Przewlekły autoimmunologiczny model szczura z suchym okiem ze wzrostem liczby efektorowych limfocytów T pamięci w tkance gałki ocznej

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie klinicznych cech dysfunkcji łez i zapalenia gruczołów łzowych u szczurów za pomocą immunizacji podskórnej oraz podspojówkowego i śródłzowego wstrzyknięcia ekstraktów z gruczołów łzowych w celu oceny terapii autoimmunologicznego zespołu suchego oka. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące zespołu suchego oka, takie jak to, czy leki hamujące limfocyty T w chorobie autoimmunologicznej są skuteczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że wywołuje ona objawy choroby oczu podobne do ludzkiego zespołu suchego oka, a także określa ilościowo limfocyty T naciekające gruczoł łzowy i oko.

Implikacje tego modelu zwierzęcego rozszerzają się w kierunku zrozumienia transportu limfocytów, ponieważ można badać śledzionę i węzły chłonne. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z powodu braku odpowiedniego oprzyrządowania do dokumentowania zmian w małym oku szczura. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ niektóre kroki są trudne do nauczenia się ze względu na szybkie wysychanie oka szczura i brak mrugnięć po znieczuleniu.

Po eutanazji samicy szczura Sprague Dawley zgodnie z protokołem tekstowym, połóż zwierzę płasko jednym uchem przy stole, a drugim skierowanym do góry. Za pomocą nożyczek wykonaj 10-milimetrowe nacięcie góra-dół pod odsłoniętym uchem. Następnie należy usunąć gruczoł łzowy, wycinając go z otaczającej tkanki łącznej i z kanału drenażowego.

Następnie za pomocą nożyczek zmiel tkankę tak drobno, jak to możliwe na lodzie. Następnie dodaj 150 mikrolitrów PBS z 1X inhibitorem proteazy na gruczoł łzowy. Przy sonikatorze ustawionym na 10 sekund włączenia, 10 sekund przerwy i amplitudzie 30%, sonikuj próbki na lodzie z prędkością 20 kiloherców przez pięć minut.

Następnie odwirować próbki poddane sonikacji w temperaturze 13 000 g i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Przenieść supernatant do nowej probówki. Następnie podwielokrotność supernatantu do probówek o pojemności 1,5 mililitra i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Przenieść kompletny adiuwant Freunda zawierający pięć miligramów na mililitr Mycobacterium tuberculosis H37Ra lub niekompletny adiuwant Freunda do 50-mililitrowej probówki, upewniając się, że objętość adiuwantu do mieszaniny antygenów jest w stosunku jeden do jednego. Dodaj mieszaninę antygenu zawierającą dwa miligramy na mililitr albuminy jaja kurzego i 10 miligramów na mililitr ekstraktu z gruczołów łzowych kropla po kropli do roztworu adiuwanta, wirując z największą prędkością, która nie powoduje rozlania. Kontynuuj wirowanie przez pięć minut po dodaniu całego antygenu.

Przenieś emulsję do pięciomililitrowej strzykawki i użyj łącznika strzykawki, aby połączyć ją z kolejną pięciomililitrową strzykawką. Następnie przepchnij emulsję z jednej strzykawki do drugiej, aby ją wymieszać. W dniu zero rozprowadzić 200 mikrolitrów emulsji, która zawiera jeden miligram ekstraktu z gruczołu łzowego i 200 mikrogramów albuminy jaja kurzego w kompletnym adiuwantzie Freunda, do jednomililitrowych strzykawek Luer lock i wyposażyć strzykawki w igły o rozmiarze 27.

Bez użycia znieczulenia wstrzyknąć podskórnie emulsję u podstawy ogonów szczura. Następnie, w dniu 14, w podobny sposób, wstrzyknij 200 mikrolitrów tego samego antygenu do niekompletnego adiuwantu Freunda. Tego samego dnia wstrzyknąć dootrzewnowo 300 nanogramów toksyny krztuścowej w 100 mikrolitrach PBS.

W 48 dniu zważyć wymaganą ilość albuminy jaja kurzego i rozpuścić ją w PBS. Następnie połącz albuminę jaja kurzego z rozmrożonym ekstraktem gruczołu łzowego przygotowanym wcześniej w tym filmie, tworząc roztwór antygenu zawierający jeden miligram na mililitr albuminy jaja kurzego i jeden miligram na mililitr ekstraktu z gruczołów łzowych. Po znieczuleniu szczura wstrzyknij pięć mikrolitrów antygenu do przeddniówki podspojówkowej oka.

Następnie wstrzyknij 20 mikrolitrów antygenu do gruczołu łzowego. Trzymając znieczulonego szczura zgodnie z protokołem tekstowym, aby zmierzyć objętość łez za pomocą czerwonej nici fenolowej, użyj jednej pary kleszczy do przytrzymania nici, a drugiej, aby pociągnąć dolną powiekę szczura. Umieść nić w bliższym rogu dolnej dziurki na jedną minutę, a następnie usuń nić.

Następnie umieść nić obok linijki z milimetrowymi oznaczeniami i zrób zdjęcie długości zwilżonej części nici. Aby zmierzyć gładkość rozdarcia rogówki, umieść szczura pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w oświetlacz pierścieniowy i kamerę. Następnie nałóż pięć mikrolitrów soli fizjologicznej na rogówkę szczura.

Palcami w rękawiczkach biernie mrugaj, przesuwając górną i dolną powiekę około pięć razy, aby rozprowadzić sól fizjologiczną. W powiększeniu 1,6-krotnym skup oświetlacz pierścieniowy na środku powierzchni rogówki. Następnie, po 10 sekundach, uzyskaj obrazy fotograficzne.

Użyj skanowania fluoresceiną, aby zmierzyć uszkodzenie rogówki, dodając dwa mikrolitry 0,2% fluoresceiny do rogówki szczura. Palcem w rękawiczce biernie otwórz i zamknij powieki szczura trzy razy, aby rozprowadzić barwnik fluoresceinowy na powierzchni oka. Po minucie użyj trzymililitrowej strzykawki, aby pobrać jeden mililitr soli fizjologicznej.

Następnie umieść strzykawkę około dwóch do trzech milimetrów przed rogówką i delikatnie nałóż sól fizjologiczną na oko. Przy wyłączonym świetle tła uzyskuj obrazy pod filtrem kobaltowo-niebieskim mikroskopu do obrazowania oczu. Po eutanazji szczura zgodnie z protokołem tekstowym użyj nożyczek, aby usunąć górną i dolną powiekę.

Uwolnij gałkę ziemską, przecinając mięśnie zewnątrzgałkowe, nerw wzrokowy i spojówkę otworu. Wykonaj nacięcie, aby otworzyć gałkę oczną. Wyjmij soczewkę w ciele szklistym.

Następnie umieść wypreparowane gałki oczne w 1,5-mililitrowych rurkach na lodzie. Na koniec zbierz gruczoły łzowe, jak opisano wcześniej w tym filmie. Ten rysunek przedstawia reprezentatywne obrazy czerwonych nici fenolowych z kontroli i szczura DET.

Długość nici czerwieni fenolowej w grupie DED jest krótsza niż w grupie kontrolnej, co wskazuje na mniejszą objętość rozdarcia. Fluoresceina wiąże się z uszkodzonym nabłonkiem rogówki i dlatego służy do pomiaru zakresu uszkodzenia. W tym eksperymencie plamki fluoresceinowe na powierzchni rogówki szczurów DED oceniono od zera do dwóch i porównano ze szczurami kontrolnymi.

Szczury z DED mają więcej barwienia fluoresceiną niż szczury kontrolne, co sugeruje uszkodzenie rogówki. Jak widać tutaj, jeśli powierzchnia rogówki jest gładka z wysoką stabilnością rozdarcia, obraz pierścienia oświetlacza na powierzchni oka jest okrągły i doskonały. Zniekształcenie obrazu wskazuje na zmniejszoną gładkość rogówki i niestabilny film łzowy, co zaobserwowano z większym stopniem zniekształcenia w grupie SED.

Ta analiza cytometrii przepływowej pokazuje, że dominującym podzbiorem limfocytów T w normalnych tkankach gałki ocznej szczura są limfocyty T pamięci efektorowej. W gałkach ocznych szczurów DED około 70% limfocytów T CD3-dodatnich to limfocyty T pamięci efektorowej, podczas gdy u szczurów kontrolnych liczba ta wynosi około 50%Gałki oczne szczurów DED mają znacznie wyższe limfocyty T pamięci efektorowej niż u szczurów kontrolnych. Po tej procedurze można przeprowadzić barwienie innych rodzajów komórek odpornościowych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania.

Na przykład możesz barwieć wrodzone komórki odpornościowe lub limfocyty B. Po opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do zrozumienia immunologii powierzchni oka, a także do dalszego badania zespołu suchego oka u ludzi i zespołu Sjögrena. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wywołać autoimmunologiczne suche oko u szczurów i przeprowadzić solidną dokumentację wyników.