Wykorzystanie techniki fluorescencyjnej elektroforezy żelowej kapilarnej PCR do genotypowania mutantów nokautujących za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w formacie wysokoprzepustowym

Ogólnym celem tej techniki jest wysokoprzepustowe genotypowanie klonów mutantów z insercjami i delecjami indukowanymi przez CRISPR/Cas9. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny genetyki, takie jak efekt fenotypowy wywołany wyłączeniem konkretnego genu w wybranym modelu SAIL. Główną zaletą tej techniki jest możliwość prowadzenia przesiewania o niskiej lub wysokiej przepustowości, które jest wielofunkcyjne.

Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat genetyki nowotworów u ludzi, można ją również zastosować w innych systemach, takich jak komórki macierzyste, pierwotne komórki ludzkie lub komórki pochodzenia nie ludzkiego. Pomysł na tę metodę pojawił się podczas wykonywania analiz typowania krótkich powtórzeń tandemowych (STR). Aby rozpocząć procedurę, należy przetransfekować wybrane komórki plazmidem współwyrażającym fluorescencyjną etykietę cas9 oraz pojedynczy przewodnik RNA (sgRNA).

Poddaj komórki trypsynizacji i wybierz około 3 500 klonów znakowanych fluorescencyjnie. Wysiej klony w porcjach po 500, 1 000 i 2 000 komórek na szalkach 10 cm w 8 mL pożywki wzrostowej uzupełnionej o penicylinę i streptomycynę. Inkubuj komórki w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C, wymieniając pożywkę co pięć dni, aż do momentu, gdy kolonie pojedynczych komórek będą widoczne gołym okiem.

Następnie należy pobrać poszczególne kolonie za pomocą pipety 200 µL z około 5 µL pożywki wzrostowej. Każdą kolonię należy przenieść do osobnej studzienki zawierającej 200 µL pożywki wzrostowej. Każdą mieszaninę należy kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby resuspenderć komórki.

Inkubować komórki w opisanych wcześniej warunkach, aż osiągną od 50 do 90% konfluencji. Usunąć nadmiar pożywki z dołków i dodać 25 µL 0,05% trypsyny EDTA bez czerwieni fenolowej do każdego dołka. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 7 minut.

Następnie wielokrotnie pipetuj zawiesiny w górę i w dół, aby resuspenderować komórki poddane trypsynizacji. Sprawdź studzienki pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki oddzieliły się od ścianek studzienek. W celu przygotowania replikatów poszczególnych klonów, przenieś 5 µL każdej zawiesiny komórkowej do pustej płytki hodowlanej z 96 studzienkami.

Do każdego dołka dodaj 200 µL pożywki wzrostowej. Następnie do dołków pustej płytki PCR 96-dołkowej wlej po 10 µL buforu lizującego. Przenieś kolejne 5 µL każdej zawiesiny komórkowej do tej płytki 96-dołkowej.

Krótko odwiruj płytkę, aż ciecz osiądzie na dnie studni. Dodaj 200 µl pożywki do pozostałych 15 µl każdej zawiesiny komórkowej. Przechowuj oryginalną zawiesinę oraz replikaty w warunkach inkubacji w celu późniejszej weryfikacji statusu knockoutu klonów.

Następnie zastosuj cykle termiczne, aby całkowicie zlizować komórki w buforze do lizy. Krótko odwiruj lizaty. Rozcieńcz lizaty 40 µL wody wolnej od nukleaz.

Rozwiruj i krótko odwiruj rozcieńczone lizaty. Przed przeprowadzeniem fluorescencyjnego PCR zaprojektuj i przetestuj swoistość kilku par nieoznaczonych starterów na lizowanych komórkach typu dzikiego. Wyznacz optymalną parę starterów, a następnie zamów startery forward znakowane fluorophore oraz nieoznaczony starter reverse.

Należy pamiętać o sprawdzeniu swoistości starterów przy użyciu komórek poddanych mieszaniu w wortexie, poddanych lizie za pomocą domowego buforu do lizy, ponieważ wyniki mogą różnić się od tych uzyskanych przy użyciu oczyszczonego DNA genomicznego. Używając oznakowanych starterów, należy przeprowadzić 20 µL fluorescencyjnych reakcji PCR z zastosowaniem trzech µL rozcieńczonych lizatów w celu amplifikacji regionów docelowych. Wielkość i względną ilość amplikonów PCR należy ocenić poprzez rozdzielenie pięciu µL amplikonów na 1% żelu agarozowym.

Aby rozpocząć przygotowanie próbek, należy użyć wody wolnej od nukleaz do rozcieńczenia amplikonów DNA typu dzikiego oraz DNA poddanego edycji CRISPR/Cas9 do przybliżonego stężenia 2,5 nanogramów na mikrolitr. Wymieszać ze sobą równe objętości rozcieńczonych próbek DNA typu dzikiego i DNA poddanego edycji. Do dołków 96-dołkowej płytki PCR nanieść dziewięć mikrolitrów mieszaniny dejonizowanego formamidu i znakowanego barwnikiem standardu wielkości w stosunku 29:1 oraz jeden mikrolitr zmieszanych amplikonów.

Szczelnie zamknij płytkę i podgrzewaj próbki w temperaturze 95 °C przez trzy minuty w termocyklerze do PCR. Bezpośrednio po podgrzaniu chłodź płytkę na lodzie przez trzy minuty. Przeprowadź kapilarną elektroforezę żelową przy użyciu analizatora genetycznego.

Po zakończeniu elektroforezy zaimportuj dane do oprogramowania analitycznego i przedstaw je na wykresie. Zweryfikuj jakość standardu wielkości, przeglądając dane w odpowiednim kanale barwnika. Następnie wyeksportuj wartości kanału barwnika dla nieukierunkowanych kontroli typu dzikiego oraz ukierunkowanych klonów w formacie txt.

Z tego pliku zaimportuj identyfikatory barwników, nazwy plików próbek, rozmiary fragmentów oraz wartości wysokości piku do programu arkusza kalkulacyjnego. Oblicz różnicę w rozmiarze fragmentu między ukierunkowanym klonem a nieukierunkowaną kontrolą typu dzikiego w każdej próbce. Zidentyfikuj klony z mutacjami typu indel, które nie są wielokrotnościami trzech par zasad.

Przeszczepiaj seryjnie wybrane klony z przechowywanych replik. Przeprowadź sekwencjonowanie metodą Sangera oraz analizę western blot, aby określić genotypy klonów i zweryfikować status nokautu tych klonów. Linia komórkowa raka wątrobowokomórkowego HEPG2 została poddana modyfikacji za pomocą konstruktu CRISPR/Cas9 skierowanego przeciwko genowi Nap1L1.

Niecelowane allele typu dzikiego oraz allele celowane metodą CRISPR/Cas9 poddano amplifikacji PCR przy użyciu starterów znakowanych odpowiednio zielnymi i niebieskimi fluoroforami. Dzięki zastosowaniu specjalnie zoptymalizowanego protokołu fluorescencyjnego PCR uzyskano wysoką wydajność amplikonów z celowanych klonów. W próbkach poszczególnych klonów nie zaobserwowano interferencji między zielnym a niebieskim barwnikiem fluorescencyjnym.

Analiza wielkości fragmentów, przeprowadzona za pomocą kapilarnej elektroforezy żelowej, wykazała delecję jednej oraz 10 par zasad w dwóch zaprezentowanych tutaj klonach. Wyniki sekwencjonowania metodą Sangera były zgodne z analizą kapilarnej elektroforezy żelowej. Analiza Western blot potwierdziła, że wybrane klony nie wykazują ekspresji NAP1L1.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o dokładnym oznakowaniu próbek, ze względu na ich dużą liczbę, a także o zminimalizowaniu czasu ekspozycji amplikonów znakowanych fluoroforem, ponieważ są one światłoczułe. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak ilościowe RT-PCR, analiza Western blot oraz sekwencjonowanie metodą Sangera, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. czy geny docelowe zostały całkowicie znokautowane. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak w sposób wysokoprzepustowy genotypować klony mutantów indukowanych przez CRISPR/Cas9, wykorzystując fluorescencyjny PCR sprzężony z kapilarną elektroforezą żelową.