Fluorometria zaciskowa napięcia w oocytach Xenopus przy użyciu fluorescencyjnych nienaturalnych aminokwasów

Ogólnym celem tej procedury jest wprowadzenie fluorescencyjnego nienaturalnego aminokwasu do białka błonowego ulegającego ekspresji w oocytach Xenopus oraz jednoczesne określenie funkcji białka i przegrupowania strukturalnego za pomocą fluorometrii zaciskowej napięcia. Technika ta pomoże odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu relacji struktura-funkcja białek błonowych. Korzystając z fluorometrii cęgów napięciowych, możemy bezpośrednio skorelować przegrupowania strukturalne z funkcją białka.

Dodanie do niego fluorescencyjnego, nienaturalnego znakowania aminokwasów pomaga przezwyciężyć wcześniejsze ograniczenia dotyczące znakowania. Kiedyś była to dostępność miejsc etykietowania, a także etykietowanie tła ze względu na endogenne miejsca wiązania. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku lepszego zrozumienia biofizycznego białek błonowych, ponieważ można teraz badać domeny, które wcześniej były niedostępne za pomocą tradycyjnej fluorometrii zaciskowej napięcia.

Po chirurgicznym usunięciu oocytów Xenopus należy trzykrotnie przemyć oocyty roztworem SOS. Wybierz indywidualnie duże i zdrowe oocyty i inkubuj je w temperaturze 18 stopni Celsjusza przez co najmniej cztery godziny w roztworze Bartha uzupełnionym antybiotykami i 5% surowicą końską przed wstrzyknięciem. Do wstrzyknięcia jądrowego DNA przygotuj długą i cienką końcówkę do wstrzykiwania, aby dotrzeć do jądra bez uszkadzania oocytów.

Następnie napełnij końcówkę iniekcji olejem i zamontuj końcówkę iniekcyjną na urządzeniu nanowtryskiwacza. Następnie zainstaluj nanowtryskiwacz pod mikroskopem stereoskopowym i złamij koniec końcówki kleszczami. Następnie wyrzuć olej, aż w końcu końcówki nie będzie uwięzionych pęcherzyków powietrza.

Następnie umieść jeden mikrolitr 0,1 mikrograma na mikrolitr pAnap w wodzie wolnej od nukleaz na kawałku Parafilmu pod stereoskopem i wypełnij końcówkę iniekcji DNA. Następnie przenieś oocyty do naczynia iniekcyjnego zawierającego siatkę zawierającą roztwór Bartha uzupełniony antybiotykami. Ponieważ jądro oocytu znajduje się w biegunie zwierzęcia, skieruj końcówkę iniekcji na środek bieguna zwierzęcia i wbij tak, aby końcówka sięgała blisko środka półkuli zwierzęcia.

Następnie wstrzyknij 9,2 nanolitra roztworu pAnap do jądra każdego oocytu. Następnie inkubuj oocyty w dwóch mililitrach roztworu Bartha uzupełnionego antybiotykami i 5% surowicą końską w temperaturze 18 stopni Celsjusza przez sześć do 24 godzin, aby umożliwić silną ekspresję specyficznych dla Anap tRNA i syntetaz tRNA. Teraz ponownie przygotuj nanowstrzykiwacz, ale tym razem końcówka do wstrzykiwania nie musi być tak cienka jak ta do wstrzykiwania DNA.

Od tego miejsca pracuj tylko w czerwonym świetle, aby zapobiec fotowybielaniu Anap. Wymieszaj jeden mikrolitr jednomilimolowego Anap z jednym mikrolitrem od jednego do dwóch mikrogramów mRNA na mikrolitr bezpośrednio na kawałku Parafilmu i napełnij końcówkę iniekcji roztworem mieszającym. Wbij końcówkę w biegun roślinny tuż pod błoną i wstrzyknij 46 nanolitrów roztworu mieszającego do każdego oocytu, któremu wstrzyknięto pAnap.

Następnie należy chronić oocyty przed światłem, umieszczając je w nieprzepuszczającym światła pudełku lub owijając kolbę folią aluminiową. Inkubuj je w roztworze Bartha uzupełnionym antybiotykami i 5% surowicą końską w temperaturze 18 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni. Codziennie zastępuj go świeżym roztworem Bartha i usuwaj martwe oocyty, aby uniknąć zanieczyszczenia.

W tej konfiguracji urządzenie do cęgowania napięcia typu cut-open jest zintegrowane z zestawem mikroskopii fluorescencyjnej. Komora zapisu jest zamontowana na suwaku, który umożliwia poruszanie się między standardowym stereoskopem do umieszczenia oocytu a mikroskopem do wykonywania pomiarów fluorescencji. System detekcji fotodiody jest podłączony do portu wyjściowego C-mount mikroskopu fluorescencyjnego, a odczyt fotoprądu jest podłączony do drugiego kanału wejściowego w cyfrowym procesorze sygnałowym.

100-watowa, 12-woltowa lampa halogenowa jest używana jako źródło światła do wzbudzenia fluorescencji. Wzbudzenie jest kontrolowane przez mechaniczną migawkę umieszczoną między źródłem światła wzbudzenia a mikroskopem. Aktywacja jest wyzwalana za pomocą impulsu TTL pochodzącego z cyfrowego procesora sygnałowego, który jest mierzony w czasie w oprogramowaniu rejestrującym w taki sposób, że migawka otwiera się na około 100 milisekund przed rozpoczęciem nagrywania, a w wieżyczce kostki filtrującej wymagana jest odpowiednia kostka filtrująca.

W przypadku dwukolorowego VCF przygotowane oocyty należy inkubować w pięciomikromolowym maleimidowym TMR w roztworze znakującym przez 15 minut bezpośrednio przed zapisem. Następnie trzykrotnie umyj oocyty roztworem do znakowania, aby usunąć nadmiar barwnika przed zapisem. W tym momencie białko jest specjalnie znakowane dwoma różnymi fluoroforami.

Po zamontowaniu oocytu, z tyczką zwierzęcą skierowaną do góry i przepuszczalną, przesuń komorę do mikroskopu i skup się na oocycie za pomocą obiektywu 4X. Następnie przebij oocyt elektrodą V1 wykrywającą napięcie. Następnie przełącz się na obiektyw 40X zanurzenia w wodzie.

Skoncentruj się na słupie zwierzęcym, który jest skierowany do góry. Następnie wyłącz czerwone światło. Wybierz kostkę filtra Anap, obracając wieżyczkę kostki filtra i optyczny port wyjściowy podłączony do fotodiody.

Następnie włącz lampę halogenową o najwyższym natężeniu i otwórz migawkę na dwie do pięciu sekund, aby odczytać intensywność fluorescencji tła pochodzącą z oocytu. Następnie włącz zacisk, przestaw przełącznik wanny/strażnika do pozycji aktywnej i dostosuj potencjał membrany do potencjału dowodzenia, obracając pokrętło na scenie czołowej. Następnie wybierz potencjał podtrzymania, protokół krokowy, liczbę i długość impulsów w oprogramowaniu rejestrującym.

Następnie zapisz prądy zależne od napięcia i intensywności fluorescencji Anap. W przypadku dwukolorowego VCF wybierz kostkę filtra TMR, obracając wieżyczkę sześcianu. Odczytaj fluorescencję tła dla TMR, zgodnie z opisem dla Anap, i jednocześnie rejestruj prądy zależne od napięcia i intensywność fluorescencji TMR.

Rysunek ten przedstawia sygnały fluorescencyjne Anap i TMR przy użyciu protokołów krokowych uzyskanych z tego samego oocytu wykazującego ekspresję mutanta Shakera. Poprzez dodanie cysteiny, dostępnej z roztworu zewnętrznego, do tła L382 stop W434F i znakowanie go maleimidem TMR, możliwe jest jednoczesne sondowanie ruchów w czasie rzeczywistym w różnych regionach tego samego białka. Zależność napięcia fluorescencji uzyskuje się przez wykreślenie intensywności fluorescencji w stanie ustalonym w funkcji napięcia.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak eksprymować fluorescencyjne nienaturalne aminokwasy w oocytach Xenopus i jak wykonać jednokolorową lub dwukolorową fluorometrię zaciskową napięcia. Kiedy już opanujesz technikę, powinno to zająć mniej więcej tyle samo czasu, co tradycyjne eksperymenty elektrofizjologiczne, masz tylko dodatkowy krok polegający na wstrzyknięciu DNA do jądra oocytu. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o sprawdzeniu, czy nie ma wycieku pod kątem braku nienaturalnego aminokwasu.

Należy to zrobić dla każdej mutacji, ponieważ ilość ekspresji przecieku zależy od miejsca insercji kodonu stop w białku. Technika ta umożliwia teraz naukowcom badanie zmian konformacyjnych w cytozolowym miejscu białka, gdzie zachodzi wiele mechanizmów regulacyjnych.