Name: Analiza elektrofizjologiczna ludzkich kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CM) przy użyciu macierzy wieloelektrodowych (MEA) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Poznaj metodę elektrofizjologicznej analizy kardiomiocytów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych przy użyciu macierzy wieloelektrodowych. Technika ta umożliwia badanie odpowiedzi na leki i modelowanie chorób serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez następujące granty: CVON (HUSTCARE): Holenderska Inicjatywa Badań Sercowo-Naczyniowych (Holenderska Fundacja Kardiologiczna, Holenderska Federacja Uniwersyteckich Centrów Medycznych, Holenderska Organizacja Badań i Rozwoju Zdrowia oraz Królewska Holenderska Akademia Nauk); Europejska Rada ds. Badań Naukowych (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC). Dziękujemy E. Giacomelli (LUMC) za pomoc w różnicowaniu serca metodą hPSC.

1. Przygotowanie roztworów i odczynników
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę hodowlaną hPSC-CM przy użyciu niskoinsulinowej, albuminy surowicy bydlęcej, alkoholu poliwinylowego, niezbędnych lipidów (LI-BPEL) pożywki34,35,36, łącząc odczynniki opisane w Tabeli 1. Przefiltrować pożywkę przez filtr porowy 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.</li>
	<li>Przygotować ludzki roztwór podstawowy rekombinowanej fibronektyny, rozpuszczając 1 mg ludzkiej rekombinowanej fibronektyny w 5 ml sterylnej wody destylowanej do osiągnięcia stężenia 200 μg/ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Przygotuj 1% (w/v) roztwór detergentu enzymatycznego (patrz Tabela materiałów), aby pomóc w usunięciu resztek komórek z chipa mikromacierzy, rozpuszczając 1 g enzymatycznego detergentu w proszku w 100 ml ciepłej (~40-45 °C) dejonizowanej wody. Pozostawić roztwór do ostygnięcia i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego roku.</li>
</ol>
2. Sterylizacja chipów MEA (Rysunek 1A)
UWAGA: Dostępnych jest kilka różnych konfiguracji MEA, z formatami jedno- lub wielodołkowymi. Opisany tutaj protokół wykorzystuje pojedynczą komorę MEA zawierającą 60 elektrod rejestrujących w układzie siatki 8 x 8 (patrz tabela materiałów). Średnica elektrody wynosi 30 μm, a odległość między elektrodami 200 μm. Obecna jest również jedna elektroda referencyjna.
<ol>
	<li>Dokładnie spłucz chip wodą dejonizowaną.</li>
	<li>Umieść chipsy MEA w szklanej szalce Petriego, którą można sterylizować w autoklawie. Zawiń naczynie w folię aluminiową.</li>
	<li>Sterylizuj frytki w szybkowarze laboratoryjnym przez 6 minut. Poczekaj, aż naczynia ostygną przed otwarciem. 
	UWAGA: Alternatywnie wióry można sterylizować, zanurzając je w 1 ml 80% (v/v) etanolu w temperaturze pokojowej na 15-30 minut.</li>
	<li>Umieść wióry w kapturze do hodowli komórkowych i wystawiaj powierzchnię na działanie światła UV przez około 30 minut.</li>
</ol>
3. Powlekanie wiórów MEA (Rysunek 1B i 1C)
<ol>
	<li>Umieść czyste frytki w standardowej sterylnej plastikowej szalce Petriego o średnicy 10 cm Ø.</li>
	<li>Dodać 8 ml sterylnej wody destylowanej do szalki Petriego, aby utworzyć wilgotną komorę, która zapobiegnie wyschnięciu małej objętości pożywki hodowlanej na chipie po umieszczeniu w inkubatorze.</li>
	<li>Użyj niestandardowych pierścieni z politetrafluoroetylenu (PTFE) (rysunek 1B), aby zapewnić posiew kardiomiocytów w środku chipa, gdzie znajduje się układ elektrod. (Pierścienie PTFE są wcześniej przechowywane w 80% etanolu.) W kapturze hodowlanym wyjmij pierścienie z etanolu, umieść je na sterylnej szalce Petriego bez pokrywki i pozwól pierścieniom wyschnąć w kapturze.</li>
	<li>Umieść suchy pierścień w jednym chipie MEA za pomocą pęsety sterylizowanej płomieniowo (Rysunek 1C). 
	UWAGA: Alternatywnie użyj 80% etanolu do umycia pęsety i pozostaw do wyschnięcia w kapturze do hodowli tkankowych przed ich użyciem.</li>
	<li>Rozmrozić jedną podwielokrotność ludzkiej rekombinowanej fibronektyny (200 μg/ml w wodzie destylowanej) i rozcieńczyć w PBS z Ca2+ i Mg2+ do uzyskania roztworu roboczego 40 μg/ml. Pokryj elektrody, dodając 50 μl fibronektyny 40 μg/ml do wnętrza pierścienia. 
	UWAGA: Powlekanie przy użyciu ludzkiej rekombinowanej fibronektyny zapewnia optymalne przyleganie hPSC-CM. Można jednak stosować inne rodzaje białek powlekających, takie jak fibronektyna bydlęca lub mieszaniny białek macierzy zewnątrzkomórkowej.</li>
	<li>Zamknąć pokrywę plastikowej szalki Petriego o średnicy 10 cm i ostrożnie przenieść szalkę zawierającą chip MEA do inkubatora. Inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę lub w temperaturze 4 °C O/N.</li>
	<li>Przenieść naczynie zawierające chip MEA do okapu do hodowli komórkowych. Przed użyciem chipa MEA należy odessać 50 μl fibronektyny za pomocą pipety P200 lub systemu próżniowego w kapturze, bez przesuwania pierścienia PTFE. Na tym etapie użyj plastikowych końcówek. Upewnij się, że żadne ciała stałe (np. końcówki pipet) nie dotykają wnętrza naczynia, ponieważ może to spowodować uszkodzenie elektrod. 
	UWAGA: Przedłuży to żywotność chipów MEA.</li>
	<li>Delikatnie dodać 950 μl podłoża LI-BPEL (patrz Tabela 1 i Tabela materiałów), upewniając się, że jest równomiernie rozprowadzone i że pierścień nie unosi się na wodzie. Włóż naczynie z powrotem do inkubatora.</li>
</ol>
4. Dysocjacja i poszycie hPSC-CMs (Rysunek 2)
UWAGA: Opisany tutaj protokół wykorzystuje hPSC-CM, które zostały zróżnicowane w hodowli jednowarstwowej za pomocą cytokin34 po ~18 dniach od rozpoczęcia różnicowania. Udowodniono jednak, że nadaje się do każdej hodowli 2D i 3D HPSC-CM. W przypadku stosowania zróżnicowanych kultur we wcześniejszych lub późniejszych punktach czasowych może być konieczne dostosowanie czasu inkubacji enzymu dysocjującego (patrz tabela materiałów). Poniższe objętości przeznaczone są dla pojedynczego dołka o formacie płytki 12-dołkowej (3,8cm2).
<ol>
	<li>Dobrze odessać pożywkę z kultury hPSC-CMs.</li>
	<li>Podczas pracy pod kapturem do hodowli tkankowej dodaj 1-2 ml / studzienkę PBS bez Ca2 + / Mg2 +, aby umyć kulturę. Zassać PBS.</li>
	<li>Dodać 500 μl/basenik enzymu dysocjacyjnego. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 1 ml li-bpel/basenik w celu rozcieńczenia enzymu. Delikatnie odczepić monowarstwę hPSC-CMs, delikatnie drapiąc za pomocą pipety P1000. Zebrać zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Przepłukać studzienkę 1 ml li-bpel, aby zebrać wszystkie pozostałe komórki i grudki komórek.</li>
	<li>Dodaj kolejne 2-3 ml LI-BPEL, aby osiągnąć końcową objętość 5-6 ml i delikatnie pipetuj w górę i w dół 3-5 razy pipetą 5 mL, aby zdysocjować grudki komórek. 
	UWAGA: Dysocjacja na pojedyncze komórki w tym momencie nie jest konieczna, ponieważ wpłynie na przeżycie komórek. Obecność małych skupisk zapewni wyższą żywotność komórek.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze pokojowej przez 3 minuty przy 300 x g.</li>
	<li>Usunąć supernatant, starając się usunąć większość nadmiaru płynu, ale bez usuwania osadu komórkowego.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 250 μL LI-BPEL (używając P1000 i pipetując bardzo delikatnie).</li>
	<li>Rozprowadzić ~50 μl zawiesiny komórek na MEA (można przygotować do 5 MEA z jednego dołka płytki 12-dołkowej), pipetując zawiesinę ogniwa bezpośrednio do środka pierścienia PTFE, na górze układu elektrod. 
	UWAGA: Na tym etapie komórki są trudne do policzenia ze względu na obecność klastrów komórek, a całkowita liczba komórek na MEA może się znacznie różnić, w zależności od użytego źródła hPSC-CM. Podczas powlekania upewnij się, że chmura zdysocjowanych komórek pokrywa obszar elektrod.</li>
	<li>Ostrożnie przenieść MEA do inkubatora w temperaturze 37 °C i pozwolić komórkom przyłączyć O/N</li>
</ol>
5. Usuwanie pierścienia i odświeżanie medium (Rysunek 3)
<ol>
	<li>Po 1 dniu od posiewu ostrożnie zdejmij pierścień w sterylnym środowisku za pomocą sterylnej pęsety (Rysunek 3A-3B).</li>
	<li>Opłucz pierścień w 80% (v/v) etanolu i przechowuj go w probówce o pojemności 50 ml zawierającej świeży 80% (v/v) etanol.</li>
	<li>Delikatnie usuń 500 μl podłoża z chipa MEA i dodaj 500 μl świeżego LI-BPEL.</li>
	<li>Przenieść MEA do inkubatora w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Komórki powinny zacząć bić 1-7 dni po usunięciu pierścienia i zmianie podłoża (ryc. 3C).</li>
	<li>Zmierz aktywność elektryczną hPSC-CM na MEA 1-7 dni po usunięciu pierścienia.</li>
</ol>
6. Sprawdź jakość sygnału (Rysunek 4)
<ol>
	<li>Włącz komputer i uruchom pakiet oprogramowania powiązany z konfiguracją MEA: TCX-Control, MC_MEA Select i MC_Rack. Ustaw temperaturę na 37 °C w TCX-Control, aby rejestrować pomiary w temperaturze fizjologicznej.</li>
	<li>Wyjąć z inkubatora naczynie zawierające chip MEA. Otwórz pokrywkę, wyjmij chip MEA i umieść go na chusteczce, aby wchłonąć resztki wody.</li>
	<li>Ostrożnie przetrzyj zewnętrzne styki płytki chusteczką i wyczyść je bawełnianym wacikiem zwilżonym 100% (v/v) etanolem, aby usunąć wszelkie resztki wody lub zanieczyszczeń, które mogą powodować szum sygnału.</li>
	<li>Przenieś płytkę MEA do podgrzewanego (37 °C) stopnia głównego nagrywającego, aby wykryć spontaniczną aktywność (np. sprzęt: patrz Table of Materials; oprogramowanie: MC_Rack).
	<ol>
		<li>Otwórz MC_Rack: Kliknij "Edytuj" → "Dodaj MC_Card", aby utworzyć nowy protokół. Użyj menu rozwijanego "Edytuj", aby dodać różne okna rejestratora i wyświetlacza do protokołu. 
		UWAGA: Zalecana jest częstotliwość próbkowania co najmniej 10 kHz. Używany przez nas protokół zawiera jedno narzędzie Longterm Display Tool, z pełnym układem całego chipa MEA, oraz jeden sorter Spike Sorter, niezbędny do uchwycenia działania leku w czasie rzeczywistym. Wycięcie kolca jest dostrojone za pomocą "Pre Trigger" wynoszącego 20 ms, "Post Trigger" trwającego 800 ms i "Dead Time" wynoszącego 2 ms. Protokół można zapisać jako plik ".rck" i ponownie załadować przed rozpoczęciem eksperymentów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom protokół w trybie odtwarzania, klikając przycisk 'play'. 
	UWAGA: W tym momencie możliwe jest ponowne załadowanie protokołu zapisanego w kroku 6.5. W MC_Rack załaduj protokół (rozszerzenie pliku .rck), klikając "Plik" → "Otwórz".</li>
	<li>Jeśli sygnały wykazują wyraźnie widoczne piki R i piki T, odczekaj 10-15 minut, aby zakończyć fazę adaptacji. Przykłady śladów dobrej i złej jakości pokazano na rysunku 4. 
	UWAGA: Jeśli w żadnej z elektrod nie można wykryć piku T, nie kontynuuj eksperymentu. Zwykle jest to wynikiem słabej aktywności elektrycznej hPSC-CM lub słabego przyłączenia ogniw do elektrod.</li>
</ol>
7. Rozpocznij eksperyment i nagrywanie
<ol>
	<li>Kliknij "nagraj", a następnie "odtwórz" i zbieraj dane przez 10 minut w warunkach bazowych, aby określić stan ustalony. Opisz elektrody, które mają najlepszy sygnał, aby można je było łatwo zidentyfikować i później wyeksportować do analizy.</li>
	<li>W celu oceny odpowiedzi na lek należy dodawać rosnące stężenia leku co 10 minut. Na przykład dodać bloker hERG E4031 w końcowym stężeniu 1 μM. W tym celu należy usunąć 100 μl pożywki i dodać taką samą objętość 10 μM E4031 rozpuszczonego w pożywce. 
	UWAGA: Jak wcześniej wykazali Cavero i współpracownicy31, mądry wybór objętości, w której leki są rozpuszczone, jest ważny, ponieważ może to głęboko zmienić krzywą odpowiedzi na lek</li>.
	<li>Powtórzyć krok 7.2 dla wszystkich pozostałych stężeń leku będących przedmiotem zainteresowania.</li>
	<li>Kliknij "stop", aby zakończyć nagrywanie na końcu protokołu.</li>
</ol>
8. Czyszczenie MEA do ponownego użycia
<ol>
	<li>Po zakończeniu nagrywania eksperymentu delikatnie usuń podłoże za pomocą pipety P1000. Nie dotykaj wnętrza naczynia, ponieważ może to spowodować uszkodzenie elektrod. Wyrzuć zgodnie z lokalnymi przepisami bezpieczeństwa.</li>
	<li>Opłucz frytki MEA wodą dejonizowaną za pomocą butelki do mycia i powtórz krok prania 3-4x. 
	UWAGA: W tym momencie nie jest konieczne, aby ogniwa były całkowicie odłączone od chipa.</li>
	<li>Dodać 1 ml roztworu detergentu enzymatycznego 1% (v/v) do każdego dołka i inkubować O/N w temperaturze 4 °C, aby umożliwić oderwanie komórek i usunięcie komórek.</li>
	<li>Dzień później dokładnie spłucz wióry MEA wodą dejonizowaną, aby usunąć enzymatyczny roztwór detergentu i resztki komórek, a następnie dodaj 1 ml wody dejonizowanej. Czyste wióry MEA można przechowywać zanurzone w wodzie dejonizowanej o temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
9. Eksport danych
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie MC_Data Tool połączone z konfiguracją MEA.</li>
	<li>Kliknij "Plik" → "Otwórz MCD".</li>
	<li>Kliknij "Narzędzia" → "Konwertuj MCD na ABF".</li>
	<li>Wybierz elektrody z najlepszymi sygnałami rejestracyjnymi, które mają zostać wyeksportowane do analizy. Wybierz katalog, w którym chcesz zapisać wyeksportowane pliki i kliknij "Zapisz". Procedura eksportu może trwać kilka minut, w zależności od liczby wyeksportowanych elektrod i całkowitego rozmiaru plików zapisu.</li>
</ol>
10. Analiza danych
<ol>
	<li>Pobierz i zainstaluj program do akwizycji i analizy danych elektrofizjologicznych (np. pClamp). Po zakończeniu uruchom oprogramowanie analityczne (np. Clampfit).</li>
	<li>Obliczanie interwału RR (rysunek 5).
	<ol>
		<li>Umieść dwa pionowe kursory, aby zdefiniować obszar zainteresowania na trasie. Wybierz "Wykrywanie zdarzeń" → "Wyszukiwanie progowe". Kursor poziomy powinien przecinać wszystkie zdarzenia, które muszą zostać określone ilościowo, jak pokazano na rysunku 5A.</li>
		<li>Kliknij "OK", a następnie "Zaakceptuj całą kategorię". Następnie oprogramowanie przeszuka ślad w poszukiwaniu wszystkich odpowiednich zdarzeń. Nad wydarzeniami zostaną umieszczone niebieskie oznaczenia.</li>
		<li>Dostosuj czułość automatycznego wyboru, dostrajając parametry w głównym oknie wykrywania zdarzeń</li>.
		<li>Po automatycznej identyfikacji wszystkich zdarzeń przejdź do okna wyników (Okno → Wyniki) i skopiuj kolumnę zatytułowaną "Interwał interwału", która zawiera dane dotyczące częstotliwości (Rysunek 5B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczanie odstępu QT (ryc. 6-9):
	<ol>
		<li>Umieść jeden kursor tuż przed i jeden po pojedynczym FP w stanie ustalonym. Wybierz opcję "Wykrywanie zdarzeń" → "Utwórz szablon" (Rysunek 6). </li>
		<li>Sprawdź, czy FP jest poprawnie zidentyfikowany i kliknij "Dodaj". Szablon zostanie przeniesiony do dolnego panelu.</li>
		<li>Zapisz szablon jako plik ".atf". W ten sposób utworzono szablon śladu, który będzie przeszukiwany przez oprogramowanie przez cały czas trwania nagrania (rysunek 7). Utwórz jeden szablon dla każdego schorzenia, ponieważ działanie leku może zmienić kształt FP. W razie potrzeby nieznacznie przefiltruj ślad, aby uwzględnić maksymalnie 10 000 punktów w obrębie dwóch kursorów.</li>
		<li>Po zapisaniu szablonu z rozszerzeniem ".atf" wybierz "Wykrywanie zdarzeń" → "Wyszukiwanie szablonów" i załaduj szablon.</li>
		<li>Dostosuj "Próg dopasowania szablonu", aby poprawnie zidentyfikować wszystkie FP w wybranym interwale.</li>
		<li>Gdy wszystkie zdarzenia zostaną poprawnie zidentyfikowane, zapisz je w nowym pliku ".abf".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otwórz plik z oprogramowaniem analitycznym i automatycznie oblicz "czas szczytu" zarówno dla pików Q/R, jak i T (rysunki 8, 9). Jeśli ślady są bardzo głośne, zastosuj filtr. Oblicz odstęp QT, odejmując wartość Q/R od wartości T w wybranym edytorze arkuszy kalkulacyjnych.</li>
</ol>

C.L.M. jest współzałożycielem i doradcą Pluriomics bv. Część kosztów publikacji została pokryta przez Multi Channel Systems.

Protokół ten pokazuje, jak dysocjować i przygotować hPSC-CM do pomiaru ich FP za pomocą MEA. hPSC-CM zwykle wykazują spontaniczną aktywność elektryczną, którą można zmierzyć jako FP i mogą dostarczyć istotnych danych w odniesieniu do częstotliwości dudnienia, czasu trwania odstępu QT i zdarzeń arytmicznych.
Dysocjacja 2D zróżnicowanych kultur serca jest potrzebna do odtworzenia warstwy dudnienia na MEA i stanowi krytyczny krok. Naprężenia mechaniczne spowodowane wielokrotnym pipetowaniem i/lub agresywnym leczeniem enzymami dysocjacyjnymi mogą powodować wysoką śmiertelność komórek, brak przyczepienia do płytki MEA i brak spontanicznej aktywności elektrycznej. Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem kultur jednowarstwowych. Jednak podobne podejście można zastosować do kultur trójwymiarowych (3D) (np. ciał zarodkowych lub EB) z niewielkimi modyfikacjami, takimi jak pobieranie EB, a następnie płukanie PBS i dłuższy czas inkubacji z enzymem dysocjującym. Co ważne, zarówno w kulturach zróżnicowanych 2D, jak i 3D, im starsze są zróżnicowane komórki, tym dłuższy czas inkubacji może być wymagany do oderwania komórek z powodu zwiększonego odkładania się macierzy zewnątrzkomórkowej.
Opisany tutaj protokół do ilościowego określania parametrów FP może być wykorzystany do generowania krzywych dawka-odpowiedź dla leków kardioaktywnych. Jak niedawno opisali Cavero i wsp.31, początkowe stężenie leku może mieć głęboki wpływ na wynik pomiaru MEA. Dlatego, aby poprawić dokładność i wiarygodność wyników, sugerujemy, co następuje: 1) w przypadku nieodwracalnych aktywatorów/blokerów należy użyć stosunkowo dużych objętości pożywki zawierającej badany lek. Bardziej szczegółowo, usuń 10-50% objętości pożywki z chipa MEA i dodaj równą objętość podłoża, w którym lek został wcześniej rozpuszczony w odpowiednim stężeniu. W takim przypadku, aby obliczyć końcowe stężenie leku, należy wziąć pod uwagę zmianę stężenia po usunięciu pożywki. 2) W przypadku odwracalnych aktywatorów/blokerów należy dodać 10 μl każdej dawki leku z 100-krotnego roztworu podstawowego.
Większość protokołów różnicowania serca skutkuje zmienną mieszaną populacją kardiomiocytów węzłowych, przedsionkowych i komorowych, przy czym najbardziej reprezentowany jest typ komorowy. Może to stanowić ograniczenie podczas modelowania chorób serca wpływających na określony podtyp kardiomiocytów lub leków działających na kanały jonowe specyficzne dla podtypu serca. Chociaż w kilku badaniach zoptymalizowano warunki, aby skierować bardziej kontrolowaną specyfikację podczas różnicowania serca 3,5,37,38, ich szersze zastosowanie jest nadal badane.
Ponadto można zaobserwować zmienną efektywność różnicowania (w różnych doświadczeniach i w różnych liniach hPSC) 39,40,41,42,43,44. Strategie wzbogacania kardiomiocytów oparte na ekspresji białek powierzchniowych35,45 (przez sortowanie komórek wspomagane florescencją lub selekcję magnetyczną46,47) i selekcję metaboliczną44,48 mogą stanowić ważne strategie, które można zastosować do dowolnej (genetycznie zmodyfikowanej lub niezmodyfikowanej) linii hPSC przed posiewem hPSC-CM, w celu poprawy sygnału elektrycznego.
Chociaż hPSC-CM są notorycznie niedojrzałe w porównaniu z dorosłymi kardiomiocytami 4,49, okazały się cenne w rekapitulacji i identyfikacji specyficznych zmian związanych z chorobą (np. w kanałopatiach)19,20,50 i odpowiedzi wywołanych lekami (np. blokery kanałów jonowych serca)4,51. Co więcej, niedojrzałe komórki są łatwiejsze do dysocjacji i lepiej się regenerują niż dorosłe kardiomiocyty po dysocjacji i posiewie44, dlatego niedojrzałość hPSC-CM może być nagradzana jako zaleta w tym względzie. Jednak, aby móc podsumować np. choroby serca o późnym początku i wiernie odtwarzają odpowiedzi lekowe dorosłych kardiomiocytów, należy uzyskać bardziej dojrzały stan mechaniczny, metaboliczny i elektryczny hPSC-CM. Metody dojrzewania tych komórek obejmują wydłużony czas w hodowli52, naprężenie mechaniczne53, stymulację elektryczną54, dodanie małych cząsteczek55, hodowlę 3D56, wspólną hodowlę z innymi typami komórek57, a nawet kombinację tych podejść58; Do tej pory żadne z tych podejść nie doprowadziło do fenotypu podobnego do dorosłego.
W ramach cech niedojrzałości, hPSC-CM wykazują automatyzm elektryczny. W tym miejscu znajdują się szczegółowe informacje na temat dokładnego określania odstępów QT i RR. Jednym z ograniczeń pomiaru spontanicznej aktywności elektrycznej jest to, że porównanie odstępów QT może być trudne, gdy hPSC-CM wykazują różne częstotliwości dudnień. W takim przypadku można użyć wzorów Bazetta lub Fridericii w celu skorygowania odstępu QT dla danej częstotliwości. Jednak, jak wcześniej informowaliśmy30, zdecydowanie zalecamy przeprowadzenie analizy regresji osi głównej poprzez wykreślenie przedziału QT w funkcji odstępu QR zarówno dla danych surowych, jak i skorygowanych, aby wykluczyć wszelkie możliwe odchylenia wynikające z samej metody korekcji.
Przedstawiony tu protokół, wraz z wcześniej opisanymi metodami59,60, przyczynia się do standaryzacji procedur i analizy FP hPSC-CM, poprawiając odtwarzalność danych i umożliwiając lepsze porównanie wyników międzylaboratoryjnych.

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) mają zdolność do samoodnawiania się i generowania praktycznie każdego typu komórek ludzkiego ciała poprzez różnicowanie1,2. Opisano szczegółowe protokoły dotyczące kierowania różnicowaniem hPSC na kilka linii serca (kardiomiocyty komorowe, przedsionkowe, kardiomiocyty podobne do rozrusznika serca)3,4,5,6,7. Kardiomiocyty są komórkami aktywnymi elektrycznie, a szczegółowa wiedza na temat ich aktywności elektrofizjologicznej może być niezwykle pouczająca dla zrozumienia rozwoju i chorób serca8. Specyficzne dla pacjenta kardiomiocyty pochodzące z hiPSC (hiPSC-CMs) zostały z powodzeniem wykorzystane do modelowania i badania cech komórkowych, molekularnych i elektrycznych kilku zaburzeń rytmu serca, w tym zespołu długiego odstępu QT (LQTS)9,10,11,12,13, zespół Brugadów14 i polimorficzny katoloaminergiczny częstoskurcz komorowy<klasa SUP="xref">15,<klasa SUP="XREF">16. Ponadto do chorych hiPSC-CM dodano wiele leków, aby podsumować interwencję terapeutyczną i uratować komórkowe patologiczne fenotypy10,15,20,21,22. Niedawno opracowano platformy przesiewowe oparte na hiPSC-CM WT, w odpowiedzi na zapotrzebowanie na systemy ludzkie we wczesnych fazach odkrywania leków23,24,25 ponieważ kardiomiocyty gryzoni różnią się znacznie od ludzi pod względem ekspresji kanałów jonowych i biofizyki26.
W tym celu opracowywane i wdrażane są technologie odpowiednie dla aplikacji o średniej i wysokiej przepustowości. Obejmują one optyczne zapisy potencjału błonowego, stanów nieustalonych i odkształceń Ca2+, pomiary impedancji (jako pośrednia miara kurczliwości komórek) oraz pomiary potencjału pola zewnątrzkomórkowego (FP) (w celu przeglądu patrz odniesienie24). Urządzenia z matrycami wieloelektrodowymi (MEA) umożliwiają rejestrację sygnałów fal elektrycznych (lub FP) generowanych i kształtowanych przez monowarstwy lub małe skupiska kardiomiocytów. Kontur FP koreluje z potencjałem czynnościowym serca i w pewnym stopniu z zapisami elektrokardiogramu (EKG)27; zazwyczaj wykazują początkowy szybki skok w górę odpowiadający napływowi Na + i depolaryzacji błony (pik R / Q), fazę wolnej fali / plateau prawdopodobnie odpowiadającą napływowi Ca2 + oraz fazę repolaryzacji odpowiadającą dominującemu wypływowi K + (pik T). Perturbacja przebiegu FP może być skorelowana ze zmianami w określonych fazach potencjału czynnościowego28.
Chociaż zapisy potencjałów czynnościowych z zaciskami krosowymi mogłyby być bardziej pouczające, szczególnie dla parametrów takich jak prędkość ruchu w górę i spoczynkowy potencjał membranowy, ręczne pomiary nie są możliwe do przeprowadzenia eksperymentów na średnim i wysokim poziomie przepustowości, podczas gdy automatyczny zacisk krosowy został dopiero niedawno zastosowany do hPSC-CMs29. Ponieważ jednak długotrwałe zapisy na MEA pozwalają na badanie zarówno ostrego, jak i przewlekłego narażenia na związki, obecnie możliwe jest wykorzystanie platform hPSC-CM do badań przesiewowych leków, discovery24,30 oraz do farmakologii bezpieczeństwa31,32. To obietnica przyszłej medycyny precyzyjnej lub spersonalizowanej33.
Celem tego protokołu jest dostarczenie niezbędnych informacji do dysocjacji i powlekania hPSC-CM na chipach MEA oraz mierzenia ich FP. W tej procedurze każdy krok został zoptymalizowany, zapewniając optymalną przeżywalność i regenerację komórek po dysocjacji, optymalne przyleganie komórek do płytki MEA oraz standaryzowaną analizę i kwantyfikację parametrów. W szczególności wyjaśniono i zilustrowano procedurę zewnątrzkomórkowego zapisu FP, analizę odstępów QT i RR oraz ocenę działania leku.

<table><tbody><tr><td>Komora bezpieczeństwa biologicznego/okap z przepływem laminarnym</td><td>System rejestracji Cleanair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEA2100 in vitro Systemy</td><td></td><td></td><td>wielokanałowe</td></tr><tr><td>Inkubator kultur komórkowych CO2 Wirówka</td><td>Sanyo</td><td>MCO-15A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hitachi</td><td>himac-CT6EL</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy Leica</td><td> Microsystems</td><td>MS5</td><td></td></tr><tr><td>Pipeter ręczny (P-10 (10 &mu; L), P-200 (200 &mu; L), P-1000 (1,000 &mu; L))</td><td>Gilson International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcówki filtrujące (10 &mu; L, 200&mu; L, 1,000&mu; L)</td><td>Corning</td><td>4807 (10 &mu; L), 4810 (200&mu; L), 4809 (1000&mu; L)</td><td></td></tr> <tr><td>Jednorazowy filtr górny do butelki (0,22 i mu; m wielkość porów)</td><td>Millipore</td><td>SCGVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna plastikowa pipeta</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606180 (5 mL), 607180 (10 mL), 760180 (25 mL)</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoklawowalne szalki Petriego</td> Układ <td>VWR/ Duran Group</td><td>391-0860</td><td></td></tr><tr><td>MEA</td><td>Systemy wielokanałowe</td><td>MEA200/30iR-Ti-gr</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna (PBS) wapń, magnez</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040-091</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) bez wapnia, bez magnezu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-169</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka rekombinowana fibronektyna</td><td>Tebu-Bio</td><td>J64560</td><td></td></tr><tr><td>Wykonane na zamówienie pierścienie MEA z politetrafluoroetylenu (PTFE)</td><td>LUMC: Dział Rozwoju</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>InstrumentówEnzym dysocjacyjny - TrypLE Select 1x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563-029</td><td></td></tr><tr><td>Tergazyme detergent enzymatyczny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273287-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Woda destylowana</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15230-089</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td> Uwagi</strong</td></tr><tr><td>>Odczynniki do podłoża LI-BPEL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21056-023</td><td></td></tr><tr><td>F12 mieszanka odżywcza (szynka)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>2-fosforan kwasu askorbinowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>Bezbiałkowy hybrydoma Medium-II (PFHMII)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12040-077</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Bovogen Biologicals Australia</td><td>BSAS05</td><td></td></tr><tr><td>Poli(Alkohol winylowy) (PVA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowy (CDLC)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11905-031</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferyna-Selen-Etanoloamina (ITS-X) 100x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51599-056</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-Monotioglicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td> Nazwa</td><td>Company</td><td>Wersja oprogramowania</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>MC_Rack</td><td>Systemy wielokanałowe</td><td>4.6.2</td><td>Alternatywnie dane mogą być rejestrowane za pomocą Cardio2D lub MC_Experimenter (systemy wielokanałowe)</td></tr><tr><td>TCX Control</td><td>Multi Channel Systems</td><td>1.3.4</td><td></td></tr><tr><td>MEA Select</td><td>Multi Channel Systemy</td><td>1.3.0</td><td></td></tr><tr><td>MC_Data Narzędzie</td><td>Systemy wielokanałowe</td><td>2.6.15</td><td>Alternatywnie, Multi Channel Data Manager (MultiChannel Systems) może być używany, gdy wymagany jest niestandardowy eksport danych (HDF5, EDF, etc.)</td></tr><tr><td>Clampfit</td><td>Molecular Devices</td><td>7.0.0</td><td>Używany w kroku 10.1 do analizowania, tworzenia wykresów i formatowania wszystkich danych. Aby korzystać z Clampfit, pobierz i zainstaluj aplikację do zbierania danych elektrofizjologicznych i pClam (najnowsza wersja, 10.7.0), dostępną na stronie internetowej Molecular Devices. Po zakończeniu uruchom oprogramowanie Clampfit. Alternatywnie dane mogą być analizowane za pomocą Cardio2D (MultiChannel Systems) lub niestandardowego kodu MatLab.</td></tr></tbody></table>

analiza elektrofizjologiczna ludzkich kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hpsc-cm) przy użyciu macierzy wieloelektrodowych (mea)

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs)

Kardiomiocyty mogą być teraz uzyskiwane z dużą wydajnością zarówno z ludzkich embrionalnych, jak i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). Kardiomiocyty pochodzące z hPSC (hPSC-CMs) są coraz częściej uznawane za mające wielką wartość w modelowaniu chorób sercowo-naczyniowych u ludzi, zwłaszcza zespołów arytmii. Wykazały one również znaczenie jako systemy in vitro w przewidywaniu reakcji na leki, co czyni je potencjalnie przydatnymi w badaniach przesiewowych i odkrywaniu leków, farmakologii bezpieczeństwa, a być może ostatecznie w medycynie spersonalizowanej. Byłoby to ułatwione dzięki wyprowadzeniu hPSC-CM od pacjentów lub osób podatnych na zakażenie jako hiPSC. Jednak we wszystkich zastosowaniach precyzyjny pomiar i analiza właściwości elektrycznych hPSC-CM są niezbędne do identyfikacji zmian spowodowanych mutacjami kanałów jonowych serca i/lub lekami, które celują w kanały jonowe i mogą powodować nagłą śmierć sercową. W porównaniu z ręcznym zaciskiem krosowym, urządzenia z matrycą wieloelektrodową (MEA) mają tę zaletę, że umożliwiają zapisy o średniej i wysokiej przepustowości. Protokół ten opisuje, w jaki sposób dysocjować hodowle komórkowe 2D hPSC-CM na małe agregaty i pojedyncze komórki oraz umieszczać je na MEA, aby rejestrować ich spontaniczną aktywność elektryczną jako potencjał pola. Opisano tu również metody analizy zarejestrowanych danych w celu wyodrębnienia określonych parametrów, takich jak odstępy QT i RR. Zmian tych parametrów można oczekiwać w przypadku hPSC-CM zawierających mutacje odpowiedzialne za zaburzenia rytmu serca i po dodaniu specyficznych leków, co pozwoli na wykrycie tych, które niosą ze sobą ryzyko kardiotoksyczne.

Jeden dzień po dysocjacji i wysiewaniu warstwa hPSC-CM będzie widoczna jako gęsta, biała błona pokrywająca środek komory MEA (Rysunek 3A). Po zdjęciu pierścienia (Rycina 3B), warstwa powinna pozostać na swoim miejscu, a oględziny pod mikroskopem świetlnym wykażą, że elektrody MEA są pokryte (kurczącą się) warstwą hPSC-CM (Rycina 3C). Ze względu na fizyczne i elektryczne sprzężenie komórek, do analizy zostanie użyta tylko jedna elektroda (elektroda złota).
Alternatywnie, podczas pracy ze strukturami 3D, takimi jak ciała embrionalne lub mikrotkanki, można je wysiewać w taki sposób, aby były one odizolowane fizycznie i elektrycznie. Inspekcja wizualna pod mikroskopem mogłaby potwierdzić brak fizycznego połączenia między klastrami, a niesynchronizowane fale R w MEA potwierdzają brak sprzężenia elektrycznego. W takim przypadku można analizować wiele niezależnych elektrod.
Typowe zapisy śladów FP przedstawiono na Rysunku 4. W szczególności, ślad dobrej jakości można zdefiniować poprzez obecność wyraźnego piku odpowiadającego napływowi Na+ i depolaryzacji błony (pik R/Q), wyraźnej fazy repolaryzacji odpowiadającej odpływowi K+ (pik T) oraz wysokiego stosunku sygnału do szumu (Rysunek 4A, lewa strona: zwrócić uwagę na skalę osi y oraz Rysunek 4B). Ślady złej jakości (Rysunek 4A, środek) mogą być wynikiem braku przywierania hPSC-CM do płytki MEA lub słabej aktywności elektrycznej hPSC-CM. Odczekanie 1–3 dni w celu lepszego przywierania może poprawić sygnał; jednak, jeśli nie jest widoczna poprawa sygnału, zaleca się wykluczenie tej MEA z eksperymentów. Zaszumione ślady (Rysunek 4A, prawa strona) można analizować po zastosowaniu filtracji.
Prawidłową analizę odstępu RR można potwierdzić poprzez wizualną inspekcję ekranu wyświetlającego detekcję szczytów (Rysunek 5A, 5B). W przedziale czasowym wyznaczonym przez kursory pionowe powinny znajdować się niebieskie oznaczenia odpowiadające każdemu szczytowi. W przypadku, gdy program nie zidentyfikuje jednego lub więcej szczytów, należy spróbować przesunąć kursor poziomy i ponownie uruchomić analizę lub dostosować ustawienia detekcji. Analogicznie, prawidłową analizę odstępu QT można potwierdzić poprzez wizualną inspekcję ekranu wyświetlającego detekcję FP (Rysunek 7). W przedziale czasowym wyznaczonym przez kursory pionowe powinny znajdować się niebieskie oznaczenia odpowiadające każdej detekcji FP. Jeśli program nie zidentyfikuje jednego lub więcej FP, należy spróbować ponownie zdefiniować szablon FP (Rysunek 6) lub dostosować ustawienia detekcji i ponownie uruchomić analizę.
Wyekstrahowane pojedyncze zapisy FP lub ich średnia (Rysunek 8) mogą być wykorzystane do wyznaczenia wartości odstępu QT przy zastosowaniu konkretnych ustawień, zgodnie z Rysunkiem 9. Zaleca się analizę zależności QT-RR, która jest istotna w przypadku linii hPSC zmutowanych oraz WT (Rysunek 10A), a także w celu oceny konieczności i/lub efektu korekcji odstępu QT (Rysunek 10B-10D). hPSC-CM niosące mutacje wywołujące LQTS wykazują wydłużone odstępy QT w porównaniu z kontrolą WT (Rysunek 1A). Leczenie hPSC-CM blokerem hERG skutkuje wydłużeniem odstępu QT (Rysunek 1B); przeciwnie, zastosowanie aktywatora hERG prowadzi do skrócenia odstępu QT (Rysunek 1C). Wreszcie, podawanie leków wpływających na częstotliwość skurczów hPSC-CM powinno być widoczne jako zmiana odstępu RR (Rysunek 1D, skrócenie odstępu RR).
<img alt="Proces przygotowania chipa MEA; schemat sterylizacji i powlekania fibronektyną do hodowli komórkowej." src="/files/ftp_upload/55587/55587fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Sterylizacja i powlekanie chipów MEA. (A) Schemat przedstawiający proces sterylizacji, obejmujący umieszczenie chipa MEA w autoklawowalnej szklanej szalce Petriego, zawinięcie w folię aluminiową, sterylizację parową przez 6 min oraz naświetlanie promieniami UV przez 30 min. (B) Widok z góry (panel lewy) i z boku (panel środkowy) specjalnie wykonanego pierścienia z PTFE; pierścień posiada średnicę zewnętrzną 1,2 cm, w tym 4 wypustki umożliwiające jego pozycjonowanie w centrum chipa MEA, natomiast średnica wewnętrzna wynosi 0,4 cm (panel prawy). (C) Schemat przedstawiający przygotowanie chipa MEA, obejmujący umieszczenie chipa w standardycznej plastikowej szalce Petriego, dodanie 8 ml wody dejonizowanej poza komorą MEA, umieszczenie pierścienia PTFE na środku komory oraz pokrycie macierzy elektrod fibronektyną. Po czasie inkubacji fibronektyna zostaje usunięta i zastąpiona pożywką hodowlaną. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55587/55587fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat przygotowania hodowli komórkowej; dysocjacja, wirowanie i konfiguracja MEA do analizy." src="/files/ftp_upload/55587/55587fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Dysocjacja i wysiewanie hPSC-CM. Schemat przedstawiający procesy dysocjacji enzymatycznej hPSC-CM, wirowania, resuspensji oraz wysiewania na środku komory MEA. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55587/55587fig2large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Konfiguracja urządzenia mikrofluidycznego do analizy hodowli komórkowych w szalce Petriego; obejmuje układ elektrod." src="/files/ftp_upload/55587/55587fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3: Chipy MEA z warstwą hPSC-CM. (A) Widoki z góry chipa MEA zawierającego pierścień oraz warstwę hPSC-CM. (B) widok z boku układu MEA po usunięciu pierścienia. (C) Obraz w jasnym polu warstwy hPSC-CMs wysianej na matrycy mikroelektrod; powiększenie 4X. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55587/55587fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki pomiarów napięcia; wykresy szeregów czasowych; porównanie jakości sygnału; analiza danych." src="/files/ftp_upload/55587/55587fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Rejestracja MEA dla hPSC-CM. (A) Reprezentatywne zapisy zarejestrowane za pomocą MEA, przedstawiające zapis dobrej jakości z wyraźnie widocznymi pikami R/Q i T oraz wysokim stosunkiem sygnału do szumu (po lewej), zapis złej jakości bez wyraźnie widocznych pików R/Q i T (w środku) oraz zapis zaszumiony z wyraźnie widocznymi pikami R/Q i T, lecz niskim stosunkiem sygnału do szumu (po prawej). (B) Reprezentatywne przykłady wysokiej jakości zapisów FP o różnej morfologii, które mogą zostać zarejestrowane podczas eksperymentów z użyciem MEA i hPSC-CM. Zacieniowany obszar przedstawia odstęp QT zmierzony podczas analizy. Ponieważ sygnał FP w MEA przypomina pierwszą pochodną potencjału czynnościowego28obliczyliśmy całkę z zapisu FP, przedstawioną jako czerwona przerywana linia, jako teoretyczną demonstrację wyboru fali T zbliżonego do całkowitej repolaryzacji potencjału czynnościowego. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55587/55587fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres pomiaru odstępów kardiologicznych oraz analiza danych z wykorzystaniem interfejsu oprogramowania do przetwarzania sygnałów." src="/files/ftp_upload/55587/55587fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Obliczanie odstępu RR. (APrzykład analizy odstępów RR z automatyczną detekcją szczytów (góra) i ekstrakcją danych (dół) przy użyciu oprogramowania analitycznego (patrz Tabela materiałów). Kursory pionowe wyznaczają interesujący przedział czasowy, a kursor poziomy przecina wszystkie zdarzenia, które zostały wykryte i zidentyfikowane niebieskimi znacznikami.B) Powiększona kolumna przedstawia wyekstrahowane dane wykorzystane do obliczenia odstępu RR. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55587/55587fig5large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Wykres analizy spektralnej przedstawiający sygnał fotoniczny w funkcji czasu z przejściowymi pikami absorpcji." src="/files/ftp_upload/55587/55587fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Tworzenie szablonu FP. Przykład wyboru szablonu przy użyciu kursorów pionowych umieszczonych przed i po pojedynczym FP. Szablon ten jest wykorzystywany do automatycznej identyfikacji FP. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55587/55587fig6large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres elektrofizjologiczny przedstawiający analizę danych sygnałów nerwowych z grafami odpowiedzi przejściowej w oprogramowaniu." src="/files/ftp_upload/55587/55587fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Automatyczna identyfikacja matrycy FP. Przykład wyszukiwania wzorca w przedziale ograniczonym dwoma kursorami pionowymi. Wszystkie wykryte zdarzenia są oznaczone niebieskimi markerami i automatycznie nałożone na siebie na wstawce. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55587/55587fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres napięcie-czas w elektrofizjologii; przedstawia zmiany potencjału błonowego w czasie; analiza danych." src="/files/ftp_upload/55587/55587fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Ilościowe określenie parametrów FP. Analiza zapisanych zdarzeń, w których szczyt R został zidentyfikowany ręcznie w obrębie dwóch pierwszych kursorów, a szczyt T został zidentyfikowany ręcznie w obrębie dwóch ostatnich kursorów. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55587/55587fig8large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Konfiguracja pomiaru sygnału, dobór parametrów pomiarowych, interfejs analizy danych elektrofizjologicznych." src="/files/ftp_upload/55587/55587fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 9"> 
Rysunek 9: Okno analizy. Parametry użyte w oknie Statystyki w celu wykrycia szczytu R. W celu wykrycia szczytu T należy zmienić kursory i (jeśli to konieczne) polaryzację. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55587/55587fig9large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić tę figurę w powiększeniu, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykresy porównawcze odstępu QT i odstępu RR; dane LQT i WT; badanie elektrofizjologii serca." src="/files/ftp_upload/55587/55587fig10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 10"> 
Rysunek 10: Zależność QT-RR. (A) Przykład różnic w zależności między odstępami QT i RR u osobników WT (LQT1korelacja) i zespół wydłużonego odstępu QT typu 1 (LQT1R190Q) hPSC-CMs. Zakreślone obszary wskazują, że ta sama zmiana w odstępie RR generuje większą zmianę w odstępie QT w linii chorobowej LQT1, co prawdopodobnie zwiększa podatność na arytmię. (B) Zależność między niekorygowanymi odstępami QT i RR zmierzonymi za pomocą MEA w kardiomiocytach (CMs) pochodzących z 7 różnych linii hPSC. Efekt korekty QT według wzoru Bazetta (C) lub Fridericii (D) formuła jest pokazana i widoczna jako zmiana nachylenia zależności między odstępem QT a RR. Rysunki zaadaptowano z literatury30. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55587/55587fig10large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres zależności napięcia od czasu przedstawiający WT w porównaniu z LQTS, blokadę kanałów hERG, aktywację oraz skrócenie odstępu RR." src="/files/ftp_upload/55587/55587fig11.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Zmiany odstępu QT i RR wywołane chorobą lub lekami. (APrzykład wydłużenia odstępu QT w kardiomiocytach pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CM) wyizolowanych od pacjenta z mutacją powodującą zespół wydłużonego QT (LQTS) w porównaniu z izogeniczną kontrolą typu dzikiego (WT).B) Przykład wydłużenia odstępu QT w hPSC-CM po farmakologicznym zablokowaniu kanałów hERG. (C) Skrócenie odstępu QT po zastosowaniu zwiększających się dawek aktywatora kanałów hERG. Strzałka wskazuje kierunek skrócenia. (D) Przykład wywołanego lekiem skrócenia odstępu RR. Panel (C) został opracowany na podstawie źródła30. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55587/55587fig11large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Pożywka LI-BPEL (niska zawartość insuliny, BSA, alkohol poliwinylowy, lipidy niezbędne)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Komponent</td>
			<td colspan="2">Ilość na 10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">IMDM</td>
			<td colspan="2">43 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">F12</td>
			<td colspan="2">43 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">2-fosforan kwasu askorbinowego (5 mg/ml w wodzie destylowanej)</td>
			<td colspan="2">1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Suplement do hodowli komórkowych (bezpośredni zamiennik L-glutaminy)</td>
			<td colspan="2">1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Penicylina/Streptomycyna</td>
			<td colspan="2">0,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Czerwony fenol</td>
			<td colspan="2">1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bezbiałkowe pożywka dla hybridomów-II (PFHMII)</td>
			<td colspan="2">5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">BSA (10% mas./obj. w IMDM)</td>
			<td colspan="2">2,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">PVA (5% wag./obj. w wodzie destylowanej)</td>
			<td colspan="2">2,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowy (CDLC)</td>
			<td colspan="2">1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Insulina-Transferryna-Selen-Etanoloamina (ITS-X) 10X</td>
			<td colspan="2">0,1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">$\alpha$-monotioglicerol (13 µL w 1 ml IMDM)</td>
			<td colspan="2">0,3 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Połączyć odczynniki, przefiltrować za pomocą 0.22 µm przefiltrować przez filtr porowy i przechowywać medium w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 2 tygodnie.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Skład pożywki Li-BPEL.

Elektrofizjologiczna charakterystyka kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CMs) jest kluczowa dla modelowania chorób serca i określania odpowiedzi na leki. Protokół ten dostarcza informacji niezbędnych do dysocjacji i płytki hPSC-CM na matrycach wieloelektrodowych, pomiaru ich potencjału pola oraz metody analizy odstępów QT i RR.

Analiza elektrofizjologiczna ludzkich kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CM) przy użyciu macierzy wieloelektrodowych (MEA)

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest dysocjacja kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i ich wysianie na matryce wieloelektrodowe w celu pomiaru i kwantyfikacji czasu trwania oraz częstotliwości ich typowego sygnału elektrycznego, zwanego również potencjałem polowym. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w tej dziedzinie, takie jak różnice elektrofizjologiczne między kardiomiocytami z mutacjami a grupą kontrolną. Główną zaletą tej techniki jest możliwość przeprowadzania badań przesiewowych leków na ludzkich kardiomiocytach pochodzących z komórek pacjenta.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy dysocjacji i wysiewania są niezbędne do pomyślnego zapisu sygnałów elektrycznych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, gdyż identyfikacja sygnałów elektrycznych dobrej lub złej jakości nie jest trywialna, a analiza potencjału spoczynkowego wymaga doświadczenia.Aby rozpocząć tę procedurę, należy umieścić czyste chipy w standardycznej sterylnej plastikowej płytce Petriego o średnicy 10 centymetrów. Następnie do płytki Petriego należy dodać osiem mililitrów sterylnej wody destylowanej w celu stworzenia komory nawilżającej, co zapobiegnie odparowywaniu niewielkiej objętości pożywki hodowlanej znajdującej się na chipie po umieszczeniu go w inkubatorze. Następnie należy użyć wykonanych na zamówienie pierścieni z politetrafluoeroetylenu, aby zapewnić wysianie kardiomiocytów w centrum chipa, w miejscu rozmieszczenia matrycy elektrod.W komorze z laminarnym przepływem powietrza wyjmij pierścienie z etanolu. Umieść je w sterylnej szalce Petriego bez pokrywki i pozostaw pierścienie do wyschnięcia w komorze. Następnie, używając wysterylizowanych w płomieniu pęsety, umieść suchy pierścień w chipie MEA.Pokryj elektrody, dodając 50 µL fibronektyny o stężeniu 40 µg/mL do wnętrza pierścienia. Następnie przykryj szalkę Petriego pokrywką i ostrożnie przenieś szalkę zawierającą chip MEA do inkubatora. Po tym czasie przenieś szalkę z chipem MEA do komory z dygestorium do hodowli komórkowej.Przed użyciem chipa MEA, odessać 50 µL fibronektyny za pomocą pipety P200 lub systemu próżniowego w dygestorium, uważając, aby nie przesunąć pierścienia PTFE. Należy zachować kąt nachylenia końcówki pipety, aby żadne ciało stałe nie dotknęło elektrod. Następnie ostrożnie dodać 950 µL pożywki LI-BPEL, dbając o jej równomierne rozprowadzenie i dopilnowując, aby pierścień nie unosił się na powierzchni.Następnie przenieś naczynie z powrotem do inkubatora. Jest to pierwotna hodowla bijących kardiomiocytów. W komorze z laminarnym przepływem powietrza odessaj pożywkę z dołka z hodowlą hPSC-CMs.Do każdego dołka dodaj od 1 do 2 ml PBS bez wapnia i magnezu, aby wypłukać hodowlę, a następnie odessaj PBS. Następnie dodaj 500 µl enzymu dysocjującego do każdego dołka. Inkubuj próbkę przez 5 minut w temperaturze 37 °C.Po pięciu minutach dodaj jeden mililitr LI-BPEL do każdej studni, aby rozcieńczyć enzym. Odklej monowarstwę hPSC-CMs, delikatnie zdrapując je pipetą P1000. Następnie zbierz zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 mililitrów.Następnie przepłucz dołek 1 ml LI-BPEL, aby zebrać wszystkie pozostałe komórki i agregaty komórkowe. Dodaj kolejne 2–3 ml LI-BPEL, aby osiągnąć końcową objętość około 5–6 ml, i delikatnie pipetuj w górę i w dół od trzech do pięciu razy za pomocą pipety 5 ml w celu rozbicia agregatów komórkowych. Następnie odwiruj komórki w temperaturze pokojowej przez 3 minuty przy 300 ×g.Następnie należy usunąć nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Potem osad komórkowy należy resuspender w 250 µL LI-BPEL. Następnie, za pomocą pipety, nanosi się 50 µL zawiesiny komórkowej na każdą MEA, dozując ją bezpośrednio do środka pierścienia PTFE znajdującego się na macierzy elektrod.Ostrożnie przenieś MEA do inkubatora w temperaturze 37 °C i pozostaw komórki do przytwierdzenia na noc. Dzień po wysianiu, w warunkach sterylnych, ostrożnie zdejmij pierścień za pomocą sterylnej pęsety. Przepłucz pierścień w 80% etanolu.Następnie należy przechowywać go w probówce o pojemności 50 mL zawierającej 80% świeżego etanolu. Potem delikatnie należy usunąć 500 µL pożywki z chipa MEA i dodać do niego 500 µL świeżego LI-BPEL.Są to bijące kardiomiocyty po usunięciu pierścienia. Następnie przenieś MEA do inkubatora w temperaturze 37 °C. Potem mierz aktywność elektryczną hPSC-CMs na MEA, zaczynając od jednego dnia po usunięciu pierścienia aż do jednego tygodnia.Następnie uruchom pakiet oprogramowania powiązanego z zestawem MEA. W programie TCX-Control ustaw temperaturę na 37 °C w celu zarejestrowania pomiarów. Po tym kroku wyjmij z inkubatora szalkę zawierającą chip MEA.Wyjmij chip MEA z naczynia i połóż go na chusteczce, aby wchłonęła resztki wody. Ostrożnie przetrzyj zewnętrzną część płytki chusteczką, a następnie oczyść ją za pomocą patyczka bawełnianego zwilżonego 100% etanolem, aby usunąć resztki wody lub zanieczyszczenia, które mogłyby powodować szumy w sygnale. Następnie przenieś płytkę MEA na głowicę rejestrującą w temperaturze 37 °C, aby wykryć aktywność spontaniczną.Otwórz MC Rack i kliknij edytuj, aby załadować sprzęt MEA. Aby utworzyć nowy protokół, użyj rozwijanego menu edytuj, aby dodać do protokołu różne okna rejestratora i wyświetlacza. Następnie uruchom protokół w trybie odtwarzania, klikając przycisk play.Jeśli sygnały wykazują wyraźnie widoczne załamki R i T, należy odczekać od 10 do 15 minut do zakończenia fazy adaptacji. Aby rozpocząć eksperyment, kliknij „record”, a następnie „play” i zbieraj dane przez 10 minut w warunkach bazowych w celu określenia stanu stacjonarnego. Oznacz elektrody, które wykazały najlepszy sygnał, aby można było je łatwo zidentyfikować i wyeksportować do późniejszej analizy.W celu oceny odpowiedzi na lek, dodawaj zwiększające się stężenia leku co 10 minut. Kliknij stop, aby zakończyć rejestrację po zakończeniu protokołu. Poniżej przedstawiono reprezentatywne zapisy zarejestrowane za pomocą MEA, wykazujące wysoką jakość sygnału z wyraźnie widocznymi piktami RQ i T oraz wysokim stosunkiem sygnału do szumu.Zapis o złej jakości bez wyraźnie widocznych pików RQ i T oraz zapis z szumami, w którym piki RQ i T są wyraźnie widoczne, ale stosunek sygnału do szumu jest niski. A tutaj znajdują się reprezentatywne przykłady wysokiej jakości zapisów potencjałów polowych o różnych morfologiach, które można zarejestrować podczas eksperymentów MEA z użyciem hPSC-CMs. Zacieniowany obszar reprezentuje odstęp QT zmierzony podczas analizy.Ponieważ potencjał polowy w MEA przypomina pierwszą pochodną potencjału czynnościowego, obliczono całki z zapisów potencjału polowego jako teoretyczne demonstracje fal T, które są bliskie pełnej repolaryzacji potencjału czynnościowego. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby wybrać jak największą liczbę elektrod, co zapewni wiarygodne i spójne sygnały. Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak ilościowy PCR czasu rzeczywistego lub patch-clamp pojedynczej komórki, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. dotyczące specyficznej ekspresji genów związanych z fenotypem elektrycznym lub specyficznych gęstości prądów jonowych.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie komórek macierzystych do badania arytmii serca oraz farmakologii in vitro z wykorzystaniem kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak dysocjować i wysiewać kardiomiocyty pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na MEA w celu przeprowadzenia pomiarów elektrofizjologicznych oraz przesiewania leków. Należy pamiętać, że praca z lekami może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak standardowe zasady GLP.

electrophysiological-analysis-human-pluripotent-stem-cell-derived

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten artykuł zawiera zestaw protokołów do rozwoju ludzkich sieci indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-CM) hodowanych na wielodołkowych płytkach MEA w celu odwracalnego elektroportowania błony komórkowej do pomiarów potencjału czynnościowego. Nagrania o wysokiej przepustowości są uzyskiwane z tych samych lokalizacji komórkowych wielokrotnie przez kilka dni.

Sieci kardiomiocytów pochodzące z ludzkich iPSC na wielodołkowych układach mikroelektrod do powtarzalnych zapisów potencjału czynnościowego

Tutaj opisujemy optyczne pozyskiwanie i charakterystykę potencjałów czynnościowych z indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych za pomocą szybkiego modułowego systemu fotometrycznego.

Pomiar potencjału czynnościowego optycznego pojedynczej komórki w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) okazały się obiecującym modelem in vitro do badań przesiewowych kardiotoksyczności indukowanej lekami i modelowania chorób. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół pomiaru kurczliwości i elektrofizjologii hiPSC-CM.

Techniczne zastosowania nagrań matrycy mikroelektrod i patch clamp na indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Analiza zmian w funkcji skurczowej i integralności komórkowej ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC ma ogromne znaczenie dla nieklinicznego rozwoju leków. Hybrydowy system analizy komórek z 96 dołkami analizuje oba parametry w czasie rzeczywistym i w sposób fizjologiczny, zapewniając wiarygodne wyniki istotne dla człowieka, niezbędne do bezpiecznego przejścia do etapów klinicznych.

Hybrydowy system analizy komórek do oceny zmian strukturalnych i kurczliwych ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC do przedklinicznej oceny ryzyka kardiologicznego

Kombinacja poracji laserowej i matryc mikroelektrod (MEA) pozwala na rejestrację kardiomiocytów z hodowanych pierwotnych i pochodzących z komórek macierzystych zapisów podobny do potencjału czynnościowego. Kształt fali zapewnia lepszy wgląd w sposób działania badanych związków niż standardowe nagrania. Łączy on patch-clamp i odczyt MEA, aby jeszcze bardziej zoptymalizować badania nad bezpieczeństwem kardiologicznym w przyszłości.

Indukowane laserowo pomiary potencjału czynnościowego kardiomiocytów na układach mikroelektrod w celu zwiększenia predykcyjności bezpieczeństwa farmakologii

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) stanowią alternatywę dla wykorzystywania zwierząt do przedklinicznych badań przesiewowych kardiotoksyczności. Ograniczeniem dla powszechnego stosowania hiPSC-CM w przedklinicznych badaniach przesiewowych toksyczności jest niedojrzały, podobny do płodu fenotyp komórek. Poniżej przedstawiono protokoły solidnego i szybkiego dojrzewania hiPSC-CM.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe kardiotoksyczności z wykorzystaniem dojrzałych, indukowanych przez człowieka monowarstw kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj opisana jest sprawdzona metoda wykonywania pomiarów kurczliwości i wapnia w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych za pomocą platformy opartej na optyce. Platforma ta umożliwia naukowcom badanie wpływu mutacji i reakcji na różne bodźce w szybki i powtarzalny sposób.

Pomiary parametrów wapnia i kurczliwości w czasie rzeczywistym w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Ten protokół ma na celu stabilne umieszczanie grzbietowo-brzusznych zrośniętych asembloidów na wieloelektrodowych układach do modelowania padaczki in vitro.

Wieloelektrodowa platforma matrycowa do modelowania padaczki przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych zespołów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Tutaj opisujemy solidny protokół do pozyskiwania ludzkich kardiomiocytów, który łączy modulowane małymi cząsteczkami różnicowanie serca i oczyszczanie kardiomiocytów za pośrednictwem deprywacji glukozy, umożliwiając produkcję oczyszczonych kardiomiocytów dla celów modelowania chorób sercowo-naczyniowych i badań przesiewowych leków.

Otrzymywanie wysoce oczyszczonych kardiomiocytów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu różnicowania modulowanego małymi cząsteczkami i późniejszego głodu glukozy

Generowanie kardiomiocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych in vitro umożliwia dostęp do dużych ilości tkanki serca in vitro dla nauk podstawowych i zastosowań klinicznych.  Protokół ten wykorzystuje czynnik przedsionkowy Grem2 zarówno do zwiększenia liczby uzyskanych kardiomiocytów, jak i do wytworzenia kardiomiocytów o fenotypie przedsionkowym.

Różnicowanie kardiomiocytów przedsionkowych od pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą antagonisty BMP Grem2

Poznaj metodę elektrofizjologicznej analizy kardiomiocytów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych przy użyciu macierzy wieloelektrodowych. Technika ta umożliwia badanie odpowiedzi na leki i modelowanie chorób serca.

Analiza elektrofizjologiczna ludzkich kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CM) przy użyciu macierzy wieloelektrodowych (MEA) (Wideo) | JoVE Journal

Analiza elektrofizjologiczna ludzkich kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CM) przy użyciu macierzy wieloelektrodowych (MEA)

Przeglądaj więcej filmów