Name: Wykorzystanie nadzwyczajnej transmisji optycznej do ilościowego oznaczania biomarkerów serca w ludzkiej surowicy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Poznaj metodę ilościowego oznaczania biomarkerów serca w ludzkiej surowicy przy użyciu nadzwyczajnej transmisji optycznej. Technika ta umożliwia wykrywanie troponiny I w punktach opieki bez złożonych układów optycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

AP dziękuje za wsparcie Prof. T Venkatesana, Dyrektora NUS Nanoscience and Nanotechnology Initiative oraz Biura Wiceprezydenta (National University of Singapore) (R-398-000-084-646). CLD dziękuje za wsparcie udzielone przez Krajową Radę ds. Badań Medycznych Ministerstwa Zdrowia Singapuru w ramach programu finansowania dla naukowców klinicystów NMRC/CSA/035/2012 oraz Narodowy Uniwersytet Singapuru. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

1. Wykonanie czujnika i pozyskiwanie danych
<ol>
	<li>Przygotowanie formy niklowej
	<ol>
		<li>Nałóż warstwę negatywowego rezystu do litografii elektronowej o grubości 220 nm na 600 µm- gruby podłoże krzemowe o średnicy 4 cali. Na tym podłożu należy nanieść zaprojektowaną strukturę nanootworów za pomocą systemu litografii wiązką elektronów.
		<ol>
			<li>Aby przyspieszyć zapis wiązką elektronów, należy wykonać wzory z niską rozdzielczością mapy punktów (N) wynoszącą 20 tys. dla każdego z nich 300 µm rozmiar pola (A) (tj. na każdym z nich naniesiono 0,4 miliarda punktów 300 µm2 obszarze, a każdy punkt zostanie albo naświetlony wiązką elektronów, albo nie, w zależności od projektu wzoru). Ustaw dawkę ekspozycji wiązki elektronów dla rezystu na 110 µC cm−2 i zapisuj przy prądzie (I) wynoszącym 80 pA. 
			UWAGA: W litografii wiązką elektronową dawka naświetlania (D) jest kontrolowana przez czas naświetlania każdego punktu (T)kropka), obliczone na podstawie <img alt="Równanie równowagi statycznej: T_dot = (D × (A/N)^2) / I, istotne dla badań z zakresu fizyki." src="/files/ftp_upload/55597/55597eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1">Dla dawki ekspozycyjnej przy 110 µC cm−2czas przebywania wiązki elektronowej na każdej naświetlanej kropce wynosi 0.5 µs12Ponieważ macierz obejmuje obszar o wielkości 1,8 mm2łącznie znajduje się 36 obszarów o wielkości 30-µm2 połączone ze sobą obszary pola, tworzące jedną dużą macierz nanootworów złota.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wywołać warstwę resistu, zanurzając 4-calowy wafele krzemowy w roztworze wywoływacza na 10 s, a następnie pozostawiając wafele do wyschnięcia na powietrzu.</li>
		<li>Osadź warstwę zarodkową metalu, takiego jak nikiel, miedź lub aluminium, na płytce krzemowej.</li>
		<li>Poddaj wafelek elektrogalwanizacji w systemie do galwanizacji w kąpieli z sulfamianu niklu. Elektrogalwanizację przeprowadź w dwóch etapach. W pierwszym etapie, trwającym 95 min, zastosuj gęstość prądu 0,7 A/dm²−2; powoduje to całkowite wypełnienie nanowzorów niklem. W drugim kroku, trwającym 125 min, należy zastosować natężenie 12 A dm-2−2 osiągnąć 300 µm jako końcową grubość niklowej formy (20 nm). Należy upewnić się, że wartość pH wynosi 3,5–3,8, a temperatura wynosi 52– 54 °C.</li>
		<li>Oddziel formę niklową od podłoża krzemowego, przykładając delikatną siłę mechaniczną. Namocz formę niklową w około 100 ml odczynnika do usuwania pozytywnego fotorezystu przez całą noc, aby wypłukać pozostałości rezystu do litografii wiązką elektronów.</li>
		<li>Włożyć formę niklową do pieca i suszyć w temperaturze 100 °C przez 3 h. Oczyścić w systemie trawienia plazmowego O22 gaz w przepływie 10 sccm i mocy 10 W przez 3 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytwarzanie złotej nanostruktury
	<ol>
		<li>Powlecz 150 µL heptadecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrodecylotrichlorosilanu (FDTS) na formie niklowej w urządzeniu do nanoszenia powłok samoorganizujących się monowarstw (SAM) przy 80 °C. 
		UWAGA: Pozwoli to na utworzenie warstwy antyadhezyjnej, która umożliwi oddzielenie formy od fotorezystu („rozformowanie”) po zakończeniu etapu nanoimprintingu. Czas odparowania powinien wynosić 180 s, a czas reakcji 90 s.</li>
		<li>Wytłocz nanowzory na szklanym waflu o średnicy 4 cali, pokrytym warstwą fotoutwardzalnego resistu NIL o grubości 30 nm, przy użyciu nanoimprintera pod ciśnieniem 10 bar i w temperaturze 40 °C przez 10 min.</li>
		<li>Przenieś formę, fotorezyst oraz szklaną płytkę do systemu utwardzania światłem UV i poddaj fotoutwardzaniu przy mocy 75 mW cm-2-2 naświetlania promieniami UV przez 30 s. 
		UWAGA: Jeśli wszystkie kroki zostały wykonane prawidłowo, forma niklowa powinna zostać łatwo oddzielona od fotorezistu.</li>
		<li>W systemie reaktywnego trawienia jonowego (RIE) przeprowadź trawienie kontrolne (blank etch) fotorezystu na szklanym podłożu, przy użyciu O2 przepływ gazu 10 sccm, przy mocy 50 W przez 2 s, aby poddać działaniu szkło w obszarach wciśniętych.</li>
		<li>Nanieś na szklaną płytkę w urządzeniu do naparowania wiązką elektronów warstwę chromu (Cr) o grubości 5 nm w celu zapewnienia adhezji metalu oraz warstwę złota (Au) o grubości 10 nm, służącą jako sensor plazmoniczny. Zastosuj szybkość osadzania na poziomie 1 Å/s.−1 dla Cr i 2 Å s−1 dla Au.</li>
		<li>Przeprowadź usuwanie fotorezystu metodą lift-off w tlenku2 trawienie plazmowe przez 3 min, a następnie 15-sekundowy etap sonikacji w acetonie.</li>
		<li>Pokroić próbkę na kostki o wymiarach 5 mm × 5 mm. Matryca nanootworów będzie zajmować centralny obszar kostki o wymiarach 2 mm × 2 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozyskiwanie danych
	<ol>
		<li>Przygotuj aparaturę do pomiarów optycznych w taki sposób, aby wiązka białego światła wychodząca z końca światłowodu nadawczego była skolimowana i padała na powierzchnię czujnika (macierz nanootworów) pod kątem 90°. 
		UWAGA: Światło przechodzi przez całą macierz nanootworów.</li>
		<li>Sygnał przetransportowany należy zebrać za pomocą odbiorczego światłowodu i zarejestrować go spektrometrem UV-Vis pracującym w zakresie od 30 do 10 nm.</li>
		<li>Ustaw czas akwizycji dla każdej klatki na 20 ms. Wykonaj uśrednienie 100 klatek w celu uzyskania końcowego widma, aby zredukować szumy w pomiarach.</li>
		<li>Należy wykorzystać oprogramowanie do wykresów w celu analizy danych w oparciu o wcześniej zidentyfikowane piki przenikalności (przy zastosowaniu metody opartej na funkcji Lorentza).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test czułości masowej sensora
<ol>
	<li>Napełnić komórkę pomiarową standardowym cieczem o znanym współczynniku załamania światła (RI), w zakresie od 1,31 do 1,39.</li>
	<li>Zanurzyć chip sensora w standardowym cieczu RI i ustawić go w wiązce białego światła. Następnie zarejestrować widmo transmisyjne.</li>
	<li>Po każdym pomiarze oczyścić chip sensora za pomocą powierzchniowo czynnego środka czyszczącego i osuszyć go strumieniem azotu.</li>
</ol>
3. Modyfikacja powierzchni sensora
<ol>
	<li>Przed wprowadzeniem jakichkolwiek modyfikacji chemicznych oczyścić chipy sensoryczne poprzez sekwencyjne zanurzenie w izopropanolu, acetonie i wodzie dejonizowanej. Suszyć w temperaturze pokojowej w strumieniu suchego azotu.</li>
	<li>Inkubować chipy sensoryczne w etanolowym roztworze 0,4 mM 10-karboksy-1-dekanotiolu i 1,6 mM 1-oktanotiolu przez 12 h w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Proces ten spowoduje utworzenie aminoreaktywnej samoporządkującej się monowarstwy (SAM).</li>
	<li>Dokładnie wypłukać etanolem i wysuszyć w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę 75 mM sulfo-N-hydroksysuccynimidu (sulfo-NHS) i 15 mM 1-etylo-3-(3-dimetylaminopropylo)karbodiimidu (EDC). Zanurzyć chipy w tej mieszaninie na 15 min. 
	UWAGA: Proces ten aktywuje grupy karboksylowe w warstwie SAM.</li>
	<li>Nanieść 50 µL roztworu przeciwciał antytroponinowych o stężeniu 20 µg/mL w buforze octanowym o pH 4,5 na powierzchnię sensora i inkubować przez 30 min.</li>
	<li>Zneutralizować niezwiązane estry, zanurzając chip sensoryczny w 1 M roztworze etanolaminy-HCl na 15 min.</li>
	<li>Wypłukać chip wodą dejonizowaną i wysuszyć w strumieniu suchego azotu w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
4. Analiza cTnI
<ol>
	<li>Zablokuj wiązania nieswoiste, nakładając 10 µL 1% roztworu albuminy wołowej (BSA) na powierzchnię. Inkubuj przez 15 min.</li>
	<li>Przepłucz chipy sensoryczne trzykrotnie w roztworze buforu fosforanowego (PBS). Włóż chip do celi pomiarowej, aby zarejestrować widmo transmisji. 
	UWAGA: Jest to widmo referencyjne.</li>
	<li>Nanieś 50 µL standardu cTnI na powierzchnię chipa i inkubuj w wilgotnym środowisku przez 30 min.</li>
	<li>Przepłucz chipy sensoryczne trzykrotnie w roztworze PBS i włóż je do celi pomiarowej, aby zarejestrować widmo transmisji. 
	UWAGA: Jest to widmo po wiązaniu.</li>
	<li>Zanurz chipy w 50 mM glicynie-HCl (pH 2) na 1 min, a następnie przepłucz trzykrotnie w roztworze PBS, aby zregenerować powierzchnię chipa. Zmierz widmo transmisji w PBS, aby zweryfikować powodzenie etapu regeneracji.</li>
</ol>
5. Pomiar powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR)
<ol>
	<li>Przeprowadź analizę przy użyciu multipleksowego chipa sensorycznego SPR w systemie SPR z zastosowaniem buforu PBS-T. 
	UWAGA: Skład buforu PBS-T to 20 mM fosforanu sodu, 150 mM NaCl oraz 0,05% Tween 20. pH wynosi 7,4.</li>
	<li>Użyj standardu cTnI oraz przeciwciała, zgodnie z opisem w kroku 4.</li>
	<li>Aktywuj 3 z 6 dostępnych kanałów mieszaniną EDC (0,2 M) i sulfo-NHS (0,05 M) przez 5 min. Wykonaj 5-minutową injekcję przeciwciała 560 w stężeniu 50 µg/mL, a następnie 5-minutową injekcję 1 M roztworu etanolaminy-HCl.</li>
	<li>Obróć chip sensoryczny o 90° i wstrzyknij standardy cTnI o różnych stężeniach (75, 30, 7,5 i 2,5 ng/mL).</li>
	<li>Obserwuj sprzęganie z przeciwciałem w punktach interakcji na chipie w czasie rzeczywistym za pomocą odczytu SPR.</li>
	<li>Zregeneruj chip, wstrzykując 50 mM glicyny-HCl (pH 2) przez 1 min.</li>
</ol>

<ol><li>Ebbesen, T. W., Lezec, H. J., Ghaemi, H., Thio, T., Wolff, P. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v391/n6668/abs/391667a0.html">Extraordinary optical transmission through sub-wavelength hole arrays.</a> Nature. 391 (6668), 667-669 (1998).</li>
<li>Krishnan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0030401801015589">Evanescently coupled resonance in surface plasmon enhanced transmission.</a> Optics Comm. 200 (1), 1-7 (2001).</li>
<li>Yang, J. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+optical+transmission+mediated+by+localized+plasmons+in+anisotropic%2C+three-dimensional+nanohole+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Enhanced optical transmission mediated by localized plasmons in anisotropic, three-dimensional nanohole arrays.</a> Nano letters. 10 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Kim, J. H., Moyer, P. J. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.2355468?journalCode=apl">Transmission characteristics of metallic equilateral triangular nanohole arrays.</a> Appl Phys Lett. 89 (12), 121106(2006).</li>
<li>Liu, H., Lalanne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+theory+of+the+extraordinary+optical+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microscopic theory of the extraordinary optical transmission.</a> Nature. 452 (7188), 728-731 (2008).</li>
<li>Shon, Y. -S., Choi, H. Y., Guerrero, M. S., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s11468-009-9079-1">Preparation of nanostructured film arrays for transmission localized surface plasmon sensing.</a> Plasmonics. 4 (2), 95-105 (2009).</li>
<li>Xiang, G., Zhang, N., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+surface+plasmon+resonance+biosensing+with+large+area+of+gold+nanoholes+fabricated+by+nanosphere+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Res+Lett%22%5BJournal%5D)">Localized surface plasmon resonance biosensing with large area of gold nanoholes fabricated by nanosphere lithography.</a> Nanoscale Res Lett. 5 (5), 818(2010).</li>
<li>Valsecchi, C., Brolo, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodic+metallic+nanostructures+as+plasmonic+chemical+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Periodic metallic nanostructures as plasmonic chemical sensors.</a> Langmuir. 29 (19), 5638-5649 (2013).</li>
<li>Gates, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+to+nanofabrication%3A+molding%2C+printing%2C+and+other+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">New approaches to nanofabrication: molding, printing, and other techniques.</a> Chem Rev. 105 (4), 1171-1196 (2005).</li>
<li>Guo, L. J. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.200600882/abstract">Nanoimprint lithography: methods and material requirements.</a> Adv Mater. 19 (4), 495-513 (2007).</li>
<li>Wong, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+and+high+yield+nanofabrication+of+precisely+designed+gold+nanohole+arrays+for+fluorescence+enhanced+detection+of+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">High throughput and high yield nanofabrication of precisely designed gold nanohole arrays for fluorescence enhanced detection of biomarkers.</a> Lab on a Chip. 13 (12), 2405-2413 (2013).</li>
<li>Deng, J., Wong, T. I., Sun, L. L., Quan, C., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167931716303975">Acceleration of e-beam lithography by minimized resist exposure for large scale nanofabrication.</a> Microelect Eng. 166, 31-38 (2016).</li>
<li>Wu, L., Bai, P., Li, E. P. <a target="_blank" href="https://www.osapublishing.org/josab/abstract.cfm?uri=josab-29-4-521">Designing surface plasmon resonance of subwavelength hole arrays by studying absorption.</a> JOSA B. 29 (4), 521-528 (2012).</li>
<li>Ding, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+a+cardiac+biomarker+in+human+serum+using+extraordinary+optical+transmission+%28EOT%29%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Quantification of a cardiac biomarker in human serum using extraordinary optical transmission (EOT).</a> PloS one. 10 (3), 0120974(2015).</li>
<li>Im, H., Sutherland, J. N., Maynard, J. A., Oh, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanohole-based+surface+plasmon+resonance+instruments+with+improved+spectral+resolution+quantify+a+broad+range+of+antibody-ligand+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Nanohole-based surface plasmon resonance instruments with improved spectral resolution quantify a broad range of antibody-ligand binding kinetics.</a> Anal Chem. 84 (4), 1941-1947 (2012).</li>
<li>Bhagawati, M., You, C., Piehler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+imaging+of+protein-protein+interactions+by+LSPR+detection+with+micropatterned+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time imaging of protein-protein interactions by LSPR detection with micropatterned gold nanoparticles.</a> Anal Chem. 85 (20), 9564-9571 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Symulacja oddziaływania między padającym światłem a nanostrukturami umożliwia zidentyfikowanie odpowiedniego piku (w widmie transmisyjnym), którego przesunięcie można zarejestrować w funkcji stężenia analitu. Należy zauważyć, że lokalizacja pasm w stosunku do struktury czujnika ma kluczowe znaczenie dla wyboru odpowiedniego pasma, którego przesunięcie można śledzić w celu wykrycia analitu. Wizualizację można uzyskać za pomocą symulacji. Ma to również kluczowe znaczenie dla zaprojektowania optymalnej struktury, która umoż...

Czujniki chemiczne oparte na matrycach nanootworów były przedmiotem licznych badań od czasu opublikowania pierwszego raportu na temat nadzwyczajnej transmisji optycznej (EOT) przez Ebbesen et al. w 1998 roku1. Gdy światło pada na okresowe układy struktur nanodziurowych o wymiarach poniżej długości fali, wzmocniona transmisja zachodzi przy określonych długościach fal. Dzieje się tak, gdy padające światło łączy się z polarytonem powierzchniowym fali Blocha (BW-SPP) i/lub zlokalizowanymi plazmonami powierzchniowymi (LSP)2.
Podstawowa zasada fizyczna wykorzystywana podczas biodetekcji za pomocą takich układów okresowych jest prosta. Adsorpcja cząsteczek na lub w pobliżu granicy faz metalu zmienia stałą dielektryczną ośrodka stykającego się z metalem, co z kolei przesuwa położenie pasm transmisyjnych w widmie. Samo widmo można dostosować za pomocą nanoinżynierii kształtu, rozmiaru i odległości separacji3,4,5. Z założenia czujniki oparte na EOT mają charakterystyczne pasma w swoich widmach, które ułatwiają określone przypisania6,7,8 podczas badania zdarzeń wiązania molekularnego. Jest to kluczowa przewaga nad dostępnymi na rynku platformami powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR).
Czujniki korzystające z EOT zazwyczaj wykorzystują źródło światła optycznie ustawione tak, że skolimowana wiązka pada na powierzchnię czujnika. Techniki generowania dużych powierzchni nanodziur, takie jak matryce kopolimerowe oraz litografia interferencyjna i nanosferyczna, mają słabą odtwarzalność9. Ze względu na te ograniczenia w dokładnym wytwarzaniu dużych powierzchni, które wykazują zjawisko EOT, potrzebny był mikroskop optyczny, aby prawidłowo ustawić źródło światła i detektor. Aby uprościć tę technikę, zastosowano wysokiej jakości litografię nanoimprintingową (NIL)10. Umożliwiło to produkcję dużych powierzchni czujników11 (skala mm), eliminując potrzebę korzystania z mikroskopu w celu poszukiwania powierzchni wykrywania na chipie. Zamiast tego czujnik ten można łatwo połączyć ze standardowym światłowodowym.
Ponieważ piki transmisji dla tej matrycy nanodziur są zawarte w obszarze widzialnym do bliskiej podczerwieni (NIR), doskonale nadaje się ona do wykrywania zdarzeń wiązania biomolekuł w środowisku wodnym. Przeprowadzono symulację oczekiwanego zachowania optycznego układu nanodziur. Wynik został następnie zweryfikowany w badaniach z cieczami o standardowych współczynnikach załamania światła (RI). Matryca ta została następnie wykorzystana do pomiaru stężenia sercowej troponiny I (cTnI) w złożonym tle ludzkiej surowicy. cTnI jest klinicznym złotym standardem w diagnostyce ostrego zawału mięśnia sercowego.
Za pomocą tego czujnika, możliwe jest wykrycie i ilościowe określenie cTnI w ludzkiej surowicy przy granicy wykrywalności (LOD) 0,55 ng/ml, co jest klinicznie istotne. Wykrywanie jest znacznie szybsze niż w przypadku najczęściej stosowanej technologii w tej dziedzinie, testu immunoenzymatycznego (ELISA). Co więcej, powierzchnia pomiarowa może być łatwo zregenerowana, a tym samym ponownie wykorzystana. W związku z tym prace te pokazują, że matryce nanodziur są obiecujące jako realna technologia przyłóżkowa (POC) do biodetekcji w złożonych płynach biologicznych.

<table><tbody><tr><td>Konfiguracja litografii wiązką elektronów</td><td>Elionix ELS 700</td><td></td><td></td></tr><tr><td>o-Xylene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>95662</td><td></td></tr><tr><td>EB resist</td><td>Sumitomo</td><td>NEB-22A2</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik wywoływacza</td><td>Shipley Company</td><td>Microposit MF 321</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do galwanizacji</td><td>Technotrans AG RD 50</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stripper fotorezystu&nbsp;</td><td>Materiały elektroniczne Rohm i Haas&nbsp; LLC</td><td>Microposit Remover 1165</td><td></td></tr><tr><td>System trawienia</td><td>Trion Phantom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heptadecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrodecyl)trichlorosilan&nbsp;</td><td>Gelest (PA, USA)</td><td>78560-44-8</td><td></td></tr><tr><td>Powlekarka SAM&nbsp;</td><td>Sorona Inc.</td><td>AVC 150M</td><td></td></tr><tr><td>Fotoutwardzalny NIL</td><td>resist micro resist technology GmbH</td><td>mr-UVCur21-300nm</td><td></td></tr><tr><td>Light Curing System</td><td>Dymax&nbsp;</td><td>Model 2000 Flood</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do osadzania wiązką elektronów</td><td>Denton Explorer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr UV widzialny&nbsp;</td><td>Optyka oceaniczna HR2000+ (Dunedin, FL, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciecze o standardowym indeksie załamania światła&nbsp;</td><td>Cargill Inc (Cedar Grove, Stany Zjednoczone)</td><td>18032</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do kreślenia</td><td>Origin</td><td>Origin Pro 9</td><td></td></tr><tr><td>10-karboksyl-1-dekanotiol&nbsp;</td><td>Dojindo Laboratories (Japonia)</td><td>C385-10</td><td></td></tr><tr><td>1-oktanetiol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td><td>471386</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-N-hydroksysukcynimid i 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiiimid&nbsp;</td><td>BioRad (CA, USA)</td><td>1762410</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-troponinowe 560</td><td>Hytest (Finlandia)</td><td>4T21</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór etanoloaminy-HCl</td><td>BioRad (CA, USA 1762450</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Konfiguracja rezonansu plazmonowego</td><td>powierzchniowego BioRad XPR36 (Hajfa, Izrael)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multipleksowany chip SPR</td><td>BioRad</td><td>GLC</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki standard cTnI</td><td>Phoenix Pharmaceuticals</td><td>EK -311-05</td><td></td></tr><tr><td>Glycine-HCl</td><td>BioRad (CA, Stany Zjednoczone)</td><td>1762221</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie nadzwyczajnej transmisji optycznej do ilościowego oznaczania biomarkerów serca w ludzkiej surowicy

Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum

Aby platforma biosensoryczna miała kliniczne znaczenie w warunkach przyłóżkowych (POC), czułość testu, odtwarzalność i zdolność do niezawodnego monitorowania analitów na tle ludzkiej surowicy są kluczowe.
Litografia nanoimprintingowa (NIL) została użyta do wytworzenia, przy niskich kosztach, obszarów detekcyjnych o wymiarach 1,5 mm x 1,5 mm. Powierzchnia detekcyjna została wykonana z wysokiej jakości matryc nanodziur, z których każdy ma powierzchnię około 140 nm2. Doskonała powtarzalność NIL umożliwiła zastosowanie strategii jednego wióra i jednego pomiaru na 12 indywidualnie wyprodukowanych powierzchniach, przy minimalnych różnicach między wiórami. Te nanoimprintowane zlokalizowane powierzchniowo rezonansu plazmonowego (LSPR) zostały gruntownie przetestowane pod kątem ich zdolności do wiarygodnego pomiaru bioanalitu w stężeniach od 2,5 do 75 ng / ml na tle złożonego biopłynu - w tym przypadku ludzkiej surowicy. Wysoka wierność NIL umożliwia generowanie dużych obszarów detekcji, co z kolei eliminuje potrzebę stosowania mikroskopu, ponieważ ten bioczujnik można łatwo połączyć z powszechnie dostępnym laboratoryjnym źródłem światła. Te bioczujniki mogą wykrywać troponinę sercową w surowicy z wysoką czułością, przy granicy wykrywalności (LOD) 0,55 ng/ml, co jest klinicznie istotne. Wykazują również niską wariancję między wiórami (ze względu na wysoką jakość procesu produkcyjnego). Wyniki są porównywalne z szeroko stosowanymi testami opartymi na testach immunoenzymatycznych (ELISA), ale technika ta zachowuje zalety platformy detekcyjnej opartej na LSR (tj. możliwość miniaturyzacji i multipleksowania, dzięki czemu jest bardziej wykonalna w zastosowaniach POC).

Układ optyczny do pomiarów przedstawiono na Rysunku 1A. Obraz rzeczywistej macierzy nanootworów znajduje się na Rysunku 1B. Aby zrozumieć fizykę sterującą procesem detekcji, wykorzystano oprogramowanie symulacyjne COMSOL do odwzorowania rozkładu pola plazmonicznego w środowisku wodnym. Wyniki symulacji zestawiono następnie z rzeczywistym pomiarem. Szczegóły dotyczące przyjętych założeń i parametrów użytych w symulacji zawiera wcz...

Ta praca opisuje metodę litografii nanoimprintingowej do wytwarzania wysokiej jakości matryc czujnikowych, które działają na zasadzie niezwykłej transmisji optycznej. Bioczujnik jest tani, solidny, łatwy w użyciu i może wykrywać troponinę sercową I w surowicy w klinicznie istotnych stężeniach (odcięcie 99. percentyla ∼10-400 pg/ml, w zależności od testu).

Wykorzystanie nadzwyczajnej transmisji optycznej do ilościowego oznaczania biomarkerów serca w ludzkiej surowicy

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor ...

Ogólnym celem tej techniki jest pomiar biomarkerów występujących w złożonym tle płynu biologicznego w stężeniach istotnych klinicznie w warunkach badań przy łóżku pacjenta (point-of-care), bez konieczności stosowania rozbudowanych układów optycznych lub elektrycznych. Metoda ta może pomóc w urzeczywistnieniu biosensorów opartych na zjawisku nadzwyczajnej transmisji (extraordinary transmission) w scenariuszach diagnostyki point-of-care. Główną zaletą tej techniki jest brak potrzeby stosowania skomplikowanych układów elektrycznych lub optycznych.W naszych eksperymentach urządzenie to było w stanie wiarygodnie wykrywać biomarkery w stężeniach istotnych klinicznie. Wytwarzanie chipa sensorycznego odbywa się w pomieszczeniu czystym i nie może zostać sfilmowane. Na potrzeby demonstracyjne procedura ta została tutaj przedstawiona w formie animacji.W celu przygotowania formy niklowej nanieś warstwę negatywowego rezystu elektronowego o grubości 220 nanometr na czterocalowy wafel krzemowy o grubości 600 mikronów. Wykonaj zaprojektowaną matrycę nano-otworów na tym waflu, korzystając z systemu litografii wiązką elektronów. Aby przyspieszyć proces zapisu wiązką elektronów, wykonaj wzory przy niskiej gęstości punktów mapy wynoszącej 20 000 dla każdego pola o rozmiarze 300 mikronów.Wywołaj rezyst, zanurzając czterocalowy wafelek krzemowy w roztworze wywoływacza na 10 s, a następnie pozostawiając wafelek do wyschnięcia na powietrzu. Nanieś warstwę zarodkową metalu, takiego jak nikiel, miedź lub aluminium, na wafelek krzemowy. Następnie poddaj wafelek galwanizacji w systemie platerowania w kąpieli niklu z sulfamatem w dwóch etapach.Oddziel formę niklową od podłoża krzemowego, przykładając delikatną siłę mechaniczną. Następnie, używając nanoimprintera, odciśnij nanowzory na czterocalowym waflu szklanym, który został pokryty warstwą fotoutwardzalnego resistu do litografii nanoimprintowej o grubości 300 nanometrów. Przenieś formę, resist i wafelek szklany do systemu utwardzania promieniami UV i przeprowadź fotoutwardzanie.Jeśli wszystkie kroki zostały wykonane prawidłowo, forma niklowa powinna zostać łatwo oddzielona od fotorezystu. Po wykonaniu trawienia pustego obszaru fotorezystu na podłożu szklanym, na waflu szklanym, w maszynie do osadzania wiązką elektronów, należy osadzić warstwę chromu w celu zapewnienia adhezji metalu oraz warstwę złota dla sensora plazmonicznego. Przeprowadź proces lift-off fotorezystu poprzez trawienie plazmą tlenową przez trzy minuty, a następnie wykonaj 15-sekundowy etap sonikacji w acetonie.Następnie podziel próbkę na kostki o wymiarach 5 mm na 5 mm. Matryca nanootworów będzie znajdować się w centralnym kwadracie o wymiarach 2 mm na 2 mm kostki. Aby uzyskać dane, skonfiguruj aparat do pomiarów optycznych w taki sposób, aby wiązka białego światła wychodząca z końca światłowodu nadawczego była skolonimowana i padała prostopadle (pod kątem 90 stopni) na powierzchnię sensora.Światło jest transmitowane przez całą macierz nanootworów. Sygnał transmitowany należy zebrać za pomocą odbiorczego światłowodu i zarejestrować spektrometrem UV-Vis pracującym w zakresie od 300 do 1 000 nanometrów. W celu przetestowania czułości objętościowej czujnika, do celi cieczowej należy wprowadzić standardowe ciecze o współczynnikach załamania zmieniających się od 1,31 do 1,39.Zanurz chip czujnika w cieczy o wzorcowym współczynniku załamania światła i wyrównaj go z wiązką białego światła. Następnie uzyskaj widmo transmitancji. Po każdym pomiarze oczyść chip czujnika za pomocą powierzchniowo czynnego środka czyszczącego i osusz go strumieniem azotu.W celu modyfikacji powierzchni sensora, przed przystąpieniem do jakichkolwiek modyfikacji chemicznych, należy oczyścić chipy sensorowe poprzez sekwencyjne zanurzanie w izopropanolu, acetonie oraz wodzie dejonizowanej. Następnie chipy sensorowe należy wysuszyć w temperaturze pokojowej w strumieniu suchego azotu. W kolejnym kroku chipy sensorowe należy inkubować w roztworze etanolowym przez 12 godzin w temperaturze pokojowej.W ten sposób powstanie aminoreaktywna, samoporządkująca się monowarstwa. Po inkubacji należy dokładnie wypłukać chipy etanolem i wysuszyć je w temperaturze pokojowej. Następnie chipy należy zanurzyć w mieszaninie 75 mM sulfo-NHS i 15 mM EDC na 15 minut.Doprowadzi to do aktywacji grupy karboksylowej samoorganizującej się monowarstwy. Następnie nanieś 50 µL roztworu przeciwciała anty-triponent o stężeniu 200 µg/mL w buforze octanowym o pH 4,5 na powierzchnię sensora. Po 30-minutowej inkubacji zablokuj nieprzereagowane estry, zanurzając chip sensora w 1 M roztworze etanolaminy HCl na 15 minut.Na koniec opłucz chip wodą dejonizowaną i wysusz go strumieniem suchego azotu w temperaturze pokojowej. Zablokuj wiązania nieswoiste, nanosząc 100 µL 1% roztworu bovine serum albumine na powierzchnię chipa sensorycznego. Inkubuj przez 15 minut.Przepłucz chipy sensorowe trzykrotnie w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo. Włóż chip do celi pomiarowej w celu zarejestrowania widma transmisji. Jest to widmo referencyjne.Następnie nanieś 50 µl standardu troponiny I serca na powierzchnię chipa. Inkubuj chip w wilgotnym środowisku przez 30 minut. Po trzykrotnym wypłukaniu chipów sensorowych w roztworze PBS, włóż go do celi pomiarowej w celu zarejestrowania widma transmisji.Jest to widmo po wiązaniu. Następnie zanurz chipy w 50 millimolarnym roztworze glicyny HCL na jedną minutę, a potem wypłucz w roztworze PBS trzy razy, aby zregenerować powierzchnię chipa. Zmierz widmo transmisji w PBS, aby zweryfikować powodzenie etapu regeneracji.Przedstawiono zmianę widma transmisyjnego biosensora po oddziaływaniu z 30 nanogramami na mililitr ludzkiej troponiny sercowej w surowicy. Niebieski wykres reprezentuje stan przed oddziaływaniem, natomiast czerwony wykres reprezentuje stan po oddziaływaniu. Przerywane okrągże wskazuje śledzony pasmo.Przedstawiono tutaj przesunięcie długości fali dla pasma drugiego przy stężeniach troponiny wynoszących 2.5 nanograms per milliliter, 7.5 nanograms per milliliter, 30 nanograms per milliliter oraz 75 nanograms per milliliter. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Wykres ten pokazuje przesunięcie długości fal pasm zaobserwowanych po regeneracji w przypadku biosensora z nano-otworami.Powrót prążka drugiego na jego pierwotną pozycję wskazuje, że etap regeneracji przebiegł pomyślnie. Po opanowaniu techniki, pomiar może zostać wykonany w ciągu godziny, jeśli jest przeprowadzany prawidłowo. Podczas pomiaru bioanalitów tą metodą ważne jest stosowanie świeżo przygotowanych odczynników.Prosimy o wcześniejsze przygotowanie i rozdzielenie odczynników oraz materiałów eksploatacyjnych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat sposobów wytwarzania biosensorów działających w oparciu o zasadę nadzwyczajnej transmisji optycznej, które umożliwiają monitorowanie bioanalitów na tle złożonego środowiska. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ generowanie wysokiej wierności macierzy nano-otworów, które umożliwiają połączenie chipa z włóknem optycznym bez konieczności użycia mikroskopu i przy zastosowaniu powtarzalnych żywic, jest wymagające.Technika ta umożliwia wykonywanie pomiarów seryjnych, które są kluczowe w zastosowaniach medycznych. Sposób wykonania chipa w znacznym stopniu zapewnia powtarzalność pomiarów. Przy zachowaniu tej samej podstawowej platformy, dalsze ulepszenia tej metody będą wynikać z zastosowania techniki o lepszej rozdzielczości, co zwiększy czułość, oraz z wykorzystania metod przetwarzania sygnałów w celu uzyskania lepszego stosunku sygnału do szumu.Zastosowanie tej techniki rozciąga się na monitorowanie wielu bioanalitów w złożonym środowisku surowicy w czasie rzeczywistym w ramach diagnostyki w punkcie opieki (point-of-care).

using-extraordinary-optical-transmission-to-quantify-cardiac

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Analiza ex vivo zmian w tętnicach z modeli zwierzęcych chorób sercowo-naczyniowych klasycznie opiera się na technikach histologicznych i immunohistochemicznych. Zapewniają one 2-wymiarowe pomiary w 3-wymiarowych zmianach. W artykule opisano generowanie zmian tętniczych do analizy ilościowej w 3 wymiarach z wykorzystaniem optycznej tomografii projekcyjnej.

Generowanie i 3-wymiarowa ocena ilościowa zmian w tętnicach u myszy za pomocą optycznej tomografii projekcyjnej

Pomiar biomarkerów w złożonych próbkach biologicznych coraz częściej pomaga w podejmowaniu decyzji klinicznych. Opisujemy wysoce czułą metodę jednoczesnego pomiaru białka C wiążącego miozynę sercową, kinazy kreatynowej MB i troponiny sercowej I w próbkach surowicy od osób z zawałem mięśnia sercowego i zdrowych osób z grupy kontrolnej.

Czuła i specyficzna metoda ilościowa do oznaczania białka C wiążącego miozynę sercową w surowicy za pomocą elektrochemiluminescencyjnego testu immunologicznego

Biomarkery są bezpośrednio mierzonymi biologicznymi wskaźnikami choroby lub zdrowia. W naukach populacyjnych i społecznych biomarkery muszą być łatwe do uzyskania, transportu i analizy. Pobieranie suszonych plam krwi (DBS) spełnia tę potrzebę, może być zbierane w terenie z wysokimi wskaźnikami odpowiedzi i analizowane pod kątem różnych biomarkerów.

Pobieranie biomarkerów zdrowotnych z wysuszonej kropli krwi w celu maksymalizacji udziału w badaniach populacyjnych

Opisano montaż i użycie multimodalnego mikroendoskopu, który może rejestrować dane obrazu tkanek powierzchownych z parametrami fizjologicznymi tkanek, w tym stężeniem hemoglobiny, stężeniem melaniny i nasyceniem tlenem. Technika ta może być przydatna do oceny struktury tkanki i perfuzji oraz może być zoptymalizowana pod kątem indywidualnych potrzeb badacza.

Multimodalna platforma obrazowania i spektroskopii mikroendoskopii z wiązkami włókien do nieinwazyjnej analizy tkanek in vivo

Krążące mikroRNA okazały się obiecujące jako biomarkery chorób sercowo-naczyniowych i ostrych zawałów mięśnia sercowego. W tym badaniu opisujemy protokół ekstrakcji miRNA, odwrotnej transkrypcji i cyfrowego PCR w celu bezwzględnej kwantyfikacji miRNA w surowicy pacjentów z chorobami sercowo-naczyniowymi.

Cyfrowy PCR do ilościowego oznaczania krążących mikroRNA w ostrym zawale mięśnia sercowego i chorobach sercowo-naczyniowych

Tutaj przedstawiamy metodę użycia wewnątrzkomorowego cewnika optycznego w perfundowanych sercach do wykonywania spektroskopii absorbancji przez ścianę serca. Uzyskane dane dostarczają solidnych informacji na temat napięcia tlenu w tkankach, a także wykorzystania substratu i potencjału błonowego jednocześnie z pomiarami wydolności serca w tym wszechobecnym preparacie.

Wewnątrzsercowy cewnik świetlny do bocznego zapłonu do monitorowania metabolizmu komórkowego za pomocą przezściennej spektroskopii absorpcji perfundowanych serc ssaków

Ten protokół opisuje konfigurację i korzystanie z ElectroMap, opartej na MATLAB platformy oprogramowania open source do analizy danych mapowania optycznego serca. ElectroMap zapewnia wszechstronne, wysokowydajne narzędzie do analizy zestawów danych dotyczących napięcia i wapnia w mapowaniu optycznym w szerokim zakresie eksperymentalnych modeli serca.

Wysokoprzepustowa analiza danych mapowania optycznego za pomocą ElectroMap

Celem tego badania było ustalenie metody badania dynamiki serca za pomocą translacyjnego modelu zwierzęcego. Opisane podejście eksperymentalne obejmuje optokardiografię podwójnej emisji w połączeniu z badaniem elektrofizjologicznym w celu oceny aktywności elektrycznej w izolowanym, nienaruszonym modelu serca świni.

Badania optokardiograficzne i elektrofizjologiczne serca perfundowanego ex vivo Langendorffem

Ten protokół przedstawia zbiór sarkomerów, wapnia i makroskopowych danych geometrycznych z aktywnie kurczącego się trabecula serca ex vivo. Te równoczesne pomiary są możliwe dzięki integracji trzech modalności obrazowania.

Jednoczesne obrazowanie w jasnym polu, fluorescencji i optycznej koherentnej tomografii kurczących się beleczków serca ex vivo

Opisujemy protokół do nieinwazyjnego i ciągłego pomiaru bezwzględnego wskaźnika przepływu krwi w mikronaczyniach krwionośnych i nasycenia krwi tlenem za pomocą multimodalnego urządzenia opartego na optyce dyfuzyjnej bliskiej podczerwieni. Następnie oceniamy tempo metabolizmu zużycia tlenu i reaktywnego przekrwienia za pomocą testu okluzji naczyniowej.

Nieinwazyjne monitorowanie utlenowania mikrokrążenia i reaktywnego przekrwienia przy użyciu hybrydowej, rozproszonej spektroskopii optycznej w bliskiej podczerwieni do intensywnej terapii

Ten artykuł opisuje metodologię izolacji, charakterystyki i kwantyfikacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z ludzkiego osocza (EV) i przedstawia przebieg pracy do bezznacznikowej analizy proteomu EV przy użyciu chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS).

Izolacja, charakterystyka i analiza proteomiczna pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z osocza w celu odkrycia biomarkerów sercowo-naczyniowych

Poznaj metodę ilościowego oznaczania biomarkerów serca w ludzkiej surowicy przy użyciu nadzwyczajnej transmisji optycznej. Technika ta umożliwia wykrywanie troponiny I w punktach opieki bez złożonych układów optycznych.

Wykorzystanie nadzwyczajnej transmisji optycznej do ilościowego oznaczania biomarkerów serca w ludzkiej surowicy

Przeglądaj więcej filmów