Nieinwazyjny sposób izolowania i fenotypowania komórek ze spojówki
July 5th, 2017
Odsłonięta normalna powierzchnia oka składa się z rogówki i spojówki. Komórki nabłonkowe, komórki kubkowe i komórki odpornościowe są obecne w spojówce. W tym miejscu opisano nieinwazyjną technikę cytologii wyciskowej z wykorzystaniem urządzenia do cytologii wyciskowej i cytometrii przepływowej do analizy komórek odpornościowych w spojówce.
Ogólnym celem tej techniki cytologii wyciskowej jest uzyskanie wystarczającej liczby komórek do immunologicznego fenotypu komórek zaangażowanych w chorobę powierzchni oka. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na pytania w dziedzinie powierzchni oka, takie jak to, które komórki odpornościowe są ważne dla zapalenia powierzchni oka. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest stosunkowo nieinwazyjna i prosta do wykonania w klinice i laboratorium.
Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii zaburzeń zapalnych powierzchni oka, ponieważ umożliwia identyfikację określonych populacji komórek odpornościowych. Ta metoda może zapewnić wgląd w populację komórek odpornościowych na powierzchni oka. Może być również stosowany do badań toksykologii oka i zwłóknienia oka.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z powodu braku doświadczenia w radzeniu sobie z niewielką liczbą komórek pobranych z oka. Po ustaleniu stanu klinicznego uczestnika nałóż jedną lub dwie krople znieczulenia miejscowego na górną wytrysk opuszkowy i dolną złość oczu uczestnika. Odczekaj od czterech do pięciu minut, aż uczucie pieczenia środka znieczulającego ustąpi
.Następnie umieść urządzenie do cytologii wyciskowej stycznie na wyciskaczu po stronie opuszki skroniowej i delikatnie naciśnij i przytrzymaj przycisk przez dwie do trzech sekund. Za pomocą kleszczy uwolnij zebraną w całości błonę oczną do probówki mikrowirówkowej zawierającej jeden mililitr pożywki hodowlanej, a następnie przez minutę ciągłego skrobania błony za pomocą końcówki do pipety o pojemności 10 mikrolitrów w celu odzyskania reszty komórek z urządzenia. Zachowaj ostrożność podczas skrobania membrany, ponieważ zbyt duże skrobanie spowoduje połączenie zanieczyszczeń, podczas gdy zbyt małe skrobanie może skutkować niskim zużyciem komórek.
Gdy powierzchnia błony stanie się nierówna, powtórz drugie pobranie z tego samego oka po nosowej stronie oka, jak właśnie pokazano. Wyciągnij komórki z pierwszą zawiesiną próbki do oka i zbierz dwie próbki z drugiego oka uczestnika. W ciągu dwóch do trzech godzin od pobrania odwirować komórki gałki ocznej i ponownie zawiesić osad w 50 mikrolitrach buforu barwiącego do cytometrii przepływowej, zawierającego sól fizjologiczną buforowaną fosforanami uzupełnioną 0,05% albuminą surowicy bydlęcej.
Następnie wybarwiaj komórki panelem interesujących przeciwciał przez 20 do 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Pod koniec inkubacji przemyć komórki jednym mililitrem buforu barwiącego i ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach świeżego buforu barwiącego. Skalibruj napięcia kanału cytometru przepływowego w panelu ustawień cytometru i ustaw rurkę z kulkami śledzącymi, aby znormalizować akwizycję danych zgodnie z instrukcjami producenta.
Następnie w oprogramowaniu do zbierania danych cytometrii przepływowej kliknij opcję Setup QC i wybierz odpowiednią konfigurację cytometru oraz numer partii koralików śledzących. Załaduj koraliki i kliknij przycisk Start. Teraz ponownie zawieś zawiesinę ogniw delikatnym stuknięciem i załaduj rurkę na maszynę.
Otwórz oprogramowanie do zbierania danych i kliknij przycisk Podgląd. Gdy stawka progowa jest stabilna, kliknij przycisk Nabierz. Monitoruj poziom próbki, klikając przycisk Zatrzymaj, gdy próbka się wyczerpie.
Po zdobyciu 10 000 zdarzeń wygeneruj wykres punktowy obszaru rozproszonego do przodu i użyj narzędzia bramki wielokątów, aby narysować populację o jedną bramę nad wszystkimi zdarzeniami z wartością obszaru rozproszenia do przodu większą niż pięć razy 10 do czwartej, aby wykluczyć szczątki. Kliknij przycisk Utwórz wykres punktowy, aby wygenerować nowy wykres punktowy. Kliknij prawym przyciskiem myszy na działce i wybierz Właściwości, aby otworzyć okno Edytora wydruku.
Wybierz P1 i kliknij obszar punktowy do przodu na osi x, aby zmienić wyświetlaną oś na CD3. Otwórz nowy wykres punktowy dla populacji P2 i zmień oś x na 7-AAD. Narysuj bramkę wokół populacji 7-AAD ujemnej, aby wybrać żywotne komórki CD3-dodatnie.
Nazwij tę bramkę P3 i otwórz nowy wykres punktowy. W oknie Edytor wydruku wybierz CD3 dla osi x i CD4 dla osi y. Teraz użyj populacji P4 i P5, aby otworzyć dwa nowe wykresy kropkowe i ustaw osie x, aby wyświetlić komórki dodatnie CD45RO, a osie y, aby wyświetlić komórki dodatnie CCR7 na każdym wykresie.
Następnie utwórz bramkę P6 wokół komórek CD3 dodatnich, CD4 dodatnich, CCR7 dodatnich, CD45RO dodatnich i bramek P7, P8 i P9 wokół komórek CD3 dodatnich, CD4 ujemnych, CCR7 dodatnich, CD45RO dodatnich. CD45RO ujemne, CCR7 ujemne, CD4 ujemne, CD3 dodatnie komórki i CD45RO dodatnie, CCR7 ujemne, CD4 ujemne, CD3 dodatnie, odpowiednio. Populacje CD4 dodatnie i CD4 ujemne można scharakteryzować jako CD45RO dodatnie, CCR7 dodatnie, komórki T pamięci centralnej i CD45RO dodatnie, CCR7 ujemne komórki T pamięci efektorowej.
I CD45RO ujemne, CCR7 ujemne, T końcowo zróżnicowane pamięć efektorowe zgodnie z ich ekspresją markerów CCR7 i CD45RO. Spośród tych podzbiorów, CD4 dodatnie i CD8 dodatnie limfocyty pamięci efektorowej są główną subpopulacją limfocytów T zwykle obserwowanych na powierzchni oka zdrowych ludzi. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Próbując tego, można przeprowadzić inne procedury, takie jak ELISA, Western blot i inne badania, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące cytokin i genów zaangażowanych w szlak sygnałowy. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami powierzchni oka do oceny różnych typów komórek odpornościowych w określonej grupie demograficznej pacjentów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać cytologię wyciskową oraz jak izolować i przetwarzać komórki odpornościowe z powierzchni oka.
Przegląd
Ten artykuł opisuje nieinwazyjną technikę cytologii wtłaczania w celu analizy komórek odpornościowych w spojówce powierzchni ocznej. Metoda ma na celu uzyskanie wystarczającej liczby komórek do immunologicznego fenotypu tych zaangażowanych w choroby powierzchni oczu.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Immunologia powierzchni oczu
- Techniki analizy komórkowej
- Zaburzenia zapalne
Tło
- Powierzchnia oka obejmuje rogówkę i spojówkę.
- Zawiera komórki nabłonkowe, komórki kubełkowe i komórki odpornościowe.
- Rozumienie populacji komórek odpornościowych jest kluczowe dla rozwiązania zapalenia powierzchni oczu.
- Cytologia wtłaczania oferuje metodę pobierania i analizowania tych komórek.
Cel badania
- Zidentyfikowanie komórek odpornościowych istotnych dla zapalenia powierzchni oczu.
- Dostarczenie wglądu w populacje komórek odpornościowych powierzchni oczu.
- Fazylitowanie badań w dziedzinie toksykologii oczu i fibrozy.
Stosowane metody
- Zastosowanie miejscowego znieczulenia na spojówkę.
- Użycie urządzenia do cytologii wtłaczania w celu pobrania komórek.
- Cytometria przepływowa do immunologicznego fenotypu zebranych komórek.
- Analiza populacji komórek na podstawie specyficznych markerów.
Główne wyniki
- Skuteczne izolacja komórek odpornościowych z powierzchni oczu.
- Identyfikacja populacji komórek T dodatnich na CD4 i CD8.
- Charakteryzacja podzbiorów komórek T na podstawie markerów CCR7 i CD45RO.
- Wgląd w reakcję odpornościową w zdrowiu i chorobie powierzchni oczu.
Wnioski
- Technika cytologii wtłaczania jest skuteczna w badaniu komórek odpornościowych powierzchni oczu.
- Może poprawić zrozumienie chorób zapalnych powierzchni oczu.
- Opanowanie tej techniki może prowadzić do znaczących postępów w badaniach okulistycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Non-invasive impression cytology with flow cytometric immunophenotyping enables precise characterization of ocular surface immune cell populations, supporting early discovery and mechanistic de-risking in ocular inflammation research. This workflow reduces procedural trauma, increases sample integrity, and provides quantitative immune profiling critical for target validation and translational studies. The approach enhances predictive confidence for therapeutic hypothesis testing and portfolio triage in ocular and immunology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune cell involvement in ocular surface inflammation and fibrosis.
- Supports functional target validation by identifying specific T cell subsets and memory phenotypes.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying immune pathways implicated in disease.
- Provides quantitative immune cell data for hypothesis-driven portfolio decisions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, minimally perturbed cell populations for downstream immunological assays.
- Standardizes sample collection and processing, improving reproducibility across studies.
- Generates quantitative flow cytometry outputs for robust immune cell phenotyping.
- Enables reliable evaluation of compound effects on ocular immune cell populations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns immune cell phenotyping with disease-relevant ocular models for translational continuity.
- Supports biomarker discovery and validation for ocular surface inflammatory disorders.
- Provides a bridge from discovery to preclinical validation by enabling immune monitoring in patient-derived samples.
- De-risks advancement decisions by supplying mechanistic immune data relevant to clinical endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling non-invasive immune cell isolation, quantitative phenotyping, and downstream biomarker or mechanistic studies in ocular research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on immune cell roles in ocular surface pathology.
- Screening: Delivers standardized, reproducible cell samples for immunological assay development.
- Analytics: Provides quantitative flow cytometry data for comparing immune cell subsets across conditions.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and immune monitoring in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, low-trauma workflow for immune cell phenotyping in ocular and related indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in ocular immune research.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of immune cell isolation and analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust immune phenotyping data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of ocular and immunology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and immune cell gating strategies.
- Needs access to calibrated flow cytometers and validated antibody panels.
- Demands cross-team standardization of sample handling and data analysis protocols.
- May require adaptation for low cell yield and debris management in ocular samples.
- Practical limitations include operator learning curve and sample throughput constraints.
