Name: Wykorzystanie techniki fluorescencyjnej elektroforezy żelowej kapilarnej PCR do genotypowania mutantów nokautujących za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w formacie wysokoprzepustowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Naucz się genotypowania mutantów CRISPR/Cas9 za pomocą fluorescencyjnej PCR i elektroforezy żelowej kapilarnej. Ta metoda wysokoprzepustowa umożliwia efektywną analizę różnych typów komórek w badaniach genetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Pani Tan Shi Min, Pani Helen Ong i Dr. Zhao Yi za pomoc w eksperymentach z elektroforezą w żelu kapilarowym. Prace te były wspierane przez grant NMRC/IRG NMRC/1314/2011 oraz grant MOE AcRF Tier 2 Fund MOE2011-T2-1-051.

<ol><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2Fcas9%2C+a+novel+genomic+tool+to+knock+down+microRNA+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">CRISPR/cas9, a novel genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo.</a> Sci. Rep. 6, 22312(2016).</li>
<li>O'Connell, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+RNA+recognition+and+cleavage+by+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9.</a> Nature. 516, 263-266 (2014).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154, 1380-1389 (2013).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24157548">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Perez, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+HIV-1+resistance+in+CD4%2B+T+cells+by+genome+editing+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 26, 808-816 (2008).</li>
<li>Santiago, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+knockout+in+mammalian+cells+by+using+engineered+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases.</a> P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).</li>
<li>Sung, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+mice+created+by+TALEN-mediated+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting.</a> Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).</li>
<li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343, 84-87 (2014).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+a+CRISPR%2FCas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509, 487-491 (2014).</li>
<li>Guschin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+general+assay+for+monitoring+endogenous+gene+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification.</a> Methods Mol. Biol. 649, 247-256 (2010).</li>
<li>Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+in+human+cells+with+zinc+finger+nucleases+constructed+via+modular+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly.</a> Genome Res. 19, 1279-1288 (2009).</li>
<li>Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+genotyping+of+CRISPR%2FCas9-mediated+mutants+using+fluorescent+PCR-capillary+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis.</a> Sci. Rep. 5, 15587(2015).</li>
<li>Liu, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Responses+of+Stem+Cells+to+Telomere+Uncapping-A+Potential+Strategy+to+Improve+the+Safety+of+Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Distinct Responses of Stem Cells to Telomere Uncapping-A Potential Strategy to Improve the Safety of Cell Therapy.</a> Stem cells. 34, 2471-2484 (2016).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nat. Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350, 1096-1101 (2015).</li>
<li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nat. Methods. 11, 783-784 (2014).</li>
<li>Urnov, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+endogenous+human+gene+correction+using+designed+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.</a> Nature. 435, 646-651 (2005).</li>
<li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat. Rev. Genet. 15, 321-334 (2014).</li>
<li>Dahlem, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+methods+for+generating+and+detecting+locus-specific+mutations+induced+with+TALENs+in+the+zebrafish+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome.</a> PLoS Genet. 8, e1002861(2012).</li>
<li>Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+genome+editing+and+phenotyping+facilitated+by+high+resolution+melting+curve+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis.</a> PLoS One. 9, 114632(2014).</li>
<li>Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+with+CRISPR-Cas-derived+RNA-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases.</a> Nat. Commun. 5, 3157(2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Wyeliminowanie określonego genu w wybranej przez siebie modelowej linii komórkowej stało się rutyną w celu wyjaśnienia roli, jaką gen odgrywa w tym konkretnym kontekście komórkowym. W rzeczywistości obecnie dostępnych jest kilka badań przesiewowych całego genomu, które wykorzystują system CRISPR/Cas9 do celowania w praktycznie wszystkie znane ludzkie geny w genomie 14,15,16. W przypadku tych badań przesiewowych na dużą skalę (lu...

Odwrotne podejście genetyczne pozwoliło naukowcom wyjaśnić wpływ określonych zmian w genomie na komórkę lub cały organizm. Na przykład, ekspresja określonego genu może być osłabiona przez knockdown1,2 (częściowa redukcja) lub nokaut genu3,4 (całkowita ablacja) w celu określenia wpływu, jaki ma to na funkcję komórki lub na rozwój organizmu.
Eksperymenty z nokautem genów stały się łatwiejsze od czasu wprowadzenia programowalnych nukleaz specyficznych dla sekwencji, takich jak nukleazy palców cynkowych (ZFN) i aktywatory transkrypcji podobne do efektorów nukleazy (TALENs). Jednak stosunkowo niedawna charakterystyka systemu CRISPR/Cas9 z regularnie przeplatanymi krótkimi powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR)/Cas9 sprawiła, że każde laboratorium na całym świecie może niezwykle łatwo przeprowadzać eksperymenty z nokautem genów. Zasadniczo system CRISPR/Cas9 składa się z dwóch podstawowych składników - pojedynczego przewodnika RNA (sgRNA), który rozpoznaje i wiąże się poprzez komplementarność zasad z określoną sekwencją w genomie, oraz endonukleazy zwanej Cas9. Pokłosiem specyficznego wiązania i działania kompleksu sgRNA-Cas9 na genomowe DNA jest dwuniciowe rozszczepienie DNA. To z kolei uruchamia mechanizm odpowiedzi na uszkodzenie DNA w komórce, który jest następnie naprawiany za pośrednictwem niehomologicznych szlaków łączenia końców (NHEJ) lub rekombinacji homologicznej (HR). Ponieważ mechanizm naprawy NHEJ (ale nie mechanizm HR) często powoduje losową insercję lub delecję nukleotydów w miejscu naprawy, co skutkuje mutacjami insercji/delecji (indel), może to spowodować przesunięcie ramki odczytu eksonu. Może to następnie spowodować znokautowanie genu z powodu przedwczesnego zakończenia translacji i rozpadu, w którym pośredniczy nonsens5,6,7.
Pomimo wygody, jaką daje wprowadzenie systemu CRISPR/Cas9 w eliminowaniu genu, genotypowanie klonów docelowych komórek pozostaje wąskim gardłem, zwłaszcza w środowisku o wysokiej przepustowości8,9. Istniejące techniki albo mają poważne ograniczenia, albo są kosztowne finansowo. Na przykład test SURVEYOR lub T7E1, który jest testem enzymatycznym, który wykrywa niezgodności w dupleksach DNA10, nie jest w stanie odróżnić klonów typu dzikiego od mutantów homozygotycznych (klonów, których allele są identycznie zmutowane), ponieważ te klony mają identyczne allele, a zatem nie wykazują niezgodności w swojej sekwencji DNA11. Ponadto stosowanie sekwencjonowania Sangera, które jest uważane za złoty standard w genotypowaniu zmutowanych klonów, w konfiguracji o wysokiej przepustowości jest niepożądane ze względu na jego wysoki koszt. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół techniki fluorescencyjnej elektroforezy kapilarnej w żelu PCR, który może obejść ograniczenia innych istniejących technik genotypowania i jest szczególnie przydatny w przeprowadzaniu wysokoprzepustowego badania przesiewowego klonów nokautujących za pośrednictwem nukleazy. Ta metoda jest technicznie prosta do wykonania i oszczędza czas i koszty.

<table><tbody><tr><td>Komórki HEPG2</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>plazmid pSpCas9(BB)-2A-GFP</td><td>Addgene</td><td>PX458</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>11668027</tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,5%), bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific 15140122</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Water, klasa biologii molekularnej</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR sgRNA insert oligonukleotyd (sense)</td><td>AITbiotech</td><td>Brak</td><td>Sekwencja: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'CRISPR</td></tr> <tr><td>sgRNA insert oligonukleotyd (anty-sens)</td><td>AITbiotech</td><td>Brak</td><td>Sekwencja: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3'Nieoznakowana</td></tr> <tr><td>amplifikacja PCR do przodu starter</td><td>AITbiotech</td><td>Brak</td><td>Sekwencja: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; ten starter jest również używany do sekwencjonowania alleli amplifikowanych PCR</td></tr><tr><td>Fluorescencyjny starter PCR znakowany 6-FAM</td><td>AITbiotech</td><td>Brak</td><td>Sekwencja: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'znakowany</td></tr> <tr><td>HEX fluorescencyjny starter PCR do przodu</td><td>AITbiotech</td><td>Brak</td><td>Sekwencja: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'Nieoznakowany</td></tr> <tr><td>odwrócony starter PCR</td><td>AITbiotech</td><td>Brak</td><td>Sekwencja: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3'Taq</td></tr> <tr><td>PCR Core Kit</td><td>QIAGEN</td><td>201223</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Di Formamid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311320</td><td></td></tr><tr><td>GeneScan 500 LIZ Rozmiar barwnika Standardowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4322682</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>3500xL Genetyczny Analizator</td><td>Thermo Fisher Scientific 4405633</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3500 Series 2 program</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4476988</td><td></td></tr><tr><td>Gene Mapper 5</td><td>program Thermo Fisher Scientific</td><td>4475073</td><td></td></tr><tr><td>Gentra Puregene Cell Kit</td><td>QIAGEN</td><td>1045696</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System</td><td>Przeciwciało Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>NAP1L1 ( N-term)</td> <td>Abgent</td><td>AP1920b</td><td></td></tr><tr><td>Jądrowe białko macierzy jądrowej p84 przeciwciało [5E10]</td> <td>GeneTex</td><td>GTX70220</td><td></td></tr><tr><td>Peroksydaza AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>Peroksydaza AffiniPure Owca Anti-Mysz IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>515-035-003</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie techniki fluorescencyjnej elektroforezy żelowej kapilarnej pcr do genotypowania mutantów nokautujących za pośrednictwem crispr/cas9 w formacie wysokoprzepustowym

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Rozwój programowalnych narzędzi do edycji genomu ułatwił wykorzystanie genetyki odwrotnej do zrozumienia ról określonych sekwencji genomowych w funkcjonowaniu komórek i całych organizmów. Przyczyna ta została ogromnie wsparta przez niedawne wprowadzenie systemu CRISPR/Cas9 – wszechstronnego narzędzia, które pozwala naukowcom manipulować genomem i transkryptomem w celu, między innymi, wybijania, powalania lub wbijania genów w ukierunkowany sposób. W celu wyeliminowania genu, pęknięcia dwuniciowe za pośrednictwem CRISPR/Cas9 rekrutują niehomologiczny szlak naprawy DNA łączący się z końcem, aby wprowadzić powodującą przesunięcie ramki insercji lub delecję nukleotydów w miejscu pęknięcia. Jednak pojedynczy przewodnik RNA może powodować niepożądane efekty poza celem i aby je wykluczyć, konieczne jest użycie wielu przewodników RNA. Ta mnogość celów oznacza również, że wymagane są zakrojone na szeroką skalę badania przesiewowe klonów, co z kolei wymaga zastosowania wydajnej techniki wysokoprzepustowej do genotypowania klonów z nokautem. Obecne techniki genotypowania albo mają nieodłączne ograniczenia, albo wiążą się z wysokimi kosztami, co sprawia, że nie nadają się do celów o wysokiej przepustowości. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół stosowania fluorescencyjnego PCR, który wykorzystuje genomowe DNA z surowego lizatu komórkowego jako matrycę, a następnie rozpuszczanie fragmentów PCR za pomocą kapilarnej elektroforezy żelowej. Technika ta jest wystarczająco dokładna, aby rozróżnić jedną różnicę w parach zasad między fragmentami, a zatem jest odpowiednia do wskazania obecności lub braku przesunięcia ramki w sekwencji kodującej docelowego genu. Ta precyzyjna wiedza skutecznie wyklucza konieczność sekwencjonowania potwierdzającego i pozwala użytkownikom zaoszczędzić czas i koszty w procesie. Co więcej, technika ta okazała się wszechstronna w genotypowaniu różnych komórek ssaków o różnym pochodzeniu tkankowym, do których kierowane są przewodnikowe RNA przeciwko licznym genom, jak pokazano tutaj i gdzie indziej.

Opisana tutaj technika fluorescencyjnej elektroforezy kapilarnej w żelu po PCR powinna znaleźć zastosowanie w przypadku dowolnego regionu genomu w niemal każdej linii komórkowej podatnej na dostarczanie obcego DNA. Wcześniej zademonstrowaliśmy jej zastosowanie poprzez celowanie w trzy geny w linii komórkowej raka jelita grubego12. W niniejszej pracy wykazujemy jej skuteczność w genotypowaniu linii komórkowej raka wątrobowokomórkowego HEPG2, w której zastosowano kon...

Opisana tutaj technika genotypowania, która łączy reakcję łańcuchową fluorescencyjnej polimerazy (PCR) z elektroforezą żelu kapilarnego, pozwala na wysokoprzepustowe genotypowanie klonów nokautujących za pośrednictwem nukleazy. Omija ograniczenia, z jakimi borykają się inne techniki genotypowania, i jest bardziej opłacalna niż metody sekwencjonowania.

Wykorzystanie techniki fluorescencyjnej elektroforezy żelowej kapilarnej PCR do genotypowania mutantów nokautujących za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w formacie wysokoprzepustowym

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Ogólnym celem tej techniki jest wysokoprzepustowe genotypowanie klonów mutantów z insercjami i delecjami indukowanymi przez CRISPR/Cas9. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny genetyki, takie jak efekt fenotypowy wywołany wyłączeniem konkretnego genu w wybranym modelu SAIL. Główną zaletą tej techniki jest możliwość prowadzenia przesiewania o niskiej lub wysokiej przepustowości, które jest wielofunkcyjne.Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat genetyki nowotworów u ludzi, można ją również zastosować w innych systemach, takich jak komórki macierzyste, pierwotne komórki ludzkie lub komórki pochodzenia nie ludzkiego. Pomysł na tę metodę pojawił się podczas wykonywania analiz typowania krótkich powtórzeń tandemowych (STR). Aby rozpocząć procedurę, należy przetransfekować wybrane komórki plazmidem współwyrażającym fluorescencyjną etykietę cas9 oraz pojedynczy przewodnik RNA (sgRNA).Poddaj komórki trypsynizacji i wybierz około 3 500 klonów znakowanych fluorescencyjnie. Wysiej klony w porcjach po 500, 1 000 i 2 000 komórek na szalkach 10 cm w 8 mL pożywki wzrostowej uzupełnionej o penicylinę i streptomycynę. Inkubuj komórki w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C, wymieniając pożywkę co pięć dni, aż do momentu, gdy kolonie pojedynczych komórek będą widoczne gołym okiem.Następnie należy pobrać poszczególne kolonie za pomocą pipety 200 µL z około 5 µL pożywki wzrostowej. Każdą kolonię należy przenieść do osobnej studzienki zawierającej 200 µL pożywki wzrostowej. Każdą mieszaninę należy kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby resuspenderć komórki.Inkubować komórki w opisanych wcześniej warunkach, aż osiągną od 50 do 90% konfluencji. Usunąć nadmiar pożywki z dołków i dodać 25 µL 0,05% trypsyny EDTA bez czerwieni fenolowej do każdego dołka. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 7 minut.Następnie wielokrotnie pipetuj zawiesiny w górę i w dół, aby resuspenderować komórki poddane trypsynizacji. Sprawdź studzienki pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki oddzieliły się od ścianek studzienek. W celu przygotowania replikatów poszczególnych klonów, przenieś 5 µL każdej zawiesiny komórkowej do pustej płytki hodowlanej z 96 studzienkami.Do każdego dołka dodaj 200 µL pożywki wzrostowej. Następnie do dołków pustej płytki PCR 96-dołkowej wlej po 10 µL buforu lizującego. Przenieś kolejne 5 µL każdej zawiesiny komórkowej do tej płytki 96-dołkowej.Krótko odwiruj płytkę, aż ciecz osiądzie na dnie studni. Dodaj 200 µl pożywki do pozostałych 15 µl każdej zawiesiny komórkowej. Przechowuj oryginalną zawiesinę oraz replikaty w warunkach inkubacji w celu późniejszej weryfikacji statusu knockoutu klonów.Następnie zastosuj cykle termiczne, aby całkowicie zlizować komórki w buforze do lizy. Krótko odwiruj lizaty. Rozcieńcz lizaty 40 µL wody wolnej od nukleaz.Rozwiruj i krótko odwiruj rozcieńczone lizaty. Przed przeprowadzeniem fluorescencyjnego PCR zaprojektuj i przetestuj swoistość kilku par nieoznaczonych starterów na lizowanych komórkach typu dzikiego. Wyznacz optymalną parę starterów, a następnie zamów startery forward znakowane fluorophore oraz nieoznaczony starter reverse.Należy pamiętać o sprawdzeniu swoistości starterów przy użyciu komórek poddanych mieszaniu w wortexie, poddanych lizie za pomocą domowego buforu do lizy, ponieważ wyniki mogą różnić się od tych uzyskanych przy użyciu oczyszczonego DNA genomicznego. Używając oznakowanych starterów, należy przeprowadzić 20 µL fluorescencyjnych reakcji PCR z zastosowaniem trzech µL rozcieńczonych lizatów w celu amplifikacji regionów docelowych. Wielkość i względną ilość amplikonów PCR należy ocenić poprzez rozdzielenie pięciu µL amplikonów na 1% żelu agarozowym.Aby rozpocząć przygotowanie próbek, należy użyć wody wolnej od nukleaz do rozcieńczenia amplikonów DNA typu dzikiego oraz DNA poddanego edycji CRISPR/Cas9 do przybliżonego stężenia 2,5 nanogramów na mikrolitr. Wymieszać ze sobą równe objętości rozcieńczonych próbek DNA typu dzikiego i DNA poddanego edycji. Do dołków 96-dołkowej płytki PCR nanieść dziewięć mikrolitrów mieszaniny dejonizowanego formamidu i znakowanego barwnikiem standardu wielkości w stosunku 29:1 oraz jeden mikrolitr zmieszanych amplikonów.Szczelnie zamknij płytkę i podgrzewaj próbki w temperaturze 95 °C przez trzy minuty w termocyklerze do PCR. Bezpośrednio po podgrzaniu chłodź płytkę na lodzie przez trzy minuty. Przeprowadź kapilarną elektroforezę żelową przy użyciu analizatora genetycznego.Po zakończeniu elektroforezy zaimportuj dane do oprogramowania analitycznego i przedstaw je na wykresie. Zweryfikuj jakość standardu wielkości, przeglądając dane w odpowiednim kanale barwnika. Następnie wyeksportuj wartości kanału barwnika dla nieukierunkowanych kontroli typu dzikiego oraz ukierunkowanych klonów w formacie txt.Z tego pliku zaimportuj identyfikatory barwników, nazwy plików próbek, rozmiary fragmentów oraz wartości wysokości piku do programu arkusza kalkulacyjnego. Oblicz różnicę w rozmiarze fragmentu między ukierunkowanym klonem a nieukierunkowaną kontrolą typu dzikiego w każdej próbce. Zidentyfikuj klony z mutacjami typu indel, które nie są wielokrotnościami trzech par zasad.Przeszczepiaj seryjnie wybrane klony z przechowywanych replik. Przeprowadź sekwencjonowanie metodą Sangera oraz analizę western blot, aby określić genotypy klonów i zweryfikować status nokautu tych klonów. Linia komórkowa raka wątrobowokomórkowego HEPG2 została poddana modyfikacji za pomocą konstruktu CRISPR/Cas9 skierowanego przeciwko genowi Nap1L1.Niecelowane allele typu dzikiego oraz allele celowane metodą CRISPR/Cas9 poddano amplifikacji PCR przy użyciu starterów znakowanych odpowiednio zielnymi i niebieskimi fluoroforami. Dzięki zastosowaniu specjalnie zoptymalizowanego protokołu fluorescencyjnego PCR uzyskano wysoką wydajność amplikonów z celowanych klonów. W próbkach poszczególnych klonów nie zaobserwowano interferencji między zielnym a niebieskim barwnikiem fluorescencyjnym.Analiza wielkości fragmentów, przeprowadzona za pomocą kapilarnej elektroforezy żelowej, wykazała delecję jednej oraz 10 par zasad w dwóch zaprezentowanych tutaj klonach. Wyniki sekwencjonowania metodą Sangera były zgodne z analizą kapilarnej elektroforezy żelowej. Analiza Western blot potwierdziła, że wybrane klony nie wykazują ekspresji NAP1L1.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o dokładnym oznakowaniu próbek, ze względu na ich dużą liczbę, a także o zminimalizowaniu czasu ekspozycji amplikonów znakowanych fluoroforem, ponieważ są one światłoczułe. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak ilościowe RT-PCR, analiza Western blot oraz sekwencjonowanie metodą Sangera, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. czy geny docelowe zostały całkowicie znokautowane. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak w sposób wysokoprzepustowy genotypować klony mutantów indukowanych przez CRISPR/Cas9, wykorzystując fluorescencyjny PCR sprzężony z kapilarną elektroforezą żelową.

using-fluorescent-pcr-capillary-gel-electrophoresis-technique-to

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

CRISPR/Cas9 to solidny system do wywoływania zakłóceń w genach i elementach genetycznych. W tym miejscu opisujemy protokół skutecznego tworzenia delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR/Cas9.

Generowanie delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków za pomocą CRISPR/Cas9

Ostatnie osiągnięcia w zakresie genetycznego manipulowania liniami komórek somatycznych mają ogromny potencjał dla badań podstawowych i stosowanych. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia do produkcji nokautu generowanego przez CRISPR/Cas9 i badań przesiewowych w liniach komórkowych ssaków, z użyciem i bez użycia selektywnych markerów.

Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków

Ukierunkowana edycja genomu w systemie modelowym Danio rerio (danio pręgowany) została znacznie ułatwiona dzięki pojawieniu się metod opartych na CRISPR. W niniejszym artykule opisujemy uproszczony, solidny protokół generowania i identyfikacji nonsensownych alleli pochodzących z CRISPR, który obejmuje test mobilności heterodupleksowej i identyfikację mutacji przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji.

Wydajna produkcja i identyfikacja nokautów genów generowanych przez CRISPR/Cas9 w systemie modelowym Danio rerio

Protokół szybkiego rozerwania genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w pierwotnych komórkach krwiotwórczych myszy i człowieka jest opisany w tym artykule. Rybonukleoproteiny Cas9-sgRNA są wprowadzane przez elektroporację z sgRNA generowanymi przez transkrypcję in vitro i komercyjny Cas9. Wysoka wydajność edycji jest osiągana przy ograniczonych kosztach czasowych i finansowych.

Wysoce skuteczne rozrywanie genów mysich i ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych za pomocą CRISPR/Cas9

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

Technologia CRISPR-Cas9 zapewnia efektywną metodę precyzyjnej edycji genomu ssaków w dowolnym typie komórki i stanowi nowatorski sposób przeprowadzania genetycznych badań przesiewowych całego genomu. Szczegółowy protokół omawiający kroki wymagane do pomyślnego przeprowadzenia zbiorczych badań przesiewowych CRISPR-Cas9 dla całego genomu znajduje się tutaj.

Połączone genetyczne badania przesiewowe oparte na CRISPR w komórkach ssaków

Bezpośrednie dostarczanie wstępnie złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych Cas9/przewodnikowego RNA to szybki i skuteczny sposób na edycję genomu w komórkach krwiotwórczych. Tutaj wykorzystujemy to podejście do usunięcia tłumika intronowego RUNX1 i zbadania odpowiedzi transkrypcyjnych w komórkach białaczkowych OCI-AML3.

Badanie transkrypcyjnej roli tłumika intronowego RUNX1 przez rybonukleoproteinę CRISPR/Cas9 w komórkach ostrej białaczki szpikowej

Ten manuskrypt opisuje metodę badań przesiewowych na skalę genomu opartą na komórkach w celu identyfikacji interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowy.

Identyfikacja receptorów na powierzchni komórki za pomocą genetycznych badań przesiewowych CRISPR/Cas9 w skali genomu

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy proces edycji genów CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) do analizy sieci klastrów mikroRNA, który pozwala na szybkie wygenerowanie panelu genetycznie zmodyfikowanych linii komórkowych zawierających unikalne kombinacje delecji członków klastra miRNA o wielkości 35 kb w jednym eksperymencie.

Narzędzie do edycji genów CRISPR do analizy sieci klastrów mikroRNA

Technologie CRISPR-Cas zrewolucjonizowały dziedzinę edycji genomu. Jednak znalezienie i wyizolowanie pożądanej edycji linii zarodkowej pozostaje głównym wąskim gardłem. Dlatego protokół ten opisuje solidną metodę szybkiego badania przesiewowego nasienia danio pręgowanego wstrzykniętego za pomocą F0 CRISPR pod kątem edycji linii zarodkowej przy użyciu standardowych technik PCR, trawienia restrykcyjnego i elektroforezy żelowej.

Badania przesiewowe plemników w celu szybkiej izolacji zmian linii zarodkowej u danio pręgowanego

W tym miejscu opisujemy protokół generowania matczynego mutanta, który łączy stabilną linię knock-in zpc: cas9 z dostarczaniem kaset ekspresyjnych sgRNA za pośrednictwem Tol2.

Generowanie matczynych mutantów przy użyciu zpc:cas9 Knock-in Danio pręgowanego

Naucz się genotypowania mutantów CRISPR/Cas9 za pomocą fluorescencyjnej PCR i elektroforezy żelowej kapilarnej. Ta metoda wysokoprzepustowa umożliwia efektywną analizę różnych typów komórek w badaniach genetycznych.

Wykorzystanie techniki fluorescencyjnej elektroforezy żelowej kapilarnej PCR do genotypowania mutantów nokautujących za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w formacie wysokoprzepustowym (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie techniki fluorescencyjnej elektroforezy żelowej kapilarnej PCR do genotypowania mutantów nokautujących za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w formacie wysokoprzepustowym

Przeglądaj więcej filmów