Name: Przewlekły autoimmunologiczny model szczura z suchym okiem ze wzrostem liczby efektorowych limfocytów T pamięci w tkance gałki ocznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Poznaj metodę indukcji przewlekłego autoimmunologicznego suchego oka u szczurów Lewis poprzez immunizację ekstraktem gruczołu łzowego. Model ten umożliwia ocenę terapii immunosupresyjnych i badanie migracji limfocytów T w tkance gałki ocznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Pani Tin Min Qi oraz dr Veluchamy Amutha Barathi i jej zespołowi za pomoc w obchodzeniu się ze zwierzętami. Prace te były wspierane przez NHIC-I2D-1409007, SingHealth Foundation SHF/FG586P/2014 oraz NMRC/CSA/045/2012.

Zwierzęta były traktowane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. Protokół badania został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt SingHealth.
1. Przygotowanie ekstraktu z gruczołów łzowych
UWAGA: Szczury zostały znieczulone dootrzewnowym wstrzyknięciem ketaminy (75 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg). Prawidłowe znieczulenie zostało potwierdzone przez szczypanie palców u nóg i ogonów. Żel okulistyczny nakładano na oczy szczura, aby zapobiec wysuszeniu po każdym zabiegu. Znieczulone szczury umieszczono pod światłem dalekiej podczerwieni, aby utrzymać zwierzęta w cieple, dopóki w pełni nie wyzdrowieją. Podczas zabiegów i czasu rekonwalescencji zwierzęta były ściśle monitorowane przez badaczy. Wszystkie materiały i narzędzia chirurgiczne były sterylne przed użyciem. Pod koniec eksperymentu szczury poddano eutanazji poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu (80 mg/kg). Całkowita eutanazja została zweryfikowana przez brak tętna serca i brak odruchu mrugania przez dotknięcie gałki ocznej. Szczury trzymano w standardowych warunkach: temperatura pokojowa, 21-23 °C; wilgotność względna, 30-70%; cykl jasny i ciemny, na przemian 12 godzin (od 7 rano do 7 wieczorem).
<ol>
	<li>Ułóż poddane eutanazji samice szczurów Sprague-Dawley (w wieku od 8 tygodni do 16 tygodni) płasko, jednym uchem opartym o stół, a drugim skierowanym do góry. Wykonaj 10-milimetrowe nacięcie góra-dół pod odsłoniętym uchem za pomocą nożyczek sprężynowych. Usunąć gruczoł łzowy, wycinając go z otaczającej tkanki łącznej i z kanału drenażowego.
	<ol>
		<li>Przechowywać gruczoły w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą potrzebne. Rozmrozić gruczoły na lodzie. Zmiel jak najdrobniej na lodzie nożyczkami. Dodać 150 μl PBS z 1x inhibitorem proteazy na gruczoł łzowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sonikować próbki na lodzie przez 5 minut przy 20 kHz z sonikator ustawionym na 10 s włączenia, 10 s wyłączony przy 30% amplitudzie. Odwirować próbki poddane sonikacji przez 20 minut w temperaturze 13 000 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odpipetować supernatant i przenieść go do nowej probówki. Porcję supernatantu rozmieścić w probówkach o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C. Zmierzyć stężenie białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego 22, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
2. Przygotowanie emulsji i toksyny krztuścowej
<ol>
	<li>emulsja
	<ol>
		<li>Dodać 40 mg zabitego termicznie Mycobacterium tuberculosis H37Ra do 10 ml kompletnego adiuwantu Freunda zawierającego 1 mg/ml Mycobacterium tuberculosis H37Ra i dobrze wymieszać. 
		UWAGA: Ostatni kompletny adiuwant Freunda zawiera 5 mg/ml Mycobacterium tuberculosis H37Ra.</li>
		<li>Zważyć albuminę jaja kurzego, rozpuścić ją w PBS i przygotować mieszaninę antygenów zawierającą 2 mg/ml albuminy jaja kurzego i 10 mg/ml ekstraktu z gruczołów łzowych. Dążąc do uzyskania objętości iniekcji wynoszącej 200 μl dla każdego zwierzęcia, należy przygotować mieszankę wzorcową na podstawie liczby zwierząt.</li>
		<li>Przenieść niekompletny adiuwant Freunda lub kompletny adiuwant Freunda do probówki o pojemności 50 ml, upewniając się, że objętość adiuwantu do mieszaniny antygenów jest w stosunku 1:1. Dodawać mieszaninę antygenu kropla po kropli do adiuwanta, wirując z największą prędkością, która nie powoduje rozlania. Kontynuuj wirowanie przez 5 minut po dodaniu całego antygenu.</li>
		<li>Przenieść emulsję do strzykawki o pojemności 5 ml i połączyć ją z inną strzykawką o pojemności 5 ml za pomocą łącznika strzykawki. Przepchnąć emulsję z jednej strzykawki do drugiej, aby ją wymieszać. 
		UWAGA: Emulsja jest gotowa, jeśli pojedyncza kropla pozostaje w postaci kuli po umieszczeniu w wodzie. Należy stosować wyłącznie świeżo przygotowaną emulsję lub emulsję przechowywaną przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Toksyna krztuścowa
	<ol>
		<li>Rozpuść 50 μg toksyny krztuścowej w 500 μl wody, aby uzyskać końcowe stężenie 100 ng/μL. Votex pojemnik należy przechowywać przez 30 sekund, aby upewnić się, że toksyna całkowicie się rozpuści. 
		UWAGA: Nie sterylizuj przez filtrację, ponieważ spowoduje to utratę materiału. Nie zamrażać. Roztwór ten pozostaje aktywny przez co najmniej 6 miesięcy w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Rozcieńczyć 100 ng/μl toksyny krztuścowej do 3 ng/μl za pomocą PBS. Przenieść 100 μl rozcieńczonej toksyny krztuścowej do 1 ml strzykawki do wstrzykiwań Luer-lock za pomocą igły 27 G.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Szczepienia szczurów Lewisa
<ol>
	<li>W dniu 0 wymieszaj emulsję kilka razy. Rozprowadzić 200 μl emulsji, która zawiera 1 mg ekstraktu z gruczołów łzowych i 200 μg albuminy jaja kurzego w kompletnym adiuwantie Freunda, do 1-mililitrowych strzykawek Luer-lock z igłami 27G. Emulsję wstrzyknąć podskórnie u podstawy ogonów szczura bez znieczulenia. 
	UWAGA: Ogon nie musi być wstępnie rozgrzany przed wstrzyknięciem. Każdy szczur jest uodparniany 1 mg ekstraktu z gruczołów łzowych i 200 μg albuminy jaja kurzego w kompletnym adiuwant Freunda z 500 μg Mycobacterium tuberculosis H37Ra.</li>
	<li>W dniu 14 wstrzyknąć 200 μl emulsji, która zawiera 1 mg ekstraktu z gruczołów łzowych i 200 μg albuminy jaja kurzego w niekompletnym adiuwant Freunda, w taki sam sposób, jak w dniu 0. Wstrzyknąć 300 ng toksyny krztuścowej do 100 μl PBS dootrzewnowo na szczura tego samego dnia.</li>
</ol>
4. Wstrzyknięcie mieszaniny antygenu do spojówki otworu i gruczołu łzowego w celu rekrutacji komórek odpornościowych specyficznych dla antygenu i wywołania miejscowego stanu zapalnego
<ol>
	<li>Oblicz ilość albuminy jaja kurzego i ekstraktu z gruczołów łzowych na podstawie liczby szczurów w eksperymencie. Zważyć wymaganą ilość albuminy jaja kurzego i połączyć ją z rozmrożonym ekstraktem gruczołu łzowego przygotowanym w kroku 1, tworząc roztwór antygenu zawierający 1 mg/ml albuminy jaja kurzego i 1 mg/ml ekstraktu z gruczołów łzowych.</li>
	<li>Znieczulić szczury ketaminą (75 mg/kg) i ksylazyną (10 mg/kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Uszczypnij palce u nóg szczurów, aby upewnić się, że uzyskano odpowiednie znieczulenie (tj. po uszczypnięciu nie obserwuje się żadnego ruchu reagującego). Wstrzyknąć 5 μl antygenu do spojówki podspojówkowej otworu oka. Wstrzyknąć 20 μl antygenu do gruczołu łzowego.</li>
</ol>
5. Ocena cech zespołu suchego oka
UWAGA: Dla kroków 5.1-5.3, znieczulone szczury powinny być delikatnie trzymane ręką w rękawiczce w pozycji pionowej na płaskiej powierzchni, aby uniknąć ruchu.
<ol>
	<li>Zmierz objętość łez za pomocą czerwonej nici fenolowej.
	<ol>
		<li>Użyj jednej pary kleszczy, aby przytrzymać nić, a drugiej, aby pociągnąć dolną powiekę szczura. Umieść nić w proksymalnym rogu dolnej półki na 1 minutę, a następnie usuń gwint. 
		UWAGA: Łzy sprawiają, że zwilżona część nici ma kolor czerwony.</li>
		<li>Zrób zdjęcie długości zwilżonej części nici obok linijki z oznaczeniami milimetrowymi. Zmierz długość zwilżania z dokładnością do dziesiątej części milimetra za pomocą oprogramowania do obrazowania (np. ImageJ).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz gładkość rogówki/rozdarcia.
	<ol>
		<li>Umieść szczura pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w oświetlacz pierścieniowy i kamerę. Nałóż 5 μl soli fizjologicznej na rogówkę szczura. Mrugaj biernie, przesuwając górną i dolną powiekę palcami w rękawiczce ~5 razy, aby rozprowadzić sól fizjologiczną.</li>
		<li>Ustaw oświetlacz pierścieniowy na środku powierzchni rogówki pod powiększeniem 1.6x. Uzyskiwanie zdjęć po 10 s. 
		UWAGA: Oświetlacz pierścieniowy wyświetla dwa okrągłe rzędy obrazów punktowych na rogówkach zwierzęcia. Regularne odstępy między niezniekształconymi kropkami sugerują gładką warstwę rogówki/łzy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz uszkodzenie rogówki za pomocą barwienia fluoresceiną.
	<ol>
		<li>Dodać 2 μl 0,2% fluoresceiny do rogówki szczura. Pasywnie otwórz i zamknij powieki szczura 3 razy palcem w rękawiczce, aby rozprowadzić barwnik fluoresceinowy na powierzchni oka.</li>
		<li>Po 1 minucie nabierz 1 ml soli fizjologicznej za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml (bez nasadki do igły), umieść strzykawkę około 2-3 mm przed rogówką i delikatnie wlej sól fizjologiczną do oka.</li>
		<li>Uzyskuj obrazy pod filtrem kobaltowo-niebieskim (tj. ~400 nm) mikroskopu do obrazowania okulnego z wyłączonymi światłami tła. 
		UWAGA: Obrazy zostały następnie przeanalizowane za pomocą systemu oceniania zmodyfikowanego w stosunku do poprzednich publikacji23. Obrazy były następnie analizowane poprzez subiektywne stopniowanie liczby, obszaru i intensywności zielonych plam od 0 do 2, gdzie 0 oznacza ich brak, 1 oznacza punktowe barwienie mniejsze niż 50 plam, a 2 oznacza punktowe barwienie więcej niż 50 plam.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poddać szczury eutanazji poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu (80 mg/kg). Usuń górną i dolną powiekę za pomocą nożyczek. Napraw i wypadnij gałki oczne, naciskając kleszcze na tkanki okołogałkowe. Uwolnij gałkę ziemską, przecinając mięśnie zewnątrzgałkowe, nerw wzrokowy i spojówkę otworu.</li>
	<li>Napraw pozycję gałki ocznej szczura za pomocą kleszczy i otwórz ją nacięciem obwodowym wzdłuż równika. Wyjmij soczewkę i ciało szkliste. Wypreparowane gałki oczne umieścić w probówkach o pojemności 1,5 ml na lodzie.</li>
	<li>Zbierz gruczoły łzowe, jak opisano w kroku 1.1. Natychmiast przenieś wypreparowane tkanki gałki ocznej i gruczoły łzowe do laboratorium, aby przygotować się do analizy cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Wyizolowano komórki odpornościowe za pomocą metod trawienia kolagenazy i dispazy II24,25. Kontynuuj korzystanie z cytometrii przepływowej do profilowania subpopulacji limfocytów T w tkankach gałki ocznej26. 
	UWAGA: Panel przeciwciał to: anty-CD45APC-cyjanina7 (OX-1), anty-CD3 BV421 (1F4), anty-CD4 PE-cyjanina7 (OX-35), anty-CD45RC Alexa647 (OX-22), anty-CD62 PE (HRL1), anty-CD44 FITC (OX-50) i barwnik żywotności komórek 7-AAD. W populacji CD45 + CD3 + 7AAD- bramkowane były limfocyty T naiwne (CD3 + CD45RC + CD45RC + CD62L). </li>
</ol>

<ol><li><a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17508116">The definition and classification of dry eye disease: report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007).</a> Ocul Surf. 5 (2), 75-92 (2007).</li>
<li>Gayton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etiology%2C+prevalence%2C+and+treatment+of+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Etiology, prevalence, and treatment of dry eye disease.</a> Clin Ophthalmol. 3, 405-412 (2009).</li>
<li>Tong, L., Tan, J., Thumboo, J., Seow, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23773940">The dry eye.</a> Praxis (Bern 1994). 102 (13), 803-805 (2013).</li>
<li>Messmer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiology%2C+diagnosis%2C+and+treatment+of+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dtsch+Arztebl+Int%22%5BJournal%5D)">The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease.</a> Dtsch Arztebl Int. 112 (5), 71-81 (2015).</li>
<li>Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmunity+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+keratoconjunctivitis+sicca%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Allergy+Asthma+Rep%22%5BJournal%5D)">Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca.</a> Curr Allergy Asthma Rep. 14 (1), 403(2014).</li>
<li>Stevenson, W., Chauhan, S. K., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+eye+disease%3A+an+immune-mediated+ocular+surface+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 90-100 (2012).</li>
<li>Tong, L., Thumboo, J., Tan, Y. K., Wong, T. Y., Albani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eye%3A+a+window+of+opportunity+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">The eye: a window of opportunity in rheumatoid arthritis.</a> Nat Rev Rheumatol. 10 (9), 552-560 (2014).</li>
<li>Carnahan, M. C., Goldstein, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+complications+of+topical%2C+peri-ocular%2C+and+systemic+corticosteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Ocular complications of topical, peri-ocular, and systemic corticosteroids.</a> Curr Opin Ophthalmol. 11 (6), 478-483 (2000).</li>
<li>Johannsdottir, S., Jansook, P., Stefansson, E., Loftsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+cyclodextrin-based+aqueous+cyclosporin+A+eye+drop+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Development of a cyclodextrin-based aqueous cyclosporin A eye drop formulations.</a> Int J Pharm. 493 (1-2), 86-95 (2015).</li>
<li>Prabhasawat, P., Tesavibul, N., Karnchanachetanee, C., Kasemson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+cyclosporine+0.05%25+eye+drops+in+Stevens+Johnson+syndrome+with+chronic+dry+eye%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ocul+Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficacy of cyclosporine 0.05% eye drops in Stevens Johnson syndrome with chronic dry eye.</a> J Ocul Pharmacol Ther. 29 (3), 372-377 (2013).</li>
<li>Ishimaru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+destructive+autoimmune+lesions+with+aging+in+murine+Sjogren%27s+syndrome+through+Fas-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Severe destructive autoimmune lesions with aging in murine Sjogren's syndrome through Fas-mediated apoptosis.</a> Am J Pathol. 156 (5), 1557-1564 (2000).</li>
<li>Jonsson, R., Tarkowski, A., Backman, K., Holmdahl, R., Klareskog, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialadenitis+in+the+MRL-l+mouse%3A+morphological+and+immunohistochemical+characterization+of+resident+and+infiltrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Sialadenitis in the MRL-l mouse: morphological and immunohistochemical characterization of resident and infiltrating cells.</a> Immunology. 60 (4), 611-616 (1987).</li>
<li>Jonsson, R., Tarkowski, A., Backman, K., Klareskog, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+characterization+of+sialadenitis+in+NZB+X+NZW+F1+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical characterization of sialadenitis in NZB X NZW F1 mice.</a> Clin Immunol Immunopathol. 42 (1), 93-101 (1987).</li>
<li>Li, H., Dai, M., Zhuang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+T+cell+intrinsic+role+of+Id3+in+a+mouse+model+for+primary+Sjogren%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A T cell intrinsic role of Id3 in a mouse model for primary Sjogren's syndrome.</a> Immunity. 21 (4), 551-560 (2004).</li>
<li>Shull, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+mouse+transforming+growth+factor-beta+1+gene+results+in+multifocal+inflammatory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-beta 1 gene results in multifocal inflammatory disease.</a> Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).</li>
<li>Green, J. E., Hinrichs, S. H., Vogel, J., Jay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocrinopathy+resembling+Sjogren%27s+syndrome+in+HTLV-1+tax+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Exocrinopathy resembling Sjogren's syndrome in HTLV-1 tax transgenic mice.</a> Nature. 341 (6237), 72-74 (1989).</li>
<li>Shen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+autoimmunity+in+IL-14alpha-transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Development of autoimmunity in IL-14alpha-transgenic mice.</a> J Immunol. 177 (8), 5676-5686 (2006).</li>
<li>Hayashi, Y., Hirokawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunopathology+of+experimental+autoallergic+sialadenitis+in+C3H%2FHe+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunopathology of experimental autoallergic sialadenitis in C3H/He mice.</a> Clin Exp Immunol. 75 (3), 471-476 (1989).</li>
<li>Liu, S. H., Zhou, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+dacryoadenitis%3A+purification+and+characterization+of+a+lacrimal+gland+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune dacryoadenitis: purification and characterization of a lacrimal gland antigen.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (6), 2029-2036 (1992).</li>
<li>Liu, S. H., Prendergast, R. A., Silverstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+dacryoadenitis.+I.+Lacrimal+gland+disease+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune dacryoadenitis. I. Lacrimal gland disease in the rat.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 28 (2), 270-275 (1987).</li>
<li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+experimental+autoimmune+keratoconjunctivitis+sicca+%28KCS%29+induced+in+Lewis+rat+by+the+autoantigen+Klk1b22%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">A new model of experimental autoimmune keratoconjunctivitis sicca (KCS) induced in Lewis rat by the autoantigen Klk1b22.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (5), 2245-2254 (2009).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bicinchoninic+acid+%28BCA%29+assay+for+protein+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation.</a> Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+dry+eye+model+induced+by+topical+administration+of+benzalkonium+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride.</a> Mol Vis. 17, 257-264 (2011).</li>
<li>Cousins, S. W., Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+detection+of+lymphocyte+proliferation+in+eyes+with+immunogenic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric detection of lymphocyte proliferation in eyes with immunogenic inflammation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 31 (10), 2111-2122 (1990).</li>
<li>Yawata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+change+in+natural+killer+cell+type+in+the+human+ocular+mucosa+in+situ+as+means+of+immune+evasion+by+adenovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic change in natural killer cell type in the human ocular mucosa in situ as means of immune evasion by adenovirus infection.</a> Mucosal Immunol. 9 (1), 159-170 (2016).</li>
<li>Chen, Y., Chauhan, S. K., Lee, H. S., Saban, D. R., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+dry+eye+disease+is+principally+mediated+by+effector+memory+Th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chronic dry eye disease is principally mediated by effector memory Th17 cells.</a> Mucosal Immunol. 7 (1), 38-45 (2014).</li>
<li>Goldmuntz, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+the+autoimmune+disease-resistant+LER+rat%3A+an+outcross+between+the+buffalo+and+autoimmune+disease-prone+Lewis+inbred+rat+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">The origin of the autoimmune disease-resistant LER rat: an outcross between the buffalo and autoimmune disease-prone Lewis inbred rat strains.</a> J Neuroimmunol. 44 (2), 215-219 (1993).</li>
<li>Cahalan, M. D., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+network+of+ion+channels+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">The functional network of ion channels in T lymphocytes.</a> Immunol Rev. 231 (1), 59-87 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów. L.T. otrzymał wcześniejsze finansowanie i/lub prezenty od firm Alcon, Allergan, Santen, Bausch and Lomb, Eyelens i Eyedetec.

Kluczowym etapem tego protokołu jest zapewnienie jednorodności emulsji. W dobrze przygotowanych emulsjach antygeny są całkowicie pokryte olejem, co zapewnia powolne uwalnianie wstrzykniętego antygenu i ciągłą stymulację immunologiczną. Inną krytyczną cechą tego protokołu jest wykorzystanie szczurów Lewisa. Szczury Lewisa są bardziej wrażliwe na rozwój chorób autoimmunologicznych niż inne szczepy27.
Protokół ten został zmodyfikowany na podstawie dwóch wcześniej opublikowanych protokołów, w których stosowano tylko ekstrakt z gruczołów łzowych lub rekombinowany Klk1b2220,21. W obecnym protokole albumina jaja kurzego i ekstrakt z gruczołu łzowego są używane jako antygen, a komórki odpornościowe specyficzne dla antygenu są przyciągane do powierzchni oka i gruczołu łzowego, wywołując miejscowe uszkodzenie tkanki. Zespół suchego oka rozwija się powoli, osiągając ~85% do 48 dnia po początkowym szczepieniu. Prowokacja antygenowa oka i gruczołu łzowego w 48 dniu zaostrza suchość oka i zapewnia jej przewlekłość do 70 dnia.
W porównaniu z rekombinowanym Klk1b22 w modelu DED indukowanym przez Klk, ekstrakt z gruczołu łzowego i albumina jaja kurzego stosowane w obecnym modelu są tańsze i łatwiejsze do uzyskania. Ekstrakt z gruczołów łzowych zawiera również inne białka, oprócz Klk, które mogą indukować autoimmunizację, więc ekstrakt ten jest teoretycznie silniejszy niż metoda Klk w indukowaniu DED. Próbowaliśmy również uodparniać szczury tylko ekstraktem z gruczołów łzowych; chociaż te uodpornione szczury rozwinęły DED, nie było znaczącego wzrostu efektorowych limfocytów T pamięci w tkankach gałki ocznej w porównaniu z grupą kontrolną.
Ograniczeniem tej techniki jest to, że uzyskanie modelu zajmuje 70 dni. Limfocyty T pamięci efektorowej są głównymi podzbiorami limfocytów T w normalnym oku szczura. W tym modelu autoimmunologiczny DED powoduje wzrost liczby efektorowych limfocytów T pamięci CD3 + w gałce ocznej. Leki, które preferencyjnie hamują efektorowe limfocyty T pamięci, takie jak selektywne inhibitory kanału potasowego Kv1.3, mogą zatem przynieść korzyści terapeutyczne w autoimmunologicznej DED28.

Suche oko (DED) to wieloczynnikowa choroba łez i powierzchni oka, która powoduje objawy dyskomfortu, zaburzenia widzenia i niestabilność filmu łzowego, co może prowadzić do uszkodzenia powierzchni oka. Towarzyszy mu zwiększona osmolarność filmu łzowego i stan zapalny powierzchni oka1. Objawy związane z DED to pieczenie, pieczenie, ziarnistość, uczucie ciała obcego, łzawienie, zmęczenie oczu i suchość2,3. Dwie główne przyczyny DED to zmniejszona produkcja łez przez gruczoł wydzielający łzy oraz nadmierne parowanie filmu łzowego4. U pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi, takimi jak zespół Sjögrena, toczeń rumieniowaty układowy i reumatoidalne zapalenie stawów, immunologiczne uszkodzenie gruczołów Meiboma zmniejsza ekspresję lipidów niezbędnych dla stabilności łez. Ponadto immunologiczne uszkodzenie powierzchni oka zmniejsza produkcję mucyn ważnych dla zwilżalności powierzchni. Procesy te łącznie powodują przewlekłą suchość oka5,6,7.
Wymiana łez i terapia przeciwzapalna są podstawą terapii. Jednak obecne terapie przeciwzapalne DED (tj. kortykosteroidy i cyklosporyna) są zasadniczo immunosupresyjne, co prowadzi do poważnych działań niepożądanych8,9,10. Istnieje zapotrzebowanie na odpowiedni model zwierzęcy do testowania nowych środków immunomodulujących w leczeniu autoimmunologicznego zespołu suchego oka.
Myszy ze specyficznymi wadami genetycznymi11,12,13, myszy pozbawione określonych genów14,15, oraz transgeniczne myszy z nadekspresją genów immunoregulacyjnych zostały wykorzystane jako modele autoimmunologicznego zespołu suchego oka16,17. Indukowane antygenem autoimmunologiczne modele zwierzęce zostały również opisane u myszy18, rabbits19 i rats20,21. W tym miejscu opisujemy indukowany antygenem model przewlekłego autoimmunologicznego zespołu suchego oka. Model ten jest modyfikacją dwóch wcześniejszych modeli; Jeden używał ekstraktów z gruczołów łzowych, a drugi używał autoantygenu (tj. KLk1B22) z gruczołów łzowych20,21.
Choroba została wywołana przez podskórne uodpornienie 6 do 8 tygodniowych samic szczurów Lewisa albuminą jaja kurzego, kompletnym adiuwantem Freunda i emulsją zawierającą ekstrakty gruczołów łzowych od szczurów Sprague-Dawley (Rysunek 1). Drugie uodpornienie tym samym antygenem w niekompletnym adiuwantzie Freunda podano dwa tygodnie później. Aby zrekrutować komórki odpornościowe specyficzne dla antygenu do gruczołu łzowego i powierzchni oka, mieszaninę ekstraktu z gruczołu łzowego i albuminy jaja kurzego (1 mg / ml) wstrzyknięto do podspojówki otworu i gruczołów łzowych w 6-7tygodniu (ryc. 1). U ponad 85% szczurów rozwinęły się charakterystyczne cechy suchego oka 70 dni po pierwszym szczepieniu. Cechy te obejmują zmniejszoną produkcję łez (ryc. 2), zwiększone barwienie fluoresceiny rogówki (ryc. 3) i zmniejszoną stabilność łez (ryc. 4). Profilowanie immunologiczne limfocytów T w gałkach ocznych normalnych szczurów za pomocą cytometrii przepływowej ujawnia przewagę limfocytów T pamięci efektorowej CD3 + (ryc. 5 i 6). Szczury z autoimmunologicznym DED wykazują wzrost liczby efektorowych limfocytów T pamięci CD3 + i odpowiadający mu spadek liczby naiwnych i centralnych komórek T pamięci (Figura 6).

<table><tbody><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714-1BTL</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermal Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis H37Ra&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson i spółka</td><td>231141</td><td></td></tr><tr><td>uzupełnić adiuwant Freunda</td><td>Becton, Dickinson i spółka</td><td>231131</td><td></td></tr><tr><td>albuminę jaja kurzego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5503-10G</td><td></td></tr><tr><td>niekompletny adiuwant Freunda&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5506-6X10ML</td><td></td></tr><tr><td>toksyna krztuścowa&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7208-50UG</td><td></td></tr><tr><td>roztwór sodowy fluoresceiny</td><td>Bausch & Lomb U.K Limited</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonics&nbsp;</td><td>Vibra-Cell</td><td></td></tr><tr><td>fenol czerwona nić</td><td>Tianjin Jingming Nowy rozwój technologiczny Co., LTD.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy z oświetlaczem światła pierścieniowego i kamerą</td><td>Mikroskop Carl Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Micro IV&nbsp;</td><td>Phoenix Research Labs, Ameryka</td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Północna

przewlekły autoimmunologiczny model szczura z suchym okiem ze wzrostem liczby efektorowych limfocytów t pamięci w tkance gałki ocznej

A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue

Suche oko to bardzo częsty stan, który powoduje zachorowalność i obciążenie opieki zdrowotnej oraz obniża jakość życia. Istnieje zapotrzebowanie na odpowiedni model zwierzęcy z zespołem suchego oka w celu przetestowania nowych metod leczenia autoimmunologicznych schorzeń suchego oka. Protokół ten opisuje przewlekły autoimmunologiczny model szczura z suchym okiem. Szczury Lewisa uodporniono emulsją zawierającą ekstrakt z gruczołów łzowych, albuminę jaja kurzego i kompletny adiuwant Freunda. Drugie uodpornienie tymi samymi antygenami w niekompletnym adiuwantzie Freunda podano dwa tygodnie później. Szczepienia te podawano podskórnie u nasady ogona. Aby wzmocnić odpowiedź immunologiczną na powierzchni oka i gruczołów łzowych, ekstrakt z gruczołu łzowego i albumina jaja kurzego wstrzyknięto do otworu podspojówkowego i gruczołów łzowych 6 tygodni po pierwszym szczepieniu. U szczurów rozwinęły się cechy suchego oka, w tym zmniejszona produkcja łez, zmniejszona stabilność łez i zwiększone uszkodzenie rogówki. Profilowanie immunologiczne za pomocą cytometrii przepływowej wykazało przewagę efektorowych limfocytów T pamięci CD3 + w gałce ocznej.

Rysunek 1 przedstawia schemat eksperymentu. Zarówno w 48., jak i w 70. dniu oceniano cechy kliniczne zespołu suchego oka u zimmunizowanych szczurów. Objętość łez reprezentuje długość zwilżonej części nitki z czerwienią fenolową. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne obrazy nitek z czerwienią fenolową od szczurów z grupy kontrolnej oraz z grupy z DED. Długość nitek z czerwienią fenolową w grupie DED jest mniejsza niż w grupie kontrolnej, co wskazuje na mniejszą objętość łez.
Fluroscyna wiąże się z uszkodzonym nabłonkiem rogówki. W związku z tym uszkodzenie rogówki ocenia się za pomocą barwienia rogówki fluoresceiną. Plamy fluoresceinowe na powierzchni rogówki szczurów z DED oceniano w skali od 0 do 2 i porównywano ze szczurami kontrolnymi. Szczury z DED wykazują silniejsze barwienie fluoresceinowe niż szczury kontrolne (Rysunek 3), co sugeruje uszkodzenie rogówki.
Gładkość rogówki u szczurów z DED oraz w grupie kontrolnej oceniano za pomocą iluminatora pierścieniowego. Jeśli powierzchnia rogówki jest gładka, a stabilność filmu łzawowego wysoka, obraz pierścienia iluminatora na powierzchni oka jest okrągły i regularny. Zniekształcenie obrazu wskazuje na zmniejszoną gładkość rogówki i niestabilność filmu łzawowego. Stopień zniekształcenia pierścienia oceniano w skali od 0 do 2. W grupie DED odnotowano wyższy poziom zniekształcenia pierścienia (Ryc. 4), co wskazuje na mniejszą stabilność filmu łzawowego.
U szczurów stwierdza się występowanie zespołu suchego oka, gdy co najmniej dwie cechy kliniczne tego schorzenia są nieprawidłowe. spośród 24 immunizowanych szczurów, u 21 zwierząt w 48. dniu rozwinął się DED. Wyniki były spójne podczas oceny w 70. dniu.
Analiza cytometrii przepływowej wykazuje, że dominującym podzbiorem limfocytów T w prawidłowych tkankach gałek ocznych szczura są efektorowe komórki T pamięci (Rysunek 5). W gałkach ocznych szczurów z DED około 70% limfocytów T CD3+ to efektorowe komórki T pamięci, podczas gdy u szczurów kontrolnych liczba ta wynosi około 50%. Gałki oczne szczurów z DED wykazują znacznie wyższą liczbę efektorowych komórek T pamięci niż gałki oczne szczurów kontrolnych (Rysunek 6).
<img alt="Schemat osi czasu eksperymentu dla immunizacji i oceny DED, szczegółowo przedstawiający iniekcje i profilowanie." src="/files/ftp_upload/55592/55592fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Schemat planu doświadczalnego. LG: gruczoł łzowy; DED: zespół suchego oka; CFA: kompletny adiuwant Freunda; IFA: niekompletny adiuwant Freunda. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Wyniki mikroskopii nerwów rogówki: grupa kontrolna vs. stan DED, obraz mikroskopowy do analizy nerwów." src="/files/ftp_upload/55592/55592fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Pomiar objętości filmu łzowego za pomocą nici z czerwienią fenolową. Nitkę z czerwienią fenolową umieszczono w kącie przyśrodkowym obu oczu szczura na 1 min, a następnie usunięto. Przedstawiono reprezentatywne zdjęcia nitki z czerwienią fenolową wraz z linijką dla grupy kontrolnej oraz grupy z DED. Do pomiaru długości zwilżonej części nitek z czerwienią fenolową wykorzystano program ImageJ. Pasek skali = 1 mm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Uszkodzenie nabłonka rogówki, grupa kontrolna vs DED, analiza z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej." src="/files/ftp_upload/55592/55592fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Reprezentatywne obrazy uszkodzeń nabłonka rogówki zmierzone za pomocą barwienia fluoresceiną. Każda rogówka szczura została zabarwiona 0,2% fluoresceiną przez 1 min, a następnie przepłukana co najmniej 1 ml soli fizjologicznej. Obrazy wykonano za pomocą mikroskopu do obrazowania oka przy użyciu kobaltowego światła niebieskiego. Pierwsza kolumna przedstawia reprezentatywne obrazy rogówek kontrolnych. Druga kolumna zawiera reprezentatywne obrazy zabarwienia rogówek szczurów z cechami DED. Zielone fluorescencyjne plamki wskazują uszkodzenia nabłonka rogówki. Wszystkie obrazy zostały wykonane w tej samej skali kolorystycznej. Ilościowe oznaczenie zabarwienia fluoresceiną przeprowadzono na podstawie powierzchni i gęstości zielonych plamek. Pasek skali = 1 mm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Stabilność filmu łzawego rogówki; Zespół Suchego Oka (ZSO) vs grupa kontrolna; mikroskopia fluorescencyjna; zdrowie oczu; analiza filmu łzawego." src="/files/ftp_upload/55592/55592fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4: Reprezentatywne obrazy rogówki przedstawiające odblask iluminatora pierścieniowego. Wygładzenie rogówki i filmu łzowego szczura zmierzono za pomocą iluminatora pierścieniowego. Stopień zniekształcenia pierścienia na zarejestrowanych obrazach jest miarą względnej stabilności filmu łzowego. Lewa kolumna przedstawia reprezentatywne obrazy u zwierząt z grupy kontrolnej, a prawa kolumna reprezentatywne obrazy po indukcji zespołu suchego oka. Pasek skali = 1 mm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat cytometrii przepływowej; bramkowanie limfocytów T CD3+ z analizą sortowania CD3+7-AAD oraz CD3+CD45RC-." src="/files/ftp_upload/55592/55592fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Wykresy kropkowe uzyskane z analizy cytometrii przepływowej. Limfocyty T wyizolowane z tkanek gałki ocznej barwiono panelem przeciwciał. W przypadku CD45+CD3+7AAD- populacja, CD3+7-AAD- Wykonano bramkowanie limfocytów T. Wśród komórek CD3+7-AAD- Określono populacje naiwnych limfocytów T, limfocytów T pamięci centralnej oraz limfocytów T pamięci efektorowej. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig5large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy populacji komórek CD3+; DED vs kontrola; komórki naiwne, TCM, TEM; wynik eksperymentu." src="/files/ftp_upload/55592/55592fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rysunek 6: Profil subpopulacji limfocytów T w gałkach ocznych. CD3+CD45RC+ naiwne limfocyty T, CD3+CD45RC-CD4+CD62L- efektorowe limfocyty T pamięci (TEM) komórek oraz CD3+CD45RC-CD4+CD62L+ limfocyty T pamięci centralnej (TCM) komórki przedstawiono jako procent CD3+ limfocyty T. Wyniki pochodzą od 3 szczurów kontrolnych i 6 szczurów z DED. Podobne wyniki uzyskano z analizy limfocytów T z izolowanych gruczołów łzowych (dane nie przedstawiono). Do porównań statystycznych wykorzystano nieparzysty test t Studenta. Słupki błędów reprezentują SD. * p &lt;0,05, ** p &lt;0.01. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig6large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten raport opisuje metodę wywoływania przewlekłego eksperymentalnego autoimmunologicznego suchego oka u szczurów Lewisa poprzez immunizację emulsją ekstraktu z gruczołu łzowego szczura, albuminy jaja kurzego i kompletnego adiuwantu Freunda, a następnie wstrzyknięcie ekstraktu z gruczołu łzowego i albuminy jaja kurzego do otworu podspojówkowego i gruczołów łzowych sześć tygodni później.

Przewlekły autoimmunologiczny model szczura z suchym okiem ze wzrostem liczby efektorowych limfocytów T pamięci w tkance gałki ocznej

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wywołanie klinicznych objawów dysfunkcji łez oraz zapalenia gruczołu łzowego u szczurów poprzez podskórną immunizację oraz podspojówkowe i wewnątrzgruczołowe wstrzyknięcia ekstraktów z gruczołu łzowego, w celu oceny terapii w autoimmunologicznym zespole suchego oka. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące suchego oka, np. czy leki hamujące limfocyty T w chorobach autoimmunologicznych są skuteczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że wywołuje ona objawy choroby oczu podobne do ludzkiego suchego oka, a także umożliwia ilościowe określenie liczby limfocytów T infiltrujących gruczoł łzowy i oko.Wnioski płynące z tego modelu zwierzęcego rozszerzają wiedzę na temat migracji limfocytów, ponieważ możliwe jest badanie śledziony oraz węzłów chłonnych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności ze względu na brak odpowiedniego oprzyrządowania do dokumentowania zmian w małym oku szczura. Demonstracja wizualna tej metody jest kluczowa, ponieważ niektóre etapy są trudne do opanowania z powodu szybkiego wysychania oka szczura oraz braku mrugania po znieczuleniu.Po uśmierceniu samicy szczura linii Sprague Dawley zgodnie z protokołem tekstowym, należy położyć zwierzę płasko z jednym uchem opartym o stół, a drugim skierowanym do góry. Za pomocą nożyczek należy wykonać nacięcie o długości 10 mm w kierunku górno-dolnym pod odsłoniętym uchem. Następnie należy usunąć gruczoł łzowy, oddzielając go od otaczającej tkanki łącznej oraz od przewodu odpływowego.Następnie, używając nożyczek, posiekaj tkankę na lodzie tak drobno, jak to możliwe. Następnie dodaj 150 µL PBS z 1X inhibitorem proteaz na każdą gruczoł łzowy. Przy ustawieniach sonikatora: 10 sekund włączony, 10 sekund wyłączony oraz amplituda 30%, sonikuj próbki na lodzie w częstotliwości 20 kHz przez pięć minut.Następnie odwiruj sonikowane próbki przy 13 000 ×g i temperaturze 4 °C przez 20 minut. Przenieś nadsącz do nowej probówki. Następnie rozdziel nadsącz do probówek o pojemności 1,5 ml i przechowuj je w temperaturze -80 °C.Przenieś pełny adiuwant Freunda zawierający 5 mg/mL Mycobacterium tuberculosis H37Ra lub niepełny adiuwant Freunda do probówki o pojemności 50 mL, dbając o to, aby objętość adiuwantu i mieszaniny antygenów pozostawała w stosunku jeden do jednego. Dodawaj kroplami mieszaninę antygenów zawierającą 2 mg/mL owalbuminy oraz 10 mg/mL ekstraktu z gruczołu łzowego do roztworu adiuwantu, mieszając na wirówce typu vortex z najwyższą prędkością, która nie powoduje rozlania cieczy. Kontynuuj mieszanie przez pięć minut po dodaniu całego antygenu.Przenieś emulsję do strzykawki o pojemności 5 ml i za pomocą łącznika do strzykawek połącz ją z drugą strzykawką o pojemności 5 ml. Następnie przepychaj emulsję z jednej strzykawki do drugiej, aby ją wymieszać. W dniu zero rozdziel 200 µL emulsji, zawierającej 1 mg ekstraktu z gruczołu łzowego i 200 µg owalbuminy w kompletnym adjuwancie Freunda, do strzykawek o pojemności 1 ml z końcówką Luer lock i wyposaż strzykawki w igły o rozmiarze 27 G.Bez stosowania znieczulenia wstrzyknąć emulsję podskórnie u podstawy ogonów szczurów. Następnie, w 14. dniu, w podobny sposób wstrzyknąć 200 µl tego samego antygenu w niepełnym adjuwancie Freunda. Tego samego dnia wstrzyknąć dootrzewnowo 300 ng toksyny krztuśca w 100 µl PBS.W 48. dniu odważ wymaganą ilość owalbuminy i rozpuść ją w PBS. Następnie połącz owalbuminę z rozmrożonym ekstraktem z gruczołu łzowego, przygotowanym wcześniej w tym filmie, tworząc roztwór antygenu zawierający 1 mg/mL owalbuminy i 1 mg/mL ekstraktu z gruczołu łzowego. Po znieczuleniu szczura wstrzyknij 5 µL antygenu do podspójnówki forniksa oka.Następnie wstrzyknij 20 µL antygenu do gruczołu łzowego. Trzymając znieczulonego szczura zgodnie z protokołem tekstowym, aby zmierzyć objętość łez za pomocą nici z czerwienią fenolową, użyj jednej pęsety do przytrzymania nici, a drugiej do odciągnięcia dolnej powieki szczura. Umieść nić w przyśrodkowym kącie dolnego sklepienia spojówki na jedną minutę, a następnie wyjmij nić.Następnie należy umieścić nitkę obok linijki z podziałką milimetrową i wykonać zdjęcie długości zwilżonej części nitki. Aby zmierzyć gładkość filmu łzowego rogówki, należy umieścić szczura pod stereomikroskopem wyposażonym w oświetlacz pierścieniowy i kamerę. Następnie na rogówkę szczura należy nanieść 5 µL soli fizjologicznej.Palcami w rękawiczkach wykonaj pasywne mruganie, przesuwając górną i dolną powiekę około pięć razy, aby rozprowadzić sól fizjologiczną. Przy powiększeniu 1,6-krotnym skup wiązkę oświetlacza pierścieniowego na środku powierzchni rogówki. Następnie, po 10 sekundach, wykonaj zdjęcia fotograficzne.W celu pomiaru uszkodzeń rogówki należy przeprowadzić skanowanie fluoresceiną, dodając 2 µL 0,2% fluoresceiny do rogówki szczura. Palcem w rękawiczce należy pasywnie otworzyć i zamknąć powieki szczura trzy razy, aby rozprowadzić barwnik fluoresceinowy na powierzchni oka. Po jednej minucie należy użyć strzykawki o pojemności 3 mL, aby pobrać 1 mL soli fizjologicznej.Następnie umieść strzykawkę około dwóch do trzech milimetrów przed rogówką i delikatnie nanieś sól fizjologiczną na oko. Po wyłączeniu światła tła wykonaj obrazy za pomocą filtra kobaltowo-niebieskiego w mikroskopie do obrazowania oka. Po eutanazji szczura zgodnie z protokołem tekstowym, za pomocą nożyczek usuń górną i dolną powiekę.Uwolnij gałkę oczną poprzez przecięcie mięśni pozagałkowych, nerwu wzrokowego oraz spojówki fornix. Wykonaj nacięcie, aby otworzyć gałkę oczną. Usuń soczewkę wraz z ciałem szklistym.Następnie wypreparowane gałki oczne umieść w probówkach o pojemności 1,5 ml na lodzie. Na koniec pobierz gruczoły łzowe zgodnie z opisem przedstawionym wcześniej w tym filmie. Na tej rycinie przedstawiono reprezentatywne obrazy nici z czerwienią fenolową pobranych od szczura kontrolnego i szczura z DED.Długość nici z czerwienią fenolową w grupie DED jest krótsza niż w grupie kontrolnej, co wskazuje na mniejszą objętość filmu łzowego. Fluoresceina wiąże się z uszkodzonym nabłonkiem rogówki, dlatego jest wykorzystywana do pomiaru zakresu uszkodzeń. W tym eksperymencie plamki fluoresceiny na powierzchni rogówki szczurów z DED oceniano w skali od zera do dwóch i porównywano ze szczurami kontrolnymi.Szczury z DED wykazują silniejsze barwienie fluoresceiną niż szczury kontrolne, co sugeruje uszkodzenie rogówki. Jak tu widać, jeśli powierzchnia rogówki jest gładka, a stabilność filmu łzowego wysoka, obraz pierścienia iluminatora na powierzchni oka jest okrągły i idealny. Zniekształcenie obrazu wskazuje na zmniejszoną gładkość rogówki i niestabilność filmu łzowego, co zaobserwowano w stopniu większego zniekształcenia w grupie DED.Niniejsza analiza cytometryczna z przepływem wskazuje, że dominującym podzbiorem limfocytów T w prawidłowych tkankach gałki ocznej szczura są komórki T pamięci efektorowej. W gałkach ocznych szczurów z DED około 70% CD3-dodatnich limfocytów T to komórki T pamięci efektorowej, podczas gdy u szczurów kontrolnych liczba ta wynosi około 50%. Gałki oczne szczurów z DED charakteryzują się znacznie wyższym poziomem komórek T pamięci efektorowej niż gałki oczne szczurów kontrolnych. Po wykonaniu tej procedury można przeprowadzić barwienie innych rodzajów komórek odpornościowych w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania.Przykładowo, można przeprowadzić barwienie w kierunku komórek odporności wrodzonej lub limfocytów B. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom do zrozumienia immunologii powierzchni oka, a w dalszej kolejności do badania zespołu suchego oka u ludzi oraz zespołu Sjögrena. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak indukować autoimmunologiczne suche oko u szczurów oraz jak rzetelnie dokumentować uzyskane wyniki.

a-chronic-autoimmune-dry-eye-rat-model-with-increase-effector-memory

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje technikę wywoływania przewlekłej eksperymentalnej autoimmunologicznej choroby suchego oka u szczurów. Po wstrzyknięciu szczurowi emulsji antygenowo-adiuwantowej zawierającej autoantygeny i obce antygeny w określonych odstępach czasu, u uodpornionego szczura indukuje się przewlekłe zapalenie oka poprzez wstrzyknięcie tych samych antygenów do tkanek powierzchni oka.

Technika wywoływania przewlekłego eksperymentalnego autoimmunologicznego zespołu suchego oka u szczurów

Bez użycia znieczulenia wstrzyknąć podskórnie emulsję u podstawy ogonów szczura. Następnie, w dniu 14 w podobny sposób, wstrzyknij 200 mikrolitrów tego samego antygenu i niekompletnego adiuwantu Freunda. Tego samego dnia wstrzyknąć dootrzewnowo 300 nanogramów toksyny krztuścowej w 100 mikrolitrach PBS.

Ten film demonstruje test czerwonej nici fenolowej do określenia objętości łez w autoimmunologicznym modelu szczura z suchym okiem. Wrażliwa na pH kwaśna nić z czerwienią fenolową zmienia kolor w kontakcie z zasadowymi łzami. Krótsza długość zmiany koloru nici czerwieni fenolowej odpowiada zmniejszonej objętości łez.

Kwantyfikacja objętości łez w autoimmunologicznym modelu szczura z suchym okiem przy użyciu czerwonej nici fenolowej

Ten film demonstruje metodę oceny gładkości rogówki i stabilności filmu łzowego w autoimmunologicznym modelu szczura. Podkreśla wpływ dysfunkcji gruczołów na stabilność filmu łzowego, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia choroby suchego oka.

Ocena gładkości rogówki i łez w autoimmunologicznym modelu szczurzym z suchym okiem

Ten film pokazuje barwienie uszkodzonej rogówki za pomocą barwnika fluoresceinowego, aby ocenić zakres autoimmunologicznej choroby suchego oka na modelu szczurzym. Zielone plamki fluorescencyjne barwionych włókien kolagenowych wskazują na uszkodzone komórki nabłonka rogówki.

Barwienie fluoresceiną w autoimmunologicznym modelu szczura z suchym okiem w celu zbadania uszkodzenia rogówki

Ten artykuł opisuje rozwój metody wywoływania ostrej lub przewlekłej choroby suchego oka u królików poprzez wstrzykiwanie konkanawaliny A do wszystkich części układu gruczołu łzowego oczodołu. Ta metoda, lepsza od już opisanych, generuje powtarzalny, stabilny model suchego oka, odpowiedni do badania środków farmakologicznych.

Króliczy model zespołu suchego oka z niedoborem wody wywołanej wstrzyknięciem konkanawaliny A do gruczołów łzowych: zastosowanie do badań skuteczności leków

W tym raporcie prezentujemy protokół, który pozwala badaczowi na wygenerowanie mysiego modelu wewnątrzgałkowego zapalenia błony naczyniowej oka. Ten uznany model, częściej określany jako eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka (EAU), obejmuje wiele aspektów chorób u ludzi. W tym miejscu opiszemy, jak indukować i monitorować postęp choroby za pomocą kilku odczytów.

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka: wewnątrzgałkowy model zapalny myszy

Tutaj tworzymy szczurzy model dysfunkcji gruczołów łzowych, aby zapewnić podstawę do badania suchego oka z niedoborem wody wodnistej.

Model suchego oka szczura z dysfunkcją gruczołów łzowych wywołaną przez skopolaminę

Tutaj prezentujemy metodę tworzenia mysiego modelu suchego oka z niedoborem wody wodnej poprzez wycięcie gruczołów łzowych zewnątrzoczodołowych i podoczodołowych oraz ocenę zmian na powierzchni oka w suchym oku z niedoborem wodnistości.

Opracowanie mysiego modelu suchego oka z niedoborem wody wodnistej

Poznaj metodę indukcji przewlekłego autoimmunologicznego suchego oka u szczurów Lewis poprzez immunizację ekstraktem gruczołu łzowego. Model ten umożliwia ocenę terapii immunosupresyjnych i badanie migracji limfocytów T w tkance gałki ocznej.

Przewlekły autoimmunologiczny model szczura z suchym okiem ze wzrostem liczby efektorowych limfocytów T pamięci w tkance gałki ocznej (Wideo) | JoVE Journal

Przewlekły autoimmunologiczny model szczura z suchym okiem ze wzrostem liczby efektorowych limfocytów T pamięci w tkance gałki ocznej

Przeglądaj więcej filmów