Izolacja kropelek lipidów do ilościowej analizy spektrometrii mas

Ogólnym celem izolacji kropli lipidowych do ilościowej spektrometrii mas jest zrozumienie funkcji tych organelli, na przykład w replikacji patogenów, takich jak wirus zapalenia wątroby C. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób zakaźnych, np. dlaczego patogeny wiążą się z kroplami w celu replikacji. Izolacja kropli lipidowych może zostać przeprowadzona w ciągu sześciu do siedmiu godzin.

Podczas tej procedury ważne jest unikanie kontaminacji keratyną. W pierwszej kolejności należy odlać 50 ml z każdej butelki pożywki DMEM i dodać 50 ml dializowanego płodowego surowicy cielęcej. Następnie należy rozpuścić 50 mg lizyny znakowanej węglem 13 oraz 50 mg argininy znakowanej węglem 13 w 1 ml pożywki.

Dokładnie wymieszać, a następnie dodać aminokwasy do pożywki DMEM z dodatkiem FCS. Następnie dodać PenStrep oraz substytut glutaminy. Pożywkę przefiltrować sterylnie za pomocą filtra 0,45 mikrona i opisać butelkę jako pożywka ciężka SILAC.

Aby przygotować pożywkę lekką, powtórz te kroki, używając 50 mg argininy i 50 mg lizyny. Oznacz butelkę jako lekka pożywka SILAC. Poddaj komórki trypsynizacji, a następnie rozdziel je do dwóch studzienek sześciostudzienkowej płytki hodowlanej.

Jedna studzienka powinna zawierać dwa mililitry ciężkiego medium SILAC, a druga dwa mililitry lekkiego medium SILAC. Hodować komórki przez co najmniej sześć pasażów. Po sześciu pasażach stopień wbudowania ciężkich aminokwasów powinien przekraczać 95%. Zebrać jeden milion komórek z populacji komórek znakowanych ciężko i lekko w celu analizy wydajności wbudowania.

Po przemyciu komórek w 1X PBS, należy je zpelletować poprzez wirowanie przez pięć minut przy 160 ×g i temperaturze czterech stopni Celsjusza. Osady komórkowe należy zawiesić ponownie w 150 µL buforu MS. Następnie komórki należy inkubować na lodzie przez 30 minut.

Następnie należy poddać komórki lizie poprzez sonikację w temperaturze 4°C. Odśrodkować debris komórkowy przez 10 minut przy 11 000 ×g i w temperaturze 4°C. Przenieść nadsącz do nowej probówki i oznaczyć stężenie białka za pomocą testu białkowego kompatybilnego z detergentami.

Następnie zmieszać 75 µg białka z sześciokrotnym buforem do próbek. Po gotowaniu w temperaturze 95 °C przez pięć minut, rozdzielić białka metodą SDS-PAGE w buforze do elektroforezy SDS przy napięciu 180 V przez około jedną godzinę. Po barwieniu Coomassie wyciąć pasmo odpowiadające danemu białku i przeanalizować wydajność inkorporacji za pomocą analizy MS.

Zakaź lekką populację komórek wirusem reporterowym HCV, inkubując je z zapasami włóknistymi przez cztery godziny w temperaturze 37°C. Namnóż zakażone HCV lekkie komórki oraz niezinfekowane ciężkie komórki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W przypadku użycia szczepu HCV zawierającego gen oporności na blastycydynę, dodaj 10 µg/mL blastycydyny S do pożywki dla komórek lekkich w celu selekcji komórek HCV-dodatnich.

Na jeden dzień przed izolacją kropli lipidowych przemyć komórki buforem PBS, poddać je trypsynizacji i zawiesić ponownie w odpowiednim medium lekkim lub ciężkim. Policzyć komórki, korzystając z komory licznikowej Neubauera. Następnie wysiać siedem milionów komórek z każdej populacji do naczynia hodowlanego o powierzchni 150 cm².

Przygotować co najmniej pięć szalek dla każdej z populacji lekkich i ciężkich komórek. Hodować komórki przez noc w 30 mililitrach pożywki na szalkę. Następnego dnia usunąć pożywkę i przemyć komórki w 1X PBS.

Ododerwać komórki w 1X PBS za pomocą skrobaka do komórek. Po przeliczeniu obu populacji komórek w sposób opisany wcześniej, przenieść równą liczbę komórek do probówek wirówkowych o pojemności 50 mililitrów. Zbić komórki w pellet poprzez wirowanie przez pięć minut przy 160 ×g i temperaturze czterech stopni Celsius.

Usunąć PBS i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu sacharozowego. Przenieść zawiesinę komórek do szczelnie dopasowanego homogenizatora Ounce, a następnie poddać komórki lizie, wykonując 200 pociągnięć w lodzie. Następnie przenieść lizat do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwirować jądra komórkowe oraz debris komórkowy przez 10 minut przy 1 000 ×g w temperaturze 4 °C.

Po wirowaniu należy przechowywać alikwot 25 µL frakcji ponuklearnej (PNS) w temperaturze -20 °C jako kontrolę wejściową. Pozostałą część frakcji PNS należy pozostawić na dnie probówki do wirowania i przykryć około 3 mL buforu do przemywania kropel lipidowych. Wirować przez dwie godziny przy 100 000 ×g w temperaturze 4 °C.

Po wirowaniu należy zebrać pływającą frakcję kropli lipidowych z górnej części probówki, używając zgiętej tępej kaniuli. Następnie frakcję kropli lipidowych należy przenieść do probówki do wirowania, przykryć buforem do przemywania kropli lipidowych i powtórzyć etap wirowania. Zbieranie kropli lipidowych z góry gradientu wymaga doświadczenia.

Im większa jest frakcja, tym jest to łatwiejsze. Do ćwiczeń można wykorzystać adipocyty. Można również podać komórkom oleinian, aby zwiększyć liczbę kropli lipidowych.

Ponownie pobierz pływającą frakcję kropli lipidowych z powierzchni probówki, używając zgiętej kaniuli tępej. Przenieś krople lipidowe do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra i dodaj 500 mikrolitrów buforu do przemywania kropli lipidowych. Następnie wiruj próbkę przez 20 minut przy 21 000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Usuń znajdujący się poniżej bufor płuczący za pomocą końcówki do pipety do nakładania żelu i powtórz etap płukania trzy razy. Po końcowym usunięciu buforu płuczącego zmieszaj 5 µL frakcji kropel lipidowych z 10 µL buforu lizującego NP 40 w celu oznaczenia zawartości białka. Jeśli pracujesz z materiałem zakaźnym, inkubuj próbkę na lodzie przez jedną godzinę, aby dezaktywować wirusa.

Na tym etapie frakcje kropel lipidowych można przechowywać w temperaturze -20 °C. Następnie objętość odpowiadającą co najmniej 35 µg białka zmieszać z 4x barwnikiem do nakładania próbek (loading dye). Jeśli pracuje się z materiałem zakaźnym, mieszaninę inkubować na lodzie przez jedną godzinę w celu inaktywacji wirusa.

Gotować próbkę w temperaturze 95 °C przez pięć minut. Następnie przeprowadzić elektroforezę SDS-PAGE, a potem barwienie Coomassie, aby przygotować próbkę do chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przeanalizować czystość kropli lipidowych, rozcieńczyć alikwoty frakcji kropli lipidowych, od jednej do dwóch, w buforze lizującym NP 40.

Rozcieńczyć frakcje kontrolne wejściowe w stosunku jeden do dziesięciu w tym samym buforze. Jeśli pracowano z materiałem zakaźnym, inkubować próbki na lodzie przez jedną godzinę w celu inaktywacji wirusa. Następnie oznaczyć poziom białka za pomocą testu białkowego kompatybilnego z detergentami.

Następnie zmieszaj równą ilość białka z 6x buforem do próbek i inkubuj próbki na lodzie przez jedną godzinę w celu inaktywacji wirusa, jeśli pracujesz z materiałem zakaźnym. Na koniec przeprowadź elektroforezę SDS-PAGE i przenieś białka na membranę nitrocelulozową metodą transferu w komorze (tank blotting) przy napięciu 80 V przez 90 minut. Przedstawiono tutaj reprezentatywną analizę western blot frakcji ponuklearnej oraz frakcji kropli lipidowych.

Analiza western blot wyraźnie wykazuje wzbogacenie frakcji kropli lipidowych w białka markerowe perilipina 2 i perilipina 3 oraz ubytek markerów innych przedziałów komórkowych. Frakcje ponuklearne i frakcje kropli lipidowych można dodatkowo analizować za pomocą barwienia błękitem Coomassie oraz barwienia srebrem. Przedstawiona mapa ciepła ilustruje liczbę peptydów oraz procentową stopień pokrycia białek zidentyfikowanych w frakcjach kropli lipidowych analizowanych komórek.

Końcowa mapa ciepła przedstawia, w jaki sposób zakażenie HCV zmienia skład kropel lipidowych w przeliczeniu na dobę. Białka związane z kroplami lipidowymi, których poziom wzrósł, zaznaczono na czerwono, a białka, których poziom spadł, zaznaczono na niebiesko. Główną zaletą tej metody jest to, że mieszamy komórki przed izolacją oraz przed izolacją kropel lipidowych, dzięki czemu możemy zminimalizować błędy, które mogą wystąpić podczas lizy komórek i etapów izolacji.