Test ablacji chirurgicznej do badania regeneracji oka u wypławków

Ogólnym celem tej procedury jest pokazanie, jak niezawodnie usunąć wypławkową miseczkę nerwu wzrokowego bez naruszania mózgu lub otaczających tkanek, tak aby technika ta mogła być wdrażana przez badaczy i studentów na wszystkich poziomach edukacji. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie regeneracji, takie jak określenie mechanizmów regulujących utrzymanie i różnicowanie endogennych komórek macierzystych oka in vivo. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona badaczom usunąć tylko tkanki oka przy minimalnym naruszeniu innych tkanek.

Ogólnie rzecz biorąc, wymagana jest praktyka, zanim osoby nowe w tej metodzie będą mogły niezawodnie usunąć odpowiednią ilość tkanki, ablując całe oko, unikając ablacji otaczających tkanek. Na początek wybierz robaki, które nie były karmione przez co najmniej tydzień i mają co najmniej pięć do siedmiu milimetrów długości. Przenieś od 15 do 30 robaków na 100-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną w dwóch trzecich wodą z robaków i natychmiast załóż pokrywę.

Obserwuj robaki pod kątem brakujących lub niepigmentowanych tkanek, takich jak białe głowy lub ogony, aby upewnić się, że są nieuszkodzone i nie regenerują się niedawno. Najpierw przetrzyj obszar roboczy i podstawę mikroskopu preparacyjnego 70% roztworem etanolu i pozostaw do całkowitego wyschnięcia. Umieść naczynie z wybranymi robakami po lewej stronie mikroskopu.

Następnie po prawej stronie mikroskopu umieść parę kleszczyków numer pięć, igłę do insuliny o rozmiarze 31 i średnicy 5/16 cala ze strzykawką o średnicy jednego mililitra, czystą pipetę do przenoszenia i oznaczoną 12-dołkową płytkę do zbierania ablowanych robaków. Umieść pudełko z niestrzępiącymi się chusteczkami higienicznymi, plastikową butelkę do mycia wypełnioną świeżą wodą z robaków oraz dodatkowe pipety transferowe, aby były łatwo dostępne podczas operacji. Umieść płytkę Peltiera na środku podstawy mikroskopu preparacyjnego i ustaw wyjście na źródle prądu stałego tak, aby powierzchnia płytki Peltiera była wystarczająco chłodna, aby unieruchomić robaki.

Alternatywnie, zamiast talerza Peltiera można użyć wypełnionej lodem szalki Petriego. Aby przygotować powierzchnię operacyjną, najpierw wytnij kawałek plastikowej folii parafinowej o wymiarach pięć na dziesięć centymetrów i umieść go na środku płytki Peltiera. Następnie złóż niestrzępiącą się chusteczkę w kwadrat o długości około dwóch centymetrów i umieść ją na folii.

Następnie przytrzymaj złożoną chusteczkę na miejscu, zwilż ją wodą z robakiem i zwiń chusteczkę płasko za pomocą pipety transferowej. Na koniec wytnij kawałek białej bibuły filtracyjnej o powierzchni od 1,5 do dwóch centymetrów kwadratowych i połóż go na chusteczce. Aby rozpocząć operację, umieść jedną stronę grzbietową robaka do góry na bibule filtracyjnej za pomocą pipety transferowej.

Włącz światło i skieruj jego wiązkę na robaka. Dostosuj ostrość i powiększenie mikroskopu preparacyjnego tak, aby oczy robaka były wyraźnie widoczne. Obróć folię parafinową, aby dostosować położenie robaka tak, aby jego głowa była skierowana w stronę badacza i odchylona pod kątem od 30 do 40 stopni w prawo.

Jeśli robak jest ustawiony brzuszną stroną do góry, a otwór gardłowy jest widoczny, użyj strony kleszczy, aby delikatnie zmienić pozycję robaka na grzbietową stroną do góry z widocznymi oczami. Dostosuj ustawienia mikroskopu tak, aby oczy były wyraźnie ostre. Upewnij się również, że zarówno oczy, jak i otaczające tkanki głowy są w zasięgu wzroku.

Trzymać czystą strzykawkę w prawej ręce między kciukiem a palcem wskazującym. Podeprzeć dolną część strzykawki na lewym kciuku, opierając się o płytkę Peltiera. Spójrz przez mikroskop, aby upewnić się, że skos igły jest widoczny.

Umieść lewy palec wskazujący na powierzchni operacyjnej tak, aby tworzył kąt 40 stopni z lewym kciukiem, aby zapewnić, że powierzchnia pozostaje stabilna podczas zabiegu. Ustawić igłę pod kątem 90 stopni do oka, ze skosem igły skierowanym do góry. Czubkiem igły delikatnie wbij się w cienką warstwę tkanki pokrywającą miskę wzrokową oka widoczną jako biały, niepigmentowany obszar.

Nabierając od prawej do lewej, bardzo delikatnie usuń czarną pigmentowaną tkankę znajdującą się w miseczce optycznej, a także wszystkie białe tkanki. Jeśli wykonujesz podwójną ablację oka, należy teraz przeprowadzić ablację drugiego oka. Po zakończeniu zabiegu zalej pipetę niewielką ilością wody z robaków i wypuść wodę na robaka, aby podnieść go z bibuły filtracyjnej.

Natychmiast wciągnąć robaka do pipety transferowej. Przenieś robaka na oznaczoną 12-dołkową płytkę wypełnioną w dwóch trzecich świeżą wodą z robaków. Po przeniesieniu wszystkich robaków umyj je, zastępując wodę ze studni świeżą wodą z robaków.

Wysiaduj robaki chronione przed światłem w inkubatorze o temperaturze 20 stopni Celsjusza i monitoruj proces regeneracji. Aby złożyć w ofierze żywe robaki, usuń wodę z robaków z talerza i zastąp ją 70% etanolem. Wysiaduj robaki przez trzy do pięciu minut i obserwuj, czy robaki ulegają lizie i stają się szare.

Prezentowane są fotografie płazińców poddanych podwójnej ablacji oka i ablacji pojedynczego oka, wykonane przed, cztery dni po i dwa tygodnie po zabiegu chirurgicznym. Obrazy pokazują postęp regeneracji w czasie. Regenerację oczu u robaków po ablacji potwierdzono również barwieniem immunohistochemicznym aresztyny i nowo powstałych neuronów fotoreceptorowych.

Odzyskiwanie układu wzrokowego u płazińców po podwójnej ablacji oka badano również w teście funkcjonalnym opartym na światłowstrętnej reakcji typu dzikiego na światło. 24 godziny po ablacji robaki bezokie nie unikają światła i przemieszczają się przez jasne plamy. Światłowstręt ustępuje po siedmiu dniach od zabiegu, co świadczy o tym, że zregenerowany układ wzrokowy jest sprawny.

Po opanowaniu procedura podwójnej ablacji oka jednego robaka może być wykonana około trzech minut. Podczas ablacji ważne jest, aby wyciąć wszystkie pigmentowane i niepigmentowane tkanki oka, jednocześnie uważając, aby nie uszkodzić tkanki między oczami ani nie rozerwać tkanki później do oka. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak immunohistochemia i interferencja RNA, w celu zbadania roli określonych genów i ich procesu regeneracyjnego.

Dodatkowo można wykonać testy behawioralne w celu zbadania funkcji oka po odrastaniu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyciąć wypławki oczu bez naruszania otaczających tkanek. Nie zapominaj, że praca z igłami może być niebezpieczna i należy podjąć środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i trzymanie igły skierowanej od siebie.