Przewlekły autoimmunologiczny model szczura z suchym okiem ze wzrostem liczby efektorowych limfocytów T pamięci w tkance gałki ocznej
7 czerwca 2017
Ten raport opisuje metodę wywoływania przewlekłego eksperymentalnego autoimmunologicznego suchego oka u szczurów Lewisa poprzez immunizację emulsją ekstraktu z gruczołu łzowego szczura, albuminy jaja kurzego i kompletnego adiuwantu Freunda, a następnie wstrzyknięcie ekstraktu z gruczołu łzowego i albuminy jaja kurzego do otworu podspojówkowego i gruczołów łzowych sześć tygodni później.
Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie klinicznych cech dysfunkcji łez i zapalenia gruczołów łzowych u szczurów za pomocą immunizacji podskórnej oraz podspojówkowego i śródłzowego wstrzyknięcia ekstraktów z gruczołów łzowych w celu oceny terapii autoimmunologicznego zespołu suchego oka. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące zespołu suchego oka, takie jak to, czy leki hamujące limfocyty T w chorobie autoimmunologicznej są skuteczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że wywołuje ona objawy choroby oczu podobne do ludzkiego zespołu suchego oka, a także określa ilościowo limfocyty T naciekające gruczoł łzowy i oko.
Implikacje tego modelu zwierzęcego rozszerzają się w kierunku zrozumienia transportu limfocytów, ponieważ można badać śledzionę i węzły chłonne. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z powodu braku odpowiedniego oprzyrządowania do dokumentowania zmian w małym oku szczura. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ niektóre kroki są trudne do nauczenia się ze względu na szybkie wysychanie oka szczura i brak mrugnięć po znieczuleniu.
Po eutanazji samicy szczura Sprague Dawley zgodnie z protokołem tekstowym, połóż zwierzę płasko jednym uchem przy stole, a drugim skierowanym do góry. Za pomocą nożyczek wykonaj 10-milimetrowe nacięcie góra-dół pod odsłoniętym uchem. Następnie należy usunąć gruczoł łzowy, wycinając go z otaczającej tkanki łącznej i z kanału drenażowego.
Następnie za pomocą nożyczek zmiel tkankę tak drobno, jak to możliwe na lodzie. Następnie dodaj 150 mikrolitrów PBS z 1X inhibitorem proteazy na gruczoł łzowy. Przy sonikatorze ustawionym na 10 sekund włączenia, 10 sekund przerwy i amplitudzie 30%, sonikuj próbki na lodzie z prędkością 20 kiloherców przez pięć minut.
Następnie odwirować próbki poddane sonikacji w temperaturze 13 000 g i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Przenieść supernatant do nowej probówki. Następnie podwielokrotność supernatantu do probówek o pojemności 1,5 mililitra i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Przenieść kompletny adiuwant Freunda zawierający pięć miligramów na mililitr Mycobacterium tuberculosis H37Ra lub niekompletny adiuwant Freunda do 50-mililitrowej probówki, upewniając się, że objętość adiuwantu do mieszaniny antygenów jest w stosunku jeden do jednego. Dodaj mieszaninę antygenu zawierającą dwa miligramy na mililitr albuminy jaja kurzego i 10 miligramów na mililitr ekstraktu z gruczołów łzowych kropla po kropli do roztworu adiuwanta, wirując z największą prędkością, która nie powoduje rozlania. Kontynuuj wirowanie przez pięć minut po dodaniu całego antygenu.
Przenieś emulsję do pięciomililitrowej strzykawki i użyj łącznika strzykawki, aby połączyć ją z kolejną pięciomililitrową strzykawką. Następnie przepchnij emulsję z jednej strzykawki do drugiej, aby ją wymieszać. W dniu zero rozprowadzić 200 mikrolitrów emulsji, która zawiera jeden miligram ekstraktu z gruczołu łzowego i 200 mikrogramów albuminy jaja kurzego w kompletnym adiuwantzie Freunda, do jednomililitrowych strzykawek Luer lock i wyposażyć strzykawki w igły o rozmiarze 27.
Bez użycia znieczulenia wstrzyknąć podskórnie emulsję u podstawy ogonów szczura. Następnie, w dniu 14, w podobny sposób, wstrzyknij 200 mikrolitrów tego samego antygenu do niekompletnego adiuwantu Freunda. Tego samego dnia wstrzyknąć dootrzewnowo 300 nanogramów toksyny krztuścowej w 100 mikrolitrach PBS.
W 48 dniu zważyć wymaganą ilość albuminy jaja kurzego i rozpuścić ją w PBS. Następnie połącz albuminę jaja kurzego z rozmrożonym ekstraktem gruczołu łzowego przygotowanym wcześniej w tym filmie, tworząc roztwór antygenu zawierający jeden miligram na mililitr albuminy jaja kurzego i jeden miligram na mililitr ekstraktu z gruczołów łzowych. Po znieczuleniu szczura wstrzyknij pięć mikrolitrów antygenu do przeddniówki podspojówkowej oka.
Następnie wstrzyknij 20 mikrolitrów antygenu do gruczołu łzowego. Trzymając znieczulonego szczura zgodnie z protokołem tekstowym, aby zmierzyć objętość łez za pomocą czerwonej nici fenolowej, użyj jednej pary kleszczy do przytrzymania nici, a drugiej, aby pociągnąć dolną powiekę szczura. Umieść nić w bliższym rogu dolnej dziurki na jedną minutę, a następnie usuń nić.
Następnie umieść nić obok linijki z milimetrowymi oznaczeniami i zrób zdjęcie długości zwilżonej części nici. Aby zmierzyć gładkość rozdarcia rogówki, umieść szczura pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w oświetlacz pierścieniowy i kamerę. Następnie nałóż pięć mikrolitrów soli fizjologicznej na rogówkę szczura.
Palcami w rękawiczkach biernie mrugaj, przesuwając górną i dolną powiekę około pięć razy, aby rozprowadzić sól fizjologiczną. W powiększeniu 1,6-krotnym skup oświetlacz pierścieniowy na środku powierzchni rogówki. Następnie, po 10 sekundach, uzyskaj obrazy fotograficzne.
Użyj skanowania fluoresceiną, aby zmierzyć uszkodzenie rogówki, dodając dwa mikrolitry 0,2% fluoresceiny do rogówki szczura. Palcem w rękawiczce biernie otwórz i zamknij powieki szczura trzy razy, aby rozprowadzić barwnik fluoresceinowy na powierzchni oka. Po minucie użyj trzymililitrowej strzykawki, aby pobrać jeden mililitr soli fizjologicznej.
Następnie umieść strzykawkę około dwóch do trzech milimetrów przed rogówką i delikatnie nałóż sól fizjologiczną na oko. Przy wyłączonym świetle tła uzyskuj obrazy pod filtrem kobaltowo-niebieskim mikroskopu do obrazowania oczu. Po eutanazji szczura zgodnie z protokołem tekstowym użyj nożyczek, aby usunąć górną i dolną powiekę.
Uwolnij gałkę ziemską, przecinając mięśnie zewnątrzgałkowe, nerw wzrokowy i spojówkę otworu. Wykonaj nacięcie, aby otworzyć gałkę oczną. Wyjmij soczewkę w ciele szklistym.
Następnie umieść wypreparowane gałki oczne w 1,5-mililitrowych rurkach na lodzie. Na koniec zbierz gruczoły łzowe, jak opisano wcześniej w tym filmie. Ten rysunek przedstawia reprezentatywne obrazy czerwonych nici fenolowych z kontroli i szczura DET.
Długość nici czerwieni fenolowej w grupie DED jest krótsza niż w grupie kontrolnej, co wskazuje na mniejszą objętość rozdarcia. Fluoresceina wiąże się z uszkodzonym nabłonkiem rogówki i dlatego służy do pomiaru zakresu uszkodzenia. W tym eksperymencie plamki fluoresceinowe na powierzchni rogówki szczurów DED oceniono od zera do dwóch i porównano ze szczurami kontrolnymi.
Szczury z DED mają więcej barwienia fluoresceiną niż szczury kontrolne, co sugeruje uszkodzenie rogówki. Jak widać tutaj, jeśli powierzchnia rogówki jest gładka z wysoką stabilnością rozdarcia, obraz pierścienia oświetlacza na powierzchni oka jest okrągły i doskonały. Zniekształcenie obrazu wskazuje na zmniejszoną gładkość rogówki i niestabilny film łzowy, co zaobserwowano z większym stopniem zniekształcenia w grupie SED.
Ta analiza cytometrii przepływowej pokazuje, że dominującym podzbiorem limfocytów T w normalnych tkankach gałki ocznej szczura są limfocyty T pamięci efektorowej. W gałkach ocznych szczurów DED około 70% limfocytów T CD3-dodatnich to limfocyty T pamięci efektorowej, podczas gdy u szczurów kontrolnych liczba ta wynosi około 50%Gałki oczne szczurów DED mają znacznie wyższe limfocyty T pamięci efektorowej niż u szczurów kontrolnych. Po tej procedurze można przeprowadzić barwienie innych rodzajów komórek odpornościowych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania.
Na przykład możesz barwieć wrodzone komórki odpornościowe lub limfocyty B. Po opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do zrozumienia immunologii powierzchni oka, a także do dalszego badania zespołu suchego oka u ludzi i zespołu Sjögrena. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wywołać autoimmunologiczne suche oko u szczurów i przeprowadzić solidną dokumentację wyników.
Przegląd
Niniejszy raport opisuje metodę indukowania przewlekłego eksperymentalnego autoimmunologicznego zespołu suchego oka u szczurów linii Lewis poprzez immunizację emulsją ekstraktu z gruczołu łzowego szczura, owalbuminy oraz pełnego adiuwantem Freunda. Procedura ma na celu odtworzenie klinicznych cech dysfunkcji łez i stanu zapalnego gruczołu łzowego w celu przeprowadzenia oceny terapeutycznej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Oftalmologia
- Immunologia
Wstęp
- Przewlekły zespół suchego oka to powszechna schorzenie wpływająca na produkcję łez.
- Modele zwierzęce są niezbędne do badania chorób autoimmunologicznych.
- Metoda ta pozwala na ocenę terapii ukierunkowanych na supresję limfocytów T.
- Zrozumienie transportu limfocytów jest kluczowe dla opracowywania metod leczenia.
Cel badania
- Wywołanie objawów klinicznych zespołu suchego oka u szczurów.
- Ocena skuteczności leków w stanach autoimmunologicznych.
- Ilościowe określenie nacieku limfocytów T w gruczole łzowym i oku.
Zastosowane metody
- Immunizacja podskórna za pomocą ekstraktu z gruczołu łzowego i owalbuminy.
- Wstrzyknięcia antygenu podspójniówkowo i do wnętrza gruczołu łzowego.
- Pomiar objętości łez i uszkodzeń rogówki przy użyciu fluoresceiny.
- Disekcja i przygotowanie gruczołów łzowych do analizy.
Główne wyniki
- Wywołano objawy choroby oczu podobne do ludzkiego zespołu suchego oka.
- Ilościowo określono naciek limfocytów T w gruczołach łzowych.
- Wykazano zmniejszoną objętość łez w grupie eksperymentalnej.
- Wykazano uszkodzenia rogówki przy użyciu barwienia fluoresceiną.
Wnioski
- Model ten jest skuteczny w badaniu autoimmunologicznego zespołu suchego oka.
- Pozwala on na lepsze zrozumienie mechanizmów ruchu limfocytów.
- Dokumentacja wizualna jest kluczowa dla pomyślnej realizacji procedury.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten przewlekły autoimmunologiczny model suchego oka u szczurów umożliwia mechaniczną weryfikację bezpieczeństwa terapeutyków celujących w limfocyty T poprzez odtworzenie stanu zapalnego powierzchni oka przypominającego ten u ludzi oraz kwantyfikację infiltracji efektorowych limfocytów T pamięci w tkance gałki ocznej. Wspiera on walidację celu i rozwój modeli przedklinicznych dla autoimmunologicznego suchego oka oraz zespołu Sjögrena, zapewniając system istotny z punktu widzenia choroby do oceny związków immunomodulujących przed translacją kliniczną. Zdolność modelu do pomiaru migracji komórek odpornościowych i uszkodzeń rogówki zapewnia pewność prognostyczną w identyfikacji wiodących kandydatów oraz w selekcji portfolio immunoterapii okulistycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez modelowanie autoimmunologicznego zespołu suchego oka za pomocą immunizacji ekstraktem z gruczołu łzowego, co umożliwia funkcjonalną walidację patologii zapśredniczonej przez limfocyty T.
- Wartość operacyjna: Zapewnia odtwarzalny system ilościowego oznaczania komórek T pamięci efektorowej CD3+ w tkance gałki ocznej za pomocą cytometrii przepływowej, wspierając badania nad angażowaniem celu oraz mechanizmem działania.
- Biomarker translacyjny: Akumulacja komórek T pamięci efektorowej służy jako odczyt farmakodynamiczny do oceny skuteczności leków immunomodulujących w warunkach przedklinicznych.
Przesiewanie i opracowywanie analiz
- Gotowość testu: Standaryzowane odczyty, w tym pomiar objętości przerwania nici z czerwienią fenolową oraz ocena uszkodzeń rogówki z użyciem fluoresceiny, umożliwiają ilościowe przesiewanie związków.
- Powtarzalność: Określony harmonogram immunizacji i dawek przypominających zapewnia spójną indukcję choroby w obrębie kohort, co wspiera standaryzację testu w celu oceny terapeutycznej.
- Skalowalność: Zastosowanie strzykawek, sonikacji i protokołów wirowania pozwala na przetwarzanie partiami ekstraktów z gruczołów łzowych, co ułatwia replikację modelu w kampaniach odkrywania leków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- System istotny dla choroby: Model odzwierciedla kluczowe cechy kliniczne zespołu suchego oka u ludzi — zmniejszoną produkcję łez, niestabilność filmu łzowego oraz uszkodzenia rogówki — co wspiera ciągłość translacyjną.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Umożliwia ocenę migracji limfocytów oraz infiltracji ocznych komórek odpornościowych, co redukuje ryzyko w przypadku celów terapeutycznych zaangażowanych w patogenezę autoimmunologiczną.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Dane z profilowania immunologicznego dostarczają informacji do decyzji go/no-go poprzez powiązanie modulacji celu z redukcją efektorowych komórek T pamięci oraz poprawą objawów klinicznych.
Integracja rurociąga i przepływu pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum odkrywania leków, od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne testy skuteczności, w szczególności w przypadku immunomodulatorów i leków biologicznych ukierunkowanych na stan zapalny powierzchni oka.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów autoimmunologicznych poprzez indukowanie stanu zapalnego gruczołów łzowych i naciekania limfocytów T za pomocą immunizacji swoistej dla antygenu.
- Przesiewanie: Umożliwia ilościową ocenę objętości łez i integralności rogówki, zapewniając skalowalne punkty końcowe do przesiewania bibliotek związków.
- Analityka: Cytometria przepłyewowa i barwienie fluoresceiną dostarczają ilościowych odczytów odpornościowych i uszkodzeń, które wspierają analizę porównawczą między grupami terapeutycznymi.
- Badania translacyjne: Łączy oczne odpowiedzi immunologiczne z patologią zespołu suchego oka u ludzi, wspierając dopasowanie biomarkerów i walidację przedkliniczną.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zestandaryzowane przepływy pracy w zakresie przygotowania antygenów, immunizacji i przetwarzania tkanek umożliwiają ich ponowne wykorzystanie w wielu programach terapeutycznych w immunologii i okulistyce.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Wiarygodność prognostyczna w walidacji celu poprzez kwantyfikację efektorowych limfocytów T pamięci oraz klinicznych fenotypów suchego oka.
- Wartość operacyjna: Standaryzowana immunizacja, przetwarzanie tkanek i pomiar wyników zapewniają powtarzalność pomiędzy ośrodkami i badaniami.
- Wartość strategiczna: Umożliwia lepsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez powiązanie mechanizmu immunomodulacyjnego z redukcją patogennych limfocytów T i poprawą objawów klinicznych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja kandydatów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o skuteczność modulacji odpornościowej oraz profile ochrony rogówki.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w chirurgii gryzoni, obchodzeniu się z gałką oczną oraz w cytometrii przepływowej do analizy komórek odpornościowych.
- Zależne od procesu sonikacji, wirowania oraz sterylnego przygotowania strzykawek do wytwarzania emulsji antygenowej.
- Konieczna jest standaryzacja między zespołami w zakresie czasu immunizacji, dawkowania antygenu oraz pobierania tkanek w celu zapewnienia spójności modelu.
- Rozważania dotyczące adaptacji obejmują wybór szczepu (szczury Lewis), źródło antygenu oraz protokoły znieczulenia do zastrzyków i pomiarów okulistycznych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują trudności techniczne w pomiarach okulistycznych ze względu na szybkie wysychanie oka i brak mrugania po znieczuleniu, co wymaga przeszkolenia w zakresie obserwacji wizualnej i standaryzacji obrazowania.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
8:57
Conclusion
7:19
Results
1:18
Preparation of Lacrimal Gland Extract
2:32
Preparation of Emulsion
3:30
Immunization of Lewis Rats and Injection of Antigen Mixture into the Forniceal Subconjunctiva and Lacrimal Gland
4:53
Assessment of Dry Eye Features
