Wykorzystanie nadzwyczajnej transmisji optycznej do ilościowego oznaczania biomarkerów serca w ludzkiej surowicy
13 grudnia 2017
Ta praca opisuje metodę litografii nanoimprintingowej do wytwarzania wysokiej jakości matryc czujnikowych, które działają na zasadzie niezwykłej transmisji optycznej. Bioczujnik jest tani, solidny, łatwy w użyciu i może wykrywać troponinę sercową I w surowicy w klinicznie istotnych stężeniach (odcięcie 99. percentyla ∼10-400 pg/ml, w zależności od testu).
Ogólnym celem tej techniki jest pomiar biomarkerów obecnych w złożonym tle płynu biologicznego w klinicznie istotnych stężeniach w miejscu opieki nad pacjentem bez konieczności stosowania skomplikowanych konfiguracji optycznych lub elektrycznych. Metoda ta może pomóc w urzeczywistnieniu bioczujników opartych na nadzwyczajnej transmisji w scenariuszach opieki nad pacjentem. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga ona żadnych skomplikowanych konfiguracji elektrycznych ani optycznych.
W naszych eksperymentach udało nam się niezawodnie wykryć biomarkery w klinicznie istotnych stężeniach. Produkcja chipa czujnika odbywa się w pomieszczeniu czystym i nie można go filmować. W celach demonstracyjnych procedura jest tutaj przedstawiona za pomocą animacji.
Aby przygotować formę niklową, należy pokryć warstwą ujemnej wiązki elektronów o grubości 220 nanometrów na czterocalowej płytce krzemowej o grubości 600 mikronów. Napisz zaprojektowaną tablicę nano-otworów na tej płytce, używając systemu litografii wiązką elektronów. Aby przyspieszyć zapis wiązki elektronów, napisz wzory z mapą niskokropkową wynoszącą 20 000 na każdy rozmiar pola o wielkości 300 mikronów.
Rozwiń rezystancję, zanurzając czterocalową płytkę krzemową w roztworze wywoływacza na 10 sekund i pozwalając płytce wyschnąć na powietrzu. Umieść warstwę zalążkową metalu, takiego jak nikiel, miedź lub aluminium, na płytce krzemowej. Następnie galwanizować płytkę w systemie galwanicznym w kąpieli niklowo-sulfaminianowej w dwóch etapach.
Oddziel formę niklową od podłoża silikonowego, przykładając delikatną, mechaniczną siłę. Następnie, za pomocą nanoimprintera, odciśnij nano wzory na czterocalowej szklanej płytce, która została pokryta fotoutwardzalnym rezystantem litografii nanoimprintingowej o grubości 300 nanometrów. Przenieś formę, fotorezystor i szklaną płytkę do systemu utwardzania światłem UV i fotoutwardzania.
Jeśli wszystkie kroki zostały wykonane prawidłowo, formę niklową należy łatwo wyjąć z fotorezystu. Po wykonaniu ślepego wytrawiania fotorezystu na prostej szklanej, na płytce szklanej, w maszynie do osadzania wiązką elektronów osadzaj warstwę chromu dla adhezji metalu i warstwę złota dla czujnika plazmonicznego. Wykonaj uniesienie fotorezystu przez wytrawianie plazmą tlenową przez trzy minuty, a następnie 15-sekundowy etap sonofikacji w acetonie.
Następnie pokrój próbkę w kostkę na wióry o wymiarach pięć milimetrów na pięć milimetrów. Układ nano-otworów będzie zajmował centralny kwadrat chipa o wymiarach dwa na dwa milimetry. Aby uzyskać dane, ustaw aparaturę tak, aby dokonywała pomiarów optycznych, tak aby wiązka białego światła wychodząca przez koniec światłowodu nadajnika była kolumnowana i padała na powierzchnię czujnika pod kątem 90 stopni.
Światło jest przepuszczane przez cały układ nanootworów. Zbierz przesyłany sygnał światłowodem odbiorczym i zapisz go za pomocą spektrometru UV-visible pracującego w zakresie od 300 do 1 000 nanometrów. W celu przeprowadzenia testu czułości czujnika należy umieścić wzorcową ciecz o współczynniku załamania światła w ogniwie cieczowym o współczynnikach załamania światła w zakresie od 1,31 do 1,39.
Zanurz chip czujnika w cieczy o standardowym indeksie załamania światła i wyrównaj go z wiązką białego światła. Następnie uzyskaj widmo transmisyjne. Po każdym pomiarze wyczyść chip czujnika odczynnikiem do czyszczenia powierzchni czynnego i osusz go gazowym azotem.
W celu modyfikacji powierzchni czujnika należy oczyścić chipy czujnika przez sekwencyjne zanurzenie w izopropanolu, acetonie i wodzie dejonizowanej przed jakimikolwiek modyfikacjami chemicznymi. Następnie wysusz chipy czujnika w temperaturze pokojowej w parze suchego azotu gazowego. Następnie inkubuj chipy czujnika w roztworze etanolowym przez 12 godzin w temperaturze pokojowej.
W ten sposób powstanie monowarstwa reagująca z aminami, samoorganizująca się. Po inkubacji użyj etanolu, aby dokładnie wypłukać i wysuszyć frytki w temperaturze pokojowej. Następnie zanurz chipsy w mieszaninie 75-milimolowego sulfonu i hydroksysukcynimidu i 15-milimolowego EDC na 15 minut.
Spowoduje to aktywację grupy karboksykrzemowej monowarstwy do samoorganizacji. Następnie na powierzchni czujnika nanieść 50 mikrolitrów roztworu przeciwciał antytriponentowych o stężeniu 200 mikrogramów na mililitr sporządzonego w buforze o Ph 4,5. Po inkubacji przez 30 minut dezaktywować niereaktywne estry, zanurzając chip czujnika w jednym molowym roztworze etanoloaminy HCL na 15 minut.
Na koniec opłucz chip wodą dejonizowaną i wysusz go w strumieniu suchego azotu o temperaturze pokojowej. Zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania, wykrywając 100 mikrolitrów 1% roztworu albuminy surowicy bydlęcej na powierzchni chipa czujnika. Inkubować przez 15 minut.
Opłucz chipy czujnika trzykrotnie w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem. Włóż chip do komórki pomiarowej, aby zarejestrować widmo transmisyjne. To jest spektrum referencyjne.
Następnie nanieś 50 mikrolitrów troponiny sercowej w jednym wzorcu na powierzchnię chipa. Inkubuj chip w wilgotnym środowisku przez 30 minut. Po trzykrotnym przepłukaniu chipów czujnika w roztworze PBS, włóż go do celi pomiarowej, aby zarejestrować widmo transmisyjne.
To jest widmo po związaniu. Następnie zanurz wióry w 50-milimolowym glicynie HCL na jedną minutę, a następnie trzykrotnie spłucz w roztworze PBS, aby zregenerować powierzchnię chipa. Zmierz widmo transmisji w PBS, aby zweryfikować powodzenie etapu regeneracji.
Pokazano zmianę widma transmisji biosensora po interakcji z 30 nanogramami na mililitr ludzkiej troponiny sercowej w surowicy. Niebieski wykres reprezentuje okres przed interakcją, a czerwony wykres reprezentuje okres po interakcji. Kropkowane kółko wskazuje śledzone pasmo.
Pokazano tutaj przesunięcie długości fali dla pasma drugiego przy stężeniach troponiny wynoszących 2,5 nanograma na mililitr, 7,5 nanograma na mililitr, 30 nanogramów na mililitr i 75 nanogramów na mililitr. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Wykres ten pokazuje przesunięcie długości fal pasm obserwowane po regeneracji dla chipa biosensora z nanootworami.
Przesunięcie pozycji pasma drugiego z powrotem do jego pierwotnego położenia wskazuje, że etap regeneracji zakończył się sukcesem. Po opanowaniu pomiaru można go wykonać w ciągu godziny, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Podczas pomiaru bioanalitów tą metodą ważne jest, aby używać świeżo przygotowanych odczynników.
Upewnij się, że masz w ręku materiały eksploatacyjne. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać bioczujniki, które działają na zasadzie nadzwyczajnej transmisji optycznej i mogą monitorować bioanality na złożonym tle. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ trudno jest wygenerować matryce nano-otworów o wysokiej wierności, które umożliwiają połączenie chipa ze światłowodem bez konieczności korzystania z mikroskopu i wyboru powtarzalnych żywic.
Technika ta umożliwia wykonywanie pomiarów seryjnych, które mają kluczowe znaczenie w warunkach medycznych. Produkcja chipa w znacznym stopniu przyczynia się do zapewnienia powtarzalności pomiarów. Ponieważ podstawowa platforma pozostaje taka sama, dalsze ulepszenia tej techniki będą wynikać z zastosowania techniki o lepszej rozdzielczości, co poprawi czułość, oraz z zastosowania metod przetwarzania sygnału w celu uzyskania lepszych proporcji sygnału do szumu.
Implikacje tej techniki obejmują monitorowanie wielu bioanalitów na złożonym tle surowicy w miejscu opieki nad pacjentem w czasie rzeczywistym.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza praca opisuje metodę litografii nanoimprintowej do wytwarzania wysokiej jakości matryc detekcyjnych, działających w oparciu o zasadę nadzwyczajnej transmisji optycznej. Biosensor został zaprojektowany do zastosowań w diagnostyce przy łóżku pacjenta (point-of-care), umożliwiając wykrywanie troponiny I mięśnia sercowego w surowicy w klinicznie istotnych stężeniach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biotechnologia
- Inżynieria biomedyczna
Wstęp
- Potrzeba niezawodnego wykrywania biomarkerów w złożonych płynach biologicznych.
- Wyzwania związane z tradycyjnymi technologiami biosensorów.
- Zasada nadzwyczajnej transmisji optycznej w biosensoryce.
- Znaczenie diagnostyki w punkcie opieki (point-of-care) w warunkach klinicznych.
Cel badania
- Opracowanie niskokosztowego, wytrzymałego biosensora do wykrywania troponiny I mięśnia sercowego.
- Uproszczenie procesu detekcji poprzez wyeliminowanie złożonych układów pomiarowych.
- Wykazanie możliwości zastosowania biosensorów opartych na zjawisku nadzwyczajnej transmisji w aplikacjach klinicznych.
Zastosowane metody
- Litografia nanodrukowania do wytwarzania czujników.
- Testowanie biosensora w próbkach surowicy.
- Animowana reprezentacja procesu wytwarzania.
- Ocena granic detekcji i parametrów wydajności.
Główne wyniki
- Biosensor może wykrywać troponinę I serca w stężeniach od 10-400 pg/mL.
- Działa skutecznie w warunkach diagnostyki przy łóżku pacjenta (point-of-care).
- Wykazał niezawodność w wykrywaniu biomarkerów w złożonych płynach ustrojowych.
- Eliminuje konieczność stosowania rozbudowanych układów optycznych lub elektrycznych.
Wnioski
- Ta metoda stanowi znaczący postęp w technologii biosensorów.
- Posiada ona potencjał do usprawnienia diagnostyki przy łóżku pacjenta w przypadku schorzeń kardiologicznych.
- Przyszłe prace mogą skupić się na rozszerzeniu zakresu wykrywanych biomarkerów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta platforma biosensoryczna odpowiada na krytyczną potrzebę niezawodnego i niskokosztowego wykrywania biomarkerów sercowych w złożonych płynach biologicznych, takich jak surowica ludzka, bezpośrednio wspierając procesy diagnostyki w punkcie opieki (point-of-care). Umożliwiając powtarzalne, ilościowe pomiary troponiny I w stężeniach istotnych klinicznie, bez konieczności stosowania rozbudowanych układów optycznych lub elektrycznych, metoda ta zmniejsza bariery techniczne w wczesnej diagnostyce i stratyfikacji ryzyka w chorobach układu krążenia. Wysokoprecyzyjne wytwarzanie metodą nanoimprintingu zapewnia minimalną zmienność między poszczególnymi chipami, co wspiera skalowalną produkcję i spójną wydajność testów na etapach odkryć naukowych oraz badań translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie dynamiki uwalniania troponiny sercowej jako mechanistycznego biomarkera uszkodzenia mięśnia sercowego w modelach przedklinicznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia bezznacznikowy odczyt optyczny kompatybilny z wysokowiernymi macierzami nanootworów, co pozwala na spójną detekcję sygnału w podłożu surowicy.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Dostarcza ilościowe wyniki przesunięcia długości fali, które korelują z stężeniem analitytu, co umożliwia charakteryzację zależności dawka-odpowiedź w macierzach surowicy.
- Wartość operacyjna: Wspiera strategię jednego chipa i jednego pomiaru przy niskiej wariancji, co zwiększa powtarzalność w celu standaryzacji analizy i przesiewania reagentów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Umożliwia monitorowanie kinetyki biomarkerów sercowych w ludzkiej surowicy o znaczeniu chorobowym, co poprawia ciągłość translacyjną od etapu odkrycia do walidacji.
- Wartość operacyjna: Eliminuje konieczność stosowania mikroskopii dzięki dużym obszarom detekcji (1.5 mm x 1.5 mm), co upraszcza integrację ze standardowymi laboratoryjnymi źródłami światła i spektrometrami.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od wczesnego etapu odkrywania do identyfikacji wiodących cząsteczek, zapewniając wiarygodny, ilościowy odczyt detekcji biomarkerów w złożonych płynach, co wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o zaangażowanie celu i modulację szlaku.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących mechanizmów uszkodzeń serca poprzez niezawodną detekcję troponiny I w fizjologicznie istotnych stężeniach w surowicy.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne przesunięcia widma transmisyjnego, które pozwalają na porównanie poziomów biomarkerów w różnych warunkach doświadczalnych bez konieczności stosowania złożonej aparatury.
- Analityka: Dostarcza pomiary przesunięcia długości fali (np. pasma drugiego) jako wyjściowy wynik ilościowy do śledzenia wiązania biomarkerów i skuteczności regeneracji.
- Badania translacyjne: Wykorzystuje surowicę ludzką jako matrycę detekcyjną, co zapewnia odpowiedniość dla próbek klinicznych i zmniejsza ryzyko błędów translacyjnych specyficznych dla gatunku.
- Zastosowania przemysłowe: Proces wytwarzania oparty na nanodruku jest możliwy do zastosowania w wielu generacjach chipów, co wspiera skalowalność platformy dla multipleksowych paneli biomarkerów.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w detekcji biomarkerów dzięki klinicznie istotnej granicy wykrywalności LOD (0.55 ng/mL) oraz minimalnej zmienności między chipami.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja za pomocą litografii nanoimprintowej oraz kompatybilność z powszechnie stosowanymi spektrometrami UV-Vis i układami światłowodowymi.
- Wartość strategiczna: Redukcja ryzyka biologicznego na późnych etapach dzięki umożliwieniu wczesnego i dokładnego monitorowania biomarkerów w środowiskach symulujących POC.
- Wpływ na portfolio: Wsparcie dla priorytetyzacji kandydatów celowanych w cardiomyocytes z uwzględnieniem ryzyka poprzez niezawodne odczyty kompatybilne z surowicą.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu litografii nanoimprintingowej, chemii powierzchni oraz spektroskopii optycznej w celu wytwarzania i funkcjonalizacji chipów.
- Proces jest zależny od dostępu do czystego pomieszczenia w celu generowania formy matki oraz systemów utwardzania UV do polimeryzacji rezystu.
- Konieczne jest znormalizowane przygotowanie powierzchni (np. blokowanie BSA, płukanie EDTA), aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie w macierzach surowicy.
- Adaptacja do innych biomarkerów wymaga walidacji wydajności immobilizacji przeciwciał oraz stabilności regeneracji w płynach złożonych.
- Ograniczenie praktyczne: wydajność regeneracji musi być weryfikowana w każdym cyklu, aby zapewnić powtarzalność powierzchni podczas pomiarów seryjnych.
