Analiza elektrofizjologiczna ludzkich kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CM) przy użyciu macierzy wieloelektrodowych (MEA)
12 maja 2017
Elektrofizjologiczna charakterystyka kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CMs) jest kluczowa dla modelowania chorób serca i określania odpowiedzi na leki. Protokół ten dostarcza informacji niezbędnych do dysocjacji i płytki hPSC-CM na matrycach wieloelektrodowych, pomiaru ich potencjału pola oraz metody analizy odstępów QT i RR.
Ogólnym celem tej procedury jest dysocjacja kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i umieszczenie ich na matrycach wieloelektrodowych w celu zmierzenia i ilościowego określenia czasu trwania i częstotliwości ich typowego sygnału elektrycznego, zwanego również potencjałem pola. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w tej dziedzinie, takie jak jakie są różnice elektrofizjologiczne między kardiomiocytami przenoszącymi mutacje a grupą kontrolną. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona badania przesiewowe leków na ludzkich kardiomiocytach pochodzących z komórek pacjenta.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie. Ponieważ etapy dysocjacji i galwanizacji są niezbędne do pomyślnego zarejestrowania sygnału elektrycznego. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają przygodę z tą metodą, będą miały trudności, ponieważ identyfikacja sygnałów elektrycznych dobrej lub złej jakości nie jest trywialna, a analiza swobodnego potencjału wymaga doświadczenia.
Aby rozpocząć tę procedurę, umieść czyste wióry na standardowej sterylnej plastikowej szalce Petriego o średnicy 10 centymetrów. Następnie dodaj osiem mililitrów sterylnej wody destylowanej do szalki Petriego, aby utworzyć nawilżoną komorę, która zapobiegnie pobieraniu małej objętości pożywki hodowlanej na chipie po umieszczeniu w inkubatorze. Następnie użyj niestandardowych pierścieni z politetrafluoroetylenu, aby zapewnić posiew kardiomiocytów w środku chipa, w którym znajduje się układ elektrod.
W kapturze hodowlanym usuń pierścienie z etanolu. Umieść je na sterylnej szalce Petriego bez pokrywki i pozwól pierścieniom wyschnąć w kapturze. Następnie umieść suchy pierścień w chipie MEA za pomocą pęsety sterylizowanej płomieniem.
Pokryj elektrody, dodając 50 mikrolitrów 40 mikrogramów na mililitr fibronektyny wewnątrz pierścienia. Następnie przykryj szalkę Petriego pokrywką i ostrożnie przenieś naczynie zawierające chip MEA do inkubatora. Następnie przenieś naczynie zawierające chip MEA do kaptura do hodowli komórkowej.
Przed użyciem chipa MEA należy odessać 50 mikrolitrów fibronektyny za pomocą pipety P200 lub systemu próżniowego w kapturze bez przesuwania pierścienia PTFE. Upewnij się, że żadne stałe przedmioty nie dotykają elektrod, trzymając końcówkę pod kątem. Następnie delikatnie dodaj 950 mikrolitrów podłoża LI-BBEL, upewniając się, że jest równomiernie rozprowadzone i że pierścień nie unosi się na wodzie.
Następnie włóż naczynie z powrotem do inkubatora. Jest to początkowy posiew bijących kardiomiocytów. W kapturze do hodowli tkankowej dobrze odessać pożywkę z kultury hPSC-CMs.
Dodaj jeden do dwóch mililitrów PBS bez wapnia i magnezu do każdej studzienki, aby umyć kulturę i odessać PBS. Następnie dodaj 500 mikrolitrów enzymu dysocjacyjnego do każdej studzienki. Inkubować próbkę przez 5 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Po pięciu minutach dodaj jeden mililitr LI-BPEL do każdej studzienki, aby rozcieńczyć enzym. Odłączyć monowarstwę hPSC-CM, delikatnie zarysowując je pipetą P1000. Następnie zbierz zawiesinę komórek w 15-mililitrowej probówce.
Następnie przepłucz studzienkę jednym mililitrem LI-BPEL, aby zebrać wszystkie pozostałe komórki i grudki komórek. Dodaj kolejne dwa do trzech mililitrów LI-BPEL, aby osiągnąć końcową objętość około pięciu do sześciu milimetrów i delikatnie pipetuj w górę i w dół trzy do pięciu razy pipetą o pojemności pięciu mililitrów, aby zdysocjować grudki komórek. Następnie odwiruj komórki w temperaturze pokojowej przez trzy minuty w temperaturze 300 razy g.
Następnie usunąć supernatant bez usuwania osadu komórkowego. Następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w 250 mikrolitrach LI-BPEL. Następnie rozprowadź 50 mikrolitrów zawiesiny ogniw na MEA, doprowadzając zawiesinę ogniwa bezpośrednio do środka pierścienia PTFE na górze układu elektrod.
Ostrożnie przenieś MEA do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pozwól komórkom przyczepić się na noc. Dzień po posiewie ostrożnie zdejmij pierścień w sterylnym środowisku za pomocą sterylnej pęsety. Opłucz pierścień w 80 procentach etanolu.
I przechowuj go w 50-mililitrowej tubie zawierającej 80 procent świeżego etanolu. Następnie delikatnie usuń 500 mikrolitrów pożywki z chipa MEA. I dodaj do niego 500 mikrolitrów świeżego LI-BPEL.
Są to bijące kardiomiocyty po zdjęciu pierścienia. Następnie przenieś MEA do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie zmierz aktywność elektryczną hPSC-CM na MEA, zaczynając od jednego dnia po usunięciu pierścienia i trwając do jednego tygodnia.
Teraz uruchom pakiet oprogramowania połączony z konfiguracją MEA. Następnie ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza w TCX-Control, aby zarejestrować pomiary. Następnie wyjmij naczynie zawierające chip MEA z inkubatora.
Wyjmij chip MEA z naczynia i umieść go na chusteczce, aby wchłonąć resztki wody. Ostrożnie przetrzyj zewnętrzny kontekst płytki chusteczką i wyczyść go bawełnianym wacikiem zwilżonym 100% etanolem, aby usunąć wszelkie resztki wody lub zanieczyszczenia, które mogą powodować szum sygnału. Następnie przenieś płytkę MEA do stopnia nagrywającego o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby wykryć spontaniczną aktywność.
Otwórz MC Rack i kliknij edytuj, aby załadować sprzęt MEA. Aby utworzyć nowy protokół, użyj menu rozwijanego edycji, aby dodać różne okna rejestratora i wyświetlania do protokołu. Następnie uruchom protokół w trybie odtwarzania, klikając przycisk odtwarzania.
Jeśli sygnały wykazują wyraźne piki R i piki T, należy odczekać od 10 do 15 minut, aby zakończyć fazę adaptacji. Aby rozpocząć eksperyment, kliknij przycisk Nagraj, a następnie odtwarzaj i zbieraj dane przez 10 minut w warunkach linii bazowej, aby określić stan ustalony. Opisz elektrody, które miały najlepszy sygnał, aby można je było łatwo zidentyfikować i później wyeksportować do analizy.
Aby ocenić odpowiedź na lek, należy dodawać rosnące stężenia leku co 10 minut. Kliknij stop, aby zakończyć nagrywanie na końcu protokołu. Oto reprezentatywne ścieżki zarejestrowane za pomocą MEA, pokazujące dobrej jakości ścieżkę z wyraźnie widocznymi pikami RQ i T z wysokim stosunkiem sygnału do szumu.
Ślad złej jakości bez wyraźnie widocznych pików RQ i T oraz hałaśliwy ślad z wyraźnie widocznymi pikami RQ i T, ale z niskim stosunkiem sygnału do szumu. A oto reprezentatywne przykłady dobrej jakości śladów potencjału pola o różnych morfologiach, które można zarejestrować podczas eksperymentów MEA z użyciem hPSC-CM. Zacieniony obszar reprezentuje odstęp QT zmierzony podczas analizy.
Ponieważ potencjał pola w MEA przypomina pierwszą pochodną potencjału czynnościowego, całka śladów potencjału pola została obliczona jako teoretyczne demonstracje fal T, które są bliskie pełnej repolaryzacji potencjału czynnościowego. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby wybrać największą liczbę elektrod, aby zapewnić niezawodne i spójne sygnały. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak kwanty PCR w czasie piszczeli lub patch clamp z pojedynczą komórką, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak specyficzna ekspresja genów związana z fenotypem elektrycznym lub określone gęstości prądów jonowych.
Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się komórkami macierzystymi do zbadania zaburzeń rytmu serca i farmakologii in vitro z wykorzystaniem kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak dysocjować i umieścić ludzkie kardiomiocyty pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych na MEA w celu pomiarów elektrofizjologicznych i badań przesiewowych leków. Nie zapominaj, że praca z lekami może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak standardowy GLP.
Przegląd
Ten protokół opisuje dysocjację i osadzanie kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CMs) na wieloelektrodowych tablicach (MEAs) do charakteryzacji elektrofizjologicznej. Zawiera szczegółowe metody pomiaru potencjału pola i analizy odstępów QT i RR, które są niezbędne do modelowania chorób serca i oceny reakcji na leki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Elektrofizjologia serca
- Biologia komórek macierzystych
- Testowanie leków
Tło
- Rozumienie właściwości elektrofizjologicznych hPSC-CMs jest niezbędne w badaniach nad sercem.
- Ta metoda pozwala na ocenę reakcji na leki w ludzkich kardiomiocytach.
- Pomiar potencjału pola dostarcza informacji o aktywności elektrycznej komórek.
- Wiзуalna demonstracja protokołu jest kluczowa dla pomyślnej implementacji.
Cel badania
- Charakteryzowanie sygnałów elektrycznych hPSC-CMs.
- Porównanie różnic elektrofizjologicznych między zmutowanymi i kontrolnymi kardiomiocytami.
- Ułatwienie testowania leków przy użyciu komórek pochodzących od pacjentów.
Stosowane metody
- Dysocjację hPSC-CMs za pomocą enzymu dysocjującego.
- Osadzenie komórek na MEAs z powłoką fibronektyny.
- Pomiar aktywności elektrycznej za pomocą specjalistycznego oprogramowania.
- Ocena reakcji na leki poprzez zmienianie stężeń leków podczas rejestracji.
Główne wyniki
- Udane dysociowani i osadzanie hPSC-CMs na MEAs.
- Wyraźne pomiary potencjałów pola i identyfikacja szczytów R i T.
- Możliwość oceny reakcji na leki w czasie rzeczywistym.
- Demonstracja zmiennej jakości sygnału w zależności od warunków eksperymentalnych.
Wnioski
- Ten protokół zapewnia niezawodną metodę badania hPSC-CMs.
- Charakteryzacja elektrofizjologiczna jest niezbędna do zrozumienia chorób serca.
- Metoda wspiera wysiłki testowania leków w medycynie personalizowanej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Electrophysiological profiling of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) using multi-electrode arrays (MEAs) enables medium- to high-throughput assessment of cardiac ion channel function and drug-induced electrophysiological changes. This approach supports early detection of cardiotoxic liabilities and mechanistic de-risking of arrhythmogenic compounds in discovery-stage screening. By providing quantitative field potential parameters such as QT and RR intervals, the method enhances predictive confidence in translational cardiovascular research and safety pharmacology workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by comparing electrophysiological phenotypes between mutant and control hPSC-CMs to clarify ion channel dysfunction mechanisms.
- Operational Value: Supports biological de-risking through functional validation of cardiac ion channel targets using human-relevant cellular models.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying compounds that prolong QT interval or alter field potential morphology, indicating pro-arrhythmic risk.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated hPSC-CM monolayers on MEAs for consistent, reproducible field potential recording across multiple electrodes.
- Quantitative Output: Enables extraction of interval-based metrics (QT, RR) and waveform morphology as dependable readouts for compound effect assessment.
- Scalability & Reuse: Supports medium-throughput drug response profiling with dose-response capability, enabling reuse across screening campaigns and compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Disease Modeling: Uses hPSC-CMs derived from patients with arrhythmia syndromes to model human cardiac electrophysiology in a disease-relevant system.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase electrophenotyping with preclinical validation by providing human-derived data predictive of in vivo drug responses.
- Mechanistic De-risking: Allows detection of ion channel-mediated effects early, reducing late-stage attrition due to cardiac safety findings.
Pipeline & Workflow Integration
The MEA-based electrophysiological assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical safety assessment, enabling data-driven decisions at each stage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of ion channel involvement in arrhythmia mechanisms by measuring field potential changes in genetically defined hPSC-CMs.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible electrophysiological readouts with temperature-controlled, automated signal acquisition for compound library profiling.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (QT, RR intervals, waveform morphology) that enable objective comparison of electrophysiological states across conditions.
- Translational Research: Connects in vitro electrophenotyping to clinical relevance by modeling human cardiac electrophysiology and drug response in a scalable format.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology platform applicable across multiple projects, targets, and therapeutic areas in cardiovascular research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in cardiac electrophysiology through direct human cell-based measurement.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via controlled plating, coating, and environmental conditions, minimizing inter-lab variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling early detection of cardiotoxic compounds, thereby reducing late-stage biological risk and capital inefficiency.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying electrophysiological liabilities early, informing resource allocation toward safer candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, cardiac differentiation, and electrophysiological signal interpretation to ensure data quality.
- Dependent on MEA-compatible instrumentation, temperature control units, and signal acquisition software for reliable field potential recording.
- Necessitates cross-team standardization of cell preparation, plating density, and analysis protocols to ensure comparability across studies.
- Involves adaptation considerations when extending to 3D cultures or alternative maturation states of hPSC-CMs to maintain signal fidelity.
- Limited by the need for optimization of dissociation and plating conditions to avoid cellular stress that could confound electrophysiological readouts.
