad i praktyk bezpieczeństwa biologicznego BSL2+ (USA) lub S3** (Niemcy). Zamiast zakażenia HCV, komórki mogą być zakażone różnymi patogenami.</li>
	<li>Rozszerzaj "lekkie" komórki zakażone HCV i niezakażone "ciężkie" komórki. Podczas pasażowania kultur należy ustalić podwielokrotność z 4% paraformaldehydem (PFA) w PBS i określić szybkość infekcji HCV za pomocą cytometrii przepływowej białka markera fluorescencyjnego (np. mKO2), zgodnie z opisem21; Wskaźniki infekcji powinny być wyższe niż 90% w przypadku izolacji kropelek lipidów. UWAGA: W przypadku stosowania szczepu HCV Jc1NS5AB-mKO2-BSD, dodaj 10 μg/ml blasticydyny S do "lekkiej" pożywki, aby wybrać komórki HCV-dodatnie.</li>
	<li>1 dzień przed izolacją kropelek lipidów, przemyć komórki PBS, trypsynizować, ponownie zawiesić w "lekkim" i "ciężkim" podłożu i policzyć komórki za pomocą komory liczącej Neubauera. Wysiew 7 x 106 komórek z każdej populacji w naczyniu do hodowli2 komórek o długości 150 cm. Przygotuj co najmniej 5 potraw na "lekką" i "ciężką" populację komórek. Hodować komórki w 30 ml pożywki/szalki O/N.</li>
	<li>Usuń pożywkę i umyj komórki w 1x PBS. Odłącz komórki w 1x PBS za pomocą skrobaka do komórek.</li>
	<li>Policz obie populacje komórek za pomocą komory liczącej Neubauera i zbierz równą liczbę komórek w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Granulować komórki przez odwirowywanie przez 5 minut w temperaturze 160 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć PBS i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu sacharozy (0,25 M sacharozy, 1 mM EDTA i 1 mM DTT, uzupełnione koktajlem inhibitorów proteazy). Przenieś zawiesinę komórek do ciasno dopasowanego homogenizatora Dounce i poddaj komórki lizie za pomocą 200 uderzeń na lodzie. 
	UWAGA: Potwierdź całkowitą lizę komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym.</li>
	<li>Przenieść lizat do probówki do mikrofug o pojemności 1,5 ml i wirować jądra i resztki komórek przez 10 minut w temperaturze 1 000 x g i 4 °C.</li>
	<li>Po odwirowaniu przechowywać podwielokrotność 25 μl frakcji pojądrowej (PNS) w temperaturze -20 °C jako kontrolę wejściową.</li>
	<li>Umieścić pozostałą część frakcji PNS na dnie probówki wirówkowej (11 x 60 mm) i nałożyć na bufor do przemywania kropelkami lipidów (~3 ml; łącznie 4 ml) (50 mM bufor fosforanu potasu o pH 7,4, 100 mM chlorek potasu, 1 mM EDTA i 1 mM fluorek fenylometanosulfonylu).</li>
	<li>Wirować przez 2 godziny w temperaturze 100 000 x g i temperaturze 4 °C. Zebrać pływającą frakcję kropelek lipidów za pomocą wygiętej, kaniuli od góry probówki (około 250 - 500 μl, w zależności od ilości kropelek lipidów). Umieścić frakcję kropelek lipidów w probówce wirówkowej (11 x 60 mm), nałożyć na nią bufor do przemywania kropelkami lipidów (~3,5 ml; łącznie 4 ml) i powtórzyć etap wirowania.</li>
	<li>Zbierz unoszącą się frakcję kropelek lipidów za pomocą wygiętej, kaniuli z górnej części probówki i przenieś kropelki lipidów do nowej probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml. Dodać 500 μl buforu do przemywania kropelkami lipidów i wirować przez 20 minut w temperaturze 21 000 x g i temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Kropelki lipidów pojawiają się jako biały pasek unoszący się na górze bufora.</li>
	<li>Usuń subjacent wash buffer za pomocą żelowej końcówki pipety i powtórz ten krok mycia trzy razy.</li>
	<li>Po ostatecznym usunięciu buforu płuczącego za pomocą żelowej końcówki pipety należy zmieszać 5 μL frakcji kropelkowych lipidów z 10 μL buforu do lizy NP-40 (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl i 1% NP-40, uzupełnione koktajlem inhibitorów proteazy). Próbkę należy inkubować na lodzie przez 1 godzinę w celu dezaktywacji wirusa w przypadku pracy z materiałem zakaźnym. Określić poziom białka za pomocą testu białkowego kompatybilnego z detergentem; do analizy MS potrzebne jest co najmniej 35 μg białka.</li>
	<li>Frakcje kropelek lipidów przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Wymieszaj odpowiednią objętość frakcji kropelek lipidów z 4x barwnikiem ładującym. Inkubować na lodzie przez 1 godzinę w celu dezaktywacji wirusa w przypadku pracy z materiałem zakaźnym. Gotować w temperaturze 95 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Oddziel białka za pomocą SDS-PAGE zgodnie z protokołem producenta. Przenieś żel do koloidalnego roztworu barwiącego Coomassie. Wyciąć wszystkie prążki białkowe z żelu. Po tryptycznym roztrawieniu w żelu24, odparuj próbki i rozpuść je w 0,1% kwasie mrówkowym. Analiza przez LC-MS/MS. 
	UWAGA: W tym przypadku analizy LC-MS/MS przeprowadzono na kwadrupolowym spektrometrze masowym czasu przelotu (Q-TOF) lub na orbitalnym spektrometrze masowym z liniową pułapką kwadrupolową (LTQ). Oba instrumenty zostały sprzężone ze źródłem ESI do systemu nano-UPLC. Analizy danych i analizy LC-MS/MS na Q-TOF i na spektrometrze masowym orbitrap przeprowadzono zgodnie z opisem21,22. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie zanieczyścić próbki ludzką keratyną. Zawsze używaj końcówek i probówek do pipet bez keratyny. Przygotuj pod okapem z przepływem laminarnym z chemikaliami niezawierającymi keratyny. Przed użyciem wyczyść wszystkie powierzchnie i urządzenia wodą destylowaną i etanolem. Zawsze noś rękawice i fartuch laboratoryjny.</li>
</ol>
4. Analiza czystości kropelek lipidów
<ol>
	<li>Rozcieńczyć podwielokrotności frakcji kropelek lipidów w stosunku 1:2 i frakcji wejściowych (patrz krok 3.9) w stosunku 1:10 za pomocą buforu do lizy NP-40. Próbki należy inkubować na lodzie przez 1 godzinę w celu dezaktywacji wirusa w przypadku pracy z materiałem zakaźnym. Określ poziom białka za pomocą testu białkowego kompatybilnego z detergentem.</li>
	<li>Wymieszać równe ilości białka z 6-krotnym buforem próbki i inkubować próbki na lodzie przez 1 godzinę w celu dezaktywacji wirusa w przypadku pracy z materiałem zakaźnym. Postępuj z SDS-PAGE i przenieś białka na membranę nitrocelulozową poprzez osuszanie w zbiorniku pod napięciem 80 V przez 90 min. 
	UWAGA: Po zablokowaniu błony w buforze blokującym (5% beztłuszczowego mleka w proszku w TBS-T (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM NaCl i 0,05% Tween20)), inkubuj z przeciwciałami skierowanymi przeciwko markerom kropelek lipidów (np. PLIN1, PLIN2 lub PLIN3) i markerom innych przedziałów subkomórkowych (np. CALR, MnSOD lub tubulina), a następnie wtórnymi przeciwciałami sprzężonymi z HRP. Użyj chemiluminescencji do wykrywania białek.</li>
</ol>

<ol><li>Thiam, A. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biophysics+and+cell+biology+of+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The biophysics and cell biology of lipid droplets.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 775-786 (2013).</li>
<li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+roles+for+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Expanding roles for lipid droplets.</a> Curr Biol. 25 (11), R470-R481 (2015).</li>
<li>Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+review+series%3A+adipocyte+biology.+The+perilipin+family+of+structural+lipid+droplet+proteins%3A+stabilization+of+lipid+droplets+and+control+of+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis.</a> J Lipid Res. 48 (12), 2547-2559 (2007).</li>
<li>Choudhary, V., Ojha, N., Golden, A., Prinz, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+family+of+proteins+facilitates+nascent+lipid+droplet+budding+from+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A conserved family of proteins facilitates nascent lipid droplet budding from the ER.</a> J Cell Biol. 211 (2), 261-271 (2015).</li>
<li>Kory, N., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Fat%3A+Mechanisms+of+Protein+Localization+to+Lipid+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeting Fat: Mechanisms of Protein Localization to Lipid Droplets.</a> Trends Cell Biol. 26 (7), 535-546 (2016).</li>
<li>Hashemi, H. F., Goodman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+cycle+of+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The life cycle of lipid droplets.</a> Curr Opin Cell Biol. 33, 119-124 (2015).</li>
<li>Gao, Q., Goodman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+droplet-a+well-connected+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The lipid droplet-a well-connected organelle.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 49(2015).</li>
<li>Herker, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+lipid+droplets+in+host%2Fpathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Emerging role of lipid droplets in host/pathogen interactions.</a> J Biol Chem. 287 (4), 2280-2287 (2012).</li>
<li>Wedemeyer, H., Dore, G. J., Ward, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates+on+HCV+disease+burden+worldwide+-+filling+the+gaps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Viral+Hepat%22%5BJournal%5D)">Estimates on HCV disease burden worldwide - filling the gaps.</a> J Viral Hepat. 22 Suppl 1, 1-5 (2015).</li>
<li>Paul, D., Madan, V., Bartenschlager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+RNA+replication+and+assembly%3A+living+on+the+fat+of+the+land%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus RNA replication and assembly: living on the fat of the land.</a> Cell Host Microbe. 16 (5), 569-579 (2014).</li>
<li>Lindenbach, B. D., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+hepatitis+C+virus+entry+and+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of hepatitis C virus entry and assembly.</a> Nat Rev Microbiol. 11 (10), 688-700 (2013).</li>
<li>Barba, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+core+protein+shows+a+cytoplasmic+localization+and+associates+to+cellular+lipid+storage+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus core protein shows a cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage droplets.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (4), 1200-1205 (1997).</li>
<li>Shi, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+NS5A+colocalizes+with+the+core+protein+on+lipid+droplets+and+interacts+with+apolipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus NS5A colocalizes with the core protein on lipid droplets and interacts with apolipoproteins.</a> Virology. 292 (2), 198-210 (2002).</li>
<li>Herker, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+hepatitis+C+virus+particle+formation+requires+diacylglycerol+acyltransferase-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1.</a> Nat Med. 16 (11), 1295-1298 (2010).</li>
<li>Camus, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diacylglycerol+acyltransferase-1+localizes+hepatitis+C+virus+NS5A+protein+to+lipid+droplets+and+enhances+NS5A+interaction+with+the+viral+capsid+core%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Diacylglycerol acyltransferase-1 localizes hepatitis C virus NS5A protein to lipid droplets and enhances NS5A interaction with the viral capsid core.</a> J Biol Chem. 288 (14), 9915-9923 (2013).</li>
<li>Miyanari, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+droplet+is+an+important+organelle+for+hepatitis+C+virus+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The lipid droplet is an important organelle for hepatitis C virus production.</a> Nat Cell Biol. 9 (9), 1089-1097 (2007).</li>
<li>Boulant, S., Targett-Adams, P., McLauchlan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupting+the+association+of+hepatitis+C+virus+core+protein+with+lipid+droplets+correlates+with+a+loss+in+production+of+infectious+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Disrupting the association of hepatitis C virus core protein with lipid droplets correlates with a loss in production of infectious virus.</a> J Gen Virol. 88 (Pt 8), 2204-2213 (2007).</li>
<li>Vogt, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet-binding+protein+TIP47+regulates+hepatitis+C+Virus+RNA+replication+through+interaction+with+the+viral+NS5A+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet-binding protein TIP47 regulates hepatitis C Virus RNA replication through interaction with the viral NS5A protein.</a> PLoS Pathog. 9 (4), e1003302(2013).</li>
<li>Ploen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIP47+plays+a+crucial+role+in+the+life+cycle+of+hepatitis+C+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">TIP47 plays a crucial role in the life cycle of hepatitis C virus.</a> J Hepatol. 58 (6), 1081-1088 (2013).</li>
<li>Ploen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIP47+is+associated+with+the+hepatitis+C+virus+and+its+interaction+with+Rab9+is+required+for+release+of+viral+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TIP47 is associated with the hepatitis C virus and its interaction with Rab9 is required for release of viral particles.</a> Eur J Cell Biol. 92 (12), 374-382 (2013).</li>
<li>Rosch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Lipid+Droplet+Proteome+Analysis+Identifies+Annexin+A3+as+a+Cofactor+for+HCV+Particle+Production%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantitative Lipid Droplet Proteome Analysis Identifies Annexin A3 as a Cofactor for HCV Particle Production.</a> Cell Rep. 16 (12), 3219-3231 (2016).</li>
<li>Kwiatkowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+extraction+of+proteins+from+tissues+using+desorption+by+impulsive+vibrational+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Ultrafast extraction of proteins from tissues using desorption by impulsive vibrational excitation.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 285-288 (2015).</li>
<li>Webster, B., Ott, M., Greene, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evasion+of+superinfection+exclusion+and+elimination+of+primary+viral+RNA+by+an+adapted+strain+of+hepatitis+C+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Evasion of superinfection exclusion and elimination of primary viral RNA by an adapted strain of hepatitis C virus.</a> J Virol. 87 (24), 13354-13369 (2013).</li>
<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li>
<li>Ting, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+and+statistical+analysis+of+quantitative+proteomics+data+generated+by+metabolic+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Normalization and statistical analysis of quantitative proteomics data generated by metabolic labeling.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (10), 2227-2242 (2009).</li>
<li>Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+proteins+associated+with+lipid+droplets+of+basal+and+lipolytically+stimulated+3T3-L1+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes.</a> J Biol Chem. 279 (45), 46835-46842 (2004).</li>
<li>Tingting, P., Caiyun, F., Zhigang, Y., Pengyuan, Y., Zhenghong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subproteomic+analysis+of+the+cellular+proteins+associated+with+the+3%27+untranslated+region+of+the+hepatitis+C+virus+genome+in+human+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Subproteomic analysis of the cellular proteins associated with the 3' untranslated region of the hepatitis C virus genome in human liver cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 347 (3), 683-691 (2006).</li>
<li>Ariumi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DDX3+DEAD-box+RNA+helicase+is+required+for+hepatitis+C+virus+RNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">DDX3 DEAD-box RNA helicase is required for hepatitis C virus RNA replication.</a> J Virol. 81 (24), 13922-13926 (2007).</li>
<li>Weinlich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGF2BP1+enhances+HCV+IRES-mediated+translation+initiation+via+the+3%27UTR%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">IGF2BP1 enhances HCV IRES-mediated translation initiation via the 3'UTR.</a> RNA. 15 (8), 1528-1542 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy protokół izolowania kropelek lipidów do ilościowej analizy proteomu kropelek lipidów w celu porównania wzbogacania i zubożania białek związanych z kropelkami lipidów w różnych warunkach hodowli, takich jak infekcje wirusowe. Alternatywną metodą jest analiza proteomu z bezznacznikowymi kwantyfikacjami opartymi na całkowitych intensywnościach pików. Ta metoda nie ma ograniczenia zakresu dynamicznego i pozwala uniknąć problemów metabolicznych. Zaletą podejścia SILAC jest to, że próbki są łączone prze...

Kropelki lipidów to wysoce dynamiczne cytoplazmatyczne (i jądrowe) organelle komórkowe złożone z rdzenia neutralnych lipidów (trójglicerydów (TG) i estru cholesterolu (CE)) otoczonych monowarstwą fosfolipidów z osadzonymi białkami1. Wszystkie typy komórek wytwarzają kropelki lipidów, ale różnią się one wielkością, składem lipidowym i dekoracją białka. Kropelki lipidów pełnią różne funkcje, w tym służą jako rezerwuary prekursorów energii i błon lub jako depozyty białkowe. Ponadto, poprzez wychwyt lipidów, chronią komórki przed lipotoksycznością, uwalniają lipidy jako cząsteczki sygnałowe i biorą udział w degradacji białek i reakcjach na stres retikulum endoplazmatycznego (ER)2. W związku z tym wiele białek wiąże się z kropelkami lipidów i zarządza ich generowaniem, degradacją, transportem i interakcją z innymi organellami. Wśród nich znajduje się rodzina perylipiny białek wiążących kropelki lipidów w dobrej wierze (PLIN1-5)3.
Biogeneza kropelek lipidów prawdopodobnie zaczyna się w ER, gdzie enzymy rezydujące w ER katalizują syntezę neutralnych lipidów, które gromadzą się w dwuwarstwie błony, tworząc soczewkę neutralnych lipidów, proces, który został niedawno ładnie zwizualizowany w drożdżach4. Uważa się, że zginanie błony i podwyższony poziom kwasu fosfatydowego i diacyloglicerolu przyciągają białka biorące udział w biosyntezie fosfolipidów, ponieważ jednoczesna synteza neutralnych lipidów rdzeniowych i fosfolipidów ekranujących jest wymagana do wytwarzania kropelek lipidów5. Enzymy zawierające domeny transbłonowe, które znajdują się w ER, katalizują ten proces. Ekspansja do dużych kropelek lipidów wymaga aktywności innej klasy enzymów syntetyzujących lipidy, które zawierają amfipatyczną helisę i mogą w ten sposób przemieszczać się z ER do kropelek lipidów. Mobilizacja lipidów z kropelek lipidów zachodzi poprzez lokalną aktywację lipaz triglicerydowych i diacylogliceryjskich, tłuszczowej lipazy trójglicerydowej (ATGL) i lipazy hormonowrażliwej (HSL) lub przez różne szlaki autofagiczne, takie jak makro- i mikrolipofagia lub autofagia za pośrednictwem chaperonu6. Kropelki lipidów oddziałują z innymi organellami komórkowymi, takimi jak mitochondria (do beta-oksydacji i syntezy lipidów) i ER (do syntezy lipidów i transportu białek), ale także z lizosomami, endosomami i wakuolami indukowanymi przez bakterie wewnątrzkomórkowe7. Rzeczywiście, bakterie, wirusy, a nawet pasożyty atakują kropelki lipidów w celu replikacji i trwałości, wśród nich HCV8.
Zakażenie HCV jest jedną z głównych przyczyn zachorowalności i śmiertelności związanej z wątrobą na całym świecie, odpowiadając za około 0,5 miliona zgonów rocznie9. Prawdziwa liczba zakażeń HCV nie jest znana, ale ostatnie szacunki sugerują, że 130 - 150 milionów ludzi jest przewlekle zakażonych. Nie ma szczepionki, ale niedawno zatwierdzone leki przeciwwirusowe o bezpośrednim działaniu znacznie zwiększają odpowiedź terapeutyczną w porównaniu ze standardową terapią opartą na interferonie. Jednak na całym świecie leczenie pacjentów będzie prawdopodobnie ograniczone ze względu na niezwykle wysokie koszty nowych terapii. U około połowy wszystkich osób przewlekle zakażonych HCV rozwija się stłuszczenie wątroby (stłuszczenie), stan charakteryzujący się nadmiernym gromadzeniem się kropelek lipidów w hepatocytach. Co ciekawe, kropelki lipidów okazały się również ważnymi organellami komórkowymi do replikacji HCV, przypuszczalnie służąc jako miejsca składania wirusów10,11.
W komórkach zakażonych HCV, rdzeń białka wirusa i NS5A lokalizują się w kropelkach lipidów w procesie, który zależy od biosyntezy trójglicerydów, ponieważ inhibitory acylotransferazy diacyloglicerolu-1 (DGAT1) upośledzają transport do kropelek lipidów i późniejszą produkcję cząsteczek HCV12,13,14,15. Ponadto mutacje w domenach wiążących kropelki lipidów zarówno rdzenia, jak i NS5A hamują montaż HCV16,17. Core i NS5A następnie rekrutują wszystkie inne białka wirusowe, a także wirusowe kompleksy replikacyjne RNA, do błon ściśle związanych z kropelkami lipidów16. Do pomyślnego wytworzenia zakaźnego potomstwa wirusa wymagane jest skoordynowane działanie wszystkich białek wirusowych10,11. Białka strukturalne są częścią wirionów, a białka niestrukturalne promują interakcje białko-białko wymagane w tym procesie. Co ciekawe, prawdziwe białko wiążące kropelki lipidów PLIN3/TIP47 jest wymagane zarówno do replikacji RNA HCV, jak i uwalniania wirionów18,19,20. Pomimo tych ostatnich postępów, szczegóły mechanistyczne, zwłaszcza interakcje wirus-gospodarz w późnych stadiach replikacji HCV, pozostają słabo zdefiniowane, a dokładna funkcja kropelek lipidów jest nieznana.
Tutaj opisujemy metodę izolowania kropelek lipidów do ilościowej spektrometrii mas powiązanych białek. Korzystając z tej metody, znaleźliśmy głębokie zmiany w proteomie kropelek lipidów podczas infekcji HCV i zidentyfikowaliśmy anektynę A3 jako białko gospodarza, które współfrakcjonuje z kropelkami lipidów i jest wymagane do efektywnego dojrzewania HCV21.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do oznaczania ilościowego białka SILAC - DMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>89983&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>13C6 L-arginina-HCl 50&nbsp; mg</td><td>Thermo Fisher</td><td>88210</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Load 1</td><td>Roth GmbH</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Blue 5x Koncentrat</td><td>Roth GmbH</td><td>A152.2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>10x SDS-Tris-Glycine - Bufor</td><td>Geyer Th. GmbH & Co.KG&nbsp;</td><td>A1415,0250&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>Life Technologies GmbH&nbsp;</td><td>350500038&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny/streptomycyny do hodowli komórkowych</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&nbsp;</td><td>P4333-100ml&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy Dulbecco</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&nbsp;</td><td>D8537&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&nbsp;</td><td>T3924-100ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu BioChemica</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1149,1000</td><td></td></tr><tr><td>Tris Ultrapure&nbsp; &nbsp;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1086,5000A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EDTA BioChemica</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1103,0250</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy 5 ml</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&nbsp;</td><td>P8340-5ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-sacharoza BioChemica</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3935,1000</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl) o czystości 37% Ph. Eur., NF</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A0625</td><td></td></tr><tr><td>Test białka DC&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratoris GmbH&nbsp;</td><td>500-0116&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>AppliChem GmbH</td><td>151339</td><td></td></tr><tr><td>SDS Ultrapure</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1112</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A2331</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol&nbsp;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A4338</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Invivogen</td><td>ant-bl-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu&nbsp;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1039</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometanosulfonylu&nbsp;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A0999</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu Monobasic</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&nbsp;</td><td></td><td></td>221309</tr><tr><td>Wodorofosforan dipotasu</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&nbsp;</td><td>P3786&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Naziemna telewizja cyfrowa&nbsp;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A2948</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>AppliChem</td><td>A1694</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>AppliChem</td><td>A4974</td><td></td></tr><tr><td>Beztłuszczowe mleko w proszku w proszku</td><td>AppliChem</td><td>A0830</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ADFP/ ADRP&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab52355</td><td></td></tr><tr><td>M6PRB1/TIP47 100 & mikro; g</td><td>abcam</td><td>ab47639</td><td></td></tr><tr><td>Kalretykulina, pAb 200 i mikro; g</td><td>Enzo Life Science GmbH&nbsp;</td><td>ADI-SPA-600-F&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anty-&beta;-tubulina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&nbsp;</td><td>T6074 200&mikro; l &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absolutny (EtOH)</td><td>Geyer Th. GmbH & Co.KG&nbsp;</td><td>A3678,0250 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anty-MnSOD</td><td>Enzo Life Science GmbH&nbsp;</td><td>ADI-SOD-110-F</td><td></td></tr><tr><td>Przeciw myszom HRP</td><td>Thermo Fisher Pierce</td><td>32430</td><td></td></tr><tr><td>Przeciw królikom</td><td>HRP Thermo Fisher&nbsp; Pierce</td><td>32460</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Hyperfilm ECL</td><td>GE Healthcare</td><td>28906836</td><td></td></tr><tr><td>Lumi-Light Western Blotting Substrate</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&nbsp;</td><td></td><td></td>12015196001</tr><tr><td>96-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Greiner Bio-One GmbH&nbsp;</td><td>655 180&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Terumo 1 ml</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur BT 50, 500 mL, 0,45 &mikro; m&nbsp;</td><td>SARSTEDT&nbsp;</td><td>83.1823.100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Żele prefabrykowane Mini-PROTEAN TGX, dowolny żel rozdzielczy kD</td><td>Bio-Rad Laboratoris GmbH&nbsp;</td><td>tel. 456-9034&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Greiner Bio-One GmbH&nbsp;</td><td>657160&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia Nunclon 150/20&nbsp;</td><td>Fisher Scientific GmbH&nbsp;</td><td>10098720 - 168381&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Skrobak do komórek</td><td>neoLab Migge GmbH&nbsp;</td><td>C-8120&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Probówka, 50 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH&nbsp;</td><td>227261&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rurka SafeSeal bez RNaz&nbsp;</td><td>SARSTEDT&nbsp;</td><td>72.706.400&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe Ultra Clear 11 x 60 mm</td><td>Beckman Coulter GmbH&nbsp;</td><td>344062&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Igły ssące</td><td>Transcodent</td><td>6482</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere Fil. Napiwek 1000&nbsp;</td><td>SARSTEDT&nbsp;</td><td>70.762.211&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Biosfera Fil. Wskazówka 200</td><td>SARSTEDT&nbsp;</td><td>70.760.211&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Biosfera Fil. Wskazówka 10</td><td>SARSTEDT&nbsp;</td><td>70.1130.210&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Młynek do tkanek Dounce</td><td>Fisher Scientific GmbH&nbsp;</td><td></td><td></td>11883722</tr><tr><td>Tłuczki do całoszklanych młynków do tkanek Dounce</td><td>Fisher Scientific GmbH&nbsp;</td><td></td><td></td>10389444</tr><tr><td>Orbitrap Fusion</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Branson Sonifier 450</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer comfort, z Thermoblock 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>5355&nbsp; 000.127</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell, moduł Mini Trans-Blot i zasilacz PowerPac Basic,&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>165-8033</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 3 Komora odlewnicza</td><td>BioRad</td><td>165-4110</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz PowerPac HC Wirówka</td><td>Biorad</td><td>164-5052</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K</td><td>Beckman Coulter GmbH&nbsp;</td><td>365670</td><td></td></tr><tr><td>SW 60 Ti Rotor</td><td>Beckman Coulter GmbH&nbsp;</td><td></td><td></td>335649</tr><tr><td>Nieskończony M1000 PRO</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja kropelek lipidów do ilościowej analizy spektrometrii mas

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Kropelki lipidów są niezbędne do replikacji wielu różnych patogenów, w szczególności wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV), jako przypuszczalnego miejsca morfogenezy wirionu. Ilościowa analiza proteomu kropelek lipidów może być wykorzystana do identyfikacji białek, które lokalizują się lub są przemieszczane z kropelek lipidów w warunkach takich jak infekcje wirusowe. W tym miejscu opisujemy protokół, który został z powodzeniem zastosowany do scharakteryzowania zmian w proteomie kropelkowym lipidów po zakażeniu HCV. Używamy znakowania stabilnymi izotopami za pomocą aminokwasów w hodowli komórkowej (SILAC), a tym samym znakujemy cały proteom jednej populacji komórek "ciężkimi" aminokwasami w celu ilościowego określenia białek za pomocą spektrometrii mas. W celu izolacji kropelek lipidów dwie populacje komórek (tj. zakażone HCV/"lekkie" aminokwasy i niezakażone aminokwasy kontrolne/"ciężkie") miesza się w stosunku 1:1 i poddaje lizie mechanicznej w buforze hipotonicznym. Po usunięciu jąder i resztek komórkowych za pomocą wirowania z niską prędkością, białka związane z kropelkami lipidów są wzbogacane przez dwa kolejne etapy ultrawirowania, po których następują trzy etapy płukania w buforze izotonicznym. Czystość frakcji kropelek lipidów jest analizowana za pomocą western blot z przeciwciałami rozpoznającymi różne przedziały subkomórkowe. Białka związane z kropelkami lipidów są następnie rozdzielane za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS (SDS-PAGE), a następnie barwienia Coomassie. Po trawieniu tryptycznym peptydy są oznaczane ilościowo metodą chromatografii cieczowej z jonizacją elektronopryskową i tandemową spektrometrią mas (LC-ESI-MS/MS). Korzystając z tej metody, zidentyfikowaliśmy białka rekrutowane do kropelek lipidów po zakażeniu HCV, które mogą reprezentować pro- lub przeciwwirusowe czynniki gospodarza. Nasza metoda może być stosowana do wielu różnych komórek i warunków hodowli, takich jak zakażenie patogenami, stres środowiskowy lub leczenie farmakologiczne.

Kropelki lipidowe są kluczowe dla infekcji HCV jako domniemane miejsca montażu wirionów, jednak molekularne mechanizmy morfogenezy i uwalniania wirionów pozostają w dużej mierze nieznane. Aby zidentyfikować nowe czynniki zależne od gospodarza uczestniczące w tym procesie, przeprowadziliśmy ilościową analizę proteomu kropelek lipidowych w komórkach zainfekowanych HCV21 (Rycina 1A). Opracowaliśmy protokół oczyszczania kropelek lipidowych, w którym ru...

Kropelki lipidów są ważnymi organellami do replikacji kilku patogenów, w tym wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Opisujemy metodę izolowania kropelek lipidów do ilościowej spektrometrii mas powiązanych białek; Może być stosowany w różnych warunkach, takich jak infekcja wirusowa, stres środowiskowy lub leczenie farmakologiczne.

Izolacja kropelek lipidów do ilościowej analizy spektrometrii mas

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Ogólnym celem izolacji kropli lipidowych do ilościowej spektrometrii mas jest zrozumienie funkcji tych organelli, na przykład w replikacji patogenów, takich jak wirus zapalenia wątroby C. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób zakaźnych, np. dlaczego patogeny wiążą się z kroplami w celu replikacji. Izolacja kropli lipidowych może zostać przeprowadzona w ciągu sześciu do siedmiu godzin.Podczas tej procedury ważne jest unikanie kontaminacji keratyną. W pierwszej kolejności należy odlać 50 ml z każdej butelki pożywki DMEM i dodać 50 ml dializowanego płodowego surowicy cielęcej. Następnie należy rozpuścić 50 mg lizyny znakowanej węglem 13 oraz 50 mg argininy znakowanej węglem 13 w 1 ml pożywki.Dokładnie wymieszać, a następnie dodać aminokwasy do pożywki DMEM z dodatkiem FCS. Następnie dodać PenStrep oraz substytut glutaminy. Pożywkę przefiltrować sterylnie za pomocą filtra 0,45 mikrona i opisać butelkę jako pożywka ciężka SILAC.Aby przygotować pożywkę lekką, powtórz te kroki, używając 50 mg argininy i 50 mg lizyny. Oznacz butelkę jako lekka pożywka SILAC. Poddaj komórki trypsynizacji, a następnie rozdziel je do dwóch studzienek sześciostudzienkowej płytki hodowlanej.Jedna studzienka powinna zawierać dwa mililitry ciężkiego medium SILAC, a druga dwa mililitry lekkiego medium SILAC. Hodować komórki przez co najmniej sześć pasażów. Po sześciu pasażach stopień wbudowania ciężkich aminokwasów powinien przekraczać 95%. Zebrać jeden milion komórek z populacji komórek znakowanych ciężko i lekko w celu analizy wydajności wbudowania.Po przemyciu komórek w 1X PBS, należy je zpelletować poprzez wirowanie przez pięć minut przy 160 ×g i temperaturze czterech stopni Celsjusza. Osady komórkowe należy zawiesić ponownie w 150 µL buforu MS. Następnie komórki należy inkubować na lodzie przez 30 minut.Następnie należy poddać komórki lizie poprzez sonikację w temperaturze 4°C. Odśrodkować debris komórkowy przez 10 minut przy 11 000 ×g i w temperaturze 4°C. Przenieść nadsącz do nowej probówki i oznaczyć stężenie białka za pomocą testu białkowego kompatybilnego z detergentami.Następnie zmieszać 75 µg białka z sześciokrotnym buforem do próbek. Po gotowaniu w temperaturze 95 °C przez pięć minut, rozdzielić białka metodą SDS-PAGE w buforze do elektroforezy SDS przy napięciu 180 V przez około jedną godzinę. Po barwieniu Coomassie wyciąć pasmo odpowiadające danemu białku i przeanalizować wydajność inkorporacji za pomocą analizy MS.Zakaź lekką populację komórek wirusem reporterowym HCV, inkubując je z zapasami włóknistymi przez cztery godziny w temperaturze 37°C. Namnóż zakażone HCV lekkie komórki oraz niezinfekowane ciężkie komórki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W przypadku użycia szczepu HCV zawierającego gen oporności na blastycydynę, dodaj 10 µg/mL blastycydyny S do pożywki dla komórek lekkich w celu selekcji komórek HCV-dodatnich.Na jeden dzień przed izolacją kropli lipidowych przemyć komórki buforem PBS, poddać je trypsynizacji i zawiesić ponownie w odpowiednim medium lekkim lub ciężkim. Policzyć komórki, korzystając z komory licznikowej Neubauera. Następnie wysiać siedem milionów komórek z każdej populacji do naczynia hodowlanego o powierzchni 150 cm².Przygotować co najmniej pięć szalek dla każdej z populacji lekkich i ciężkich komórek. Hodować komórki przez noc w 30 mililitrach pożywki na szalkę. Następnego dnia usunąć pożywkę i przemyć komórki w 1X PBS.Ododerwać komórki w 1X PBS za pomocą skrobaka do komórek. Po przeliczeniu obu populacji komórek w sposób opisany wcześniej, przenieść równą liczbę komórek do probówek wirówkowych o pojemności 50 mililitrów. Zbić komórki w pellet poprzez wirowanie przez pięć minut przy 160 ×g i temperaturze czterech stopni Celsius.Usunąć PBS i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu sacharozowego. Przenieść zawiesinę komórek do szczelnie dopasowanego homogenizatora Ounce, a następnie poddać komórki lizie, wykonując 200 pociągnięć w lodzie. Następnie przenieść lizat do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwirować jądra komórkowe oraz debris komórkowy przez 10 minut przy 1 000 ×g w temperaturze 4 °C.Po wirowaniu należy przechowywać alikwot 25 µL frakcji ponuklearnej (PNS) w temperaturze -20 °C jako kontrolę wejściową. Pozostałą część frakcji PNS należy pozostawić na dnie probówki do wirowania i przykryć około 3 mL buforu do przemywania kropel lipidowych. Wirować przez dwie godziny przy 100 000 ×g w temperaturze 4 °C.Po wirowaniu należy zebrać pływającą frakcję kropli lipidowych z górnej części probówki, używając zgiętej tępej kaniuli. Następnie frakcję kropli lipidowych należy przenieść do probówki do wirowania, przykryć buforem do przemywania kropli lipidowych i powtórzyć etap wirowania. Zbieranie kropli lipidowych z góry gradientu wymaga doświadczenia.Im większa jest frakcja, tym jest to łatwiejsze. Do ćwiczeń można wykorzystać adipocyty. Można również podać komórkom oleinian, aby zwiększyć liczbę kropli lipidowych.Ponownie pobierz pływającą frakcję kropli lipidowych z powierzchni probówki, używając zgiętej kaniuli tępej. Przenieś krople lipidowe do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra i dodaj 500 mikrolitrów buforu do przemywania kropli lipidowych. Następnie wiruj próbkę przez 20 minut przy 21 000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Usuń znajdujący się poniżej bufor płuczący za pomocą końcówki do pipety do nakładania żelu i powtórz etap płukania trzy razy. Po końcowym usunięciu buforu płuczącego zmieszaj 5 µL frakcji kropel lipidowych z 10 µL buforu lizującego NP 40 w celu oznaczenia zawartości białka. Jeśli pracujesz z materiałem zakaźnym, inkubuj próbkę na lodzie przez jedną godzinę, aby dezaktywować wirusa.Na tym etapie frakcje kropel lipidowych można przechowywać w temperaturze -20 °C. Następnie objętość odpowiadającą co najmniej 35 µg białka zmieszać z 4x barwnikiem do nakładania próbek (loading dye). Jeśli pracuje się z materiałem zakaźnym, mieszaninę inkubować na lodzie przez jedną godzinę w celu inaktywacji wirusa.Gotować próbkę w temperaturze 95 °C przez pięć minut. Następnie przeprowadzić elektroforezę SDS-PAGE, a potem barwienie Coomassie, aby przygotować próbkę do chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przeanalizować czystość kropli lipidowych, rozcieńczyć alikwoty frakcji kropli lipidowych, od jednej do dwóch, w buforze lizującym NP 40.Rozcieńczyć frakcje kontrolne wejściowe w stosunku jeden do dziesięciu w tym samym buforze. Jeśli pracowano z materiałem zakaźnym, inkubować próbki na lodzie przez jedną godzinę w celu inaktywacji wirusa. Następnie oznaczyć poziom białka za pomocą testu białkowego kompatybilnego z detergentami.Następnie zmieszaj równą ilość białka z 6x buforem do próbek i inkubuj próbki na lodzie przez jedną godzinę w celu inaktywacji wirusa, jeśli pracujesz z materiałem zakaźnym. Na koniec przeprowadź elektroforezę SDS-PAGE i przenieś białka na membranę nitrocelulozową metodą transferu w komorze (tank blotting) przy napięciu 80 V przez 90 minut. Przedstawiono tutaj reprezentatywną analizę western blot frakcji ponuklearnej oraz frakcji kropli lipidowych.Analiza western blot wyraźnie wykazuje wzbogacenie frakcji kropli lipidowych w białka markerowe perilipina 2 i perilipina 3 oraz ubytek markerów innych przedziałów komórkowych. Frakcje ponuklearne i frakcje kropli lipidowych można dodatkowo analizować za pomocą barwienia błękitem Coomassie oraz barwienia srebrem. Przedstawiona mapa ciepła ilustruje liczbę peptydów oraz procentową stopień pokrycia białek zidentyfikowanych w frakcjach kropli lipidowych analizowanych komórek.Końcowa mapa ciepła przedstawia, w jaki sposób zakażenie HCV zmienia skład kropel lipidowych w przeliczeniu na dobę. Białka związane z kroplami lipidowymi, których poziom wzrósł, zaznaczono na czerwono, a białka, których poziom spadł, zaznaczono na niebiesko. Główną zaletą tej metody jest to, że mieszamy komórki przed izolacją oraz przed izolacją kropel lipidowych, dzięki czemu możemy zminimalizować błędy, które mogą wystąpić podczas lizy komórek i etapów izolacji.

lipid-droplet-isolation-for-quantitative-mass-spectrometry-analysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy nową ilościową metodę lipidomiki służącą do identyfikacji licznych gatunków lipidów w drożdżach z wykorzystaniem spektrometrii mas z jonizacją przez elektroryś spray w trybie skanowania przeglądowego (ESI/MS). Metoda ta przewyższa obecnie dostępne metody identyfikacji i oznaczania ilościowego lipidów pod względem zdolności do rozdzielania różnych form cząsteczkowych lipidów, czułości oraz szybkości analizy.

Ilościowa ocena lipidomu drożdży z wykorzystaniem spektrometrii mas z jonizacją elektrorsprayową

Ten protokół pokaże ekstrakcję i analizę wolnych i estryfikowanych bioaktywnych kwasów tłuszczowych z komórek. Kwasy tłuszczowe są dokładnie oznaczane ilościowo za pomocą rozcieńczania stabilnych izotopów, chiralnej chromatografii cieczowej, wychwytywania elektronów, atmosferycznej jonizacji chemicznej, wielokrotnego monitorowania spektrometrii mas (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Ekstrakcja lipidów komórkowych do ukierunkowanego rozcieńczania stabilnych izotopów Chromatografia cieczowa - analiza spektrometrii mas

Izolacja i charakterystyka domeny lipidów A lipopolisacharydu (LPS) od bakterii Gram-ujemnych dostarcza wglądu w oparte na powierzchni komórek mechanizmy oporności na antybiotyki, przeżywalność i sprawność bakterii, oraz jak chemicznie zróżnicowane gatunki molekularne lipidów A różnie modulują wrodzoną odpowiedź immunologiczną gospodarza.

Izolacja i charakterystyka chemiczna lipidu A z bakterii Gram-ujemnych

Przedstawiono dwie techniki izolowania kropelek lipidów komórkowych z 1) komórek drożdży i 2) ludzkich łożysk. Centralnym elementem obu procedur jest wirowanie w gradionym gradimencie gęstości, w którym powstałą pływającą warstwę zawierającą kropelki można łatwo zwizualizować za pomocą oka, wyekstrahować i określić ilościowo za pomocą analizy Western Blot w celu uzyskania czystości.

Izolacja kropelek lipidów komórkowych: dwie techniki oczyszczania, zaczynając od komórek drożdży i ludzkich łożysk

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określenia i kwalifikacji każdego gatunku sfingomieliny za pomocą monitorowania wielu reakcji i trybu MS/MS/MS, odpowiednio.

Ilościowa i jakościowa metoda oznaczania sfingomieliny metodą LC-MS przy użyciu dwóch stabilnych izotopowo znakowanych gatunków sfingomieliny

Ten protokół ustanawia nowatorską metodę izolacji i oczyszczania kropelek lipidów z wątroby myszy, przy użyciu dobrze znanego zestawu do izolacji retikulum endoplazmatycznego.

Protokół szybkiej izolacji kropelek lipidów przy użyciu dobrze znanego zestawu do izolacji organelli

Ta metoda dostarcza ram do badania inkorporacji egzogennych kwasów tłuszczowych z kompleksowych źródeł gospodarza do błon bakteryjnych, szczególnie Staphylococcus aureus. Aby to osiągnąć, opisano protokoły wzbogacania cząstek lipoprotein z żółtka jaja kurzego i późniejszego profilowania fosfolipidów bakteryjnych za pomocą spektrometrii mas.

Izolacja cząstek lipoprotein z żółtka jaja kurzego w celu zbadania włączenia kwasów tłuszczowych patogenów bakteryjnych do fosfolipidów błonowych

Lipidomika oparta na spektrometrii mas typu shotgun dostarcza czuły ilościowy obraz szerokiego spektrum klas lipidów jednocześnie w jednym pomiarze z różnych tkanek gryzoni.

Lipidomika tkanek gryzoni

Tutaj ustalamy metodę analizy ilościowej dla czterech składników systemu dostarczania RNA nanocząsteczek lipidowych (LNP) za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej połączonej z detektorem rozpraszania światła wyparnego (ELSD). Metoda charakteryzuje się dobrą separacją, wysoką czułością i wysoką wydajnością.

Oznaczanie czterech składników w systemie dostarczania nanocząstek lipidowych RNA za pomocą chromatografii cieczowej połączonej z detektorem rozpraszania światła wyparnego

Protokół ten opisuje unikalny protokół kliniczny pobierania próbek ludzkiego płynu łezowego za pomocą czerwonych nici fenolowych oraz workflow oparty na chromatografii cieczowej i spektrometrii mas tandemowej (LC-MS/MS) w celu odkrycia profilu lipidomicznego łz. Prosta metoda bifazowej separacji metyloter-butyloeteru (MTBE)/metanolu umożliwia szybką ekstrakcję lipidów łzowych z wysoką odbudową i odkryciem biomarkerów łz.

Procedura pobierania próbek oparta na niciach fenolowych czerwonych dla lipidomiki nieukierunkowanego płynu łzowego w odkrywaniu biomarkerów

Naucz się izolacji kropelek lipidów do ilościowej analizy spektrometrii mas w badaniach wirusa zapalenia wątroby typu C. Ta metoda pozwala zrozumieć mechanizmy replikacji patogenów.

Izolacja kropelek lipidów do ilościowej analizy spektrometrii mas

Przeglądaj więcej filmów