Analiza elektrofizjologiczna ludzkich kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CM) przy użyciu macierzy wieloelektrodowych (MEA)

Ogólnym celem niniejszej procedury jest dysocjacja kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i ich wysianie na matryce wieloelektrodowe w celu pomiaru i kwantyfikacji czasu trwania oraz częstotliwości ich typowego sygnału elektrycznego, zwanego również potencjałem polowym. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w tej dziedzinie, takie jak różnice elektrofizjologiczne między kardiomiocytami z mutacjami a grupą kontrolną. Główną zaletą tej techniki jest możliwość przeprowadzania badań przesiewowych leków na ludzkich kardiomiocytach pochodzących z komórek pacjenta.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy dysocjacji i wysiewania są niezbędne do pomyślnego zapisu sygnałów elektrycznych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, gdyż identyfikacja sygnałów elektrycznych dobrej lub złej jakości nie jest trywialna, a analiza potencjału spoczynkowego wymaga doświadczenia.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy umieścić czyste chipy w standardycznej sterylnej plastikowej płytce Petriego o średnicy 10 centymetrów. Następnie do płytki Petriego należy dodać osiem mililitrów sterylnej wody destylowanej w celu stworzenia komory nawilżającej, co zapobiegnie odparowywaniu niewielkiej objętości pożywki hodowlanej znajdującej się na chipie po umieszczeniu go w inkubatorze. Następnie należy użyć wykonanych na zamówienie pierścieni z politetrafluoeroetylenu, aby zapewnić wysianie kardiomiocytów w centrum chipa, w miejscu rozmieszczenia matrycy elektrod.

W komorze z laminarnym przepływem powietrza wyjmij pierścienie z etanolu. Umieść je w sterylnej szalce Petriego bez pokrywki i pozostaw pierścienie do wyschnięcia w komorze. Następnie, używając wysterylizowanych w płomieniu pęsety, umieść suchy pierścień w chipie MEA.

Pokryj elektrody, dodając 50 µL fibronektyny o stężeniu 40 µg/mL do wnętrza pierścienia. Następnie przykryj szalkę Petriego pokrywką i ostrożnie przenieś szalkę zawierającą chip MEA do inkubatora. Po tym czasie przenieś szalkę z chipem MEA do komory z dygestorium do hodowli komórkowej.

Przed użyciem chipa MEA, odessać 50 µL fibronektyny za pomocą pipety P200 lub systemu próżniowego w dygestorium, uważając, aby nie przesunąć pierścienia PTFE. Należy zachować kąt nachylenia końcówki pipety, aby żadne ciało stałe nie dotknęło elektrod. Następnie ostrożnie dodać 950 µL pożywki LI-BPEL, dbając o jej równomierne rozprowadzenie i dopilnowując, aby pierścień nie unosił się na powierzchni.

Następnie przenieś naczynie z powrotem do inkubatora. Jest to pierwotna hodowla bijących kardiomiocytów. W komorze z laminarnym przepływem powietrza odessaj pożywkę z dołka z hodowlą hPSC-CMs.

Do każdego dołka dodaj od 1 do 2 ml PBS bez wapnia i magnezu, aby wypłukać hodowlę, a następnie odessaj PBS. Następnie dodaj 500 µl enzymu dysocjującego do każdego dołka. Inkubuj próbkę przez 5 minut w temperaturze 37 °C.

Po pięciu minutach dodaj jeden mililitr LI-BPEL do każdej studni, aby rozcieńczyć enzym. Odklej monowarstwę hPSC-CMs, delikatnie zdrapując je pipetą P1000. Następnie zbierz zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 mililitrów.

Następnie przepłucz dołek 1 ml LI-BPEL, aby zebrać wszystkie pozostałe komórki i agregaty komórkowe. Dodaj kolejne 2–3 ml LI-BPEL, aby osiągnąć końcową objętość około 5–6 ml, i delikatnie pipetuj w górę i w dół od trzech do pięciu razy za pomocą pipety 5 ml w celu rozbicia agregatów komórkowych. Następnie odwiruj komórki w temperaturze pokojowej przez 3 minuty przy 300 ×g.

Następnie należy usunąć nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Potem osad komórkowy należy resuspender w 250 µL LI-BPEL. Następnie, za pomocą pipety, nanosi się 50 µL zawiesiny komórkowej na każdą MEA, dozując ją bezpośrednio do środka pierścienia PTFE znajdującego się na macierzy elektrod.

Ostrożnie przenieś MEA do inkubatora w temperaturze 37 °C i pozostaw komórki do przytwierdzenia na noc. Dzień po wysianiu, w warunkach sterylnych, ostrożnie zdejmij pierścień za pomocą sterylnej pęsety. Przepłucz pierścień w 80% etanolu.

Następnie należy przechowywać go w probówce o pojemności 50 mL zawierającej 80% świeżego etanolu. Potem delikatnie należy usunąć 500 µL pożywki z chipa MEA i dodać do niego 500 µL świeżego LI-BPEL.

Są to bijące kardiomiocyty po usunięciu pierścienia. Następnie przenieś MEA do inkubatora w temperaturze 37 °C. Potem mierz aktywność elektryczną hPSC-CMs na MEA, zaczynając od jednego dnia po usunięciu pierścienia aż do jednego tygodnia.

Następnie uruchom pakiet oprogramowania powiązanego z zestawem MEA. W programie TCX-Control ustaw temperaturę na 37 °C w celu zarejestrowania pomiarów. Po tym kroku wyjmij z inkubatora szalkę zawierającą chip MEA.

Wyjmij chip MEA z naczynia i połóż go na chusteczce, aby wchłonęła resztki wody. Ostrożnie przetrzyj zewnętrzną część płytki chusteczką, a następnie oczyść ją za pomocą patyczka bawełnianego zwilżonego 100% etanolem, aby usunąć resztki wody lub zanieczyszczenia, które mogłyby powodować szumy w sygnale. Następnie przenieś płytkę MEA na głowicę rejestrującą w temperaturze 37 °C, aby wykryć aktywność spontaniczną.

Otwórz MC Rack i kliknij edytuj, aby załadować sprzęt MEA. Aby utworzyć nowy protokół, użyj rozwijanego menu edytuj, aby dodać do protokołu różne okna rejestratora i wyświetlacza. Następnie uruchom protokół w trybie odtwarzania, klikając przycisk play.

Jeśli sygnały wykazują wyraźnie widoczne załamki R i T, należy odczekać od 10 do 15 minut do zakończenia fazy adaptacji. Aby rozpocząć eksperyment, kliknij „record”, a następnie „play” i zbieraj dane przez 10 minut w warunkach bazowych w celu określenia stanu stacjonarnego. Oznacz elektrody, które wykazały najlepszy sygnał, aby można było je łatwo zidentyfikować i wyeksportować do późniejszej analizy.

W celu oceny odpowiedzi na lek, dodawaj zwiększające się stężenia leku co 10 minut. Kliknij stop, aby zakończyć rejestrację po zakończeniu protokołu. Poniżej przedstawiono reprezentatywne zapisy zarejestrowane za pomocą MEA, wykazujące wysoką jakość sygnału z wyraźnie widocznymi piktami RQ i T oraz wysokim stosunkiem sygnału do szumu.

Zapis o złej jakości bez wyraźnie widocznych pików RQ i T oraz zapis z szumami, w którym piki RQ i T są wyraźnie widoczne, ale stosunek sygnału do szumu jest niski. A tutaj znajdują się reprezentatywne przykłady wysokiej jakości zapisów potencjałów polowych o różnych morfologiach, które można zarejestrować podczas eksperymentów MEA z użyciem hPSC-CMs. Zacieniowany obszar reprezentuje odstęp QT zmierzony podczas analizy.

Ponieważ potencjał polowy w MEA przypomina pierwszą pochodną potencjału czynnościowego, obliczono całki z zapisów potencjału polowego jako teoretyczne demonstracje fal T, które są bliskie pełnej repolaryzacji potencjału czynnościowego. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby wybrać jak największą liczbę elektrod, co zapewni wiarygodne i spójne sygnały. Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak ilościowy PCR czasu rzeczywistego lub patch-clamp pojedynczej komórki, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. dotyczące specyficznej ekspresji genów związanych z fenotypem elektrycznym lub specyficznych gęstości prądów jonowych.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie komórek macierzystych do badania arytmii serca oraz farmakologii in vitro z wykorzystaniem kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak dysocjować i wysiewać kardiomiocyty pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na MEA w celu przeprowadzenia pomiarów elektrofizjologicznych oraz przesiewania leków. Należy pamiętać, że praca z lekami może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak standardowe zasady GLP.