Fluorometria zaciskowa napięcia w oocytach Xenopus przy użyciu fluorescencyjnych nienaturalnych aminokwasów

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wprowadzenie fluorescencyjnego nienaturalnego aminokwasu do białka błonowego ekspresowanego w oocytach Xenopus oraz jednoczesne określenie funkcji białka i jego reorganizacji strukturalnej za pomocą fluorometrii z zaciskiem napięcia (voltage-clamp fluorometry). Technika ta pomoże odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie zależności między strukturą a funkcją białek błonowych. Dzięki zastosowaniu fluorometrii z zaciskiem napięcia możemy bezpośrednio skorelować reorganizacje strukturalne z funkcją białka.

Dodanie fluorescencyjnego znakowania nienaturalnymi aminokwasami pomogło pokonać wcześniejsze ograniczenia w znakowaniu. Chodziło przede wszystkim o dostępność miejsc znakowania, a także o znakowanie tła wynikające z obecności endogennych miejsc wiązania. Zastosowanie tej techniki pozwala na lepsze zrozumienie biofizyczne białek błonowych, ponieważ umożliwia teraz badanie domen, które wcześniej były niedostępne przy użyciu tradycyjnej fluorometrii metodą clampowania napięcia.

Po chirurgicznym usunięciu oocytów Xenopus, przemyj oocyty trzykrotnie roztworem SOS. Wybierz pojedynczo duże i zdrowe oocyty, a następnie inkubuj je w temperaturze 18 °C przez co najmniej cztery godziny w roztworze Bartha z dodatkiem antybiotyków i 5% surowicy konia przed wstrzyknięciem. W celu wstrzyknięcia DNA do jądra komórkowego przygotuj długą i cienką końcówkę do iniekcji, aby dotrzeć do jądra bez uszkadzania oocytów.

Następnie należy napełnić końcówkę do iniekcji olejem i zamontować ją w nanowstrzykiwaczu. Kolejnym krokiem jest zainstalowanie nanowstrzykiwacza pod mikroskopem stereoskopowym i odłamanie końca końcówki za pomocą pęsety. Po tym zabiegu należy wypchnąć olej, aż w końcówce nie pozostaną żadne pęcherzyki powietrza.

Następnie, pod stereomikroskopem, nanieś jedną mikrolitr 0,1 µg/µL pAnap w wodzie wolnej od nukleaz na fragment Parafilmu i pobierz DNA do końcówki do mikroiniekcji. Następnie przenieś oocyty do naczynia do iniekcji z siatką, zawierającego roztwór Bartha z dodatkiem antybiotyków. Ponieważ jądro oocytu znajduje się w biegunie zwierzęcym, skieruj końcówkę do iniekcji w centrum bieguna zwierzęcego i wprowadź ją tak, aby końcówka dotarła w pobliże środka półkuli zwierzęcej.

Następnie wstrzyknij 9,2 nanolitra roztworu pAnap do jądra każdego oocytu. Po tym inkubuj oocyty w dwóch mililitrach roztworu Bartha z dodatkiem antybiotyków i 5% surowicy konia w temperaturze 18°C przez okres od 6 do 24 godzin, aby umożliwić silną ekspresję specyficznych dla Anap tRNA oraz syntetaz tRNA. Teraz ponownie przygotuj nanowtryskiwacz, jednak tym razem końcówka do iniekcji nie musi być tak cienka jak ta używana do wstrzykiwania DNA.

Od tego momentu pracuj wyłącznie przy czerwonym świetle, aby zapobiec fotoblaknięciu Anap. Wymieszaj 1 µL 1 mM Anap z 1 µL mRNA o stężeniu od 1 do 2 µg/µL bezpośrednio na kawałku Parafilmu, a następnie napełnij końcówkę do mikroiniekcji tak przygotowanym roztworem. Wbij końcówkę w biegun wegetatywny tuż poniżej błony i wstrzyknij 46 nl roztworu do każdego oocyta poddanego iniekcji pAnap.

Następnie należy zabezpieczyć oocyty przed światłem, umieszczając je w ciemnej skrzynce lub owijając kolbę folią aluminiową. Inkubować je w roztworze Bartha z dodatkiem antybiotyków i 5% surowicy konia w temperaturze 18 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni. Każdego dnia wymieniać roztwór na świeży roztwór Bartha oraz usuwać martwe oocyty, aby uniknąć kontaminacji.

W tej konfiguracji urządzenie do clampowania napięcia z przeciętą membraną (cut-open voltage-clamp) zostało zintegrowane z układem mikroskopii fluorescencyjnej. Komora rejestracyjna jest zamontowana na prowadnicy, która umożliwia jej przemieszczanie pomiędzy standardowym stereoskopem, służącym do umieszczania oocytu, a mikroskopem do przeprowadzania pomiarów fluorescencji. System detekcji fotodiodowej jest podłączony do wyjścia z mocowaniem C-mount mikroskopu fluorescencyjnego, a odczyt prądu fotoprzeciążonego jest podłączony do drugiego kanału wejściowego w cyfrowym procesorze sygnałowym.

W качестве źródła światła do wzbudzania fluorescencji zastosowano lampę halogenową o mocy 100 W i napięciu 12 V. Wzbudzanie jest kontrolowane przez mechaniczną migawkę umieszczoną pomiędzy źródłem światła wzbudzającego a mikroskopem. Aktywacja następuje poprzez impuls TTL generowany przez cyfrowy procesor sygnałowy, który jest zsynchronizowany w oprogramowaniu rejestrującym w taki sposób, aby migawka otwierała się około 100 ms przed rozpoczęciem rejestracji, przy czym w wieżyczce filtrów wymagany jest odpowiedni kostk filtracyjny.

W przypadku dwukolorowego VCF, bezpośrednio przed rejestracją inkubować przygotowane oocyty w 5 µM TMR maleimide w roztworze znakującym przez 15 minut. Następnie, przed rozpoczęciem rejestracji, przemyć oocyty trzykrotnie roztworem znakującym, aby usunąć nadmiar barwnika. Na tym etapie białko zostaje swoiście oznakowane dwoma różnymi fluoroforami.

Po zamocowaniu oocytu, w pozycji z biegunem zwierzęcym skierowanym do góry i po jego permeabilizacji, przesuń komorę pod mikroskop i ustaw ostrość na oocycie, korzystając z obiektywu 4X. Następnie przebij oocyt elektrodą V1 do pomiaru napięcia. Potem przełącz na obiektyw imersyjny wodny 40X.

Skup obraz na biegunie zwierzęcym, który jest skierowany do góry. Następnie wyłącz czerwone światło. Wybierz kostkę filtru Anap, obracając wieżę z kostkami filtrów oraz port wyjściowy optyki połączony z fotodiodą.

Następnie włącz lampę halogenową na najwyższą intensywność i otwórz migawkę na dwa do pięciu sekund, aby odczytać natężenie fluorescencji tła pochodzącej z oocytu. Po tym czasie włącz zacisk (clamp), przełącz przełącznik bath/guard w tryb aktywny i dostosuj potencjał błonowy do potencjału sterującego, obracając pokrętło na głowicy wzmacniacza. Następnie w oprogramowaniu rejestrującym wybierz potencjał podtrzymujący, protokół skokowy, liczbę oraz długość impulsów.

Następnie zarejestruj prądy zależne od napięcia oraz natężenia fluorescencji Anap. W przypadku dwukolorowego VCF wybierz kostkę filtracyjną TMR, obracając wieżyczkę kostek. Odczytaj fluorescencję tła dla TMR, zgodnie z opisem dla Anap, a następnie jednocześnie zarejestruj prądy zależne od napięcia i natężenie fluorescencji TMR.

Rycina ta przedstawia sygnały fluorescencji Anap i TMR przy zastosowaniu protokołów skokowych uzyskanych z tego samego oocyta wykazującego ekspresję mutanta Shaker. Poprzez wprowadzenie cysteiny, dostępnej z roztworu zewnętrznego, do tła L382 stop W434F i jej znakowanie maleimidem TMR, możliwe jest jednoczesne badanie ruchów w czasie rzeczywistym w różnych regionach tego samego białka. Zależność fluorescencji od napięcia uzyskano poprzez wykreślenie intensywności fluorescencji w stanie stacjonarnym w funkcji napięcia.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak wprowadzać fluorescencyjne nienaturalne aminokwasy do oocytów Xenopus oraz jak przeprowadzać jedno- lub dwukolorową fluorometrię z blokadą potencjału (voltage-clamp fluorometry). Po opanowaniu tej techniki czas przeprowadzenia badania będzie zbliżony do czasu tradycyjnych eksperymentów elektrofizjologicznych; jedynym dodatkowym krokiem jest wstrzyknięcie DNA do jądra oocytu. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o sprawdzeniu obecności ekspresji nieszczelnej (leak expression) w przypadku braku nienaturalnego aminokwasu.

Należy to przeprowadzić dla każdej mutacji, ponieważ poziom ekspresji przeciekowej zależy od miejsca wstawienia kodonu stop w obrębie białka. Technika ta umożliwia teraz badaczom analizę zmian konformacyjnych w obrębie domeny cytozolowej białka, gdzie zachodzi wiele mechanizmów regulacyjnych.