Name: Nieinwazyjny sposób izolowania i fenotypowania komórek ze spojówki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Poznaj nieinwazyjną metodę cytologii wyciskowej do izolacji i immunofenotypowania komórek z powierzchni oka. Technika umożliwia identyfikację podpopulacji limfocytów T metodą cytometrii przepływowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Nandini Nallappan i Sharon Yeo za pomoc w technicznych krokach. Badanie zostało sfinansowane z grantu na rozpoczęcie działalności dla KGC z Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University oraz z nagrody Senior Clinician Scientist Award przyznanej przez Narodową Radę ds. Badań Medycznych (NMRC) Ministerstwa Zdrowia Singapuru dla LT (NMRC/ CSA/ 045/ 2012) oraz z grantu NMRC i zarządzanego przez Narodowe Centrum Innowacji Zdrowia dla KGC i LT (NHIC-12D-1409007).

Wszystkie próbki oczu użyte w tym badaniu zostały pobrane z Kliniki Suchego Oka w Narodowym Centrum Okulistycznym w Singapurze, zatwierdzonej przez SingHealth Centralized Institutional Review Board i Nanyang Technological University Institutional Review Board, Singapur.
UWAGA: Badani przeszli testy kliniczne w celu oceny stopnia stanu zapalnego i nasilenia dysfunkcji łez przed wykonaniem IC. Testy kliniczne obejmowały nieinwazyjny czas rozpadu łez (NI-TBUT)14 i zaczerwienienie spojówek (przekrwienie)15,16 oceniane za pomocą przyrządu diagnostycznego, test Schirmera17, standardowy kwestionariusz oceny suchości oczu (SPEED) przez pacjenta18 oraz barwienie rogówki19.
1. Pobieranie próbek oczu przez IC
<ol>
	<li>Po ustaleniu stanu klinicznego należy znieczulić oczy uczestnika, nakładając 1-2 krople znieczulenia miejscowego, chlorowodorku proparakainy, na spojówkę opuszkową górną i sklepienie dolne. Odczekaj 4 - 5 minut, aż uczucie pieczenia środka znieczulającego ustąpi.</li>
	<li>Pobrać próbki zarówno z spojówki opuszkowej nosa, jak i skroniowej za pomocą dwóch urządzeń do cytologii wyciskowej. 
	UWAGA: Jedno urządzenie służy do pobierania dwóch próbek wyciskowych. W tym przypadku wykorzystano dwa urządzenia do pobrania czterech membran wyciskowych.
	<ol>
		<li>Umieść urządzenie do cytologii wyciskowej stycznie na spojówce. Delikatnie naciśnij przycisk i przytrzymaj przez 2 - 3 s. 
		UWAGA: Do urządzenia dołączona jest membrana. Ciśnienie jest zwalniane automatycznie po naciśnięciu przycisku. Wystarczy kilka sekund, aby zwolnić ciśnienie i wyjąć urządzenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uwolnić membranę do probówki mikrowirówkowej zawierającej 1 ml pożywki hodowlanej (pożywka Roswell Park Memorial Institute (RPMI) + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) + 1% penicyliny-streptomycyny (Pen Strep)) za pomocą skalpela.</li>
	<li>Odizolować komórki od błony urządzenia poprzez ciągłe skrobanie przez około 1 minutę za pomocą końcówki do pipety o pojemności 10 μl. 
	UWAGA: Skrobanie jest zakończone, gdy powierzchnia membrany stanie się nierówna. Liczba komórek z każdej błony jest zmienna (100 - 500 komórek/błonę). Próbki należy przetworzyć w ciągu 2 - 3 godzin od pobrania.</li>
</ol>
2. Immunofenotypowanie komórek metodą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia pożywki. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 50 μl buforu barwiącego do cytometrii przepływowej (sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) + 0,05% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)).</li>
	<li>Wybarwić komórki panelem przeciwciał (np. CD3 fiolet brylantowy (BV) 510 (UCHT1), CD4 allofikocyjaninę-H7 (APC-H7) (SK3), CCR7 fikoerytrynę (PE)-A, CD45RO PE-cyjaninę 7 (PE-Cy7)-A i żywy/martwy znak komórki 7-ADD) w temperaturze pokojowej przez 20 - 30 minut w ciemności. Przeciwciała należy stosować bezpośrednio z zapasu zgodnie z protokołem producenta. 
	UWAGA: Do pomiaru stężenia przeciwciał należy użyć 2,5 μl CD3-BV510, 1,25 μl CD4-APC-H7, CD45RO-PE-Cy7, 7-AAD i 10 μL CCR7-PE. Użyć komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) do miareczkowania różnych stężeń przeciwciał. Do miareczkowania należy przyjąć stężenie przeciwciał wymienione w protokole producenta i użyć połowy i jednej czwartej zalecanego stężenia. Stosować minimalne stężenie przeciwciał, aby uniknąć rozlania się na inne kanały fluorochromowe. Zaobserwowano wyraźne sygnały przy wspomnianych stężeniach przeciwciał. Kompensacja została przeprowadzona poprzez testowanie PBMC początkowo zgodnie z protokołem wspomnianym w Williams i wsp. 20 Do testów, PBMC inkubowano z tym samym zestawem przeciwciał, co tutaj, i kompensowano je poprzez porównanie pojedynczych i wielokrotnych barwień przeciwciał.</li>
	<li>Po okresie inkubacji dodać 1 ml buforu barwiącego do probówki, dobrze wymieszać i odwirować przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu barwiącego.</li>
	<li>Uruchom próbki na maszynie do cytometrii przepływowej.
	<ol>
		<li>Przed uzyskaniem danych skalibruj napięcia kanału cytometru przepływowego za pomocą koralików do ustawiania i śledzenia cytometru (CS&T), aby znormalizować akwizycję danych w różnych dniach zgodnie z instrukcjami producenta.
		<ol>
			<li>Otwórz oprogramowanie do zbierania danych cytometrii przepływowej, kliknij przycisk "Konfiguracja i kontrola jakości", wybierz prawidłowy numer partii koralików CS&T, załaduj kulki, a następnie kliknij przycisk "Start".</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ponownie zawieś komórki, delikatnie stukając w rurkę przed załadowaniem próbek do maszyny. Otwórz oprogramowanie do zbierania danych i kliknij "Podgląd". Gdy stawka progowa jest stabilna, kliknij "Acquire". Monitoruj poziom próbki i kliknij "Stop", gdy próbki się wyczerpią. 
		UWAGA: Uzyskaj 10 000 zdarzeń na próbkę.</li>
		<li>Po uzyskaniu 10 000 zdarzeń wygeneruj wykres punktowy SSC-A i FSC-A w arkuszu.
		<ol>
			<li>Kliknij przycisk "Brama wielokątna" i narysuj bramkę (jest to P1) nad wszystkimi zdarzeniami o wartości FSC-A > 5 x 104, aby wykluczyć zanieczyszczenia. Kliknij przycisk "Utwórz wykres punktowy", aby wygenerować nowy wykres punktowy, kliknij prawym przyciskiem myszy wykres kropkowy, wybierz "Właściwości", aby otworzyć okno "Edytor wykresu", a następnie wybierz "P1". Kliknij FSC-A na osi x wykresu punktowego P1, zmień ją na CD3-BV510. Narysuj ''Bramę wielokąta'', aby wybrać populację CD3+ i nazwać ją ''P2''.</li>
			<li>Kliknij przycisk "Utwórz wykres punktowy", aby wygenerować nowy wykres punktowy, kliknij prawym przyciskiem myszy wykres kropkowy, wybierz "Właściwości", aby otworzyć okno "Edytor wykresu". Kliknij FSC-A na osi x wykresu punktowego P2 i zmień ją na 7-AAD. Narysuj ''Bramę wielokąta'' dla populacji 7-AAD- i wybierz ''P3''. P3 to żywe komórki CD3 +.</li>
			<li>Kliknij przycisk "Utwórz wykres punktowy", aby wygenerować nowy wykres punktowy, kliknij prawym przyciskiem myszy wykres kropkowy, wybierz "Właściwości", aby otworzyć okno "Edytor wykresu". Kliknij CD3-BV510 na osi x i CD4-APCH7 na osi y wykresu punktowego P3. Narysuj prostokątne bramki na górnej i dolnej stronie kwadrantu i wybierz odpowiednio ''P4'' i ''P5''. P4 to żywe CD3 + CD4 +, a P5 to żywe komórki T CD3 + CD4.</li>
			<li>Kliknij przycisk "Utwórz wykres punktowy", aby wygenerować nowy wykres punktowy, kliknij prawym przyciskiem myszy wykres kropkowy, wybierz "Właściwości", aby otworzyć okno "Edytor wykresu". Kliknij CD45RO PE-Cy7 na osi x i CCR7-PE na osi y wykresów P4 i P5. Narysuj ''Poczwórna brama'' na tym wykresie punktowym. 
			UWAGA: Górna lewa strona, górna prawa strona, dolna prawa strona i dolna lewa strona to odpowiednio naiwne, pamięć centralna (TCM), pamięć efektorowa (TEM), końcowo różnicowana pamięć efektorowa (TEMRA) limfocyty T.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Thatcher, R. W., Darougar, S., Jones, B. R. <a target="_blank" href="http://jamanetwork.com/journals/jamaophthalmology/article-abstract/632182">Conjunctival impression cytology.</a> Arch Ophthalmol. 95 (4), 678-681 (1977).</li>
<li>Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+conjunctival+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A simple conjunctival biopsy.</a> Am J Ophthalmol. 84 (6), 798-801 (1977).</li>
<li>Baudouin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathology+of+dry+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Surv+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The pathology of dry eye.</a> Surv Ophthalmol. 45, Suppl 2. S211-S220 (2001).</li>
<li>Nelson, J. D., Wright, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjunctival+goblet+cell+densities+in+ocular+surface+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Conjunctival goblet cell densities in ocular surface disease.</a> Arch Ophthalmol. 102 (7), 1049-1051 (1984).</li>
<li>Brignole, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Fas-Fas+ligand+antigens+and+apoptotic+marker+APO2.7+by+the+human+conjunctival+epithelium.+Positive+correlation+with+class+II+HLA+DR+expression+in+inflammatory+ocular+surface+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Expression of Fas-Fas ligand antigens and apoptotic marker APO2.7 by the human conjunctival epithelium. Positive correlation with class II HLA DR expression in inflammatory ocular surface disorders.</a> Exp Eye Res. 67 (6), 687-697 (1998).</li>
<li>Knop, E., Knop, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+eye-associated+lymphoid+tissue+in+corneal+immune+protection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">The role of eye-associated lymphoid tissue in corneal immune protection.</a> J Anat. 206 (3), 271-285 (2005).</li>
<li>Lopez-Miguel, A., Gutierrez-Gutierrez, S., Garcia-Vazquez, C., Enriquez-de-Salamanca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Collection+From+Human+Conjunctival+Epithelial+Cells+Obtained+With+a+New+Device+for+Impression+Cytology%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">RNA Collection From Human Conjunctival Epithelial Cells Obtained With a New Device for Impression Cytology.</a> Cornea. 36 (1), 59-63 (2017).</li>
<li>Tomlins, P., Roy, P., Cunow, J., Rauz, S. <a target="_blank" href="http://iovs.arvojournals.org/article.aspx?articleid=2150378">Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival impression for Flow Cytometry.</a> Invest Opthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).</li>
<li>Barros Jde, N., Almeida, S. R., Lowen, M. S., Cunha, M. C., Gomes, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impression+cytology+in+the+evaluation+of+ocular+surface+tumors%3A+review+article%5BTitle%5D)+AND+%22Arq+Bras+Oftalmol%22%5BJournal%5D)">Impression cytology in the evaluation of ocular surface tumors: review article.</a> Arq Bras Oftalmol. 78 (2), 126-132 (2015).</li>
<li>Calonge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impression+cytology+of+the+ocular+surface%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Impression cytology of the ocular surface: a review.</a> Exp Eye Res. 78 (3), 457-472 (2004).</li>
<li>Haller-Schober, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+an+impression+cytology+grading+system+%28IC+score%29+in+patients+with+dry+eye+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Evaluating an impression cytology grading system (IC score) in patients with dry eye syndrome.</a> Eye (Lond). 20 (8), 927-933 (2006).</li>
<li>Singh, R., Joseph, A., Umapathy, T., Tint, N. L., Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impression+cytology+of+the+ocular+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Impression cytology of the ocular surface.</a> Br J Ophthalmol. 89 (12), 1655-1659 (2005).</li>
<li>Williams, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjunctival+Neutrophils+Predict+Progressive+Scarring+in+Ocular+Mucous+Membrane+Pemphigoid%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Conjunctival Neutrophils Predict Progressive Scarring in Ocular Mucous Membrane Pemphigoid.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5457-5469 (2016).</li>
<li>Best, N., Drury, L., Wolffsohn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+evaluation+of+the+Oculus+Keratograph%5BTitle%5D)+AND+%22Cont+Lens+Anterior+Eye%22%5BJournal%5D)">Clinical evaluation of the Oculus Keratograph.</a> Cont Lens Anterior Eye. 35 (4), 171-174 (2012).</li>
<li>Downie, L. E., Keller, P. R., Vingrys, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+ocular+bulbar+redness%3A+a+comparison+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Physiol+Opt%22%5BJournal%5D)">Assessing ocular bulbar redness: a comparison of methods.</a> Ophthalmic Physiol Opt. 36 (2), 132-139 (2016).</li>
<li>Amparo, F., Wang, H., Emami-Naeini, P., Karimian, P., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ocular+Redness+Index%3A+a+novel+automated+method+for+measuring+ocular+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">The Ocular Redness Index: a novel automated method for measuring ocular injection.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 54 (7), 4821-4826 (2013).</li>
<li>Shapiro, A., Merin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schirmer+test+and+break-up+time+of+tear+film+in+normal+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Schirmer test and break-up time of tear film in normal subjects.</a> American journal of ophthalmology. 88 (4), 752-757 (1979).</li>
<li>Finis, D., Pischel, N., Konig, C., Hayajneh, J., Borrelli, M., Schrader, S., Geerling, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+OSDI+and+SPEED+questionnaires+for+the+evaluation+of+dry+eye+disease+in+clinical+routine%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmologe%22%5BJournal%5D)">Comparison of the OSDI and SPEED questionnaires for the evaluation of dry eye disease in clinical routine.</a> Ophthalmologe. 111 (11), 1050-1056 (2014).</li>
<li>Behrens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+tear+syndrome%3A+a+Delphi+approach+to+treatment+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional tear syndrome: a Delphi approach to treatment recommendations.</a> Cornea. 25 (8), 900-907 (2006).</li>
<li>Williams, G. P., Pachino, A., Long, H. M., Rauz, S., Curnow, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+production+and+antigen+recognition+by+human+mucosal+homing+conjunctival+effector+memory+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Opthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytokine production and antigen recognition by human mucosal homing conjunctival effector memory CD8+ T cells.</a> Invest Opthalmol Vis Sci. 55 (12), 8523-8530 (2014).</li>
<li>Bose, T., Lee, R., Hou, A., Louis, T., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+resident+memory+T+cells+in+the+human+conjunctiva+and+immune+signatures+in+human+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Tissue resident memory T cells in the human conjunctiva and immune signatures in human dry eye disease.</a> Sci Rep. 7, 45312(2017).</li>
<li>Williams, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dominant+human+conjunctival+epithelial+CD8alphabeta%2B+T+cell+population+is+maintained+with+age+but+the+number+of+CD4%2B+T+cells+increases%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%29%22%5BJournal%5D)">The dominant human conjunctival epithelial CD8alphabeta+ T cell population is maintained with age but the number of CD4+ T cells increases.</a> Age (Dordr). 34 (6), 1517-1528 (2012).</li>
<li>Mrugacz, M., Zak, J., Bakunowicz-Lazarczyk, A., Wysocka, J., Minarowska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+HLA-DR+antigen+in+conjunctival+epithelial+cells+of+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of HLA-DR antigen in conjunctival epithelial cells of patients with cystic fibrosis.</a> Eye (Lond). 21 (8), 1062-1066 (2007).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Jest to łatwa, szybka i mniej inwazyjna technika, która może być stosowana w przychodniach do stosunkowo szybkiego profilowania immunologicznego, w przeciwieństwie do konwencjonalnych technik, takich jak skrobanie, wymaz, pipetowanie lub chłonna bibuła filtracyjna 1,2. Wariant tej techniki jest już stosowany w warunkach badawczych22. Przyszłościowe zastosowanie proponowanej metodologii dotyczy stratyfikacji pacjentów w badaniach klinicznych z chorobami oczu, zwłaszcza wymagającymi immunofenotypowania.
Głównym wyzwaniem związanym z tą techniką jest stosunkowo niewielka liczba komórek odpornościowych pobranych po pobraniu i zeskrobaniu wycisków. Całkowita liczba limfocytów T CD3 + odzyskanych z czterech wycisków na osobę wahała się od ~ 500 - 1,000 komórek. Próbki oka przemywano przed analizą cytometrii przepływowej minimalną liczbę razy, aby uniknąć dalszej utraty komórek. Kluczowymi krokami i wyzwaniami, które pozostają w protokole, są efektywne pobieranie próbek z oka i prawidłowe zeskrobywanie błony w celu uzyskania większej liczby komórek. Niemniej jednak jest mało prawdopodobne, aby to ograniczenie skłaniało się ku jakiemukolwiek specyficznemu fenotypowi immunologicznemu. Rozwiązywanie problemów przeprowadzone w tym miejscu w celu maksymalizacji wydajności komórek polegało na zmniejszeniu liczby etapów mycia po i przed inkubacją przeciwciał.
Istnieją inne ograniczenia w korzystaniu z IC. U pacjentów z silnie zrogowaciałą lub zwłókniejącą powierzchnią oka, taką jak w zespole Stevena Johnsona, wydajność komórkowa może być jeszcze mniejsza niż w tym badaniu. Proporcja komórek odpornościowych może ulec zmianie, jeśli próbki są przechowywane, a nie analizowane tego samego dnia. Trudno jest przewidzieć, czy niektóre typy komórek są bardziej odporne na przechowywanie niż inne. Poprzednie badania wykazały podwyższony poziom ekspresji HLA-DR w komórkach nabłonka spojówki23, więc interesująca byłaby ocena korelacji między HLA-DR a poziomami określonych komórek odpornościowych. Komórki odpornościowe mogą być również związane z poziomem ekspresji chemokin. Kwestie te powinny zostać poruszone w przyszłych badaniach.

Cytologia wyciskowa (IC) została po raz pierwszy przeprowadzona w 1977 roku przez Thatcher et al1. Do pobrania komórek spojówek od pacjentów użyto plastikowego krążka wyciskowego, zamiast innych technik dostępnych w tamtym czasie, takich jak skrobanie, pobieranie wymazów lub pipetowanie1. Obecna technika IC wykorzystuje chłonną bibułę filtracyjną 2 do odciskania spojówki opuszkowej i powiekowej oraz zbierania najbardziej powierzchownej warstwy komórek spojówki. Komórki te, osiągnąwszy końcowy etap różnicowania, są nieustannie wylewane do łez3. W próbkach IC znaleziono trzy główne populacje komórek: komórki nabłonkowe4, komórki kubkowe3,5, oraz tkanka limfatyczna związana z błoną śluzową, tj. efektorowe limfocyty T związane z nabłonkiem lub komórki dendrytyczne6. Komórki powierzchni oka w próbkach IC można analizować za pomocą mikroskopii, blottingu immunologicznego i reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR)7. Cytometria przepływowa została ostatnio wykorzystana do analizy komórek odpornościowych zebranych przez zeskrobanie błony IC8. Co ciekawe, IC6,9 był używany do oceny wielu chorób powierzchni oka, w tym zapalenia rogówki i spojówki, niedoboru witaminy A, pemfigoidu bliznowacieliowego, choroby atopowej, limbicznego zapalenia rogówki i spojówki górnej, wiosennego zapalenia rogówki i spojówki oraz metaplazji płaskonabłonkowej. IC został również wykorzystany do oceny wpływu noszenia soczewek kontaktowych, wykrywania drobnoustrojów powierzchni oka oraz testowania skuteczności terapeutycznej i tolerancji interwencji terapeutycznych w badaniach podłużnych10,11,12.
Wyrób medyczny (EyePrim) jest wspierany przez rodzaj membrany 0,2 μm z polieterosulfonu (PES), która została wcześniej zatwierdzona do techniki cytologii wycisku oka z cytometrią przepływową (OSIC-flow) i otwiera możliwości wykorzystania pobierania próbek podłużnych do monitorowania postępu choroby i odpowiedzi na leczenie (np., szczegółowa analiza leukocytów śródnabłonkowych zdefiniowanych jako domniemane markery choroby postępującego zwłóknienia spojówek w pemfigoidzie błony śluzowej)<klasa SUP="xref">13. Pierwsi badacze używali autoklawowanych filtrów PES, które wymagały ręcznego wycisku. W rezultacie wydajność była zmienna i zależna od użytkownika. Zaletą tego urządzenia medycznego jest łatwość użycia, standaryzowane ciśnienie (Pa lub N/m2) oraz możliwość powtarzalności, odtwarzalności i konsekwentnej regeneracji komórek. Ta technika jest przydatna w przychodni, ponieważ jest niechirurgiczna, łatwa do wykonania i szybka. Jest to wyrób medyczny klasy I (sterylny) zgodnie z dyrektywą 93/42/CEE, CE 0499 (SNCH). Wymaga jedynie znieczulenia miejscowego podczas zabiegu, co zapewnia zachowanie integralności powierzchni oka. Po IC komórki mogą być natychmiast przetworzone do cytometrii przepływowej. Ponadto możliwe jest przeszkolenie techników niebędących okulistami i pielęgniarek w zakresie pobierania próbek z powierzchni oka.
Pomimo ulepszenia IC w stosunku do innych technik, nadal pozostaje kilka wyzwań. Na przykład mogą występować różnice wynikające z obszaru pobierania próbek i różnic regionalnych w spojówce opuszkowej w zależności od położenia IC. Innym źródłem zmienności jest stosowanie różnych wartości ciśnienia podczas IC. Inne kwestie metodologiczne wiążą się ze standaryzacją przetwarzania komórek: dotyczą one czasu trwania i metody utrwalania oraz warunków ewentualnego przechowywania, co może mieć wpływ na stabilność pobieranego materiału.
Ogólnym celem tej techniki jest opracowanie metody izolacji próbek wycisków ocznych, która jest łatwa w użyciu, nieinwazyjna i może być zastosowana do immunologicznej charakterystyki próbek klinicznych.

<table><tbody><tr><td><silne>odczynniki</silne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzkie CD3 BV510</td><td>BD Biosciences</td><td>563109</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzkie CD4 APCH7</td><td>BD Biosciences</td><td>641398</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzkie CD45RO PECy7</td><td>BD Biosciences</td><td>337168</td><td></td></tr><tr><td>roztwór 7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>555816</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzki CCR7 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>552176</td><td></td></tr><tr><td>Pippetes</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Znieczulenie miejscowe</td><td>Alkaina</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceina roztwór sodu</td><td>Bausch & Lomb U.K Limited</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keratograph 5M</td><td>Oculus</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Lampa szczelinowa BioMicroscope</td><td>Haag Streit</td><td>BM900</td><td></td></tr><tr><td>EyePrim</td><td>Opia Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FACS Verse</td><td>BD BioSciences</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad 6.0</td><td>Prism</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FACSPerse oprogramowanie analityczne</td><td>BD</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

nieinwazyjny sposób izolowania i fenotypowania komórek ze spojówki

A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Tradycyjnie, cytologia powierzchni oka jest badana za pomocą technik takich jak technologia szpatułkowa i technologia szczotek. Problem z tymi technikami polega na tym, że mogą one wywoływać zmiany pourazowe na powierzchni oka, które mogą prowadzić do bliznowacenia, deformacji powiek, niedoboru rąbkowych komórek macierzystych, a w niektórych przypadkach powodować duży dyskomfort u pacjenta. Aby uniknąć tych problemów klinicznych, opracowano cytologię wyciskową (IC) w celu diagnozowania zespołu suchego oka, a później nowotworów, choroby atopowej, wiosennego zapalenia rogówki i spojówki. Zazwyczaj klinicyści ręcznie tną bibuły filtracyjne do wymaganych kształtów i nakładają je na powierzchnię oka. Tutaj opisujemy, jak wykonać IC za pomocą dostępnego na rynku urządzenia medycznego. Technika ta została wyjaśniona tutaj, a następnie następuje immunofenotypowanie za pomocą cytometrii przepływowej. Ta technika wymaga mniej ręcznej obsługi i powoduje mniej obrażeń powierzchni oka.

Zastosowanie IC za pomocą tego urządzenia klinicznego pozwoliło nam wyizolować komórki odpornościowe powierzchni oka przy jednoczesnym zachowaniu nienaruszonej struktury tej powierzchni. Rysunek 1 opisuje sposób przeprowadzenia procedury IC. Oznaczono na nim różne miejsca oka, z których pobrano próbki. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywny wynik cytometrii przepływowej uzyskany od 10 zdrowych osób z grupy kontrolnej. Do bramkowania należy wykorzystać SSC oraz 7-AAD w celu odróżnienia komórek żywych od martwych. Komórki 7-AAD- są identyfikowane jako komórki żywe. Komórki żywe są następnie charakteryzowane za pomocą markerów CD3+ oraz CD4+. Ponadto populacje CD4+ i CD4- zostały każda z osobna dalej scharakteryzowane jako Naïve, TEM, TCM oraz TEMRA przy użyciu markerów CCR7 i CD45RO. Wśród limfocytów T CD3+ na powierzchni oka człowieka przeważają efektorowe komórki pamięci T. Wcześniejsze eksperymenty wykazały również, że komórki pamięci CD8+ stanowią główną populację limfocytów T w nabłonku spojówki u zdrowych osób20. Rysunek 3 pokazuje, że efektorowe komórki pamięci T CD4+ i CD8+ (TEM oraz TEMRA) stanowią główną podgrupę na powierzchni oka u 10 badanych zdrowych osób z grupy kontrolnej. Każda populacja wymieniona na rysunku jest oznaczona odpowiednim fenotypem markerów i nazwą (Naïve, TCM, TEM, TEMRA). Liczby zaznaczone na czerwono oznaczają procentowy udział danej populacji. Dane na tym rysunku są przedstawione jako średnia ± SEM
<img alt="Cytologia odciskowa, pobieranie próbek z spojówki, schemat z oznaczonymi stronami skroniową i nosową." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Pobieranie próbek IC z powierzchni oka za pomocą urządzenia do cytologii odciskowej. Próbki pobrano z bocznej części twardówki, jak pokazano na schemacie.
<img alt="Analiza cytometrii przepływowej wykazująca markery CD3, CD4; sześć wykresów kropkowych przedstawiających bramkowanie populacji komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Wykres kropkowy z analizy cytometrii przepływowej. Wyselekcjonowano żywe komórki 7-AAD- . W pierwszej kolejności dokonano bramkowania komórek CD3+, a następnie tę populację podzielono na podgrupy CD4+ oraz CD4-. Udziały podgrup naiwnych (CCR7+CD45RO-), pamięci centralnej (CCR7+CD45RO+) i pamięci efektorowej (CCR7-CD45RO+; CCR7-CD45RO-) określono przy użyciu markerów CCR7 i CD45RO. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55591/55591fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres cytometrii przepływowej przedstawiający populacje podzbiorów limfocytów T CD3+CD4+ i CD3+CD8+ według fenotypu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Podtypy komórek odpornościowych w limfocytach T CD4+ i CD8+ zdrowej ludzkiej powierzchni oka. Rozkład naiwnych podzbiorów CD4+ i CD8+, komórek pamięci centralnej (TCM) oraz komórek pamięci efektorowej (TEM i TEMRA) w spojówce zdrowych osób kontrolnych; każdy punkt danych reprezentuje oddzielną osobę, przedstawiono średnią ± SEM. Procent populacji jest zaznaczony na czerwono pod nazwą każdej z populacji. Całkowity procent populacji wynosi 98%, ponieważ populacja CD4+ TEMRA nie została uwzględniona na wspomnianym wykresie punktowym (zmodyfikowano na podstawie Bose et al.21). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55591/55591fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Odsłonięta normalna powierzchnia oka składa się z rogówki i spojówki. Komórki nabłonkowe, komórki kubkowe i komórki odpornościowe są obecne w spojówce. W tym miejscu opisano nieinwazyjną technikę cytologii wyciskowej z wykorzystaniem urządzenia do cytologii wyciskowej i cytometrii przepływowej do analizy komórek odpornościowych w spojówce.

Nieinwazyjny sposób izolowania i fenotypowania komórek ze spojówki

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...

Ogólnym celem tej techniki cytologii z odbitki jest pozyskanie wystarczającej liczby komórek do immunologicznego fenotypowania komórek uczestniczących w chorobach powierzchni oka. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na pytania z zakresu badani powierzchni oka, takie jak określenie, które komórki odpornościowe są istotne dla stanu zapalnego powierzchni oka. Głównymi zaletami tej techniki są fakt, że jest ona stosunkowo nieinwazyjna oraz prosta w wykonaniu zarówno w warunkach klinicznych, jak i laboratoryjnych.Zastosowania tej techniki obejmują terapię zapalnych schorzeń powierzchni oka, ponieważ pozwala ona na identyfikację specyficznych populacji komórek odpornościowych. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat populacji komórek odpornościowych powierzchni oka. Może być również wykorzystana w badaniach nad toksykologią oraz włóknieniem oka.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na brak doświadczenia w obchodzeniu się z niewielką liczbą komórek pobranych z oka. Po ustaleniu stanu klinicznego uczestnika, należy zakroplić jedną lub dwie krople miejscowego środka znieczulającego do górnej spojówki bulbarnej oraz dolnego sklepienia spojówki w oczach uczestnika. Należy odczekać od czterech do pięciu minut, aż ustąpi uczucie pieczenia wywołane przez anestetyk.Następnie należy przyłożyć urządzenie do cytologii imprintowej stycznie do spojówki po skroniowej stronie gałki ocznej, a następnie delikatnie nacisnąć i przytrzymać przycisk przez dwie do trzech sekund. Za pomocą pincety należy przenieść pobraną błonę oczną do probówki do mikrocentryfugi zawierającej 1 ml pożywki hodowlanej, a następnie przez jedną minutę intensywnie drapać błonę końcówką pipety 10 µL, aby odzyskać pozostałe komórki z urządzenia. Należy zachować ostrożność podczas drapania błony, ponieważ zbyt intensywne działanie doprowadzi do powstania zanieczyszczeń, natomiast zbyt słabe może skutkować niską liczbą uzyskanych komórek.Jeśli powierzchnia błony stanie się nierówna, powtórz drugą kolekcję z tego samego oka po stronie nosa, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Pobierz komórki wraz z pierwszą zawiesiną próbki ocznej i pobierz dwie próbki z drugiego oka uczestnika. W ciągu dwóch do trzech godzin od pobrania odwiruj komórki oczne i zawieś osad w 50 µL Buforu do Barwienia w Cytometrii Przepływowej, zawierającego fosforanowy bufor solny uzupełniony o 0,05% albuminy surowicy bydlęcej.Następnie barwi się komórki za pomocą panelu wybranych przeciwciał przez 20 do 30 minut w temperaturze pokojowej, z osłoną przed światłem. Po zakończeniu inkubacji komórki należy przemyć 1 ml buforu do barwienia, a następnie ponownie zawiesić osad w 200 µL świeżego buforu do barwienia. Napięcia kanałów cytometru przepływowego należy skalibrować w panelu ustawień urządzenia, a następnie przygotować probówkę z kuleczkami śledzącymi (tracking beads) w celu normalizacji akwizycji danych zgodnie z instrukcjami producenta.Następnie w oprogramowaniu do gromadzenia danych z cytometrii przepływowej kliknij Setup QC i wybierz odpowiednią konfigurację cytometru oraz numer partii kulek śledzących. Załaduj kulki i kliknij przycisk Start. Teraz ponownie zawieś suspensję komórkową, delikatnie opukując probówkę, i wprowadź ją do urządzenia.Otwórz oprogramowanie do gromadzenia danych i kliknij Preview. Gdy wartość Threshold Rate będzie stabilna, kliknij Acquire. Monitoruj poziom próbki, klikając Stop w momencie wyczerpania próbki.Po zarejestrowaniu 10 000 zdarzeń wygeneruj wykres kropkowy powierzchniowego rozpraszania w przód (forward scatter area) względem rozpraszania bocznego (side scatter) i za pomocą narzędzia bramki wielokąta (polygon gate) wyznacz bramkę populacji jeden (population one) dla wszystkich zdarzeń o wartości powierzchniowego rozpraszania w przód większej niż 5×10⁴, aby wykluczyć debris. Kliknij Create Dot Plot, aby wygenerować nowy wykres kropkowy. Kliknij prawym przyciskiem myszy na wykresie i wybierz Properties, aby otworzyć okno edytora wykresów (Plot Editor).Wybierz P1 i kliknij obszar rozproszenia w przód (forward scatter) na osi x, aby zmienić wyświetlaną oś na CD3. Otwórz nowy wykres kropkowy dla populacji P2 i zmień oś x na 7-AAD. Wyznacz bramkę wokół populacji negatywnej pod kątem 7-AAD, aby wybrać żywe komórki CD3 dodatnie.Nazwij tę bramkę P3 i otwórz nowy wykres kropkowy. W oknie Edytora Wykresów (Plot Editor) wybierz CD3 dla osi x oraz CD4 dla osi y. Następnie wykorzystaj populacje P4 i P5, aby otworzyć dwa nowe wykresy kropkowe; ustaw osie x tak, aby wyświetlały komórki dodatnie pod kątem CD45RO, a osie y tak, aby w każdym z wykresów wyświetlały komórki dodatnie pod kątem CCR7.Następnie należy utworzyć bramkę P6 wokół komórek CD3 dodatnich, CD4 dodatnich, CCR7 dodatnich i CD45RO dodatnich, a także bramki P7, P8 i P9 wokół komórek CD3 dodatnich, CD4 ujemnych, CCR7 dodatnich i CD45RO dodatnich; komórek CD45RO ujemnych, CCR7 ujemnych, CD4 ujemnych i CD3 dodatnich oraz odpowiednio komórek CD45RO dodatnich, CCR7 ujemnych, CD4 ujemnych i CD3 dodatnich. Populacje CD4 dodatnie i CD4 ujemne można scharakteryzować jako CD45RO dodatnie, CCR7 dodatnie limfocyty T pamięci centralnej oraz CD45RO dodatnie, CCR7 ujemne limfocyty T pamięci efektorowej.Oraz CD45RO negatywne, CCR7 negatywne, terminalnie zróżnicowane limfocyty T pamięci efektorowej, zgodnie z ekspresją markerów CCR7 i CD45RO. Z tych podgrup limfocyty T pamięci efektorowej CD4 dodatnie i CD8 dodatnie stanowią główną subpopulację limfocytów T zazwyczaj obserwowaną na powierzchni oka u zdrowych ludzi. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w ciągu dwóch godzin, pod warunkiem jej prawidłowego przeprowadzenia.Podczas wykonywania tej procedury można przeprowadzić inne badania, takie jak ELISA, Western blot oraz inne analizy, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące cytokin i genów zaangażowanych w szlak sygnałowy. Po opracowaniu technika ta otworzyła badaczom zajmującym się powierzchnią oka drogę do oceny różnych typów komórek odpornościowych w określonej, interesującej grupie demograficznej pacjentów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić cytologię z odbitki oraz jak izolować i przetwarzać komórki odpornościowe z powierzchni oka.

a-non-invasive-way-to-isolate-and-phenotype-cells-from-the-conjunctiva

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film opisuje technikę opartą na wymazówce, aby izolować żywe bakterie komensalne ze spojówki oka. Technika ta może być wykorzystana do profilowania komensalnego mikrobiomu bakteryjnego spojówki, który odgrywa rolę obronną przed patogenami.

Izolacja bakterii komensalnych spojówek na podstawie wymazówki: technika izolacji bakterii komensalnych z spojówki modelu mysiego

W tym filmie pokazujemy procedurę pozyskiwania komórek nabłonka pigmentowego oka od modelu królika. Komórki są pomocne w opracowywaniu strategii terapeutycznych w chorobach zwyrodnieniowych siatkówki.

Izolowanie komórek IPE i RPE: technika pozyskiwania komórek nabłonka pigmentowego oka z oka królika

Zebraliśmy, wybarwiliśmy i zobrazowaliśmy komórki z spojówki wewnętrznej krawędzi powieki u ludzi. Charakteryzując morfologię komórek i aktywność metaboliczną, metoda ta może pogłębić naszą wiedzę na temat suchego oka i roli, jaką tarcie między powierzchniami oka może odgrywać w odczuwaniu dyskomfortu ocznego.

Cytologia wyciskowa obszaru wycieraczki pokrywy

Miliony ludzi cierpią na choroby zwyrodnieniowe siatkówki, które prowadzą do nieodwracalnej ślepoty. Wspólnym elementem wielu z tych chorób jest utrata komórek zwojowych siatkówki (RGC). Ten szczegółowy protokół opisuje izolację pierwotnych mysich RGC przez selekcję dodatnią i ujemną za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja pierwotnych mysich komórek zwojowych siatkówki (RGC) za pomocą cytometrii przepływowej

Ten protokół opisuje metodę izolacji gałki ocznej myszy z powieką, powierzchnią oka, przednimi i tylnymi segmentami w względnie nienaruszonej pozycji.

Izolacja nienaruszonej gałki ocznej w celu uzyskania integralnej tkanki powierzchni oka do badania histologicznego i immunohistochemii

Prezentowana tutaj jest wielofotonowa mikroskopijna platforma do obrazowania powierzchni oka myszy na żywo. Fluorescencyjna mysz transgeniczna umożliwia wizualizację jąder komórkowych, błon komórkowych, włókien nerwowych i naczyń włosowatych na powierzchni oka. Nieliniowe sygnały generujące drugą harmoniczną pochodzące ze struktur kolagenowych zapewniają obrazowanie bez znaczników dla architektur zrębowych.

Niestandardowa platforma mikroskopii wielofotonowej do obrazowania na żywo rogówki i spojówki myszy

Prezentowany tutaj jest protokół izolacji i amplifikacji tlenowych i fakultatywnych beztlenowych mysich bakterii komensalnych spojówek przy użyciu unikalnego wymazu z oka i etapu wzbogacania opartego na hodowli z późniejszą identyfikacją za pomocą metod mikrobiologicznych i spektrometrii mas MALDI-TOF.

Izolacja komensalna spojówek i identyfikacja u myszy

Tutaj przedstawiono protokół izolacji i transfekcji pierwotnych komórek nabłonka tęczówki i barwnika siatkówki od różnych ssaków (myszy, szczury, króliki, świnie i bydło). Metoda ta idealnie nadaje się do badania podejść do ocznej terapii genowej w różnych konfiguracjach do analiz ex vivo i badań in vivo, które można przenieść na ludzi.

Izolacja, hodowla i inżynieria genetyczna pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego ssaków do niewirusowej terapii genowej

Pożywka bez płodowej surowicy bydlęcej bez czerwieni fenolowej jest lepszą opcją niż zaawansowane RPMI, aby wyeliminować egzogenne hormony bez zmiany normalnej funkcji komórek kubkowych spojówki w badaniu różnic związanych z płcią.

In vitro Metoda badania różnic opartych na płci w komórkach kubkowych spojówek

Tutaj prezentujemy protokół do izolacji i identyfikacji ludzkich komórek niszy rąbkowej.

Izolacja i identyfikacja komórek niszy rąbka ramiennego

Niniejszy artykuł demonstruje działanie i wpływ mikroskopii konfokalnej in vivo w diagnozie i leczeniu suchego oka oraz bada zastosowanie i wyniki mikroskopii konfokalnej in vivo , aby stanowić podstawę przyszłych badań.

In Vivo Mikroskopia konfokalna w diagnostyce i leczeniu suchego oka: Skupienie się na protokołach obrazowania i interpretacji

Poznaj nieinwazyjną metodę cytologii wyciskowej do izolacji i immunofenotypowania komórek z powierzchni oka. Technika umożliwia identyfikację podpopulacji limfocytów T metodą cytometrii przepływowej.

Nieinwazyjny sposób izolowania i fenotypowania komórek ze spojówki

Przeglądaj więcej filmów